LỜI CẢM ƠN
Được sự đồng ý của trường Đại học Lâm Nghiệp, khoa Quản lý tài
nguyên rừng và môi trường, bộ môn Bảo vệ thực vật và giáo viên hướng dẫn
tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: "Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của
nấm Thƣợng hoàng (Phellinus linteus) trong ni cấy thuần khiết". Để
hồn thành được luận văn tốt nghiệp, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ,
hướng dẫn của các cán bộ tại Trung tâm nghiên cứu bảo vệ rừng, đặc biệt sự
quan tâm, tận tình của PGS. TS. Phạm Quang Thu. Nhân dịp này, tôi xin bày
tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phạm Quang Thu thầy giáo trực tiếp
hướng dẫn khoa học cùng tồn thể các cán bộ cơng tác tại Trung tâm nghiên
cứu bảo vệ rừng - Viện khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam nơi tôi thực hiện đề
tài này.
Mặc dù đã rất cố gắng để hoàn thiện đề tài tốt nhất. Tuy nhiên do điều
kiện về thời gian cũng như khả năng bản thân cịn hạn chế, nên khơng thể
tránh khỏi được những thiếu sót. Vì vậy, rất mong nhận được ý kiến đóng
góp, xây dựng của các Thầy cơ giáo cùng toàn thể bạn bè để đề tài được hoàn
thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội ngày 13 tháng 5 năm 2015
Sinh viên thực hiện:
Trần Nhật Tân


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. 1
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
1.1. Giới thiệu nấm Thượng hoàng ................................................................... 3
1.2. Nghiên cứu trên thế giới............................................................................. 4
1.3. Nghiên cứu tại Việt Nam ........................................................................... 6
Phần 2: MỤC TIÊU - ĐỐI TƢỢNG - ĐỊA ĐIỂM - THỜI GIAN - NỘI
DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................. 8

2.1. Mục tiêu, đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................. 8
2.1.1. Mục tiêu................................................................................................... 8
2.1.2. Đối tượng ................................................................................................ 8
2.1.3. Địa điểm .................................................................................................. 8
2.1.4. Thời gian nghiên cứu .............................................................................. 8
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 8
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 9
2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi nấm trong điều kiện nuôi cấy
thuần khiết ......................................................................................................... 9
2.3.1.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến
sinh trưởng và phát triển của hệ sợi .................................................................. 9
2.3.1.2. Phương pháp nghiên cứư ảnh hưởng của nhiệt độ khơng khí đến sinh
trưởng và phát triển của hệ sợi ........................................................................ 11
2.3.2. Bước đầu nghiên cứu hoạt tính sinh kháng sinh và ức chế phát triển tế bào
ung thư thông qua hai chủng nấm Phytophthora sp. và Ceratocystis sp. ............. 12
2.3.3. Nghiên cứu nhân sinh khối hệ sợi trên môi trường lỏng ...................... 13
2.3.3.1. Phương pháp xác định thời gian nhân sinh khối hệ sợi ..................... 14
2.3.3.2. Phương pháp sấy thu hoạch sản phẩm hệ sợi nuôi cấy ...................... 14
Phần 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 15
3.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi nấm trong điều kiện nuôi cấy
thuần khiết. ...................................................................................................... 15


3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và
phát triển của nấm. .......................................................................................... 15
3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển của
nấm .................................................................................................................. 19
3.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của ẩm độ đến sinh trưởng phát triển của nấm
thượng hoàng ................................................................................................... 21
3.2. Bước đầu nghiên cứu hoạt tính sinh kháng sinh và ức chế phát triển tế bào

ung thư thông qua 2 chủng nấm Phytophthora sp. và Ceratocystis sp. .............. 23
3.3. Nghiên cứu nhân sinh khối hệ sợi trên môi trường lỏng ......................... 24
3.3.1. Xác định thời gian nhân sinh khối hệ sợi .............................................. 24
3.3.2. Xác định thời gian sấy sản phẩm hệ sợi nuôi cấy ................................. 27
Chƣơng 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ - TỒN TẠI ................................... 29
4. 1. Kết luận ................................................................................................... 29
4.2. Tồn tại ...................................................................................................... 29
4.3. Kiến nghị .................................................................................................. 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BIỂU

Biểu 3.1: Sinh trưởng của hệ sợi nấm trên các môi trường dinh dưỡng khác
nhau ..................................................................................................... 15
Biểu 3.2: Khối lượng của hệ sợi nấm ở hai công thức môi trường dinh dưỡng
khác nhau ............................................................................................ 17
Biểu 3.3: Tốc độ sinh trưởng trung bình của hệ sợi nấm ở các thang nhiệt độ
khác nhau ............................................................................................ 19
Biểu 3.4: Ảnh hưởng của độ ẩm khơng khí đến sinh trưởng phát triển đường
kính hệ sợi ........................................................................................... 22
Biểu 3.5: Đánh giá hiệu lực kháng nấm bệnh của nấm Thượng hoàng .......... 24
Biểu 3.6: Sinh khối hệ sợi nấm sau những khoảng thời gian nuôi khác nhau 25
Biểu 3.7: Thời gian sấy khô hệ sợi với các thang nhiệt độ ............................. 27


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1: Biểu đồ tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm trên 2 môi trường dinh
dưỡng .................................................................................................. 16
Hình 3.2: Hệ sợi nấm trên hai mơi trường dinh dưỡng khác nhau ................. 16

Hình 3.3: Biểu đồ sinh trưởng hệ sợi nấm trên hai công thức môi trường dinh
dưỡng khác nhau ................................................................................. 17
Hình 3.4: Hệ sợi nấm trên mơi trường CT1 .................................................... 18
Hình 3.5: Hệ sợi nấm trên mơi trường CT2 .................................................... 18
Hình 3.6: Biểu đồ sinh trưởng hệ sợi nấm ở các thang nhiệt độ khơng khí khác
nhau ..................................................................................................... 20
Hình 3.7: Hệ sợi nấm trên mơi trường dinh dưỡng ở các thang nhiệt độ ....... 21
Hình 3.8: Biểu đồ tốc độ mọc của hệ sợi ở các thang độ ẩm khác nhau ......... 22
Hình 3.9: Hệ sợi nấm trên môi trường dinh dưỡng theo thang độ ẩm ............ 23
Hình 3.10: Khả năng kháng nâm của Phellinus linteus .................................. 24
Hình 3.12: Hệ sợi chưa đến thời gian thu hoạch ............................................. 26
Hình 3.13: Hệ sợi đến thời gian thu hoạch ..................................................... 26
Hình 3.14: Hệ sợi quá thời gian thu hoạch ..................................................... 26
Hình 3.15: Biểu đồ thời gian sấy hệ sợi ở các thang nhiệt độ ........................ 27
Hình 3.16: Hệ sợi nấm trước khi sấy ........................................................................28
Hình 3.17: Hệ sợi nấm sau khi sấy ..................................................................... 28


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cuộc sống của chúng ta đang phải đối mặt với rất nhiều vấn đề sức
khỏe do ảnh hưởng của mơi trường cũng như biến đổi của khí hậu hay do
thực phẩm chúng ta sử dụng hàng ngày có rất hóa chất độc hại. Chính vì
những ngun nhân trên mà sức khỏe của con người đang suy giảm một cách
vơ cùng nghiêm trọng. Có rất nhiều các bệnh dịch hay các bệnh nan y chưa có
các phương pháp điều trị một cách tối ưu nhất. Một trong những bệnh đang là
thách thức cũng như áp lực đối với toàn xã hội đó chính là ung thư. Hiện nay
các nhà khoa học vẫn chưa có một phương pháp chữa trị sao cho có hiệu quả
và chi phí cho việc điều trị là vô cùng cao. Các phương pháp được các nhà
khoa học áp dụng thường là xạ trị, truyền hóa chất hay cắt bỏ khối u ung thu.
Các cách này thường mang tính tình thế vào tỉ lệ thành cơng trong điều trị

chiếm tí lệ rất nhỏ. Ngồi việc chi phí đắt đỏ hiệu qủa khơng cao các phương
pháp này cịn có nhiều tác dụng phụ sau chữa trị khơng mong muốn. Đứng
trước địi hỏi đó các nhà khoa học đang cố gắng tìm kiếm các sản phẩm có
nguồn gốc từ thiên nhiên trong việc điều trị cũng như loại bỏ các bệnh nan y
mà đến nay khoa học hiện đại cũng đang gắp khó khăn. Từ hàng ngàn năm
phát triển của loài người, chúng ta đã biết sử dụng các dược liệu có sẵn trong
tự nhiên để chữa bệnh và nâng cao thể lực cho cơ thể. Các loài cỏ cây hoa lá
sung quanh chúng ta có rất nhiều tác dụng y học đáng quý mà chúng ta đang
hàng ngày sử dụng cũng như đang tìm tịi nghiên cứu để tìm ra thêm các cơng
hiệu của chúng. Trong số các dược liệu mà con người thường sủ dụng và
được đánh gía cao trong số đó chính là các lồi nấm. Chúng đã được dùng
hàng trăm năm qua trong y học Đông Á như Nấm Linh chi, Nấm lim, Đông
trùng hạ thảo và được chú ý rất nhiều trong thời gian gần đây chính là nấm
Thượng hồng “ Phellinus linteus” trong điều trị và phòng ngừa ung thu rất
hiệu quả. Được nhận định là có đặc tính phịng chống khối u trên, tế bào ung
thư phổi và ung thư tuyến tiền liệt. Khi tiến hành thí nghiệm với các tế bao
ung thư vú ở người, các nhà các nhà khoa học nhận thấy lồi nấm này có khả
1


năng hạn chế hiệu quả enzym AKT, loại enzym kích thích tế bào ung thư phát
triển. Với tác dụng rất tốt như vậy nhưng việc áp dụng vào nuôi trồng nhân
tạo ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Chúng ta thường phải nhập khẩu ở các
nước như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc chúng rất đa dạng giá cả cũng
như khó có thể kiểm sốt được chất lượng. Vì vậy việc đưa vào nghiên cứu
điều kiện sinh trưởng tối ưu nhất để phục vụ nuôi trồng đại trà là rất cần thiết
vấn đề có ý nghĩa khơng chỉ về mặt khoa học mà còn đáp ứng nhu cầu của xã
hội. Xuất phát từ nhu cầu trên tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu một số đặc
điểm sinh học của nấm Thƣợng hồng (Phellinus linteus) trong ni cấy
thuần khiết”.


2


Phần I
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu nấm Thƣợng hoàng
Nấm Thượng hồng (hay cịn gọi là Hồng sơn) là tên chỉ các loài gần
nhau trong chi Phellinus, họ Hymenochaetaceae… được sử dụng từ rất lâu
trong y học cổ truyền với dạng dùng là nấu nước uống. Đây là các loài nấm
mọc nhiều năm, lớp thụ tầng năm sau chồng lên lớp thụ tầng năm trước. Nấm
thường mọc trên cây dâu tằm ở những vùng rừng sâu, núi cao hiểm trở, các
khu rừng nguyên sinh, tuổi nấm có khi đến vài chục năm. Nấm Thượng hồng
có tên khoa học là Phellinus linteus, Ở Trung Quốc, được gọi là Song-gen,
Sang-hwang ở Hàn Quốc và Meshimakobu ở Nhật Bản, ở Việt Nam có tên là
Nấm Thượng hoàng hay Hoàng sơn.
Các loại nấm trong chi Phellinus này đang được các nhà nấm học thế
giới quan tâm, vì đặc tính hỗ trợ chống phát triển khối u rất mạnh, có tác dụng
trong phịng chống ung thư, trẻ hóa cơ thể. Tuy nhiên, loại nấm này thường
mọc ở những vùng rừng sâu, núi cao hiểm trở, đặc biệt là các khu rừng
nguyên sinh. Tuổi nấm có khi đến vài chục năm.
Nấm Thượng hồng được mơ tả theo y học Phương Đơng là có khả
năng điều hịa miễn dịch mạnh và tăng chức năng miễn dịch. Nấm cũng hiệu
quả đối với nhiều bệnh, bao gồm việc tăng lưu thông máu, ngăn ngừa và điều
trị bệnh tim, tăng khả năng giải độc và bảo vệ gan, chống lại bệnh dị ứng và
tiểu đường, giảm căng thẳng. Đặc biệt, Nấm Thượng hồng có cơng dụng
chống ung thư mạnh và ngăn ngừa sự phát triển của khối u.
Nấm Thượng hoàng đã từng được chứng minh là có đặc tính chống
khối u trên da, tế bào ung thư phổi và ung thu tuyến tiền liệt. Nấm Thượng
hoàng rất quý và hiếm, phù hợp với mọi lứa tuổi, khơng có tác dụng phụ.

Thành phần của nấm Thượng hồng: Chín hợp chất được phân tách từ
các phần ethyl acetate hoạt động của thân cây nấm được xác định là axit
protocatechuic , protocatechualdehyde , axit caffeic , axit ellagic , hispidin ,
3


davallialactone , hypholomine B , interfungins A và inoscavin . Một trong số
đó interfungins A là một chất ức chế mạnh protein glycation (một protein gây
suy yếu mạch máu gây đột quỵ). Mặc dù việc nghiên cứu thành phần của nấm
thượng hoàng khá phức tạp nhiều chất vẫn chưa được tìm hiểu phát hiện ra do
các hợp chất sinh học phức tạp.
Điểm khác nhau giữa nấm Linh chi và nấm Thượng hoàng: Cả Nấm
Thượng hoàng và Linh chi đều là hai loại dược thảo quý hiếm truyền thống
của phương Đông. Trong Từ điển y dược đầu tiên của Trung Quốc "Thần
Nông Bản Thảo" xuất bản 2000 năm trước đã mô tả Nấm Linh chi Và Nấm
Thượng hoàng như một loại thuốc thần tiên với các tác dụng điều trị tiếp thêm
sinh lực men sức sống, không độc hại, là loại thảo mộc có giá trị cao, có tác
dụng mang lại lợi ích thiết thực và năng lượng quan trọng cho cơ thể, tăng
cường gân và xương, ổn định huyết áp, giảm mỡ máu, phòng chữa bệnh tiểu
đường, bệnh gan, đặc biệt hỗ trợ điều trị bệnh ung thư. Nếu sử dụng trong một
thời gian dài nó có thể trẻ hóa cơ thể và kéo dài tuổi thọ và đặc biệt sau khi
dùng thuốc kéo dài. Tuy nhiên về hoạt chất chống ung thư thì Nấm Thượng
hồng cao hơn 32% (hoạt chất chống ung thư của Nấm Linh chi là 64,9%,
Nấm Thượng hoàng : 96,7%.
1.2. Nghiên cứu trên thế giới
Nấm Phellinus linteus, cịn có tên gọi Song gen ở Trung Quốc, Sanghwang ở Hàn Quốc và Mesimakobu ở Nhật Bản được coi là nấm ''trường sinh
bất lão'' và là dược liệu quý được sử dụng trong các thang thuốc đông y từ
nhiều thế kỷ qua.
Theo nghiên cứu gần đây. Hoạt động miễn dịch trị liệu của việc cho
uống cơ thể quả Phellinus linteus tự nhiên (nPF) chống lại sự phát triển và di

căn của các tế bào khối u ác tính được tiêm B16/BL6 đã được kiểm tra. Bào
tử nấm (nPF) được sử dụng dưới dạng đường uống đối với B16/BL6 và được
thực hiện trên chuột, một mẫu cho các di căn mạch phổi của các khối u ác
tính, với liều dùng là 83, 415 và 2075 mg/kg/ngày trong chế độ ăn của chúng.
4


Chế độ dùng bào tử nấm nPF có ý nghĩa kéo dài thời gian sống của những con
chuột mang B16/BL6. Hơn thế nữa việc sử dụng liều lượng nPF phụ thuộc
vào sự tăng cường sản xuất NO bởi các đại thực bào đã chuẩn bị từ mang khối
u, nPF đã điều trị cho các loài động vật. Đồng thời nPF đã không trực tiếp gây
ra sự nhiễm độc cho các tế bào chống lại B16/BL6. Những kết quả nghiên
cứu khuyên rằng việc cho uống bào tử nấm nPF có thể hữu ích trong miễn
dịch hóa trị liệu với ung thư bởi vì sự kéo dài sự sống của nó thơng qua việc
ức chế một cách hiệu quả sự phát triển và di căn của các tế bào ung thư.
Ikekawa (1968) và các cộng sự đã báo cáo rằng việc chọn lựa chiết xuất dung
dịch của các loại nấm, bao gồm Coriolus versicolor, Lentinus edodes và P.
linteus, đã có hiệu quả đáng chú ý trong ức chế sự tăng trưởng của 180 tế bào
khuẩn tròn bát điệp được cấy dưới da của chuột [4, 6]. Từ những chiết xuất
nấm đó, chiết xuất của nấm P. linteus đã được trưng bày với hiệu quả vượt
trội [4]. Tuy nhiên, bởi vì P. linteus khá hiếm và sự khó khăn khi phát triển nó
trong môi trường nuôi cấy đã dẫn đến sự phát triển của các tác nhân trị liệu từ
loại nấm này có rất ít thành cơng. Cùng tại thời điểm đó Krestin và Lentinan
đã được phát triển từ C. versicolor và L. edodes lần lượt [6,7] và được sử
dụng như chất kích thích miễn dịch trong điều trị lâm sàng ung thư tại Nhật
Bản.
Tại Nhật Bản một số loại nấm bao gồm P. linteus đã được bán vì những
lợi ích duy trì sức khỏe của chúng cũng như phòng chống các bệnh tật và
được coi như những loại thuốc thay thế. Nhiều bệnh nhân ung thư biểu mô ở
Nhật Bản được biết tiêu thụ các loại nấm bằng việc kết hợp với liệu pháp trị

liệu ung thư tiêu chuẩn của họ. Hơn nữa Kojima (2006) và các cộng sự [13]
đã báo cáo một trường hợp lấn áp tự phát của ung thư biểu mô tế bào gan bởi
một chiết xuất dung dịch từ P. linteus.
Nhiều nhà nghiên cứu cũng đã báo cáo rằng polysaccharide axit đã
phân lập từ việc nuôi cấy các sợi nấm P. linteus đã kích thích miễn dịch
chống lại khối u, ức chế khối u phát triển và di căn [9-12]. Tuy nhiên rất ít
5


được biết về đặc điểm của các hợp chất chịu trách nhiệm đối với các phản ứng
sinh học liên quan tới việc cho uống P. linteus. Ngồi việc có thể được biết
chiết xuất ra polysaccharides bằng P. linteus, Nagatsu (2004) và các đồng
nghiệp đã báo cáo rằng việc chiết xuất từ loại nấm này cũng gồm những hợp
chất non- polysaccharides [14-16]. Hiện tại lần đầu tiên Lee (2006) và đồng
nghiệp cũng báo cáo rằng cho uống thử nghiệm Cambodian P. linteus ức chế
sự di căn đối với tế bào khối u trên chuột [13]. Tuy nhiên khơng có báo cáo
nào ghi nhận đối với việc kéo dài sự sống thông qua kích thích miễn dịch hiệu
quả của cho uống P. linteus. Do đó những nghiên cứu hiện tại thể hiện sự tiếp
tục phát triển tác dụng của cho uống phấn nPF với độ dài sự sống của những
con chuột mang B16/BL6.
Hiện tại Ko (1995) và các cộng sự [8] đã thành công trong việc sử dụng
một hệ thống nuôi cấy những sợi nấm để phát triển P. linteus trong môi
trường nuôi cấy ở Hàn Quốc. Sử dụng hệ thống này họ đã chứng tỏ rằng một
polysaccharide có tính axit phân lập từ việc ni cấy các sợi nấm P. linteus
kích thích sự gia tăng tế bào lympho T. Cùng lúc đó loại polysaccharide này
đã có một ảnh hưởng đến chức năng miễn dịch dịch thể, bao gồm hiệu quả khi
kích hoạt đa giá của các tế bào B, ức chế khối u phát triển và di căn [9-12].
Điều này đã đem đến kết quả trong việc phát triển phương pháp chiết xuất
dung dịch từ môi trường nuôi cấy sợi nấm của P. linteus và đã được sử dụng
như một chất kích thích miễn dịch trong điều trị lâm sàng ung thư ở Hàn

Quốc. Hầu hết những chiết xuất thương mại có sẵn của P. linteus được bán
trên thị trường như là những chất bổ sung được sản xuất từ phương pháp nuôi
cấy những sợi nấm này.
1.3. Nghiên cứu tại Việt Nam
Việt Nam là nước có khá nhiều lồi Phellinus mọc, tuy nhiên, đợt sốt
“cổ Linh chi” vài năm trước đã làm các loài nấm Phellinus bị tận thu và gần
như rất khó gặp trong vùng rừng núi Việt Nam nếu khơng đi sâu vào các vùng
rừng ngun sinh. Do đó việc sưu tầm, phân lập, định loại và bảo tồn nguồn
6


gen, là cả một vấn đề lớn để gìn giữ các lồi nấm có giá trị dược tính này. Từ
nhiều năm qua, các cán bộ khoa học của Trung tâm Nghiên cứu Linh chi &
nấm dược liệu đã sưu tầm khá nhiều loài Phellinus, đã lưu giữ được giống các
loài này và nghiên cứu trồng trọt. (CỔ ĐỨC TRỌNG, 2009).
Đến nay, Trung tâm Nghiên cứu Linh chi và Nấm dược liệu đã trồng
thành cơng một loại nấm thượng hồng với công thức do Trung tâm phối chế
trong bịch mạt cưa. Đây là kết quả nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam trên cơ
sở sưu tầm nguồn giống mọc hoang tại TP. HCM, mở ra triển vọng phát triển
loài nấm quý này. Trước đây, phương pháp truyền thống là cấy giống nấm
vào gỗ khúc; sau khi hệ sợi nấm lan đầy, các khúc gỗ sẽ được treo, hoặc đặt
trên mặt đất để nấm mọc ra. Trồng nấm trên gỗ khúc có ưu điểm tạo môi
trường tự nhiên cho nấm. Tuy nhiên vẫn còn nhiều hạn chế như: mất thời gian
dài (vài năm) để nấm có thể đạt yêu cầu khai thác; các khúc gỗ khi đặt xuống
đất dễ bị các loại địch hại xâm nhiễm như sâu bọ, côn trùng, mối, nấm bệnh. .
. khiến tỷ lệ hao hụt sản phẩm khá cao; treo lên cao khiến gỗ dễ bị mất nước
và cần phải tưới ẩm liên tục; trồng trên gỗ khúc cũng tốn nhiều mặt bằng. Với
quy trình trồng nấm thượng hồng trên mạt cưa cao su, có thể khắc phục được
những hạn chế của quy trình trồng nấm trên gỗ khúc nói trên: tránh được địch
hại, dễ phối trộn dinh dưỡng và bổ sung nước, thời gian thu hoạch ngắn hơn

(chỉ khoảng 9 tháng). ThS. Cổ Đức Trọng cho biết, cho đến nay nhóm nghiên
cứu của ơng đã sản xuất được gần 150 kg nấm thượng hoàng (tại hai địa điểm
là Trung tâm Nghiên cứu Linh chi & Nấm dược liệu Tp. HCM, và Trại nấm
Bến Cát, tỉnh Bình Dương). Số nấm này đã được kiểm nghiệm chất lượng tại
Viện vệ sinh y tế cơng cộng. Nhóm nghiên cứu đang tiếp tục làm thêm một số
đề tài như phối hợp với Viện y dược học dân tộc Tp. HCM thực hiện đề tài
khảo sát về độc tính và dạng bào chế thích hợp cho nấm thượng hồng. Từ kết
quả nghiên cứu này, có thể chuyển sang sản xuất lớn nhằm cung cấp nguồn
nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm và dược phẩm trong nước trong
tương lai gần. (Cố Đức Trọng, 2009).

7


Phần 2
MỤC TIÊU - ĐỐI TƢỢNG - ĐỊA ĐIỂM - THỜI GIAN - NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu, đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu
Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi nấm trong điều kiện nuôi cấy
thuần khiết và bước đầu đánh giá hiệu lực kháng nấm bệnh của chủng nấm
thượng hoàng
2.1.2. Đối tượng
 Nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus)
 Đánh giá hoạt tính tạo kháng sinh và ức chế tế bào ung thư dùng 2
chủng Ceratocystis sp. và Ceratocystis sp.
2.1.3. Địa điểm
 Tiến hành ni cấy và phân tích tại Trung tâm nghiên cứu bảo vệ rừng
- Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
2.1.4. Thời gian nghiên cứu

 Đề tài được thực hiện trong thời gian từ ngày 09/02/2015 đến 13/5/2015.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi nấm trong điều kiện nuôi cấy
thuần khiết
 Xác định môi trường dinh dưỡng để hệ sợi nấm sinh trưởng.
 Xác định nhiêt độ khơng khí tối ưu cho hệ sợi nấm sinh trưởng.
 Xác định độ ẩm không khí tối ưu cho hệ sợi nấm sinh trưởng.
Bước đầu đánh giá hoạt tính sinh kháng sinh và ức chế phát triển tế bào
ung thư thông qua 2 chủng nấm Phytophthora sp. và Ceratocystis sp.
 Đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh của nấm thượng hồng bằng dung
mơi hữu cơ.
Nghiên cứu nhân sinh khối hệ sợi trên môi trường lỏng

8


 Xác đinh thời gian nhân sinh khối hệ sợi.
 Xác định thời gian sấy sản phẩm hệ sợi nuôi cấy.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi nấm trong điều kiện nuôi
cấy thuần khiết
2.3.1.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến
sinh trưởng và phát triển của hệ sợi
 Với mơi trƣờng có Agar
Thí nghiệm được thực hiện với 2 loại mơi trường dinh dưỡng khác
nhau như đươc trình bày dưới đây:
STT

Môi trƣờng


CT1

20g Glucose + 17g Agar + 1L nước khoai tây

CT2

40g Glucose + 20g yeast extract + 0,36g K2HPO4 + 1g KH2PO4 +
0,5g MgSO4. 7H2O + 1ml Mineral salt + 17g Agar

a. Chuẩn bị công thức môi trường CT1
Khoai tây rửa sạch để cả vỏ cắt thành miếng có kích thước 1cm3 rồi cho
vào nồi với 1000ml nước, đun sơi 30 phút tính từ lúc sơi. Dùng khăn sạch lọc
lấy nước trong cho thêm nước vào cho vừa trịn 1lít sau đó cho Glucozo và
Agar vào nồi và khuấy đều để hịa tan. Tất cả các mơi trường sau khi pha chế
và đun nấu song đều được đổ vào bình tam giác đã được rửa sạch và sấy khô
cho vào hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C (tương đương áp suất 1atm) trong
thời gian 30 phút. Sau thời gian hấp tiến hành đưa môi trường vào tủ cấy để
đợi cho môi trường nguội rồi đổ môi trường vào các hộp lồng. Khi môi
trường trong tủ cấy đã đông lại thì bắt đầu tiến hành cấy nấm. Nấm được cấy
tại 1 điểm chính giữa của hộp lồng và các thao tác phải được thực hiện dưới
ngọn lửa đèn cồn. Sau khi cấy nấm song dùng băng cuộn băng kín hộp lồng
và để trong tủ định ôn. Mẫu nấm được cấy trên 5 hộp lồng. Sinh trưởng của
hệ sợi đánh giá qua đường kính vịng sinh trưởng. Đường kính đo theo hai
9


chiều vng góc. Thí nghiệm được lập lại 2 lần và lấy trị số bình qn làm đại
diện cho thí nghiệm.
b. Chuẩn bị công thức môi trường CT2
Đong 1000ml nước vào bình tam giác và thêm các hóa chất như:

Glucose + 20g yeast extract + 0,36g K2HPO4 + 1g KH2PO4 + 0,5g MgSO4.
7H2O + 1ml Mineral salt + 17g Agar. Sau khi cho đầy đủ hóa chất vào bình
và khuấy cho tan hết các chất bằng mấy khuấy từ. Tất cả các môi trường sau
khi pha chế và đun nấu song đều được đổ vào bình tam giác đã được rửa sạch
và sấy khô cho vào hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C (tương đương áp suất
1atm) trong thời gian 30 phút. Sau thời gian hấp tiến hành đưa môi trường
vào tủ cấy để đợi cho môi trường nguội rồi đổ môi trường vào các hộp lồng.
Khi môi trường trong tủ cấy đã đơng lại thì bắt đầu tiến hành cấy nấm. Nấm
được cấy tại 1 điểm chính giữa của hộp lồng và các thao tác phải được thực
hiện dưới ngọn lửa đèn cồn. Sau khi cấy nấm song dùng băng cuộn băng kín
hộp lồng và để trong tủ định ôn. Mẫu nấm được cấy trên 5 hộp lồng. Sinh
trưởng của hệ sợi đánh giá qua đường kính vịng sinh trưởng. Đường kính đo
theo hai chiều vng góc. Thí nghiệm được lập lại 2 lần và lấy trị số bình
quân làm đại diện cho thí nghiệm
+ Với mơi trƣờng khơng agar
Thí nghiệm được thực hiện với 2 loại mơi trường dinh dưỡng khác
nhau, chỉ tiêu đánh giá là tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm.
STT

Môi trƣờng

CT1

20g Glucose + 1L nước khoai tây

CT2

40g Glucose + 20g yeast extract + 0,36g K2HPO4 + 1g KH2PO4 +
0,5g MgSO4. 7H2O + 1ml Mineral salt


Môi trường được pha chế theo đúng tỷ lệ, hấp khử trùng ở 121 oC trong thời
gian 30 phút và được đổ vào các chai thủy tinh sạch, để nguội và cấy nấm.
Mỗi loại môi trường được cấy 5 lọ thủy tinh. Sinh trưởng của hệ sợi đánh giá

10


qua khối lượng và độ dầy hệ sợi. Thí nghiệm được lập lại 2 lần và lấy trị số
bình quân làm đại diện cho thí nghiệm.
2.3.1.2. Phương pháp nghiên cứư ảnh hưởng của nhiệt độ khơng khí đến sinh
trưởng và phát triển của hệ sợi
Thí nghiệm được thực hiện trên mơi trường dinh dưỡng PDA, đặt trong
tủ định ơn có các mức nhiệt độ khác nhau. Phương pháp thí nghiệm được tiến
hành như sau:
Đổ môi trường dinh dưỡng PDA đã khử trùng vào hộp lồng đã được khử
trùng dầy 2 – 3 mm, để nguội cho môi trường đông cứng lại, cấy giống nấm
vào chính giữa hộp lồng rồi băng lại cho kín. Xếp các hộp lồng vào tủ định ôn
có nhiệt độ: 10oC ± 1; 15oC± 1; 20oC ± 1; 25oC ± 1; 30oC ± 1; 35oC ± 1, mỗi
tủ đặt 5 hộp lồng. Chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi. Đo đường kính
của nấm theo hai chiều vng góc, lấy trị số trung bình và đo ở ngày đo. Thí
nghiệm được lập lại 2 lần và lấy trị số bình quân làm đại diện cho thí nghiệm.
2.3.1.3. Phương pháp nghiên cứu ành hưởng của độ ẩm khơng khí đến sinh
trưởng và phát triển của hệ sợi
Sau khi cấy nấm vào hộp lồng chứa môi trường thích hợp (được lựa
chọn trong thí nghiệm mơi trường dinh dưỡng), đặt vào các thang độ ẩm
khơng khí khác nhau: 75%, 80%, 85%,90%, 95%. Chỉ tiêu đánh giá là sinh
trưởng của hệ sợi và sự hình thành bào tử vơ tính (bào tử chồi). Mỗi lồi nấm
được cấy trên 2 hộp lồng. Tiến hành đánh dấu sự phát triển của hệ sợi qua
đường kính vịng sinh trưởng. Đường kính đo theo hai chiều vng góc.
Tiến hành tạo mơi trường ở các độ ẩm khác nhau bằng dung dịch NaCl

ở các nồng độ khác nhau trong bảng sau.
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Both. C. Dung dịch
NaCl được pha với các nồng độ khác nhau trong bình hút ẩm tạo cho chúng
ta có được các độ ẩm như sau:

11


RH %

95

90

85

80

75

NaCl (g/lit)

8

16

24

32


40

Dung dịch pha xong đổ vào bình hút ẩm loại lớn, đậy nắp lại để ở
phịng thí nghiệm, trong tối có nhiệt độ khơng khí khoảng 23 - 270C. Sau 3
ngày trong các bình hút ẩm khác nhau sẽ có độ ẩm khơng khí khác nhau, phụ
thuộc vào nồng độ của NaCl, khi nồng độ của NaCl càng lớn thì độ ẩm của
mơi trường càng nhỏ và ngược lại nồng độ của NaCl càng nhỏ thì độ ẩm của
môi trường càng lớn. Môi trường PDA sau khi hấp khử trùng được đổ vào
hộp lồng đã được khử trùng một lớp dày 2 - 3 mm. Cấy giống nấm vào chính
giữa hộp lồng bằng que cấy. Đặt hộp lồng vào các bình hút ẩm có độ ẩm
khơng khí khác nhau, mỗi bình ta đặt 2 hộp. Chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng
của hệ sợi. Sau đó lấy hộp lồng đo đường kính nấm theo hai chiều vng góc
ở các khoảng thời gian khác nhau, lấy trị số bình quân của các hộp lồng đặt
trong mỗi bình hút ẩm. Thí nghiệm được lập lại 2 lần và lấy trị số bình qn
làm đại diện cho thí nghiệm.
2
.3Bướcđầun
g
h
iêncứuh
oạttínhsin
h
kángsin
h
vàứcc
hếp
hátriểntếb
àou
n
g

thưthơngq
u
hicủngnấ
a
m
P
h
yto
ph
o
ra
sp
.vàC
e
ra
to
cystip.
Phương pháp tách chiết:
- Hoá chất Methanol (CH3OH): viết tắt là ME là một chất lỏng khơng
màu, có mùi hơi ngọt, dễ cháy, nhiệt độ sôi 39,6oC. Là dung môi hữu cơ
thông dụng trong phịng thí nghiệm và ít độc hại cho con người.
- Chuẩn bị hệ sợi nấm: Nuôi cấy hệ sợi nấm trên mơi trường PD sau
khi sợi nấm mọc kín 5-7 ngày thu hoạch hệ sợi nấm, sấy khô, sau đó cắt nhỏ
và ngâm trong dung mơi ME với tỉ lệ dịch nấm và ME là 1:20, băng kín bằng
Farafin trong 24 - 48 giờ.
- Cô quay: Rửa sạch các bình cơ quay sau đó sấy khơ và cân khối
lượng, sau khi cơ quay lại cân khối lượng của bình và trừ đi khối lượng của
bình ban đầu sẽ thu được khối lượng chất cặn còn lại. Sử dụng dung mơi
CH3OH để hịa tan với tỷ lệ 1:10. Lắc đều bình để các chất được hịa tan rồi
đổ vào ống nghiệm, bịt kín miệng ống nghiệm và ghi nhãn.

12


- Đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh
Mơi trường PDA sau khi hấp khử trùng được để nguội. Tiến hành đổ
môi trường vào các hộp lồng. Khi hộp lồng đã đơng đục 3 lỗ ở 3 góc hộp lồng
và nhỏ 0,5ml dịch chiết nấm thượng hoàng vào lỗ. Đối chứng là mơi trường
PDA và mơi trường PDA có bổ sung Methanol. Nấm được cấy là:
Ceratocystis sp. và Phytophthora sp. Mỗi loại nấm được cấy trên 10 hộp
lồng. Nấm được cấy tại 1 điểm chính giữa của hộp lồng và các thao tác phải
được thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn. Sau khi cấy nấm song dùng băng cuộn
băng kín hộp lồng và để trong tủ định ôn. Cách đo nấm được thực hiện như
sau: dùng bút ghi kính đánh dấu vịng nấm, lấy thước đo (mm) đo theo 2
chiều vng góc rồi lấy kết quả trung bình.
- Đánh giá khả năng ức chế nấm
Đánh giá khả năng kháng nấm theo Singh và Tripathi năm 1999 bằng
công thức sau:
Pme % =

Dme  Ddc1
x100%
Dme

Trong đó:
 Pme là khả năng kháng nấm của các hợp chất hóa học tách chiết
bằng dung mơi ME, được tính bằng tỷ lệ %.
 Dme là đường kính vịng nấm của đối chứng.
 ddc là đường kính vịng nấm cơng thức thí nghiệm với dịch chiết nấm.
Chỉ tiêu tuyển chọn được đánh giá qua bảng phân cấp sau:
Tỷ lệ phần trăm nấm bị ức chế Khả năng kháng nấm


Ký hiệu

P< 25%

Kháng nấm bệnh yếu

25% ≤ P < 50

Kháng nấm bệnh trung bình ++

50 % ≤ P < 75%

Kháng bệnh mạnh

P≥75%

+

+++

Kháng nấm bệnh rất mạnh
++++
2.3.3. Nghiên cứu nhân sinh khối hệ sợi trên môi trường lỏng

13


2.3.3.1. Phương pháp xác định thời gian nhân sinh khối hệ sợi
Thí nghiệm được tiến hành với 5 bình cùng thể tích, cho 100 ml mơi

trường. Thu hoạch hệ sợi ở thời gian sau 14, 18, 22 và 26 ngày ni cấy.Thu
hoạch hệ sợi tính trọng lượng khơ của hệ sợi ở các cơng thức thí nghiệm. Thí
nghiệm được lập lại 2 lần và lấy trị số bình quân làm đại diện cho thí nghiệm.
2.3.3.2. Phương pháp sấy thu hoạch sản phẩm hệ sợi nuôi cấy
Hệ sợi sau khi thu hoạch được sấy khơ ở nhiệt độ thấp có quạt gió với
các thang nhiệt độ: 350C, 400C và 450C khi sản phẩm đạt độ ẩm 10-12% thì
kết thúc quá trình sấy, đóng gói sản phẩm. Thí nghiệm được lập lại 2 lần và
lấy trị số bình quân làm đại diện cho thí nghiệm.

14


Phần 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi nấm trong điều kiện nuôi
cấy thuần khiết.
3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và
phát triển của nấm.
Môi trường dinh dưỡng là yếu tố quan trọng quyết định đến sinh trưởng
và phát triển của hệ sơi cũng như thời gian hình thành thể quả của nấm. Bởi
vây nghiên cứu để tìm mơi trường dinh dưỡng thích hợp nhất cho nấm sinh
trưởng và phát triển trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết có ý nghĩa rất lớn.
3.1.1.1. Sinh trưởng của nấm trên mơi trường dinh dưỡng có Agar
Mơi trường dinh dưỡng có Agar là loại môi trường cơ bản và thiết yếu
để thực hiện bất kỳ một công việc nào trong điều kiện ni hay trồng nấm
nhân tạo, chính vì thế mà đề tài đã chọn lọc và thử nghiệm đánh gía sinh
trưởng của nấm trên 2 loại môi trường khác nhau nhằm tìm ra mơi trường
dinh dưỡng tối ưu cho sinh trưởng của nấm. Kết quả đánh giá sinh trưởng của
hệ sợi nấm khi nuôi cấy trên các công thức môi trường dinh dưỡng khác nhau
được thể hiện ở Biểu 3.1.

Biểu 3.1: Sinh trƣởng của hệ sợi nấm trên các môi trƣờng
dinh dƣỡng khác nhau
Tốc độ mọc trung bình

TT

Mơi trƣờng

1

CT1

2,54

2

CT2

1,41

của hệ sợi (mm/ngày)

Với kết quả như trình bày ở bảng 3.1 cho thấy sinh trưởng của nấm
Phellinus linteus trên 2 loại mơi trường dinh dưỡng như trên có sự khác nhau
rõ rệt. Sinh trưởng của nấm trên môi trường CT1 (PDA) nhanh hơn hẳn so
với CT2, cụ thể là tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm ở CT1 đạt 2,54 mm/ngày

15



cịn ở CT2 chỉ có 1,41mm/ngày, tương ứng CT1 có độ vượt so với CT2 là
180%. Kết quả một lần nữa được thể hiện trên hình 3.1

Hình 3.1: Biểu đồ tốc độ sinh trƣởng của hệ sợi nấm trên 2 mơi trƣờng
dinh dƣỡng
Ngồi sự khác nhau về tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm trên 2 môi
trường dinh dưỡng ta còn thấy sự khác nhau rõ rệt về màu sắc của nấm và độ
dày hệ sợi nấm. Hệ sợi nấm Phellinus linteus có màu trắng khi non rồi chuyển
sang màu ngà và khi già có màu vàng sậm, nhưng ở CT1 hệ sợi nấm có màu
trắng và bơng hơn hẳn với độ dầy hệ sợi gấp 2,5 lần độ dầy hệ sợi ở CT2. Và
ở CT2 hệ sợi nấm chuyển sang màu vàng rất sớm và mọc bám chặt vào bề
mặt thạch, độ dầy hệ sợi mỏng. (Hình 3. 2)

Hình 3.2: Hệ sợi nấm trên hai mơi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau

16


3.1.1.2. Mơi trường dinh dưỡng khơng có Agar
Nghiên cứu mơi trường dinh dưỡng lỏng cũng rất quan trọng bởi nấm
sinh trưởng trên môi trường lỏng thường nhanh hơn so với mơi trường thạch.
Và khi ni cấy thể quả nấm nó thường được sử dụng để làm mơi trường
giống, hay nó thường được sử dụng để nuôi nấm phục vụ cho các cơng việc
tách chiết… Thí nghiệm mơi trường dinh dưỡng lỏng được thực hiện trên 2
công thức và kết quả thí nghiệm được thể hiện ở Biểu 3.2 và Hình 3.3.
Biểu 3.2: Khối lƣợng của hệ sợi nấm ở hai công thức môi trƣờng dinh
dƣỡng khác nhau
TT

Môi trƣờng


Khối lƣợng hệ sợi nấm (g/lọ)

Độ dầy

dinh dƣỡng

Tươi

Khô

hệ sợi (mm)

1

CT1

1,82

0,31

2,04

2

CT2

1,12

0,26


2,33

Qua kết quả của bảng số liệu ta thấy khối lượng nấm được nuôi cấy
trong mơi trường dinh dưỡng CT1 có khối lượng cao hơn 1,82g so với môi
trường dinh dưỡng CT2 1,12g. Tuy nhiên độ dày hệ sợi của môi trường dinh
dưỡng CT2 lại lớn hơn 2,34g so với môi trường dinh dưỡng thứ nhất 2,04g.

Hình 3.3: Biểu đồ sinh trƣởng hệ sợi nấm trên hai công thức môi trƣờng
dinh dƣỡng khác nhau
17


Màu sắc của hệ sợi trong hai môi trường dinh dưỡng cũng khác nhau.
Với mơi trường dinh dưỡng CT1 thì hệ sợi có màu vàng tươi, cịn trong mơi
trường dinh dưỡng CT2 thì hệ sợi có màu vàng nâu và hệ sợi cũng bơng xốp
hơn như Hình 3.4 và Hình 3.5.

Hình 3.4: Hệ sợi nấm trên mơi trƣờng CT1

Hình 3.5: Hệ sợi nấm trên môi trƣờng CT2

18


3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển
của nấm
Nhiệt độ khơng khí ảnh hưởng rất lớn đến sự nảy mầm của bào tử. Đặc
biệt nhiệt độ quyết định tốc độ sinh trưởng của hệ sợi cũng như thời gian hình
thành thể quả của nấm. Yếu tố nhiệt độ là rất quan trọng đối với q trình

ni cấy nấm trong điều kiện thuần khiết. Trên cơ sở đó tìm ra nhiệt độ thích
hợp cho nấm sinh trưởng tốt nhất. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở Biểu
3.3 và Hình 3.6.
Biểu 3.3: Tốc độ sinh trƣởng trung bình của hệ sợi nấm
ở các thang nhiệt độ khác nhau
Nhiệt độ

Tốc độ sinh trƣởng của hệ sợi nấm

(oC)

(mm/ngày)

1

10

0,92

2

15

1,74

3

20

2,25


4

25

2,34

5

30

2,24

6

35

0,41

TT

Khi biểu diễn tốc độ phát triển của hệ sợi nấm bằng Biểu 3.3 cho thấy,
thang nhiêt độ sinh trưởng của nấm khá rộng, ở nhiệt độ 25 oC tốc độ sinh
trưởng của hệ sợi đạt mức cao nhất với tốc độ 2,34mm/ngày còn ở nhiệt độ
35oC tốc độ sinh trưởng là thấp nhất với tốc độ 0,41mm/ngày. Vì thế có thể
kết luận được rằng nhiệt độ thích hợp cho nấm sinh trưởng là 25 oC.

19



Hình 3.6: Biểu đồ sinh trƣởng hệ sợi nấm ở các thang nhiệt độ khơng khí
khác nhau
Qua hình 3.6 thấy được rằng điều kiện nhiệt độ là rất quan trọng trong
nuôi cấy nấm. Ở các thang nhiệt độ khác nhau tốc độ sinh trưởng của hệ sợi
cũng rất khác nhau và có sự chênh lệnh rõ rệt. Bên cạnh sự khác nhau về tốc
độ sinh trưởng yếu tố nhiệt độ còn thể hiện qua độ dày và màu sắc hệ sợi, ở
các thang nhiệt độ phù hợp cho nấm sinh trưởng nấm có độ dày lớn và có màu
vàng tươi, cịn ở các điều kiện khơng phù hợp cho nấm sinh trưởng thì hệ sợi
nấm rất mỏng và màu sắc đậm hơn điều này được thể hiện qua Hình 3.7 với
kết quả thí nghiệm trên cho thấy khi gặp điều kiện nhiệt độ khơng khí thích
hợp vào mùa xn, mùa thu trong năm khi nhiệt độ đạt ngưỡng từ 25oC đến
30oC tiến hành nuôi trồng nấm sẽ thu được hiệu quả và giá trị kinh tế cao .

20