LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này tôi đã nhận đƣợc sự
giúp đỡ nhiệt tình từ các thầy cơ, bạn bè và gia đình rất nhiều. Để có đƣợc kết
quả nhƣ hơm nay, tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ThS.
Nguyễn Thị Mai Lƣơng ngƣời đã giành nhiều thời gian hƣớng dẫn tận tình, cung
cấp nhiều kiến thức và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt q trình
thực hiện đề tài khóa luận.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo tại Trung tâm đa dạng sinh học
và quản lí rừng bền vững đã tạo điều kiện giúp đỡ, chỉ bảo tận tình tơi trong suốt
q trình nghiên cứu.
Tơi cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ để tơi hồn
thành đề tài tốt nghiệp này.
Một lần nữa, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi ngƣời.
Đại học Lâm nghiệp, ngày 11 tháng 5 năm 2019
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Hồng Thắm

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN……………………………………………………………………i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................ iv
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG I.TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................ 3
1.1. Tổng quan về làng nghề So, xã Cộng Hòa, huyện Quốc Oai, TP. Hà Nội .... 3
1.2. Giới thiệu về cây dong riềng .......................................................................... 4

1.2.1. Nguồn gốc và đặc điểm sinh học của cây dong riềng ................................. 4
1.2.2. Thành phần dinh dƣỡng và giá trị sử dụng của cây dong riềng .................. 4
1.3. Quy trình cơng nghệ sản xuất miến dong từ tinh bột dong riềng .................. 6
1.4. Các phƣơng pháp xử lí nƣớc thải ................................................................... 9
1.5. Một số nghiên cứu về vi khuẩn phân giải tinh bột trong nƣớc thải ............. 11
CHƢƠNG II.MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 13
2.1. Mục tiêu nghiên cứu. .................................................................................... 13
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 13
2.3. Vật liệu nghiên cứu. ..................................................................................... 13
2.3.1. Nguồn mẫu vi sinh vật .............................................................................. 13
2.3.2. Hóa chất..................................................................................................... 13
2.3.3. Dụng cụ - thiết bị....................................................................................... 13
2.3.4. Môi trƣờng nuôi cấy .................................................................................. 14
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 14
2.4.1. Phƣơng pháp thu thập số liệu .................................................................... 14
2.4.2. Phƣơng pháp lấy mẫu,xử lí mẫu và bảo quản mẫu .................................. 15
2.4.4. Phƣơng pháp pha loãng mẫu ..................................................................... 17

ii


2.4.5. Phƣơng pháp phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột
............................................................................................................................. 17
2.4.6. Phƣơng pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải
tinh bột cao.......................................................................................................... 18
2.4.7. Phƣơng pháp định danh chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột
cao đƣợc tuyển chọn............................................................................................ 18
2.4.8. Phƣơng pháp phân tích và xử lí số liệu ..................................................... 19
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 20

3.1. Kết quả phân tích các chỉ tiêu ơ nhiễm nƣớc trong các mẫu nƣớc thải thu
thập đƣợc ............................................................................................................. 20
3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn phân giải tinh bột trong các mẫu nƣớc thải .... 22
3.3. Kết quả tuyển chọn các chủng VK có khả năng phân giải tinh bột cao ...... 24
CHƢƠNG 4.KẾT LUẬN – TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ ........................................ 28
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 28
4.2. Tồn tại........................................................................................................... 28
4.3. Kiến nghị ...................................................................................................... 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BOD

: Biochemical Oxygen Demand

BTNMT : Bộ tài nguyên môi trƣờng
COD

: Chemical Oxygen Demand

DO

: Dissolved Oxygen

MN


: Mẫu nƣớc

MT

: Mơi trƣờng

PTN

: Phịng thí nghiệm

QCVN : Quy chuẩn Việt Nam
TSS

: Tol Suspended Solid

TP

: Thành phố

VK

: Vi khuẩn

VSV

: Vi sinh vật

iv



DANH MỤC BẢNG

STT
1
2

3

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1: Thành phần của củ dong riềng ( trên 100 g củ)

5

Bảng 1.2: Các thông số phân tích nƣớc thải tại làng nghề sản

7

xuất miến dong Cự Đà, Thanh Oai, Hà Nội
Bảng 1.3: Các chỉ tiêu ô nhiễm tại nƣớc thải làng nghề Dƣơng

8

Liễu

4

Bảng 1.4: Một số VSV có hệ enzyme amylase


11

5

Bảng 2.1: Vị trí lấy mẫu nƣớc thải

15

6

Bảng 2.2: Các thơng số phân tích trong PTN

16

Bảng 3.1: Giá trị các thông số nƣớc thải sản xuất miến của

20

7

8
9

làng nghề So xã Cộng Hòa
Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái của các chủng VK phân lập

23

đƣợc

Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính của 2 chủng VK B7 và B12

v

24


DANH MỤC HÌNH ẢNH
STT

Tên hình

Trang

1

Hình 1.1: Cây và củ dong riềng

4

2

Hình 1.2: Quy trình sản xuất miến dong của làng nghề So

6

3

Hình 3.1: Hàm lƣợng COD trong nƣớc thải tại làng nghề So


20

4

Hình 3.2: Hàm lƣợng BOD5 trong nƣớc thải tại làng nghề So

21

5

Hình 3.3: Hàm lƣợng TSS trong nƣớc thải tại làng nghề So

22

6

Hình 3.4: Hình thái tế bào (×100) của chủng vi khuẩn B7

25

7

8
9
10

11

Hình 3.5: Đồ thị khái quát mức độ bắt cặp tại từng vùng
trong trình tự gen của chủng B7 tra cứu trên NCBI

Hình 3.6: Kết quả chi tiết của trình tự tƣơng đồng của chủng
B7 đƣợc tra cứu trên NCBI
Hình 3.7: Hình thái tế bào (× 100) của chủng vi khuẩn B12
Hình 3.8: Đồ thị khái quát mức độ bắt cặp tại từng vùng
trong trình tự gen của chủng B12 tra cứu trên NCBI
Hình 3.9: Kết quả chi tiết của trình tự tƣơng đồng của chủng
B12 đƣợc tra cứu trên NCBI

vi

25

26
26
27

27


ĐẶT VẤN ĐỀ
Các làng nghề ở Việt Nam đã và đang có nhiều đóng góp cho sự phát triển
của đất nƣơc nói chung và đối với nền kinh tế nơng thơn nói riêng, giúp ngƣời nơng
dân có cuộc sống ấm no ngay trên mảnh đất quê hƣơng của mình. Nhiều làng nghề
truyền thống hiện nay đã đƣợc khôi phục, đầu tƣ phát triển với quy mô kĩ thuật cao
hơn, hàng hóa khơng những phục vụ nhu cầu trong nƣớc mà còn xuất khẩu với giá
trị lớn. Bên cạnh mặt hàng đóng góp tích cực, tình trạng ơ nhiễm ở các làng nghề đã
lên tới báo động gây bức xúc cho xã hội do việc phát triển các làng nghề mang tính
tự phát, cơng nghệ thủ cơng lạc hậu, thiết bị chắp vá, thiếu đồng bộ, ý thức bảo vệ
môi trƣờng rất thấp hoặc có ý thức nhƣng khơng đủ kinh tế để xử lí ơ nhiễm. Tất cả
các hạn chế không chỉ ảnh hƣởng tới sự phát triển các làng nghề mà cịn ảnh hƣởng

tới chất lƣợng mơi trƣờng làng nghề và sức khỏe cộng đồng.
Một trong những loại hình làng nghề phổ biền nhất ở nông thôn Việt Nam là
làng nghề chế biến lƣơng thực (bún, miến, bánh đa, chế biến tinh bột,…). Phần lớn
nƣớc thải sản xuất tinh bột đƣợc xả thẳng xuống hệ thống kênh rạch hoặc các khu đất
trống tự thấm nƣớc gây ra mùi khó chịu. Nƣớc ngấm xuống đất làm ô nhiễm nƣớc
ngầm, nƣớc chảy tràn vào đồng ruộng gây ô nhiễm môi trƣờng đất làm thay đổi đặc
tính đất, giảm năng xuất cây trồng. Mơi trƣờng sống ở những làng nghề đã có những
chuyển biến theo chiều hƣớng đáng lo ngại và đã gây nhiều bức xúc cho xã hội. Các
chỉ tiêu cơ bản của nƣớc thải nhƣ BOD, COD, TSS,.. đều vƣợt quá tiêu chuẩn cho
phép nhiều lần.
Tính chất nƣớc thải làng nghề sản xuất tinh bột dong riềng chứa hàm lƣợng
chất hữu cơ chủ yếu nhƣ là các hợp chất nhƣ tinh bột, cellulose, hemicellulose… là
các chất dễ phân hủy, chuyển hóa sinh học và các hợp chất chứa nitơ gồm nitơ ở
dạng hữu cơ (amin, axit amin,…), ở dạng vô cơ nhƣ NH4+, NO2,.. làm giảm chất
lƣợng của nƣớc và có thể gây ra một số bệnh nguy hiểm cho con ngƣời. Vì thế, việc
tìm quy trình xử lí thích hợp đối với loại nƣớc thải này có ý nghĩa to lớn. Có nhiều
biện pháp xử lý, tuy nhiên biện pháp sử dụng vi sinh vật (VSV) để phân hủy cơ chất
là ƣu thế hơn cả vì chúng có ƣu điểm về kinh tế - kỹ thuật, đồng thời không sinh ra
1


các chất độc hại khác ảnh hƣớng tới sức khỏe con ngƣời và thân thiện với môi
trƣờng bằng cách xử lí nƣớc thải, phế thải ngay trong q trình chế biến để tạo ra
nguồn hữu cơ có ích khác .
Trên cơ sở đó, tơi thực hiện đề tài: ”Phân lập và tuyển chọn các chủng vi
khuẩn có khả năng phân giải tinh bột cao từ nước thải miến dong của làng nghề
So, xã Cộng Hòa, huyện Quốc Oai, TP. Hà Nội.”

2



CHƢƠNG I
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về làng nghề So, xã Cộng Hòa, huyện Quốc Oai, TP. Hà Nội
Làng nghề So từ xa xƣa đã nổi tiếng về nghề làm miến thủ công với
hƣơng vị đặc sắc khơng đâu có. Làng nằm ở phía Đơng Nam huyện Quốc Oai,
cách trung tâm huyện 5 km và cách TP. Hà Nội 20 km về phía Đơng.
Làng có địa hình tƣơng đối đa dạng và phức tạp gồm vùng bãi đáy, vùng
đồng bằng và vùng gò đồi. Thổ nhƣỡng của vùng chủ yếu là đất feralit, đất màu
mỡ ít. Đất có thành phần cơ giới nhẹ và kết cấu rời rạc, ít chất dinh dƣỡng, chua,
khả năng giữ nƣớc và phân kém.
Làng So có khí hậu mùa đơng lạnh và khơ cịn mùa hè nóng ẩm, mƣa
nhiều. Thời tiết này hạn chế đến sản lƣợng sản xuất của làng nghề vì hầu nhƣ ở
đây, hình thức sản xuất vẫn trên cơ sở thủ công phơi miến chủ yếu dựa vào nhiệt
độ tự nhiên nên những ngày mƣa liên tục làng nghề sẽ ngƣng sản xuất. Nhìn
chung nền kinh tế của xã trong những năm qua đang phát triển theo chiều hƣớng
thuận lợi và đúng hƣớng. Tiềm lực kinh tế của xã đƣợc tăng lên đáng kể và môi
trƣờng đầu tƣ ngày càng đƣợc cải thiện và hiệu quả. Thu nhập ngƣời dân tăng
lên đáng kể. Trong cơ cấu kinh tế, tỉ lệ công nghiệp thƣơng mại và dịch vụ đã có
nhiều chuyển hƣớng tăng nhanh. Q trình thực hiện phấn đấu giá trị sản xuất
hàng hóa giảm dần theo hƣớng nông lâm nghiệp và tăng tỉ trọng công nghiệp và
dịch vụ. Riêng ngành thủ công nghiệp vẫn là thế mạnh của địa phƣơng, chiếm tỷ
trọng lớn trong tổng giá trị sản xuất và tổng thu nhập của xã. Đối với các hộ sản
xuất miến dong trên địa bàn xã chủ yếu với quy mô vừa và nhỏ. Thành phần lao
động chủ yếu là các thành viên trong gia đình và lao động địa phƣơng. Tồn xã
có 6 thơn, cả 6 thôn đều tham gia sản xuất miến dong với tổng số hộ là 98 hộ,
trong đó tập trung nhiều nhất tại thôn 4 và thôn 5. Đa số các hộ tham gia sản
xuất trong làng đều có xƣởng sản xuất riêng với quy mơ vừa và nhỏ. Với diện
tích tích mặt bằng từ 96 tới 380 m2, diện tích sử dụng từ 78 tới 322 m2 chiếm từ
37,4% - 93,7% . Ở làng nghề, quy mô đối với các hộ sản xuất miến từ 7,2 – 54

tấn/tháng.[2]
3


1.2. Giới thiệu về cây dong riềng
1.2.1. Nguồn gốc và đặc điểm sinh học của cây dong riềng
Dong riềng (Canna edulis Ker ) là một lồi cây thân thảo có nguồn gốc từ
khu vực Andean thuộc Nam Mỹ khoảng hơn 4000 năm trƣớc và đƣợc ngƣời
Pháp trồng ở Việt Nam đầu thế kỉ IXX tại nhiều địa phƣơng của nƣớc ta.[20]
Dong riềng là cây rễ củ, giàu tinh bột. Cây dong riềng có thân cao từ 1,2 –
1,5 m, màu tía, thân ngầm phình to thành củ có dạng giống củ diềng nhƣng to
hơn. Lá cây dong riềng là dạng lá đơn, hình bầu dục, mép nguyên, mọc cách, 30
- 40 × 15 cm, chót nhọn có mũi 1 cm, gốc thót lại thành bẹ ơm thân, mặt trên lá
xanh đậm, mặt dƣới nhạt màu hơn, viền lá có màu đỏ tía, gân chính có sống lồi
mặt dƣới, lõm mặt trên, màu đỏ tía ở mặt dƣới giống nhƣ thân, gân thứ cấp 20 25 cặp, song song, cách nhau khoảng 1 - 1,5 cm, mọc xiên. Hoa dạng chùm nằm
ở đầu ngọn, có màu đỏ tƣơi. Củ dong có hình tháp trịn, đƣờng kính trung bình
từ 25 – 35 mm, chiều dài từ 10 - 15 mm, vỏ nhiều xơ, màu trắng, có các vảy
mỏng xếp thành hình so le bao lấy vỏ củ [17].

Hình 1.1: Cây và củ dong riềng [11]
1.2.2. Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng của cây dong riềng
Dong riềng là loại cây khơng những cho phép khai thác sản phẩm chính là
củ mà còn cho phép tận dụng triệt để các sản phẩm phụ nhƣ lá và thân cây.
Tỷ lệ thành phần hóa học trong củ thay đổi tùy thuộc theo vị trí củ: ở đầu
củ thì nhiều nƣớc, ít bột ít xơ, ở gốc củ thì ít nƣớc, có nhiều tinh bột và nhiều xơ.
4


Bảng 1.1: Thành phần của củ dong riềng ( trên 100 g củ)[8]
% ăn đƣợc


Các thành phần chính

81
Nƣớc

56,8

Protein

0,6

Lipid

-

Glucid

20,3

Cellulose

2

Tro

1,3

Ca


51,8

P

86,7

Fe

1,4

Caroten

0,13

B1

-

B2

-

PP

-

C

2


Muối khống

Vitamin (mg%)

Trong củ dong riềng gluxid là thành phần quan trọng nhất, trong đó chủ
yếu là tinh bột. Tinh bột dong riềng có hàm lƣợng amylase cao hơn nhiều các
loại tinh bột khác. Tinh bột là một polysacarit chứa hỗn hợp amylase và
amylopectin. Ở dong riềng tỷ lệ amylose : amylopectin là 37,1: 62,9.[12]
Các thành phần dinh dƣỡng khác nhƣ protein, vitamin, lipid có hàm lƣợng
thấp. Hàm lƣợng cellulose trong củ dong riềng khá cao, cấu trúc xơ dài và bền.
Trong củ dong riềng cịn có hợp chất polyphenol, với hàm lƣợng khoảng
0,16%. Khi nghiền củ, các hợp chất này bị oxy hóa tạo các chất màu thâm đen,
hấp thu và giảm độ trắng của tinh bột.
Dong riềng có rất nhiều cơng dụng: làm thức ăn cho ngƣời và gia súc, làm
bột, nấu rƣợu,… Tinh bột dong riềng có thể làm hạt trân châu, miến, bánh đa và
các loại thức ăn tổng hợp khác. Tinh bột dong riềng có hàm lƣợng amylase
5


thuộc loại cao nên có nhiều lợi thế để sản xuất các sản phẩm cần độ dai, giòn
nhƣ miến, trân châu.
1.3. Quy trình cơng nghệ sản xuất miến dong từ tinh bột dong riềng
- Nƣớc

Công đoạn 1:

- Tinh bột dong

Rửa lọc và ngâm bột


- Bột sau rửa lọc

Công đoạn 2:

- Nƣớc, củi, than

Hấp chín

- Bột sau rửa lọc

Cơng đoạn 3:

- Điện

Ép tạo sợi

- Miến sau ép

Công đoạn 4:
Phơi khô

tạo sợi
- Miến sau phơi

Cơng đoạn 5:
Cắt và đóng túi

khơ

Nƣớc thải


Khí thải

Bột rơi vãi

Miến rơi vãi

Miến rơi vãi

Hình 1.2: Quy trình sản xuất miến dong của làng nghề So
 Thuyết minh quy trình:
Trong q trình nghiên cứu, đề tài thu thập thơng tin từ các cơ sở sản xuất
và các hộ dân tại làng So cho biết sản xuất miến dong gồm 5 cơng đoạn chính:
- Rửa lọc và ngâm bột: Bột đƣợc rửa lọc, đánh tan bằng máy khuấy và
lắng sau 2 giờ thì tháo nƣớc ra khỏi bể, nƣớc thải lẫn bột, cặn bẩn đƣợc xả ra
rãnh thải chung. Công đoạn này tiêu tốn nƣớc và phát sinh nƣớc thải nhiều nhất.
- Hấp chín: bột sau lọc đƣợc đổ nƣớc sơi, khuấy đều cho đến khi chín bằng
đũa tre. Giai đoạn này tiêu hao nhiều nhiên liệu ( củi, than ) nên phát sinh nhiều khí
và xỉ thải.
6


- Ép tạo sợi: bột sau khi hấp chín đƣợc ép thủy lực tạo thành sợi miến ƣớt
và đƣợc đón bởi phên tre đã bơi mỡ chống dính
- Phơi khơ: Miến ƣớt rải ra phên đƣợc phơi trên dàn phơi
Cắt và đóng gói: miến sau khi phơi khơ đƣợc cắt thủ cơng và đóng gói có
in tên và địa chỉ sản xuất.
 Đặc điểm nƣớc thải của các làng nghề sản xuất miến và tinh bột dong
riềng:
- Trong quá trình sản xuất miến dong công đoạn rửa lọc và ngâm bột gây

ảnh hƣởng nhiều nhất do phát sinh nƣớc thải chứa chất hữu cơ và mùi chua của
bột lên men. Nƣớc thải miến có COD tƣơng đối cao 4000-6000 mg/l, độ đục
tƣơng đối lớn 400-600 NTU do trong quá trình ngâm bột một lƣợng nhỏ tinh bột
đi theo nƣớc vào nƣớc thải, thành phần chủ yếu của bột dong riềng là tinh bột
nên hàm lƣợng amoni không cao khoảng 40-80 mg/l và nitrit thấp(< 3mg/l), pH
của nƣớc thải khá thấp (2 – 3), tất cả nƣớc thải của các công đoạn đƣợc thải
chung xuống cống cùng với nƣớc thải sinh hoạt gây ô nhiễm nặng cho môi
trƣờng nƣớc.[1]
Các thông số phân tích nƣớc thải tại làng nghề sản xuất miến dong Cự Đà,
Thanh Oai, Hà Nội trong bảng 1.2:
Bảng 1.2: Các thơng số phân tích nƣớc thải tại làng nghề sản xuất miến
dong Cự Đà, Thanh Oai, Hà Nội
STT

Thông số

Đơn vị

Giá trị

1

COD

mg/l

600

2


Độ đục

NTU

560

3

Amoni (NH4+) ( tính theo N)

mg/l

45

4

Nitrit

mg/l

3

5

P

mg/l

2,5


6

Mùi

Mùi chua khó chịu

7


COD của nƣớc thải sản xuất miến dong của làng nghề Cự Đà vƣợt 120
lần, độ đục vƣợt 5,6 lần, amoni vƣợt 45 lần… so với QCVN 08:2018/BTNMT
cột B2 – Quy chuẩn chất lƣợng quốc gia về nƣớc mặt.[21]
Nƣớc thải chế biến miến dong tại làng nghề Đông Thọ, Đông Hƣng, Thái
Bình có hàm lƣợng TSS = 928 mg/l, COD = 671 mg/l,vƣợt tiêu chuẩn cho phép
9 – 10 lần.
Tại làng nghề chế biến nông sản thực phẩm nhƣ Dƣơng Liễu, La Phù
(Hoài Đức – Hà Nội ) theo ƣớc tính mỗi ngày nƣớc thải từ các hộ chế biến nơng
sản khoảng 600 m3, thực tế con số này cịn cao hơn rất nhiều, nhất là 7 tháng vụ
chính. Loại nƣớc thải này chứa các chất tẩy rửa hóa học, mang tính acid, kiềm
qua q trình phân hủy tạo ra các khí độc có mùi hơi thối rất khó chịu. Hệ thống
dẫn nƣớc thải kém dẫn đến nƣớc mặt nhiều nơi có hàm lƣợng COD, BOD5,
NH4+, Coliform vƣợt hàng chục lần đến hàng trăm lần cho phép. Nguy hại hơn
là tồn bộ hệ thống nƣớc ngầm bị ơ nhiễm nặng. Cụ thể các chỉ tiêu ô nhiễm
nƣớc thải tại làng nghề Dƣơng Liễu đƣợc thể hiện trong bảng 1.3
Bảng 1.3: Các chỉ tiêu ô nhiễm tại nƣớc thải làng nghề Dƣơng Liễu
Các chỉ tiêu
phân tích

Nƣớc thải từ
Đơn vị tính


các hộ chế
biến

pH

Nƣớc thải từ
các kênh thải

TCVN
(5945-1945)
loại B

4

0,5

5,5 - 9

BOD

mg/l

2116

496,5

50

COD


mg/l

3638

987

100

2366

501

100

Cặn lơ lửng
N

mg/l

108

105,2

30

K

mg/l


112

197,5

-

P

mg/l

26

10,5

4

Nguồn: Lê Ngọc Thuận (2003)

8


Hầu hết các chỉ tiêu đều vƣợt tiêu chuẩn cho phép nhiều lần đặc biệt là
BOD, COD cao hơn cả chục lần.
Nƣớc thải từ các hộ chế biến đƣợc thải trực tiếp qua các hệ thống cống, rãnh,
ao hồ trong khu dân cƣ đã phần nào đƣợc xử lý nên pH và các chất ơ nhiễm có
giảm đáng kể.[15]
1.4. Các phƣơng pháp xử lí nƣớc thải
Xử lý nƣớc thải là loại bỏ các tạp chất gây ô nhiễm ra khỏi nƣớc, nƣớc
thải. Khi đạt đƣợc những chỉ tiêu, yêu cầu cho từng loại nƣớc thì có thể đổ vào
nguồn hoặc tái sử dụng lại. Để đạt đƣợc mục đích trên ngƣời ta thƣờng dựa vào

đặc điểm của các loại tạp chất để chọn phƣơng pháp xử lý thích hợp. Một số
phƣơng pháp thƣờng đƣợc áp dụng nhƣ phƣơng pháp hóa lý, phƣơng pháp hóa
học và phƣơng pháp sinh học.
Đối với các loại nƣớc thải có hàm lƣợng chất hữu cơ cao nhƣ nƣớc thải
các làng nghề sản xuất miến thì phƣơng pháp xử lý đƣợc lựa chọn là phƣơng
pháp sinh học. Ở đây nguồn nƣớc thải sau khi đƣợc xử lý sẽ đƣợc thải trực tiếp
ra các dịng sơng nên khơng thể sử dụng hóa chất một cách tùy tiện đƣợc.
Phƣơng pháp xử lý sinh học dựa vào sự phân hủy các chất hữu cơ trong nƣớc
thải bởi các VSV, nên khi thải ra sẽ không gây ô nhiễm môi trƣờng bởi các hóa
chất đƣa vào trong q trình xử lý nhƣ các phƣơng pháp khác. Nhờ hoạt động
sống của VSV, một lƣợng lớn chất hữu cơ bị phân giải và làm giảm trọng lƣợng.
Trong quá trình này các chất hữu cơ (cellulose, hemicellulose, tinh bột, protein )
đƣợc phân giải thành những phần nhỏ hơn, sinh khối của VSV mới đƣợc tạo
thành đồng thời tạo ra các sản phẩm của q trình trao đổi chất và giải phóng
năng lƣợng.
Trong nƣớc thải của các làng nghề sản xuất tinh bột, miến dong rất giàu
các chất hữu cơ nhƣ tinh bột, đƣờng, các hợp chất protein, cellulose,… Thƣờng
nƣớc thải cũng có chứa rất nhiều các VSV. VSV ở đây là một quần thể và đông
đảo nhất là vi khuẩn (VK), cả về chủng loại cũng nhƣ số lƣợng. Chúng tham gia
vào nhiều q trình chuyển hóa, sử dụng các chất hữu cơ làm nguồn dinh dƣỡng
9


và phân giải các chất độc thải bằng việ tiết ra các enzyme ngoại bào nhƣ
amylase, cellulose, protease, trong đó enzyme amylase là enzyme quan trọng
nhất do trong nƣớc thải có chứa hàm lƣợng tinh bột cao nên ƣu tiên các VSV có
hoạt tính amylase [9;7]
Một số VSV có khả năng tiết ra enzyme amylase mạnh nhƣ là nấm mốc
Aspergillus, Rhizopus; nấm men Candida, Sacharomyces, Endomycopsis,
Endomyces; VK Bacillus mesentericus, B.subtilis, B. macecassavanum,

Clostridium acetobutylium, Penicillium saccharophila,… Các VK ƣa nhiệt có
khả năng sinh trƣởng nhanh (4 – 6 lần so với VK ƣa ẩm) và phát triển tốt ở nhiệt
độ tƣơng đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm VSV khác.
Trong số VK ƣa ẩm tạo amylase mạnh thì Bacillus subtilis đƣợc nghiên cứu và
sử dụng rộng rãi nhất. Riêng ở Nhật, hằng năm ngƣời ta sản xuất tới hàng chục
nghìn tấn chế phầm amylase và protease từ lồi VK ƣa ẩm và hiếu khí này.
Nhiệt độ sinh trƣởng tối thích của Bacillus subtilis là 37

[10,18]. Một số nhỏ

các chủng xạ khuẩn cũng có khả năng sinh enzyme amylase nhƣ
Streptomyces,…[22]
Các VSV có khả năng phân hủy tinh bột khi chúng có hệ enzyme
amylase. Các liên kết glycoside của tinh bột dƣới tác dụng của VK có thể bị
thủy phân nhờ hệ enzym amylase tạo thành glucose, maltose hay dextrin tùy
thuộc vào tính chất của từng enzym.
- α – amylase chỉ cắt đứt liên kết α-1,4-glycoside ở giữa chuỗi polysaccarit,
khơng có khả năng cắt đứt nhánh α-1,6-glycoside và tạo ra nhiều dextrin phân tử
nhỏ và dextrin phân nhánh chứa liên kết α-1,6-glycoside.
- β – amylase cũng chỉ cắt liên kết α-1,4-glycoside nhƣng có khả năng cắt
từ đầu tận cùng không khử của chuỗi polysaccharide cho sản phẩm chủ yếu là
đƣờng maltose và các dextrin chứa mạch nhánh α-1,6-glycoside.
- ¥ – amylase ( Glucoamylase) đặc biệt đƣợc tổng hợp từ VSV có khả năng
cắt đứt cả liên kết α-1,4-glycoside và α-1,6-glycoside tạo ra sản phẩm chủ yếu là
glycose và dextrin phân tử nhỏ [3].
10


Thực tế ngồi enzyme amylase cịn có một số enzyme khác có thủy phân
tinh bột nhƣ dextranase, glycosidase, β – glucosidase, lactase. Tuy nhiên hệ

enzyme amylase đƣợc quan tâm và sử dụng phổ biến hơn.
Bảng 1.4: Một số VSV có hệ enzyme amylase [5]
STT

Vi sinh vật

Hệ enzyme
α-amylase

1

β-amylase

Asp. Awamori

glucoamylase
2

α-amylase

Asp.niger

glucoamylase
α-amylase

3

β-amylase

Asp.usami


glucoamylase
β-amylase

4

Asp.oryae

5

Bacillus.spp

6

Endomyces.spp

glucoamylase

7

Phizopus delemar

glucoamylase

glucoamylase
α-amylase
β-amylase

1.5. Một số nghiên cứu về vi khuẩn phân giải tinh bột trong nƣớc thải
Trong nƣớc đã có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu sử dụng VSV

phân giải tinh bột nhƣ:
Tác giả Hà Thành Toàn và các cộng sự (2008) đã thực hiện đề tài nghiên
cứu “Phân lập vi khuẩn phân giải cellulose, tinh bột và protein trong nước rỉ từ
bãi rác ở TP. Cần Thơ”. Kết quả phân lập đƣợc 62 dòng VK phân giải chất hữu
cơ bao gồm 17 dòng phân giải protein, 24 dòng phân giải celluslose và 21 dòng
phân giải tinh bột đƣợc phân lập từ nƣớc rỉ ở hai bãi rác Đông Thạnh và Tân
Long. [16]
11


Một nghiên cứu khác của tác giả Nguyễn Hoàng Mỹ và cộng sự ( 2011)
thực hiện đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn các vi khuẩn có tiềm năng phân hủy
tinh bột và protein để ứng dụng trong xử lý nước thải chế biến lương thực và
thủy sản. Kết quả đã tuyển chọn đƣợc 12 chủng VK khác nhau bao gồm 6 chủng
có khả năng phân giải tinh bột mạnh nhất và 6 chủng có khả năng phân giải
protein tốt nhất. Kết quả đề tài cho thấy hiệu quả xử lí chất hữu cơ khi phối trộn
các chủng này với nhau tăng lên khi chỉ sử dụng một chủng riêng rẽ, hiệu suất
đạt gần 90% đối với nƣớc thải nông sản và 80% đối với nƣớc thải chế biến thủy
sản [6]
Ngoài ra, Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý (2012) đã nghiên cứu
“Phân lập các dịng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột từ nước thải tại
làng nghề sản xuất bột gạo tại thị xã Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp”. Kết quả từ 25
mẫu nƣớc thải thu thập đƣợc đã phân lập đƣợc 23 chủng VK, trong đó có 13
dịng VK thuộc gram âm và 13 dịng VK thuộc gram dƣơng. Các dịng VK phân
lập đƣợc có hoạt tính enzyme amylase từ 72,44 U/ml đến 910,89 U/ml sau 72
giờ ni cấy. Trong số này có 4 dịng có hoạt tính enzyme amylase cao là 9 35,
VD2, 92 và 16. Hai dịng 935 và VD2 có khả năng xử lí đến 97% lƣợng tinh bột
có trong nƣớc thải chỉ sau 24 giờ. [4]

12



CHƢƠNG II
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu.
2.1.1. Mục tiêu chung.
- Cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu nhằm xử lí nƣớc thải miến
dong chứa nhiều chất hữu cơ.
2.1.2. Mục tiêu cụ thể.
- Phân lập và tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải
tinh bột cao.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát đặc tính nƣớc thải của khu vực nghiên cứu
- Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột từ nƣớc thải của
khu vực nghiên cứu
- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột cao từ
nƣớc thải của khu vực nghiên cứu
- Định danh các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn
2.3. Vật liệu nghiên cứu.
2.3.1. Nguồn mẫu vi sinh vật
Các chủng VK đƣợc phân lập từ nƣớc thải thu thập tại làng nghề So, xã
Cộng Hòa, huyện Quốc Oai, TP. Hà Nội.
2.3.2. Hóa chất
Các hóa chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là:
- NaCl

- Glucose

- Cao thịt


- Dung dịch Lugol

- Peptone

- Cồn

- Agar
2.3.3. Dụng cụ - thiết bị
Các dụng cụ - thiết bị đƣợc sử dụng trong phịng thí nghiệm bao gồm
- Tủ cấy vơ trùng
13


- Bình tam giác
- Cân điện tử
- Kính hiển vi quang học
- Tủ sấy
- Nồi hấp khử trùng
- Que cấy
- Pipet
- Đĩa pettri
- Ống nghiệm
Các dụng cụ khác: pipet, đũa thủy tinh, đĩa pettri,ống nghiệm, đèn cồn
2.3.4. Môi trường nuôi cấy
 Sử dụng môi trƣờng LB (dùng để phân lập, giữ giống và nuôi cấy)
- Cao thịt: 5 g
- Pepton: 10 g
- NaCl: 5 g
- Agar: 15 g
- Nƣớc cất 1000 ml.

 Sử dụng môi trƣờng NAS để tuyển chọn các chủng VK có khả năng
phân giải tinh bột cao [19]
- Cao thịt: 3 g
- NaCl: 1,5 g
- Peptone: 3 g
- Tinh bột tan: 1,5 g
- Agar: 6 g
- Nƣớc cất: 1000 ml
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp thu thập số liệu
Thu thập các tài liệu, số liệu có liên quan đến nội dung nghiên cứu.

14


- Các thông tin về điều kiện tự nhiên, kinh tế, xã hội, thực trạng làng
nghề,…đƣợc thu thập tại làng So, xã Cộng Hòa, huyện Quốc Oai, TP. Hà
Nội từ sách, báo, Internet,…
- Các tài liệu liên quan đến khả năng phân giải tinh bột của các chủng VK
đƣợc thu thập từ sách, các bài báo khoa học, báo cáo chuyên đề,…
2.4.2. Phương pháp lấy mẫu,xử lí mẫu và bảo quản mẫu
2.4.2.1. Phương pháp lấy mẫu ngồi hiện trường.
Vị trí lấy và số lƣợng các mẫu nƣớc thải tại địa điểm nghiên cứu đƣợc mô
tả trong bảng 2.1
Bảng 2.1: Vị trí lấy mẫu nước thải
STT

Kí hiệu

Đặc điểm chi tiết


mẫu nƣớc

1

MN1

Mẫu nƣớc thải đƣợc lấy từ Máng Bảy

2

MN2

Mẫu nƣớc thải đƣợc lấy từ sông Tiêu

3

MN3

Mẫu nƣớc thải lấy trực tiếp tại cống nhà ơng Cấn Văn
Tồn

 Địa điểm lấy mẫu: đến trực tiếp khu vực nghiên cứu lấy mẫu nƣớc thải
tại cống của các hộ sản xuất, mƣơng, sông.
 Nguyên tắc lấy mẫu: Để kết quả phân tích đạt kết quả chính xác cao,
việc lấy mẫu cần đảm bảo nguyên tắc:
- Các mẫu đƣợc lấy phải có tính đại diện cao.
- Dụng cụ lấy mẫu và đựng mẫu phải sạch và phải áp dụng các biện pháp
cần thiết để tránh nhiễm bẩn, đảm bảo QA/QC.
 Dụng cụ lấy mẫu: bao gồm gậy dài khoảng 2 m, chai nƣớc khống thể

tích 500 ml, băng dính, giấy, bút, gang tay.
 Phƣơng pháp lấy mẫu: (TCVN 6663-1:2011)
15


- Trƣớc khi lấy mẫu cần chuẩn bị các dụng cụ cần thiết để tránh gây mất thời
gian.
- Đeo gang tay cẩn thận, lấy chính mẫu nƣớc cần phân tích tráng qua chai
1 lần. Sau đó lấy nƣớc đầy vào chai hoặc dùng gậy để múc nƣớc ở những vị trí
xa,khó lấy mẫu. Đậy nắp chai và dùng bút ghi kí hiệu mẫu và các thơng tin cần
thiết về thời gian, vị trí lấy mẫu lên từng chai. Các chai đựng mẫu đƣợc để vào
thùng xốp và vận chuyển về phịng thí nghiệm để bảo quản và phân tích. [13]
2.4.2.3. Phương pháp xác định một số đặc tính của nước thải miến dong.
Các đặc tính của các mẫu nƣớc thải nghiên cứu đƣợc thực hiện dựa vào
các phƣơng pháp đƣợc trình bày trong bảng 2.2:
Bảng 2.2: Các thơng số phân tích trong PTN

STT
1

Thơng

Phƣơng pháp

số
pH

TCVN

Đo nhanh bằng máy đo pH

- Lấy 0,5 ml mẫu + 1,5 ml nƣớc cất + 1,5ml

COD
2

(nhu cầu
oxy hóa
học)

K2Cr2O7 + 3ml Ag2SO4:H2SO4 cho vào ống
nghiệm, đậy nắp rồi lắc đều. Đem ống nghiệm
đi nung trong vòng 120 phút.
- Dung dịch sau khi nung cho vào bình tam

TCVN
6491: 1999

giác, thêm 3 giọt chỉ thị feroin và lắc đều.
- Chuẩn độ bằng dung dịch Fe2+(Fas)

BOD5
3

Sử dụng chai DO có thể tích 300ml. Đo hàm

(nhu cầu lƣợng DO ban đầu và sau 5 ngày ủ ở 20

.

oxy sinh Lƣợng oxy chênh lệch do VSV sử dụng chính là

hóa)

BOD5

TCVN
6001-1 :
2008

DO
4

(hàm
Đo nhanh bằng máy đo DO
lƣợng
oxy hòa
tan)
16

TCVN 7324
(ISO 5813)]


- Lấy 35ml nƣớc cất + 5ml mẫu cho vào bình
tam giác. Sau đó thêm 4ml K2S2O8 và 1ml
H2SO4. Đun sơi dung dịch ở nhiệt độ nhỏ trong
Tổng
5

phốt
pho


vịng 30 phút .
- Định mức dung dịch tới vạch ở bình định mức

TCVN

50ml.

6202:2008

- Lấy 2ml mẫu trong bình định mức, thêm 8ml
nƣớc cất + 1ml acobic + 2ml molipdat. Sau đó
lắc kĩ để 30 phút rồi đem so màu ở bƣớc sóng
888nm.
- Đem sấy giấy lọc trong vòng 1 giờ rồi đem
cân, ghi lại kết quả cân đƣợc (t1)
- Dùng giấy lọc đó để lọc các mẫu nƣớc đến

6

TSS

100ml rồi đem sấy tiếp trong 4 giờ. Mang cân
giấy lọc, ghi lại kết quả (t2)

TCVN
9936:2013

- Lấy t2 - t1 thu đƣợc hàm lƣợng tổng chất rắn lơ
lửng có trong từng mẫu nƣớc thải.

2.4.4. Phương pháp pha loãng mẫu
Dùng nƣớc cất để pha loãng. Cách pha loãng nhƣ sau: Lấy 1 ml mẫu nƣớc
thải và bổ sung thêm 9 ml nƣớc cất sẽ đƣợc dung dịch nƣớc thải có nồng độ 10-1.
Sau đó lại lấy 1 ml dung dịch này bổ sung thêm 9 ml nƣớc cất, khi đó đƣợc dung
dịch nƣớc thải có nồng độ 10-2. Cứ tiếp tục nhƣ vậy, thu đƣợc nƣớc thải với
nồng độ pha loãng từ 10-3 đến 10-4. [14]
( Lưu ý: nước cất để pha loãng phải được hấp khử trùng và các bước pha
loãng phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng )
2.4.5. Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh
bột
Môi trƣờng LB sau khi đƣợc hấp khử trùng ta tiến hành phân phối ra các
đĩa pettri. Hút 0,1 ml dung dịch nƣớc thải ở mỗi nồng độ đã đƣợc pha loãng ở
17


trên cấy vô trùng và trải đều trên đĩa pettri đã có sẵn mơi trƣờng phân lập thích
hợp. Các đĩa đã đƣợc cấy đƣợc nuôi trong tủ ấm 37

từ 1 – 2 ngày. Trên mỗi

mẫu lựa chọn các khuẩn lạc vi khuẩn riêng rẽ và cấy chuyển sang môi trƣờng
thạch thích hợp trong đĩa pettri mới. Sau 2 ngày khi các khuẩn lạc đã mọc to ta
tiếp tục tiến hành cấy ria sang đĩa pettri tạo khuẩn lạc riêng rẽ và ống thạch
nghiêng để giữ giống. Các ống thạch nghiêng này đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở
nhiệt độ 4
Tất cả các thí nghiệm trên đều đƣợc thực hiện trong điều kiện vơ trùng,
mỗi thí nghiệm đều đƣợc làm lặp lại ít nhất 3 lần.
2
.4
6

P
ư
h
ơ
n
p
g
á
tu
yể
ch
ọ
n
á
ủ
g
vikh
u
n
ẩ
cóả
ă
g
p
h
n
â
ả
itb
ộ

ca
o
.
Sau 48 giờ khi các khuẩn lạc trong đĩa pettri mọc thuần khiết, tiếp tục
tiến hành cấy chấm điểm các khuẩn lạc vào môi trƣờng NAS, ủ 37 . Sau 24h,
nhỏ dung dịch thử lugol vào các khuẩn lạc để xác định hoạt tính các khuẩn lạc
có khả năng phân giải tinh bột cao. Các chủng có khả năng phân hủy tinh bột sẽ
xuất hiện vịng tan trong suốt xung quanh khuẩn lạc, phần môi trƣờng cịn lại
trên đĩa có màu xanh dƣơng. Chủng nào khơng có khả năng phân hủy tinh bột
thì xung quanh bắt màu xanh dƣơng và khơng có vịng tan trong suốt.
Lựa chọn các chủng có vịng phân giải tinh bột lớn để đem đi định danh.
2.4.7. Phương pháp định danh chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột
cao được tuyển chọn.
2.4.7.1. Định danh bằng phương pháp hình thái
 Phƣơng pháp nhuộm Gram
- Thực hiện theo phƣơng pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram.
Cách thực hiện:
- Pha lỗng dịch ni lỏng vi khuẩn bằng cách hút 1 ml dịch mẫu với 9 ml
nƣớc cất vô trùng tiến hành trong tủ cấy vơ trùng.
- Nhỏ giọt dịch pha lỗng trên phiến kính.
- Cố định tiêu bản bằng ngọn lửa đèn cồn rồi nhuộm bằng dung dịch tím kết
tinh trong 1 phút.
- Rửa bằng nƣớc cất
- Nhuộm bằng dung dịch lugol trong 1 phút.
18


- Rửa bằng nƣớc cất.
- Tẩy cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến
khi tan hết.

- Rửa bằng nƣớc cất.
- Nhuộm bổ sung uchsin trong 30 - 60 giây.
- Rửa bằng nƣớc cất, hơ trên ngọn lửa đèn cồn và quan sát dƣới kính hiển vi.
2.4.7.2. Định danh bằng phương pháp phân tử
( Các chủng nấm mốc sau khi tuyển chọn đƣợc đi định danh tại Công ty TNHH
DV & TM Nam Khoa)
Dựa vào đặc điểm hình thái (khuẩn lạc, tế bào) và đặc điểm di truyền dựa
vào trình tự 16S rDNA để định danh các chủng VK phân lập đƣợc.
Việc phân tích trình tự nucleotide của 16S rRNA đƣơc tiến hành theo các
bƣớc sau:
- Chuẩn bị mẫu cấy thuần khiết
- Tách chiết DNA để thu nhận DNA bộ gen của các chủng VK
- Đo nồng độ DNA (25 – 500 ng/phản ứng) bằng máy Biophotometer
- Lấy 5

mẫu cho vào phản ứng PCR để khuếch đại đặc hiệu đoạn DNA

dài 500 bp trên vùng gen 16S rRNA( đối với VK) bằng hệ thống máy PCR
Thermal Cycler của Bio-Rad
- Điện di sản phẩm đã tinh sạch bằng máy hệ thống máy Agilent 2100
Bioanalyzer
- PCR SIQ sản phẩm đã tinh sạch trƣớc khi giải trình tự trên hệ thống máy
ABI 3130 XL
- Phân tích kết quả bằng phần mềm Sequeccing analysis 5.3
- So với kết quả trên ngân hàng gen và ngân hàng dữ liệu NCBI (National
Basic Local Alignment Search Tool)
2.4.8. Phương pháp phân tích và xử lí số liệu
Xử lí tính tốn số liệu phân tích các thơng số ơ nhiễm nƣớc bằng phần
mềm Exel


19