TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP
KHOA QUẢN LÝ TÀI NGUYÊN RỪNG & MƠI TRƢỜNG

ơ
-------------------------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN VÀ NẤM
MEN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ NƢỚC RỈ RÁC
TẠI BÃI RÁC LƢƠNG SƠN – HỊA BÌNH.

NGÀNH: KHOA HỌC MƠI TRƢỜNG
MÃ SỐ: 306

Giáo viên hướng dẫn

: Ths. Nguyễn Thị Bích Hảo
Nguyễn Thị Mai Lương

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Văn Nam

Mã sinh viên

: 1353061427

Lớp

: 58C - KHMT

Khóa học

: 2013 - 2017

LỜI CẢM ƠN
Hà Nội, 2017

1


LỜI CẢM ƠN
Để gắn kết giữa lý thuyết và thực hành, đồng thời hồn thành chƣơng
trình học, đƣợc sự đồng ý của Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp, Khoa QLTNR &
MT, em đã tiến hành thực hiện Khóa luận tốt nghiệp tại phòng thực hành thuộc
Trung tâm ĐDSH & QLRBV. Trong thời gian thực tập và hồn thành khóa luận,
em đã nhận đƣợc nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chỉ bảo của cô giáo hƣớng dẫn
cũng nhƣ các thầy cô, cán bộ tại Trung tâm, gia đình và bạn bè.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Trƣớc tiên em xin tỏ lịng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Thị
Bích Hảo, cơ Nguyễn Thị Mai Lƣơng là những ngƣời đã định hƣớng ý tƣởng
nghiên cứu, trực tiếp hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể
hồn thành tốt khóa luận của mình.
Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, cán bộ tại Trung
tâm ĐDSH & QLRBV đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian thực
tập, hồn thành Khóa luận tốt nghiệp.
Qua đây, em cũng xin bày tỏ sự biết ơn đối với các thầy cô của Khoa
QLTNR & MT, Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ
em trong suốt quá trình học tập tại Trƣờng để em hồn thành chƣơng trình học.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên

giúp đỡ em cả về vật chất và tinh thần trong suốt quá trình học tập và nghiên
cứu.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2017
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Văn Nam

i


TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP
KHOA QUẢN LÝ TÀI NGUYÊN RỪNG VÀ MƠI TRƢỜNG
========================================================
TĨM TẮT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
1. Tên khóa luận:

“Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn và nấm men có khả năng
phân giải cellulose từ nước rỉ rác tại bãi rác thị trấn Lương Sơn – tỉnh Hịa
Bình”.
Từ khóa: nước rỉ rác, vi khuẩn phân giải cellulose, nấm men phân giải
cellulose
Keywords: leachate, cellulolytic bacteria, cellulolytic yeast
2. Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Văn Nam

3. Giảng viên hƣớng dẫn:

ThS. Nguyễn Thị Bích Hảo
Cn. Nguyễn Thị Mai Lƣơng


4. Mục tiêu nghiên cứu:
 Mục tiêu tổng quát
Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn và nấm men có khả năng phân
giải cellulose từ nƣớc rỉ rác để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
 Mục tiêu cụ thể
Phân lập và chọn lọc các chủng vi khuẩn và nấm men có hiệu lực phân giải
cellulose cao từ nƣớc rỉ rác.
Bƣớc đầu xác định một số đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn và nấm
men đƣợc phân lập.
Xác định điều kiện pH môi trƣờng tối ƣu cho sinh trƣởng phát triển của các
chủng vi khuẩn và nấm men đó.
Nâng cao hiệu quả xử lý cellulose trong nƣớc rỉ rác bằng vi khuẩn và nấm
men.
ii


5. Đối tƣợng – phạm vi nghiên cứu
 Đối tƣợng nghiên cứu
Một số chủng vi khuẩn và nấm men có khả năng phân giải cellulose đƣợc
phân lập từ nƣớc rỉ rác tại bãi rác thị trấn Lƣơng Sơn, huyện Lƣơng Sơn – tỉnh
Hịa Bình.
 Phạm vi nghiên cứu
Bãi rác thị trấn Lƣơng Sơn – huyện Lƣơng Sơn, tỉnh Hịa Bình.
6. Nội dung nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn và nấm men có hiệu lực phân
giải cellulose cao từ nƣớc rỉ rác.
Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái của chủng vi khuẩn và nấm men đƣợc
tuyển chọn.
Nghiên cứu điều kiện pH môi trƣờng tối ƣu cho sinh trƣởng phát triển của
các chủng vi khuẩn và nấm men đó.

Đề xuất giải pháp nâng cao hiệu quả xử lý cellulose trong nƣớc rỉ rác bằng
vi khuẩn và nấm men.
7. Những kết quả đạt đƣợc
Đã sàng lọc đƣợc 8 chủng vi khuẩn có khả năng sinh trƣởng trên mơi trƣờng
Hansen. Các chủng đƣợc đặt tên là BHBi1, BHBi2, BHBi3, BHBi4, BHBi5,
BHFi1, BHFi2, BHFi3. Nhƣng đề tài chƣa phân lập đƣợc chủng nấm men có
khả năng phân giải cellulose từ nƣớc rỉ rác.
Các chủng vi khuẩn nghiên cứu đều có khả năng phân giải cellulose ở mức
độ khác nhau trên mơi trƣờng bổ sung cơ chất CMC. Trong đó 4 chủng BHBi1,
BHFi1, BHFi2 và BHF3 đƣợc xác định có khả năng phân giải mạnh nhất.
Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc
sau khi nhuộm màu Gram. Trong đó, 4 chủng thuộc nhóm Gram âm gồm các
iii


chủng BHBi1, BHBi2, BHBi5 và BHFi3. Các chủng còn lại (BHBi3, BHBi4,
BHFi1 và BHFi2) thuộc nhóm Gram dƣơng.
Xác định đƣợc pH môi trƣờng nuôi cấy tối ƣu cho sự sinh trƣởng, phát triển
và sinh tổng hợp enzyme cellulase của 4 chủng có khả năng phân giải cellulose
mạnh nhất. Trong đó, chủng BHBi1 có pH tối ƣu là 6 – 7 , 3 chủng BHFi1,
BHFi2 và BHFi3 có pH tối ƣu trong khoảng 4 – 5.
Đề xuất đƣợc một số giải pháp thúc đẩy quá trình phân giải cellulose, nâng
cao hiệu quả phân hủy RTSH.
Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Văn Nam

iv



MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... i
MỤC LỤC ............................................................................................................. v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................. vii
DANH MỤC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ ..................................................... viii
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................. viii
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG I.TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................ 3
1.1. Tổng quan về nƣớc rỉ rác ............................................................................... 3
1.1.1. Khái niệm nƣớc rỉ rác.................................................................................. 3
1.1.2. Nguồn gốc phát sinh nƣớc rỉ rác ................................................................. 3
1.1.3. Thành phần và tính chất của nƣớc rỉ rác ..................................................... 3
1.2. Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên ..................................... 5
1.2.1. Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên ..................................................... 5
1.2.2. Cấu trúc của cellulose ................................................................................. 7
1.3. Sự phân giải cellulose trong tự nhiên ............................................................. 9
1.3.1. Cơ chế của quá trình phân giải cellulose nhờ vi sinh vật............................ 9
1.3.2. Vi sinh vật phân giải cellulose .................................................................. 11
1.4. Các nghiên cứu về vi sinh vật phân giải cellulose từ nƣớc rỉ rác ................ 16
1.4.1. Nghiên cứu về vi sinh vật phân giải cellulose .......................................... 16
1.4.2. Nghiên cứu về vi sinh vật phân giải cellulose trong nƣớc rỉ rác .............. 21
CHƢƠNG II. MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 23
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 23
2.1.1. Mục tiêu tổng quát..................................................................................... 23
2.1.2. Mục tiêu cụ thể .......................................................................................... 23
2.2. Đối tƣợng – phạm vi nghiên cứu ................................................................. 23
2.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 23
2.4. Vật liệu – hóa chất – thiết bị ........................................................................ 24
v



2.4.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 24
2.4.2. Hóa chất..................................................................................................... 24
2.4.3. Thiết bị - dụng cụ ...................................................................................... 24
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 25
2.5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu ................................................... 25
2.5.2. Phƣơng pháp thử nghiệm môi trƣờng nuôi cấy ........................................ 26
2.5.3. Phƣơng pháp phân lập ............................................................................... 27
2.5.4. Phƣơng pháp tuyển chọn vi sinh vật phân giải hợp chất hữu cơ cellulose30
2.5.5. Phƣơng pháp nghiên cứu điều kiện pH môi trƣờng tối ƣu cho chủng vi
sinh vật phân giải cellulose ................................................................................. 32
2.5.6. Phƣơng pháp nhuộm Gram ....................................................................... 32
2.5.7. Phƣơng pháp thu thập, kế thừa tài liệu...................................................... 33
2.5.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu......................................................................... 34
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 35
3.1. Kết quả thử nghiệm môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn và nấm men................. 35
3.3. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn và nấm men có khả năng phân giải
cellulose ............................................................................................................... 39
3.4. Đặc điểm hình thái của các chủng đƣợc phân lập........................................ 41
3.5. Nghiên cứu điều kiện pH môi trƣờng tối ƣu cho sinh trƣởng, phát triển của
chủng vi khuẩn .................................................................................................... 44
3.6. Giải pháp nâng cao hiệu quả xử lý cellulose trong rác thải sinh hoạt bằng
các chủng vi khuẩn và nấm men ......................................................................... 48
CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 51
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 51
4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 53

vi



DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
BCL:

Bãi chôn lấp

CMC:

Carboxyl methyl cellulose

CNSH:

Công nghệ sinh học

CTNH:

Chất thải nguy hại

ĐDSH & QLRBV:

Đa dạng sinh học và quản lí rừng bền vững

HEC:

Hydroxyl ethyl cellulose

ICMC:

Index of Relative Enzyme Activity (ICMC)


KBTTN:

Khu bảo tồn thiên nhiên

MĐPG:

Mức độ phân giải

QLTNR & MT:

Quản lý tài nguyên rừng và môi trƣờng

RTSH:

Rác thải sinh hoạt

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc tính của nƣớc rỉ rác tại các BCL mới và lâu năm ......................... 5
Bảng 1.2. Hàm lƣợng cellulose có trong một số nguyên liệu ............................... 6
Bảng 1.3. Các vi sinh vật phân huỷ cellulose ..................................................... 15
Bảng 2.1. Phân cấp hoạt lực enzyme cellulase ngoại bào................................... 31
Bảng 3.1. Hình thái khuẩn lạc của 8 chủng vi sinh vật có khả năng sinh trƣởng
trên mơi trƣờng Hansen ....................................................................................... 36
Bảng 3.2. Hoạt tính enzyme cellulase ................................................................. 39
Bảng 3.3. Hình thái tế bào của của các chủng vi khuẩn và nấm men phân lập ............ 42
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng

phân lập ............................................................................................................... 45

viii


DANH MỤC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Cấu trúc không gian hợp chất cao phân tử cellulose ............................ 7
Hình 1.2. Các mắt xích D – glucose trong cellulose ............................................. 8
Hình 1.3. Cellulose cấu trúc thành tế bào thực vật ............................................... 8
Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase ............................................. 11
Hình 2.1. Sơ đồ vị trí lấy mẫu ............................................................................. 25
Hình 3.1. Khả năng phân giải cellulose (V) của các chủng đƣợc phân lập ........ 40
Hình 3.2. Vịng phân giải CMC của 4 chủng BHBi1, BHFi1, BHFi2 và BHFi3....... 41
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của pH đên khả năng sinh enzyme cellulase ................... 45
Hình 3.4. Vịng phân giải CMC của 3 chủng BHFi1, BHFi2 và BHFi3 khi nuôi
cấy trên môi trƣờng có pH = 5 ............................................................................ 46
Hình 3.5. Đƣờng kính vòng phân giải của 3 chủng BHFi1, BHFi2, BHFi3 ở pH
= 5 và pH = 7 ....................................................................................................... 47

ix


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, ô nhiễm môi trƣờng bởi rác thải sinh hoạt (RTSH) đang là vấn
đề bức thiết ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Theo kết quả
điều tra của Cục Bảo vệ Môi trƣờng năm 2012, tổng lƣợng phát sinh RTSH ở
nƣớc ta ngày càng gia tăng với tỷ lệ tƣơng đối cao (10%/năm) so với các nƣớc
phát triển trên thế giới. Tổng lƣợng phát sinh RTSH khoảng 6,5 triệu tấn/năm;
dự báo đến năm 2020 khoảng gần 22 triệu tấn/năm. Ở nƣớc ta, trung bình mỗi
ngày một ngƣời thải ra khoảng 0,5 kg - 0,8 kg rác, trong khi mức chất thải rắn ở

các nƣớc đang phát triển trung bình là 0,3 kg/ngƣời/ ngày. Điều này tạo áp lực
lớn về chi phí thu gom, xử lý cũng nhƣ gây ra các vấn đề môi trƣờng nghiêm
trọng.
Ở Việt Nam, dạng “tài nguyên” đặc biệt này vẫn chƣa thực sự đƣợc quan
tâm và tận dụng triệt để. Chúng ta vẫn đang loay hoay trong bài toán là làm thế
nào để quyết đƣợc lƣợng RTSH ngày càng tăng. Chỉ một số ít thành phần nhƣ
nhựa, kim loại đƣợc tách riêng và tái sử dụng, tái chế; cịn lại vẫn đƣợc xử lý
bằng các biện pháp thơng thƣờng nhƣ chôn lấp hay thiêu đốt. Trong khi thành
phần của RTSH hết sức đa dạng; các hợp chất hữu cơ mà trƣớc hết là cellulose
và lignin chiếm tỷ lệ cao nhất, thông thƣờng là 40 – 50%, nhiều trƣờng hợp
chiếm đến 70 – 80%. Điều này không những gây lãng phí giá trị của dạng “tài
nguyên bị bỏ đi này”, mà cịn gây ơ nhiễm mơi trƣờng. Thách thức đặt ra là làm
sao vừa tận dụng đƣợc “giá trị bị lãng quên” của RTSH, góp phần giảm thiểu
gánh nặng cho mơi trƣờng, vừa đem lại lợi ích kinh tế. Đó là bài tốn khơng dễ
để giải quyết.
Hiện nay, việc ứng dụng công nghệ vi sinh vào trong xử lý RTSH là một
hƣớng đi mới. Phƣơng pháp này chứng minh đƣợc có nhiều ƣu điểm so với các
phƣơng pháp truyền thống, cả về hiệu quả kinh tế lẫn kỹ thuật, tạo ra sản phẩm
phân bón hữu cơ dùng trong sản xuất nơng nghiệp. Tuy nhiên việc phân hủy
RTSH nói chung và đặc biệt là thành phần cellulose nói riêng trong tự nhiên bởi
1


các vi sinh vật có sẵn diễn ra rất chậm, gây ra nhiều hạn chế nhƣ thời gian phân
hủy kéo dài, q trình phân hủy khơng triệt để. Do vậy cần nghiên cứu những
chủng vi sinh vật thích hợp có khả năng phân giải cellulose, tạo điều kiện thích
hợp cho các chủng vi sinh vật phát triển, bổ sung vào bên cạnh những chủng có
sẵn để thúc đẩy q trình phân giải, giúp quá trình xử lý đạt kết quả tốt hơn.
Dựa trên cơ sở lý luận trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân
lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn và nấm men có khả năng phân giải

cellulose từ nguồn nước rỉ rác tại bãi rác thị trấn Lương Sơn – Hịa Bình”.

2


CHƢƠNG I
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về nƣớc rỉ rác
1.1.1. Khái niệm nước rỉ rác
Nƣớc rỉ rác hay nƣớc rò rỉ trong bãi rác là loại chất lỏng thấm qua các lớp
rác của các ô chôn lấp và kéo theo các chất bẩn dạng lơ lửng, keo và tan từ chất
thải rắn vào tầng đất ở dƣới đáy bãi chôn lấp (BCL). Trong giai đoạn hoạt động
của BCL, nƣớc rỉ rác hình thành chủ yếu do nƣớc mƣa và nƣớc “ép” ra từ các lỗ
rỗng của chất thải do thiết bị đầm nén [12].
Hay nƣớc rỉ rác là 1 loại chất lỏng đƣợc phát sinh từ quá trình phân hủy vi
sinh đối với các chất hữu cơ có trong rác, thấm qua các lớp rác của ơ chôn lấp và
kéo theo các chất bẩn dạng lơ lửng, keo và tan từ các chất thải rắn.
1.1.2. Nguồn gốc phát sinh nước rỉ rác
Nƣớc rỉ rác đƣợc hình thành từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm một số
nguồn sau đây:
- Nƣớc sẵn có và tự hình thành khi phân hủy rác hữu cơ trong BCL.
- Mực nƣớc ngầm có thể dâng lên vào các ô chôn lấp.
- Nƣớc từ ngồi có thể thấm (rỉ) vào qua thành vách của các ô chôn lấp.
- Nƣớc từ các khu vực khác chảy qua và có thể thấm xuống các ơ chơn lấp.
- Nƣớc mƣa rơi xuống gần khu vực BCL rác sau khi phủ đất và đóng ơ
chơn lấp rác.
Tuy nhiên, nƣớc rỉ rác tại các ô rác chủ yếu đƣợc hình thành do 2 nguồn
chính là độ ẩm của rác và quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ tạo ra
nƣớc [4].
1.1.3. Thành phần và tính chất của nước rỉ rác

3


Thành phần và tính chất nƣớc rỉ rác hết sức phức tạp. Để tổng hợp và đặc
trƣng hóa thành phần nƣớc rỉ rác là rất khó vì một loạt điều kiện tác động lên sự
hình thành nƣớc rỉ rác. Thời gian chôn lấp (tuổi của bãi chôn lấp), thời tiết, khí
hậu, các mùa trong năm, độ ẩm của BCL, cơng nghệ chơn lấp, mức độ pha lỗng
với nƣớc mặt, nƣớc ngầm và thành phần chất thải rắn, tất cả đều tác động lên
thành phần và lƣợng nƣớc rỉ rác sinh ra. Mặt khác, chiều sâu bãi chôn lấp, độ
dày, độ nén, và loại của lớp nguyên liệu phủ trên cùng, sự có mặt của các chất
ức chế, các chất dinh dƣỡng đa lƣợng và vi lƣợng, việc thiết kế và hoạt động của
BCL, việc chôn lấp chất thải rắn, CTNH, bùn từ trạm xử lý nƣớc thải,… cũng
tác động lên thành phần của nƣớc rỉ rác. Thành phần và tính chất nƣớc rỉ rác còn
phụ thuộc vào các phản ứng lý, hóa sinh xảy ra trong BCL. Các q trình sinh
hóa xảy ra trong BCL chủ yếu do hoạt động của các vi sinh vật sử dụng các chất
hữu cơ từ chất thải rắn làm nguồn dinh dƣỡng cho hoạt động của chúng [4].
Trong đa số các trƣờng hợp nƣớc rác bao gồm dịch lỏng tạo thành từ quá
trình phân hủy chất thải rắn và thành phần từ bên ngoài thấm vào nhƣ nƣớc mặt,
nƣớc mƣa và nƣớc ngầm. Phần dịch lỏng qua các lớp chất rắn dạng bị phân hủy
bao gồm tất cả những sản phẩm phân hủy sinh học và hóa học. Những sản phẩm
này bị lơi cuốn bởi dịng nƣớc thấm từ ngồi vào. Song nƣớc rỉ rác gồm 2 thành
phần chính đó là các hợp chất hữu cơ và các hợp chất vô cơ.
- Các hợp chất hữu cơ: Axit humic, axit fulvic, các hợp chất tananh, các
loại hợp chất hữu cơ có nguồn gốc nhân tạo.
- Các chất vô cơ: Là các hợp chất của Nito, Phospho, lƣu huỳnh [4].
Tính chất tiêu biểu của nƣớc rỉ rác từ bãi chôn lấp mới và lâu năm đƣợc
trình bày ở bảng 1.1.

4



Bảng 1.1. Đặc tính của nƣớc rỉ rác tại các BCL mới và lâu năm

Thành phần
BOD5
TOC
COD
Chất rắn hòa tan
TSS
Nito hữu cơ
Ammoniac
Nitrate
Tổng lƣợng P
Ortho phospho
Độ kiềm theo
CaCO3
pH
Canxi
Magie
Chlorua
Tổng lƣợng sắt
Sulfate

Đơn vị
mg/l
mg/l
mg/l
mg/l
mg/l
mg/l

mg/l
mg/l
mg/l
mg/l

mg/l
mg/l
mg/l
mg/l
mg/l
mg/l

Bãi mới (dƣới 2 năm)
Khoảng
Trung bình
2000 - 20000
10000
1500 - 20000
6000
3000 - 60000
18000
10000 - 55000
10000
200 - 2000
500
10 - 800
200
10 - 800
200
5 - 40

25
5 - 100
30
4 - 80
20
1000 - 10000
3000
4,5 – 7,5
50 - 1500
50 - 1500
200 - 3000
50 - 1200
50 - 1000

6,0
250
250
500
60
300

Bãi lâu năm
(trên 10 năm)
100 – 200
80 – 160
100 – 500
1200
100 – 400
80 – 120
20 – 40

5 – 10
5 – 10
4–8
200 – 1000
6,6 – 7,5
50 – 200
50 - 200
100 – 400
20 – 200
20 – 50

(Nguồn: Intergrated Soid Waste Management)

Từ bảng 1.1 có thể thấy rằng tính chất của nƣớc rỉ rác với những BCL có
thời gian hoạt động khác nhau là khác nhau. BCL mới có nồng độ các chất hữu
cơ nhƣ BOD5, COD, TOC,…trong nƣớc rỉ rác đều ở mức cao hơn vài trăm lần
so với BCL lâu năm. Điều này đƣợc lý giải là do trong lịng BCL cũng chính là
cỗ máy phân hủy sinh học.
1.2. Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên
1.2.1. Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên
Cellulose là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật, là sản
phẩm sơ cấp của quá trình quang hợp và cũng là nguồn nguyên liệu tái tạo lớn
nhất trên Trái Đất. Thông thƣờng cellulose của tế bào thực vật chiếm 50% tổng
số carbohydrate có trên Trái Đất. Hàng năm có khoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn
5


cellulose đƣợc các loài thực vật tạo ra. Hàng ngày, hàng giờ, một lƣợng lớn
cellulose đƣợc tích lũy lại trong đất do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải
ra, cây cối chết đi, cành lá rụng xuống. Một phần không nhỏ do con ngƣời thải

ra dƣới dạng rác thải, giấy vụn, phoi bào, mùn cƣa,… Ở cấp độ sinh quyển, hàng
tỷ tấn cellulose đƣợc tạo ra mỗi năm cần phải đƣợc phân hủy, nếu khơng có q
trình phân giải của vi sinh vật thì lƣợng chất hữu cơ khổng lồ này sẽ ngập tràn
Trái Đất và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái [16].
Cellulose có trong gốc và sợi của các loại thực vật, có nhiều trong sợi
bơng (95 – 98% trọng lƣợng khô), sợi lanh (71%), đay, gai, tre, nứa (50 – 80%),
ở các loại cây gỗ nói chung cellulose chiếm tới 40 – 50% (trong gỗ cây lá kim,
cellulose chiếm khoảng 41 – 49%, trong gỗ cây lá rộng chiếm 43 – 52%.). Ngồi
ra cellulose cịn có trong gỗ, thực vật dƣới nƣớc (tảo, rong,…), sản phẩm, phụ
phẩm nông nghiệp (rơm, rạ, lõi ngô,…) [5,10].
Dƣới dạng phế thải, cellulose có trong các phế liệu nơng nghiệp chăn
nuôi, công nghiệp, đồ hộp, công nghiệp chế biến gỗ (các loại sợi thiên nhiên chế
từ bông, gỗ, gai, lanh, đay đều là cellulose đƣợc dùng trong kỹ nghệ dệt, giấy),
trong chất thải sinh hoạt,…[2, 6,10,15].
Bảng 1.2. Hàm lƣợng cellulose có trong một số ngun liệu
Ngun liệu
Kiều mạch
Vỏ đậu tƣơng
Mía
Cây trƣởng thành
Bã
Thân ngơ
Cỏ
Trấu lúa mì

Cellulose (%)
42.8
51.0
34.0
42.0

56.6
36.0
28.0
30.5

Ngun liệu
Vỏ hạt
Sợi
Gỗ thơng
Giấy báo
Rơm
Lúa mì
Lúa mạch
Bơng

Cellulose (%)
60.0
91.0
41.0
40 – 80
44.0
30.5
34.0
91.0

(Nguồn: Nguyễn Đức Lƣợng, 1996)

6



1.2.2. Cấu trúc của cellulose
Cellulose làm cho các mô thực vật có tính bền cơ học, có tính đàn hồi và
tạo thành bộ xƣơng nâng đỡ các loài cây. Ngƣời ta nhận thấy rằng trong thiên
nhiên hầu nhƣ không gặp cellulose ở dạng tinh khiết mà nó thƣờng tồn tại ở
dạng kết hợp với những chất khác nhƣ hemicellulose, lignin, pectin,…các chất
này liên kết với nhau tạo thành phức hợp bền vững, cấu trúc lên màng tế bào
thực vật và có tên gọi chung là ligno – cellulose. Trong đó cellulose và
hemicellulose chiếm tỉ lệ cao nhất. Hai chất này đƣợc bao bọc bởi một lƣợng
lignin. Các thành phần này thƣờng có tỷ lệ khác nhau trong các loại cây khác
nhau tạo ra các đặc tính lý hóa riêng cho từng loại thực vật.
Về mặt cấu tạo hóa học, cellulose có cấu trúc phân tử là một hợp chất
polysaccharide cao phân tử, cấu tạo dạng sợi, mạch thẳng đƣợc cấu tạo từ các D
– glucose liên kết với nhau bằng liên kết ᵦ – 1,4 - glucosid, có cơng thức phân
tử là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n là độ trùng hợp, có thể nằm
trong khoảng 5000 – 14000. Cellulose có phân tử khối vào khoảng 250.000 1.000.000 đvC [5].

(Nguồn: Morgana Matus, 2012)

Hình 1.1. Cấu trúc khơng gian hợp chất cao phân tử cellulose
(Ghi chú: Màu nâu – Carbon, màu trắng – hydrogen, màu đỏ - oxygen)
7


Hình 1.2. Các mắt xích D – glucose trong cellulose
Các đơn vị lặp đi lặp lại nhỏ nhất trong cellulose là cellobiose, trong đó
bao gồm 2 đơn vị glucose. Trong chuỗi cellulose tinh thể dính vào nhau bởi liên kết
Hydro và lực Van Der Waals để tạo thành cấu trúc cao phân tử khơng hịa tan.
Cellulose có cấu trúc sợi song song, các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi có
đƣờng kính từ 10 – 40 nm, những vi sợi này hợp thành bó sợi to có thể quan sát
dƣới kính hiển vi quang học, các bó sợi gắn với nhau nhờ liên kết Hydro tạo

thành các lớp, các lớp liên kết với nhau nhờ liên kết Van Der Waals. Các liên
kết này sẽ làm tăng độ vững chắc của cấu trúc cellulose làm cho cấu trúc trở nên
khó hịa tan cũng nhƣ chống lại sự tấn cơng của các dung môi hữu cơ [5].

(Nguồn: Jane B. Reece et al., 2011)
Hình 1.3. Cellulose cấu trúc thành tế bào thực vật
8


Phân tử cellulose có cấu trúc khơng đồng nhất gồm 2 vùng:
- Vùng kết tinh: cellulose liên kết chặt với nhau nên có trật tự cao, rất bền
vững, vùng này khó bị tấn cơng bởi enzyme cũng nhƣ hóa chất và mạng lƣới
liên kết hydro ngăn cản sự trƣơng lên khi hấp thụ nƣớc.
- Vùng vơ định hình: cellulose liên kết không chặt với nhau nên kém trật tự
và kém bền vững hơn, có thể hấp thụ nƣớc và trƣơng lên.
Về tính chất, cellulose là một trong những hợp chất tự nhiên khá bền vững.
Nó khơng tan trong nƣớc mà chỉ có thể bị phồng lên do hấp thu nƣớc, cellulose
bị phân hủy khi đun nóng với acid hoặc kiềm khi ở nồng độ cao. Cellulose bị
phân hủy ở nhiệt độ bình thƣờng hoặc nhiệt độ 40 -50°C nhờ các enzyme phân
hủy cellulose gọi là cellulase [5].
1.3. Sự phân giải cellulose trong tự nhiên
1.3.1. Cơ chế của quá trình phân giải cellulose nhờ vi sinh vật
Trong một số ngành công nghiệp sử dụng cellulose làm nguồn nguyên
liệu, việc phân giải, chuyển hóa hợp chất này là cơng đoạn đầu tiên trong quy
trình sản xuất; đặc biệt là lĩnh vực sản xuất nhiên liệu (cồn, xăng sinh học,…) từ
sinh khối thực vật (rơm rạ, thân ngô,…). Đầu tiên, cellulose trong sinh khối sẽ
đƣợc chuyển hóa thành các sản phẩm đơn giản nhƣ đƣờng đơn, đƣờng đơi thơng
qua các phản ứng hóa học (phản ứng thủy phân với xúc tác là axit vơ cơ) hoặc
sử dụng chính hệ enzyme phân giải cellulose gọi là cellulase. Sản phẩm thủy
phân qua các công đoạn tiếp theo tạo thành cồn công nghiệp, xăng sinh học hay

nhiên liệu hydro sinh học (Biohydrogen),…
Trong tự nhiên, cellulose đƣợc chuyển hóa bằng con đƣờng sinh học do
tác dụng của hệ enzyme cellulase có nguồn gốc từ nhiều lồi vi sinh vật khác
nhau. Nhờ q trình chuyển hóa này mà cellulose có thể đƣợc ứng dụng rộng rãi
trong các lĩnh vực nơng nghiệp hay năng lƣợng sinh học, góp phần cân bằng chu
trình vật chất Carbon trong sinh quyển.
9


Cellulose là một cơ chất khơng hịa tan, khó phân giải. Bởi vậy vi sinh vật
phân huỷ cellulose phải có một hệ enzyme gọi là hệ enzyme cellulase. Cellulase
là một hệ enzyme xúc tác q trình chuyển hóa cellulose thành các sản phẩm
hịa tan thơng qua xúc tác sự phân giải liên kết ᵦ – 1,4 – glucosid. Cellulase có
khả năng phân giải cellulose, CMC hay HEC. Enzyme này cắt đứt liên kết B –
1,4 – glucosid trong cellulose và các

ᵦ

– D - glucan có trong ngũ cốc. Hệ

enzyme cellulase khá phức tạp, bao gồm 4 enzyme khác nhau. Những enzyme
này hoạt động phối hợp cùng nhau để thuỷ phân cellulose. Đầu tiên, enzyme C1
có tác dụng cắt đứt liên kết Hydro, biến dạng cellulose tự nhiên có cấu hình
khơng gian thành dạng cellulose vơ định hình, enzyme này gọi là
Cellobiohydrolase. Enzyme thứ 2 là Endoglucanase có khả năng cắt đứt các liên
kết ᵦ - 1,4 bên trong phân tử tạo thành những chuỗi dài. Tiếp đó, enzyme thứ 3
là Exo – glucanase tiến hành phân giải các chuỗi trên thành các sản phẩm có
phân tử lƣợng nhỏ, tan trong nƣớc nhƣ Disaccharide gọi là cellobiose. Cả 2 loại
enzyme Endo và Exo – gluconase đƣợc gọi là Cx. Kết quả tác động của Endo glucanase và Exo - glucanase sẽ tạo thành các cello – oligosaccharide,
cellobiose, glucose. Cuối cùng, enzyme thứ 4 là ᵦ - glucosidase tiến hành thủy

phân cellobiose tạo thành glucose [16].
Các phản ứng thủy phân này diễn ra đồng thời trong mơi trƣờng, trong đó
hai phản ứng đầu đƣợc thực hiện trên bề mặt của cơ chất rắn, cịn phản ứng cuối
đƣợc thực hiện trong mơi trƣờng nƣớc trên nguồn cơ chất hòa tan. Tác động
phối hợp của enzyme Endo - glucanase và Exo - glucanase làm thay đổi cấu trúc
bề mặt của cellulose, dẫn đến làm thay đổi nhanh chóng tốc độ thủy phân
cellulose.

10


(Nguồn: Agriculture and Consumer Protection)
Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase
1.3.2. Vi sinh vật phân giải cellulose
Trong thiên nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân hủy
cellulose nhờ có hệ enzyme cellulase ngoại bào.
1.3.2.1. Vi khuẩn
11


Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, nhân sơ (Prokaryotes), có kích
thƣớc nhỏ (kính thƣớc hiển vi).
Vi khuẩn có nhiều hình thái, kích thƣớc và cách sắp xếp khác nhau.
Đƣờng kính của phần lớn vi khuẩn thay đổi trong khoảng 0,2 – 2,0 μm, chiều
dài cơ thể khoảng 2,0 – 8,0 μm, mặc dù có lồi có đƣờng kính đến 0,3 mm
(Thiomargarita) và thƣờng có cấu trúc tế bào đơn giản, khơng có bộ khung tế
bào (cytoskeleton) và các bào quan khác nhƣ ty thể và lục lạp.
Đa số vi khuẩn có hình que, hình cầu, hình xoắn, hình có cuống, hình có
sợi,… Những vi khuẩn có hình dạng nhƣ vậy đƣợc gọi theo thứ tự là trực khuẩn
(Bacillus), cầu khuẩn (Coccus) và xoắn khuẩn (Spirillum, Spirochete). Một

nhóm khác nữa là phẩy khuẩn (Vibrio) [3,11,16].
Vi khuẩn là nhóm hiện diện đơng đảo nhất trong sinh giới. Chúng có mặt
ở khắp nơi trong đất, nƣớc, khơng khí. Trong chu trình tuần hồn vật chất nói
chung, q trình phân giải cellulose nói riêng thì vi khuẩn đóng một vai trị hết
sức quan trọng trong q trình phân giải đó.
Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi
sinh vật kỵ khí có khả năng phân giải cellulose. Những năm đầu thế kỷ XX
(1903) G.Van Interson phân lập đƣợc các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng
này. Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose, niêm vi khuẩn chiếm một
vị trí quan trọng, chúng thƣờng có hình que nhỏ bé hơi uốn cong, có thành tế
bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kép, chủ yếu ở các giống Cytophaga,
Sporocytophaga và Sorangium. Niêm vi khuẩn nhận đƣợc năng lƣợng khi oxy
hóa các sản phẩm của sự phân giải cellulose thành CO2 và H2O [14,15].
Ngoài ra cịn thấy các lồi thuộc giống Cellvibrio cũng có khả năng phân
hủy cellulose. Trong điều kiện kỵ khí, các loài ƣa ấm hoặc ƣa nhiệt thuộc giống
Clostridium và Bacillus tiến hành phân giải cellulose. Chúng phát triển yếu trên
môi trƣờng chứa đƣờng đơn. Khi phân giải cellulose thành glucose và
12


cellobiose, chúng sử dụng các đƣờng này nhƣ nguồn năng lƣợng và nguồn
carbon cũng thƣờng kèm theo việc tạo thành các axit hữu cơ CO2 và H2O.
Nhiều loài vi khuẩn cũng có khả năng phân hủy cellulose, tuy nhiên
cƣờng độ không mạnh bằng vi nấm. Nguyên nhân là do số lƣợng enzyme tiết ra
môi trƣờng của vi khuẩn thƣờng nhỏ hơn, thành phần các loại enzyme không
đầy đủ. Thƣờng ở trong đất có ít lồi vi khuẩn có khả năng tiết ra đầy đủ 4 loại
enzyme trong hệ enzyme cellulase. Nhóm này tiết ra 1 loại enzyme, nhóm khác
tiết ra các loại khác, chúng phối hợp với nhau để phân giải cơ chất trong mối
quan hệ hỗ sinh [16].
Nhóm vi khuẩn hiếu khí bao gồm Pseudomonas, Cellulomonas,

Achromobacter. Nhóm vi khuẩn kỵ khí bao gồm Clostridium và đặc biệt là
nhóm vi khuẩn sống trong dạ cỏ của động vật nhai lại. Chính nhờ nhóm vi
khuẩn này mà trâu bị có thể sử dụng đƣợc cellulose có trong cỏ, rơm rạ làm
thức ăn. Đó là những cầu khuẩn thuộc chi Ruminococcus có khả năng phân hủy
cellulose thành đƣờng và các axit hữu cơ. Các vi sinh vật đó thƣờng là
Ruminococcus albus, Ruminococcus flavofaciens, Butyrivibrio fibrisolvens,
Cillobacterium

cellulosolvens,

Bacteroides

amylophillus,

Bacteroides

ruminicola, Clostridium perfringens, Clostridium butycium,…[14,15,16].
Ngồi ra cịn có Cellulomonas, Bacillus cũng có khả năng phân giảI
cellulose rất mạnh.
1.3.2.2. Nấm men
Nấm men (Yeast, Levure) là tên gọi thông thƣờng của một nhóm nấm có
vị trí phân loại khơng thơng nhất, chúng là những vi sinh vật điển hình cho
nhóm nhân thật (Eukaryotes). Tế bào nấm men thƣờng lớn gấp 10 lần so với vi
khuẩn. Kích thƣớc tế bào nấm men thay đổi rất nhiều tùy thuộc vào từng giống,
từng lồi, trung bình khoảng 3 – 5 × 5 – 10 μm. Nấm men có cấu tạo đơn bào,
hình thái đa dạng, thay đổi tùy thuộc vào từng loại, tùy điều kiện nuôi cấy và
13


trao đổi của ống giống (hình trứng, hình bầu dục, hình trịn, hình ống dài, hình

thoi, hình bình hành, hình tam giác, hình chai, hình lƣỡi liềm và một số hình đặc
biệt khác) [].
Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các mơi trƣờng
có chứa đƣờng, có độ pH thấp, chẳng hạn nhƣ trong hoa quả, rau dƣa, mật mía,
rỉ đƣờng, mật ong, trong đất ruộng mía, đất vƣờn cây ăn quả, trong các đất có
nhiễm dầu mỡ [3].
Vi nấm là nhóm có khả năng phân giải cellulose mạnh vì nó tiết ra mơi
trƣờng một lƣợng lớn enzyme đầy đủ các thành phần. Các nấm mốc có hoạt tính
phân giải cellulose đáng chú ý là Tricoderma. Hầu hết các loài thuộc chi
Tricoderma sống hoạt sinh trong đất và đều có khả năng phân hủy cellulose.
Chúng tiến hành phân hủy các tàn dƣ của thực vật để lại trong đất, góp phần
chuyển hóa một lƣợng chất hữu cơ khổng lồ. Tricoderma còn sống trên tre, nứa,
gỗ tạo thành lớp mốc màu xanh phá hủy các vật liệu trên. Trong nhóm vi nấm
ngồi Tricoderma cịn có nhiều giống khác có khả năng phân giải cellulose nhƣ
Aspergillus, Fusarium, Mucor…[] Các loại nấm đáng chú ý nhất là Alternaria
tenuis, Aspergillus wentii, Aspergillus fumigatus, Tricoderma reesei, Fusarium
solani, Penecillium pinophinum, Aspergillus niger…
Các nấm ƣa nhiệt cũng đƣợc chú ý vì chúng có thể tổng hợp các enzyme
bền nhiệt hơn, chúng sinh trƣởng và phân giải nhanh cellulose nhƣng hoạt tính
cellulase của dịch lọc lại thấp. nấm có khả năng sinh trƣởng và sản xuất
cellulase cực đại ở phạm vi pH bằng 3.5 – 6.6 [].
Trong rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân tổng hợp cellulase thì
nấm sợi thuộc nhóm có khả năng tổng hợp cellulase mạnh nhất. Chúng là những
vi sinh vật thuộc nhóm hạ đẳng, khơng có diệp lục, chúng chủ yếu sống hoạt
sinh trong đất, và tiết ra mơi trƣờng một lƣợng lớn enzyme chuyển hóa các tàn
dƣ của thực vật thành những chất dinh dƣỡng cung cấp cho cây và làm cho đất
trở nên màu mỡ hơn.
14



Trong thực tế khơng có một loại nấm hay vi sinh vật nào có khả năng tổng
hợp đầy đủ cả 1 phức hệ enzyme cần cho q trình chuyển hóa cellulose đến sản
phẩm cuối cùng mà mỗi lồi chỉ có thể sinh tổng hợp 1 vài loại enzyme nào đó.
Ngồi vi nấm và vi khuẩn, xạ khuẩn và niêm vi khuẩn cũng có khả năng
phân hủy cellulose. Ngƣời ta thƣờng sử dụng xạ khuẩn, đặc biệt là chi
Streptomyces trong việc phân hủy rác thải sinh hoạt.
Bảng 1.3. Các vi sinh vật phân huỷ cellulose
Các Prokaryotes

Các Eukaryotes

Chi Cytophaga

a

Aspergilus fumigatus

A

Chi Sporocytophaga

a

A. nidulans

A

Chi Archangium, Sorangium

a


Botrytis cinerea

A

Chi Polyangium

a

Chaetomium globosum

A

Pseudomonas fluorescens var.
cellulosa

a

Chi Fusarium

A

Cellulomonas fimi

a

Myrothecium verrucaria

A


Các Streptomycete

a

Trichoderma viride

A

Cellvibrio flavescens

a

T. reesei

A

Clostridium thermocellum

b

Rhizoctonia solani

A

C. cellobioparum

b

Neocallimastix frontalis


B

Ruminococcus albus,R. flavefaciens

b

Neocallimastix frontalis

B

Bacterodes succinogenes

b

Diplodinium

B

Butyrivibrio fibrisolvens

b

Entodinium

B

Eubacterium cellulosolvens

b


Entodinium

B

(Nguồn: VOER, Science and Techology)
(Ghi chú: a - Sinh trƣởng hiếu khí; b - Sinh trƣởng kị khí)
15