ĐẶT VẤN ĐỀ
Công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học (biofuel) đã phát triển từ lâu
trên thế giới và là xu hƣớng sản xuất nhiên liệu thay thế trong tƣơng lai. Đến
nay, mặc dù cịn trên quy mơ nhỏ nhƣng Việt Nam đã bƣớc đầu thử nghiệm
thành công chiết xuất dầu diesel từ hạt cây Cọc rào (Jatropha curcas) với tỷ
lệ dầu đạt 32-37% dầu. Tuy nhiên, ở nƣớc ta Cọc rào chủ yếu đƣợc trồng
phân tán và khơng vì mục đích khai thác. Trong khi đó, nhu cầu về nguồn
nguyên liệu của cây này lại rất cao không chỉ ở trong nƣớc mà trên cả thế
giới, nên cần phải trồng Cọc rào tập trung trên quy mô lớn. Trong khi chƣa có
các biện pháp gây trồng thích hợp nhằm tiến tới trồng kinh doanh quy mô lớn.
Dù mới đƣợc đi vào nghiên cứu, khai thác và sử dụng ở Việt Nam
nhƣng có thể thấy Cọc rào là cây có giá trị sử dụng cao đặc biệt là tiềm năng
về khai thác dầu Diesel sinh học. Đây là sự thay thế nguồn nguyên liệu truyền
thống gây ô nhiễm môi trƣờng và đang ngày một cạn kiệt. Bên cạnh đó Cọc
rào là lồi rất phù hợp và có ý nghĩa trong việc cải tạo môi trƣờng đặc biệt là
tại các vùng đất đai khơ hạn, hoang hóa do khả năng sinh trƣởng tốt ngay cả ở
điều kiện bất lợi.
Tuy nhiên còn rất thiếu các nghiên cứu cơ bản về tuyển chọn, gây
trồng, phát triển, quản lý và sử dụng bền vững lồi cây đa mục đích này. Các
đánh giá ban đầu nhƣ nền tảng di truyền, mức độ đa dạng di truyền, mối quan
hệ di truyền… cây Cọc rào cũng chƣa đƣợc đánh giá đầy đủ.
Do đó, với những giá trị mà cây Cọc rào có thể đem lại trong tƣơng lai
thì việc nghiên cứu, đánh giá tính đa dạng di truyền các xuất xứ khác nhau
hiện đang đƣợc trồng ở Việt nam bằng kỹ thuật RADP sẽ là cơ sở cần thiết
cho cơng tác tuyển chọn giống có năng suất và chất lƣợng cao khi trồng trên
quy mô công nghiệp.

1


Ngày nay đã nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng để nghiên cứu sự đa

dạng di truyền của các loài sinh vật ở cấp độ phân tử. Các phƣơng pháp đó
đều dựa trên những kỹ thuật cơ bản nhƣ: chỉ thị phân tử RFLP dựa trên kỹ
thuật lai DNA; các chỉ thị phân tử RAPD, SSR, AFLP, STS dựa trên kỹ thuật
PCR. Đối với cây Cọc rào ở Việt Nam do chƣa có nhiều nghiên cứu sâu ở cấp
độ phân tử về lồi cây này nên chƣa có mồi đặc hiệu, vì vậy chỉ thị RAPD
(Đa hình các đoạn DNA nhân ngẫu nhiên – Random Amplified
Polymorphism DNA) đƣợc xem là sự lựa chọn hợp lý khi phân tích đa dạng
di truyền vì đây là kỹ thuật cho kết quả nhanh, dễ làm, ít tốn kém và đặc biệt
mồi sử dụng là mồi ngẫu nhiên.
Xuất phát từ cơ sở trên, trong khuôn khổ khóa luận này, tơi thực hiện
đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền giữa các quần thể cây mẹ Cọc rào
(Jatropha curcas) bằng kỹ thuật chỉ thị phân tử RAPD làm cơ sở cho quá
trình chọn giống”

2


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tình hình nghiên cứu về cây Cọc rào trên Thế giới và ở Việt Nam
1.1.1. Tình hình nghiên cứu Thế giới
Trong bối cảnh khủng hoảng năng lƣợng, các vấn đề ô nhiễm mơi
trƣờng tồn cầu đang ngày một gia tăng, nhiều nỗ lực đang tập trung nghiên
cứu nhằm tìm ra những năng lƣợng mới, tái tạo, sạch hơn và bền vững hơn,
để dần thay thế các nguồn năng lƣợng hóa thạch đang ngày càng bị cạn kiệt,
trong đó dầu diesel sinh học là một phƣơng án rất hiện thực và đầy tiềm năng.
Những năm gần đây, nhiều nƣớc đã đƣa ra chiến lƣợc quốc gia về phát triển
và sử dụng nhiên liệu sinh học, trong đó đã đề cập chi tiết lộ trình sử dụng
Etanol sinh học với tỷ lệ trộn khác nhau (E5, E10, E20, E30…) và Diesel sinh
học với tỷ lệ trộn B5, B10, B20, B30...khác nhau.

Trên thế giới, các nghiên cứu về cây Cọc rào khá đầy đủ. Đây là những
dữ liệu quan trọng cho việc áp dụng vào điều kiện cụ thể ở Việt Nam.
Các nghiên cứu về giá trị của cây Cọc rào trong việc cung cấp nguyên
liệu cho công nghệ sản xuất biofuel đã đƣợc thực hiện tại các nƣớc nhƣ USA,
Austria, India, Nicaragua.... Nghiên cứu về các ứng dụng dƣợc liệu của cây
Cọc rào nhƣ thành phần trong thức ăn kiêng, đặc tính chống virus, chữa mụn
cơm, làm liền sẹo, hoạt tính chống nấm, chống virus, chống HIV.
Nghiên cứu về các thành phần hóa sinh của cây và hạt Cọc rào
Jatropha curcas nhƣ hoạt tính esterase và lipase, lectin ; tính chất tẩy; hoạt
chất enzym, đồng thời cũng có nhiều cơng trình nghiên cứu độc tính, thành
phần các chất trong tinh dầu cây Cọc rào.
Nghiên cứu khả năng kháng của cây Cọc rào với các đối tƣợng gây
bệnh nhƣ ốc sên, ấu trùng sán máng . . .
3


Các kỹ thuật về nhân giống và gây trồng cây Cọc rào nhƣ ni cấy mơ,
phát sinh hình thái và tái sinh trong nuôi cấy in vitro, nhân hom, gieo hạt, mật độ
trồng.
Theo Norman Jones và Ioan H.Miller (1999) các kỹ thuật gây trồng
Cọc rào cũng đƣợc nghiên cứu khá đầy đủ, đặc biệt là ở Ấn Độ. Các nghiên
cứu chủ yếu tập trung vào kỹ thuật gây trồng, sản xuất cây giống và thu hái
hạt. Hiện nay, cây Cọc rào đƣợc gây trồng dƣới 2 hình thức phổ biến là trồng
phân tán và trồng rừng tập trung trên diện rộng. Mơ hình trồng rừng tập trung
chủ yếu phát triển ở các nƣớc Châu Phi (Cape Verde, Ivory Coast,
Madagascar) và Châu Mỹ (Brazil). Ngoài ra, Ấn Độ cũng là nƣớc đang phát
triển mạnh cây Cọc rào với diện tích trồng ƣớc chừng khoảng 3 triệu ha.
1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Tại Việt Nam, theo Quyết định số 177/2007/QĐ/TTg của Thủ tƣớng chính
phủ về phê duyệt Chƣơng trình nhiên liệu sinh học quốc gia với tầm nhìn tới

năm 2025, trong đó đã đặt mục tiêu là tới năm 2010: đáp ứng đƣợc 8% nhu cầu
sử dụng xăng dầu bằng E5 & B5 (100 nghìn tấn E5 & 50 nghìn tấn B5), đến năm
2015, đáp ứng đƣợc 20% nhu cầu bằng E5 & B5 và tới năm 2025 thì đáp ứng
đƣợc 100% nhu cầu sử dụng xăng dầu bằng E5 & B5 trên toàn lãnh thổ Việt
Nam.
Ngày 19/6/2008, Bộ trƣởng Bộ NN & PTNT đã ký Quyết định số
1842/QĐ-BNN-LN phê duyệt Đề án Quốc gia theo yêu cầu của Thủ tƣớng
chính phủ về “Nghiên cứu, phát triển và sử dụng sản phẩm cây Jatropha
(Jatropha curcas L.) ở Việt Nam giai đoạn 2008-2015 và tầm nhìn đến 2025”.
Hiện nay, Cọc rào đƣợc trồng phân tán, chủ yếu để làm rào dậu. Trong
chƣơng trình nghiên cứu của TS Lê Võ Định Tƣờng (Phân viện Hóa học và
các hợp chất thiên nhiên TP.HCM) đã tiến hành trồng thử nghiệm nhân hom
Cọc rào những giống có thể cho năng suất cao tại vùng đất thối hóa Lê Hồng
4


Phong, huyện Bắc Bình và xã Vĩnh Hảo, huyện Tuy Phong (tỉnh Bình Thuận).
Kết quả cho thấy cây lớn nhanh và sau một năm đã có thể cho quả.
Các đơn vị nhƣ UBND tỉnh Thanh Hóa, Sở Nơng nghiệp và phát triển
nông thôn Lai Châu, Sở Khoa học- Công nghệ Sơn La đã có kế hoạch cho
việc trồng thử nghiệm trồng cây Cọc rào trên các vùng đất hoang hóa của
tỉnh.
UBND huyện Đăk Hà, ngày 2- 6- 2006 đã quyết định đƣa vào trồng thử
nghiệm 5ha cây Cọc rào trên các vùng đất hoang hóa. Đề án trồng thử nghiệm
này đƣợc triển khai dƣới sự bảo trợ về mặt khoa học của Viện Sinh học nhiệt
đới.
Nhìn chung, Cọc rào là đối tƣợng mới đƣợc quan tâm gần đây xuất
phát chủ yếu từ mục đích chiết xuất dầu diesel và chế biến thuốc nên các
thông tin về gây trồng, hƣớng dẫn kỹ thuật cịn rất hạn chế. Đồng thời, có rất
ít các nghiên cứu sâu ở cấp độ phân tử về lồi cây này. Đây là trở ngại lớn cho

cơng tác tuyển chọn giống Cọc rào có phẩm chất tốt, ổn định trƣớc khi trồng
và khai thác trên quy mô công nghiệp.
1.1.3. Các đặc điểm chính về cây Cọc rào
Cây Cọc rào (Jatropha curcas) (sau đây gọi là Jatropha), thuộc họ Thầu
dầu (Euphorbiaceae), cây có nguồn gốc châu Mỹ nhƣng đã du nhập vào Việt
Nam cách đây khoảng 600 năm. Sản phẩm quan trọng nhất của Jatropha hiện
nay là dầu từ hạt rất phù hợp cho sản xuất diesel sinh học.
Cọc rào là cây bụi lớn, có chu kỳ sống lâu tới 30-40 năm, cây thƣờng
xanh, cho quả, hạt sớm, hàng năm, năng suất 7-8 tấn/ha, hàm lƣợng dầu trong
hạt tới 32- 60%; tƣơng đƣơng sản lƣợng 2000-2500 lít dầu/ha/năm, là dầu
không ăn đƣợc nên không ảnh hƣởng đến an ninh lƣơng thực.
Jatropha là lồi cây thân thiện với mơi trƣờng bởi chu kỳ sống dài (3050 năm), cộng sinh với nấm rễ mycorrhiza, nên thích nghi sinh trƣởng tốt trên
5


những lập địa cằn cỗi và cả các vùng ô nhiễm bãi thải, có tác dụng cải tạo đất,
làm sạch mơi trƣờng. Mặt khác, đây là lồi cây thƣờng xanh, chỉ cần thu hái
quả hàng năm, không phải đốn hạ cây, tạo ra thảm thực vật che phủ ổn định,
có tác dụng phòng hộ, khả năng hấp thụ CO2 cao, tiềm năng cho các dự án
CDM. Đồng thời do hàm lƣợng Nitơ cao nên đƣợc làm nguồn dinh dƣỡng cho
cây trồng.
Cọc rào cịn là lồi cây có ý nghĩa to lớn trong cải thiện đời sống cộng
đồng các vùng nông thơn khó khăn, đất đai cằn cỗi. Trồng 1 ha cây Cọc rào
Jatropha có thể mang lại thu nhập cho ngƣời dân từ 15-18 triệu đồng/năm.
Có thể đa dạng hóa sản phẩm, tăng giá trị kinh tế từ các sản phẩm phụ
nhƣ bã ép hạt phân bón hữu cơ, hoạt chất trong hạt làm thuốc trừ sâu sinh
học.
Tuy nhiên, nhiều khó khăn đang đối mặt cần phải đƣợc giải quyết để
cây Jatropha trở nên có hiệu quả hiện thực. Jatropha đang từ một “cây dại”,
chƣa phải là cây trồng mùa vụ, chƣa có nguồn giống chính thức, chƣa đƣợc

kiểm sốt, nên có nhiều nguồn hạt jatropha chất lƣợng thấp đang lƣu hành,
gây rủi ro cao cho các dự án gây trồng jatropha, đây là nguyên nhân dẫn đến
năng suất hạt và hàm lƣợng dầu béo chƣa ổn định và gây biến dị lớn do thụ
phấn chéo. Bên cạnh đó, nhìn chung hiện nay còn thiếu các biện pháp kỹ
thuật gây trồng hiệu quả, phù hợp. Mặc dù Cọc rào có thể sinh trƣởng tốt trên
đất khơ cằn, nhƣng để có hiệu quả kinh tế thì cần phải đầu tƣ.
Qua nghiên cứu và thực nghiệm trồng chăm sóc cây Cọc rào có thể
nhận thấy đây là lồi cây có rất nhiều ƣu thế. Năng suất dầu thu đƣợc trên 1ha
lớn do cây có khả năng tạo hạt có hàm lƣợng dầu cao, cây bắt đầu cho sản
lƣợng hạt cao từ năm thứ 2 trở đi.
Cọc rào cho năng suất 0,4 tấn hạt/ha trong năm đầu, tăng lên 5 tấn
hạt/ha sau 3 năm. Hạt cây Cọc rào dễ thu hái do thu hái sau mùa mƣa và do
đặc điểm cây thấp. Cho tới nay, ở Việt Nam đã tiến hành chiết suất thử
6


nghiệm và kết quả cho thấy rằng có thể chiết suất dầu diesel từ hạt cây Cọc
rào với tỷ lệ dầu đạt 32-37% dầu. Mặc dù đây mới chỉ là việc tách chiết mang
tính thử nghiệm nhƣng với những gì thu đƣợc thì đây là tín hiệu mừng cho
lĩnh vực năng lƣợng mới (năng lƣợng sinh học) trong tƣơng lai. Nhiều bộ
phận khác nhau của cây có giá trị về dƣợc liệu: vỏ cây chứa tanin, hoa hấp
dẫn ong mật và do đó cây có tiềm năng cho tạo mật ong. Hiện nay, đã có thêm
những nghiên cứu về tác dụng diệt sâu (đặc biệt đối với cây rừng) bƣớc đầu
cho kết quả rất khả quan.
Đây là lồi thích nghi với nhiều điều kiện tự nhiên: có thể trồng trên
những vùng có lƣợng mƣa thấp (500mm/năm) và có vấn đề về đất. Ở những
vùng có lƣợng mƣa cao hơn hoặc đƣợc tƣới nƣớc, năng suất đạt đƣợc cịn cao
hơn. Vì thế, có thể trồng ở hầu khắp các vùng, có thể sinh trƣởng đƣợc trên
vùng đất hoang hóa. Bên cạnh đó, Cọc rào có thể sinh trƣởng đƣợc trên các
loại đất thuộc lƣu vực sông, độ màu mỡ kém, đất thối hóa, đất bỏ hoang, đất

trống hoặc các vùng đất khác nhƣ dọc theo các kênh, đƣờng cao tốc, đất khơ
cằn và bán khơ cằn, thậm chí trên đất nhiễm mặn mà vẫn có thể sinh trƣởng
nhanh. Với những đặc điểm đó, Cọc rào có thể đƣợc trồng để cải tạo các vùng
đất thối hóa hoặc ở nhiều vùng đất có điều kiện khắc nghiệt.
Có thể tạo cây con từ hạt sau 3 tháng hoặc bằng giâm hom. Nhân hom
bằng cành dễ dàng và đạt đƣợc sự sinh trƣởng nhanh. Cây Cọc rào không làm
thức ăn cho động vật do đó sẽ tránh đƣợc sự phá hoại của chúng trong q
trình gây trồng, chăm sóc và bảo vệ.
Từ những lý do trên, phát triển trồng rừng cây Cọc rào sẽ đáp ứng đƣợc
2 yêu cầu cơ bản: cung cấp nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học
(biofuel) trên quy mô lớn, phủ xanh và cải tạo những vùng đất hoang hóa
nghèo kiệt khó khai thác. Bên cạnh đó, cây Cọc rào cịn có thể trở thanh đối
tƣợng tiềm năng cho trồng rừng theo cơ chế phát triển sạch (AR-CDM).

7


Ngồi ra, đã có những tín hiệu rất khả quan về việc tách chiết các độc tính của
lồi này sử dụng trong cơng tác phịng trừ sâu bệnh cho cây rừng.
1.2. Khái niệm đa dạng sinh học và giá trị của nó trong đời sống con
ngƣời
1.2.1 Khái niệm đa dạng sinh học
Đa dạng sinh học là sự phong phú và đa dạng về nguyên liệu di truyền,
về loài và các hệ sinh thái. Đa dạng sinh học bao gồm đa dạng nguồn gene ở
mức độ trong một loài, sự đa dạng phong phú các loài và sự phong phú về các
hệ sinh thái.
Đa dạng di truyền là tập hợp những biến đổi của các gene và các kiểu
genotype trong nội bộ của một loài. Đây là sự đa dạng quan trọng nhất, là yếu
tố quyết định đến sự tồn tại lâu dài trong tự nhiên của một lồi. Vì nó có khả
năng thích nghi với những thay đổi bất lợi của mơi trƣờng [1]. Đa dạng di

truyền có thể xác định đƣợc ở mức độ cơ thể nhƣ hàm lƣợng DNA, cấu trúc
và số lƣợng NST. Những alen khác nhau của một gene có thể ảnh hƣởng đến
sự phát triển, đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể. Bởi vậy, đa dạng di truyền đã
và đang là nguồn cung cấp nguyên liệu cho mỗi chƣơng trình chọn và cải tiến
giống trong nền nơng nghiệp. Xác định đƣợc tính đa dạng di truyền của một
loài giúp ta xác định độ gần xa giữa các giống, để tự đó có thể chọn những tổ
hợp có khả năng tạo ra con lai cho ƣu thế lai cao nhất.
1.2.2. Giá trị của đa dạng sinh học đối với đời sống con ngƣời
Đa dạng sinh học duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng, thơng qua
q trình quang hợp cây xanh đã chuyển khí CO2 thành O2 để con ngƣời và
các sinh vật hô hấp. Các cây thuốc và động vật làm thuốc truyền thống là
nguồn gốc của việc bảo vệ sức khỏe cho hơn 80% dân số thế giới.
Đa dạng sinh học là nguồn cho năng suất và tính bền vững trong nơng
nghiệp. Hàng năm, nhờ có sự đa dạng của các sinh vật cố định Nitơ đã mang
lại giá trị kinh tế khoảng 50 tỷ USD. Các giống cây trồng trong nông – nghiệp
8


vẫn cịn phụ thuộc nhiều vào các lồi hoang dại. Chúng là họ hàng của các lồi
đã đƣợc thuần hóa và đƣợc xem nhƣ là nguồn nguyên liệu di truyền cung cấp
khả năng kháng bệnh, nâng cao năng suất, cải thiện sự thích nghi với mơi
trƣờng sống.
Đa dạng sinh học giúp cho sự ổn định các hệ thống chính trị, xã hội.
Con ngƣời cần lƣơng thực, nƣớc sạch, thuốc và tài nguyên khác từ các hệ sinh
thái, nếu gây mất cân bằng sinh thái thì xã hội biến động. Bên cạnh đó, đa
dạng sinh học cịn phục vụ cho nhiều hoạt động giải trí của xã hội [2],[3].
1.3. Các loại chỉ thị phân tử dựa trên DNA
Sự ra đời của các kỹ thuật chỉ thị phân tử từ năm 1980 đã đem đến sự
tiến bộ ở tất cả các lĩnh vực của sinh học hiện đại. Sự tiến bộ của các kỹ thuật
này mở ra nhiều triển vọng có thể nắm bắt và tiến tới cải biến cũng nhƣ điều

khiển các gene quy định nhiều đặc điểm quan trọng.
Chỉ thị phân tử là các gene hoặc các đoạn DNA hệ gene. Chúng có thể
dựa trên cơ sở kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) để phát hiện các
locus đơn gene hoặc đa gene, có thể địi hỏi hoặc khơng địi hỏi trình tự, có
thể khác nhau về mức độ tin cậy, mức độ khó khăn và sự chi phí, cũng nhƣ
bản chất của sự đa hình mà chúng phát hiện. Mỗi kỹ thuật có những ƣu điểm
và nhƣợc điểm riêng.
Kỹ thuật chỉ thị phân tử cho phép nghiên cứu những biến đổi trong vật
liệu di truyền của cơ thể sống ở mức DNA. Biến đổi di truyền đƣợc nghiên
cứu trực tiếp ở mức độ DNA có thể phát hiện ra một lƣợng lớn sự đa hình tạo
ra do tỷ lệ đột biến cao và vì vậy làm cho chúng phong phú hơn so với chỉ thị
hình thái.
Một số chỉ thị DNA hiện đang đƣợc sử dụng phổ biến là chỉ thị đa hình độ
dài các đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP )
và các chỉ thị dựa vào PCR nhƣ đa hình các đoạn DNA nhân ngẫu nhiên
(Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP), mircosatellite hay còn
9


gọi là đa hình các đoạn lặp lại ngẫu nhiên (SimpleSequence Repeat – SSR), đa
hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism
– AFLP)…
1.3.1. Các loại chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật DNA
* Chỉ thị RFLP
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) – đa hình chiều
dài các đoạn cắt giới hạn.
Enzyme giới hạn là các nuclease có khả năng nhận biết những đoạn
DNA có trình tự nhận biết những đoạn DNA có trình tự nucleotide xác định,
nó sẽ bám vào đoạn DNA đó và cắt cả hai sợi của phân tử DNA vào giữa 2
nucleotid đói xứng nhau tại điểm cắt hạn chế [4].

*Giới thiệu chung về RFLP
RFLP (Tanksley và cs,1989), sau đó phƣơng pháp này đƣợc sử dụng
rộng rãi trong phân tích genome [5]. Để xác định những biến dạng của một
chuỗi DNA, ngƣời ta có thể sử dụng các RE (Restriction Enzyme) – enzyeme
cắt hạn chế, để cắt chuỗi DNA thành các phân đoạn có chiều dài khác nhau.
Số lƣợng và chiều dài các mảnh cắt thể hiện vị trí giới hạn có trên chuỗi
DNA.
Đối với phân tử DNA của lục lạp thì khi xử lý với RE, các phân đoạn
có thể đƣợc tách riêng theo kích thƣớc bởi kỹ thuật điện di trên gel agarose.
Khi nhuộm gel với ethydium bromide thì sự phân bố của các mảnh cắt DNA
trên bản gel sẽ hiện rõ dƣới ánh sáng tia cực tím.
Đối với phân tử DNA của nhân khi xử lý với RE sẽ có hàng triệu mảnh
đƣợc tạo thành với mọi kích thƣớc. Bởi vậy, khi điện di trên gel agarose và
nhuộm bằng ethydium bromide, dƣới ánh sáng tia cực tím sẽ khơng nhận ra
băng riêng biệt mà là một vệt sáng. Để xác định tính đa dạng về chiều dài các
phân đoạn ta phải sử dụng các mẫu dò đánh dấu và kỹ thuật lai DNA [4].
10


* Nguyên lý của kỹ thuật RFLP
Kỹ thuật RFLP đƣợc xây dựng dựa trên sự khác biệt tự nhiên của các
chuỗi nucleotide trong phân tử DNA và khi DNA bị cắt bởi RE thì tạo ra
những phân đoạn khác nhau về kích thƣớc hay chiều dài.
* Ưu nhược điểm của kỹ thuật RFLP
Ưu điểm:
- Chỉ thị RFLP cho thấy trực tiếp các băng đa hình DNA, thể hiện tính
chất đồng trội, giúp ta dễ nhận dạng cây dị hợp tử và cây đồng hợp tử.
- Chỉ thị RFLP có thể sử dụng mẫu DNA ở bất cứ giai đoạn nào.
- Chỉ thị RFLP không bị ảnh hƣởng của môi trƣờng đối với kiểu gene [5].
Nhược điểm:

Khi sử dụng chỉ thị này thì địi hỏi nhiều thời gian, chi phí lớn. Với
chỉ thị RFLP cần một lƣợng DNA lớn nhƣng số lƣợng đa hình thu đƣợc
khơng nhiều thậm chí ở một số lồi khơng nhận đƣợc đa hình.
* Ứng dụng của Chỉ thị RFLP
- Chỉ thị RFLP đƣợc sử dụng để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của
các sinh vật.
- Chỉ thị RFLP đƣợc sử dụng để tìm chỉ thị liên kết với những gene
quan tâm.
- Chỉ thị RFLP là công cụ tạo ra giống cây trồng siêu trội mới [4].
- Chỉ thị RFLP dùng để lập bản đồ gene cho sinh vật.
1.3.2. Các chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR
1.3.2.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR (Karry Mullis và Faloona 1987) [6] là phản ứng tổng
hợp dây chuyền nhờ enzyme DNA polymerase. Thực chất đây là phản ứng
tạo dịng in vitro nhƣng khơng cần sự hiện diện của tế bào.
11


* Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR đƣợc xây dựng dựa trên sự hoạt động của enzyme DNA
polymerase và sự có mặt của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn
DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với hai đầu của mạch khuôn và DNA
polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới, các mạch mới đƣợc hình
thành lại làm khn cho chu kỳ kế tiếp theo [7].
* Các bước tiến hành phản ứng PCR: là một chuỗi nhiều chu kỳ nối
tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn chính:
- Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính, trong dung dịch phản ứng cần có
đầy đủ các thành phần cần thiết cho tái bản DNA nhƣ: dNTP, enzyme DNA
Polymerase, Mg++, PCR buffer… Phân tử DNA đƣợc biến tính ở nhiệt độ cao
hơn Tm của DNA khuôn, nhƣng thƣờng ở 940C  950C trong khoảng 30 giây

đến 1 phút.
- Giai đoạn 2: Giai đoạn gắn mồi, nhiệt độ đƣợc hạ xuống dƣới nhiệt độ
Tm của mồi, thƣờng ở khoảng 300C  600C tùy thuộc độ lớn Tm, thời gian
từ 30 giây đến 1 phút, khi đó thì các mồi sẽ bắt cặp với khn.
- Giai đoạn 3: Giai đoạn tổng hợp (giai đoạn kéo dài), nhiệt độ tăng lên
720C, ở nhiệt độ này thì các enzyme DNA Polymerase hoạt động tốt nhất.
Enzyme thƣờng đƣợc dùng là Taq DNA Polymerase đƣợc tách chiết từ vi
khuẩn Thermocellus aquaticus trong suối nƣớc nóng. Giai đoạn này kéo dài
30 giây đến vài chục phút tùy thuộc kích thƣớc DNA khn khuếch đại.
Nhƣ vậy, sau mỗi chu kỳ thì lƣợng DNA lại đƣợc tăng gấp đôi lƣợng
mẫu của chu kỳ trƣớc.
Các giai đoạn của phản ứng PCR đƣợc sơ đồ hóa nhƣ hình 1.1.

12


Hình 1.1 Các giai đoạn của phản ứng PCR
* Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Nhìn chung tất cả các yều tố tham gia vào thành phần phản ứng PCR
đều có ảnh hƣởng nhất định tới hiệu quả đạt đƣợc của phản ứng. Tuy nhiên,
từng yếu tố lại có sự ảnh hƣởng ở các mức độ và khía cạnh khác nhau. Cụ thể:
- Khn DNA có vai trị quan trọng, ảnh hƣởng rõ rệt đến hiệu quả
phản ứng PCR. Hiệu của phản ứng PCR tỷ lệ thuận với độ tinh sạch và độ
nguyên vẹn của DNA khuôn.
- Enzyme DNA Polymerase: càng mạnh thì phản ứng PCR càng triệt để.
Tùy thuộc vào nguồn gốc tách chiết enzyme, chất lƣợng của enzyme mà hiệu quả
phản ứng PCR là khác nhau. Enzyme Th polymerase tách từ vi khuẩn Thermus
thermophilus có khả năng hoạt động nhƣ một enzyme phiên mã ngƣợc, còn
enzyme Taq Polymerase lại xúc tác cho phản ứng khuếch đại DNA.
13



- Mồi (primer) là yếu tố quan trọng nhất, quyết định hiệu quả của phản
ứng PCR. Mồi xuôi và mồi ngƣợc phải có trình tự các nucleotid khơng bổ
sung nhau mà chỉ bổ sung ở hai đầu mạch khuân. Tm của mồi xuôi và mồi
ngƣợc không đƣợc chênh lệch nhau quá lớn, nhiệt độ gắn mồi là yếu tố quan
trọng vì vậy ta cần phải tính đƣợc Tm của mồi. Tùy thuộc vào độ dài của mồi
mà ta có cơng thức tính khác nhau.
+ Nếu mồi có ít hơn 20 base thì cơng thức là:
Tm = 2.∑(A+T) + 4.∑(G+X).
+ Nếu mồi có từ 20 ÷ 35 base thì cơng thức tính là:
Tm = 22+ 1,46 ﴾2.∑(G + C) +∑(A + T))
+ Nếu mồi có chiều dài lớn hơn 35 base thì:
Tm = 81,5 + 16,6lgc+ + 0,41(%∑(G + C)) – 600/L.
Trong đó:
c+: nồng độ cation hóa trị I tính theo M.
L : chiều dài của mồi.
- Nồng độ mỗi loại nucleotid dNTP khong 20 ữ 200àM, khi nng
quỏ thp thì hiệu quả phản ứng giảm hẳn, nếu quá cao sẽ dẫn đến sự bắt cặp
nhầm các cặp base.
- Nồng độ Mg++ cũng ảnh hƣởng đến hiệu quả phản ứng PCR. [6]
- Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR: thông thƣờng số chu kỳ của phản
ứng không vƣợt qúa con số 40. Bởi vì, ở những chu kỳ từ 40 trở đi lƣợng
DNA đƣợc nhân lên không đáng kể do:
+ Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần phản ứng.
+ Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
+ Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà tự bắt cặp với
nhau [7].
14



* Ứng dụng và hạn chế của kỹ thuật PCR
- PCR đƣợc ứng dụng vào việc sản xuất mẫu dò để dùng trong các
phƣơng pháp lai phân tử.
- Sử dụng PCR để khuếch đại số lƣợng RNA thông qua kỹ thuật RT –
PCR (phiên mã ngƣợc tạo cDNA từ RNA và khuếch đại cDNA).
- Dựa vào PCR để định lƣợng, so sánh một sản phẩm thu nhận từ nhiều
nguồn khác nhau. Ngồi ra, kỹ thuật PCR cịn đƣợc ứng dụng nhiều vào các
kỹ thuật khác nhƣ: SSR, RAPD, STS, AFLP.
Tuy nhiên, kỹ thuật PCR cũng có những hạn chế nhất định nhƣ: mức
độ ngoại nhiễm cao, sự kém trung thực trong quá trình tổng hợp DNA nhờ
enzyme Taq polymerase...
1.3.2.2. Chỉ thị phân tử RAPD (đa hình các đoạn DNA nhân ngẫu
nhiên – Random Amplified Polymorphism DNA)
* Nguyên lý của kỹ thuật RAPD
RAPD (Williams và cs,1990) [8] đƣợc hình thành dựa trên phƣơng
pháp PCR. Nếu thực vật có bộ gene hồn toàn giống nhau, khi nhân bằng
PCR với các mồi ngẫu nhiên thì các đoạn DNA thu đƣợc sẽ hồn tồn giống
nhau về kích thƣớc và cấu trúc. Khi điện di trên gel thì kết quả nhân gene sẽ
thu đƣợc số băng, vạch DNA ở những vị trí giống nhau trên bản gel. Nếu bộ
gene khác nhau thì kết quả thu đƣợc trên điện di đồ là không giống nhau [4].
RAPD là kỹ thuật dựa trên PCR với một mồi đơn có trình tự ngẫu
nhiên gồm khoảng từ 5÷ 12 base, các mồi này thƣờng có hơn 60% G + C để
đạt đƣợc liên kết với mẫu đủ mạnh. Sự nhân DNA chỉ xảy ra khi vị trí mồi ở
hai tiêu điểm có sự định hƣớng ngƣợc nhau trong khoảng 2000 base dọc theo
NST. Mồi càng ngắn thì khả năng bắt cặp càng cao, càng dễ thực hiện phản
ứng RAPD – PCR, ngƣợc lại khi mồi càng dài thì khả năng bắt cặp càng khó
nhƣng tính chính xác thì cao hơn, thơng thƣờng sử dụng mồi có 10 nucleotid.
15



Do mồi sử dụng có 10 nucleotid nên xác xuất bắt cặp một đoạn nucleotide
trong genom có 10 gốc bổ trợ vào khoảng 1/410 ≈ 1/106 = 1/1000000. Nhƣ vậy
cứ khoảng một triệu gốc nucleotide sẽ có một vị trí gồm 10 nucleotid của
khn DNA có trình tự bổ sung với mồi ngẫu nhiên.
Khi chọn các cặp mồi cần lƣu ý sao cho các mồi chỉ bắt cặp vào hai đầu
của đoạn khuôn để đoạn DNA ở giữa đƣợc nhân lên. Sản phẩm PCR gồm
nhiều đoạn DNA có kích thƣớc từ <100 bp đến nhiều hơn 2 kb. Sự khác nhau
của các đoạn DNA đƣợc phát hiện khi điện di sản phẩm PCR trên gel agarose,
sau đó nhuộm ethidium bromide và soi dƣới đèn tử ngoại.
* Các bước tiến hành chính của kỹ thuật RAPD
- Tách chiết DNA tổng số, xác định nồng độ và chất lƣợng DNA.
- Nhân bội DNA bằng máy PCR với mồi ngẫu nhiên.
- Điện di trên gel agarose.
- Xác định tính đa dạng di truyền của các cây thể bằng phần mềm thông
dụng NTSYSPC. Kết quả thu đƣợc sẽ cho thấy sự gần gũi hay cách biệt di
truyền của các mẫu nghiên cứu.
* Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật RAPD
RAPD là một phƣơng pháp nhanh để phát hiện đa hình vì kỹ thuật này
khơng địi hỏi việc phân lập và đọc trình tự, có thể phát hiện nhiều locus cùng một
lúc. Đây là một kỹ thuật có giá thành thấp, đơn giản, khơng dùng lai và mẫu dị
phóng xạ nên khơng địi hỏi kỹ thuật phức tạp. Mẫu DNA khơng địi hỏi độ tinh
sạch cao nhƣ trong phản ứng PCR do đó sẽ thuận lợi cho quá trình tách chiết cũng
nhƣ tinh sạch mẫu DNA dụng cho phản ứng RAPD. Mỗi mồi cung cấp số liệu từ
nhiều vị trí trong hệ gene vì vậy những đa hình hiếm giữa các mẫu có quan hệ gần
gũi có thể đƣợc phát hiện nhanh hơn với phân tích locus đơn. Mặt khác, mồi sử
dụng là mồi ngẫu nhiên nên rất thuận lợi khi tiến hành đánh giá, phân tích đối với
những đối tƣợng mà chƣa có nhiều nghiên cứu.
16



Tuy vậy, RAPD là chỉ thị trội nên không phân biệt đƣợc cá thể đồng
hợp và dị hợp. Do mồi ngắn có thể dễ dàng bị ảnh hƣởng của điều kiện gắn
mồi nên kết quả không phải luôn thống nhất, sự nhảy cảm cao với điều kiện
phản ứng nhƣ chất lƣợng DNA, nồng độ muối, nguồn và nồng độ DNA
polymerase, nồng độ DNA và nồng độ nucleotide là những hạn chế chính của
kỹ thuật.
Bên cạnh đó là sự phát sinh đa hình giả, ảnh hƣởng lên sự thể hiện của
các đoạn RAPD do khơng chắc chắn các đoạn cùng kích thƣớc từ hai mẫu
DNA khác nhau có thực sự đƣợc tạo ra từ cùng một vị trí (cùng trình tự) trên
hệ gene hay không [9].
Tuy nhiên, kỹ thuật với mồi ngẫu nhiên có nhiều ứng dụng trong các
thí nghiệm địi hỏi một số lƣợng lớn bản sao để kiểm tra độ tin cậy.
* Một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RAPD
- Bernardo và cs,1993 đã sử dụng chỉ thì RAPD để phân tích phân tử
các dịng nấm đạo ơn đƣợc phân lập ở Philippin [10].
- Một bản đồ di truyền đƣợc thiết lập với 102 dấu phân tử RAPD trên
12 NST của cây lúa Nipponbare (Japonica) và Kasalath (Indica), (Mouna và
cs, 1944) [14].
- RAPD còn đƣợc dùng phổ biến để nghiên cứu tính đa dạng di truyền
của các lồi thực vật trên thế giới nhƣ cà phê, xoài, đu đủ, cỏ linh lăng, cần
tây và hiện nay ở Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học Việt Nam đã
nhiên cứu về nhãn, vải, chuối [12],[13],[3].
1.3.2.3. Chỉ thị phân tử AFLP (Đa hình chiều dài các đoạn cắt nhân
bội - Amplified Fragment Length Polymorphism)
* Giới thiệu về AFLP
AFLP (Vos và cs,1993) [4] gồm hai nội dung cơ bản:

17



- Cắt DNA bằng RE có bổ sung các adaptor đặc hiệu, tạo thành các
đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trƣng cho các mồi đã đƣợc chọn từ trƣớc.
- Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR với hai loại mồi khác nhau.
* Nguyên tắc kỹ thuật AFLP
Kỹ thuật AFLP đƣợc hình thành trên cơ sở nhân bội có chọn lọc những
mảnh cắt giới hạn từ DNA hệ gene.
Hai loại enzyme sử dụng trong kỹ thuật này gồm 1 enzyme cắt hiếm
(cắt 6) nhƣ: SacI, PstI và 1 enzyme cắt thƣờng (cắt 4) nhƣ: MseI, TaqI sau đó
gắn bộ thích ứng (adaptor) vào 2 đầu mảnh cắt rồi nhân bội bằng PCR.
Những đoạn cắt giới hạn sử dụng mồi đặc hiệu bổ trợ với trình tự bộ
thích ứng và trình tự giới hạn của enzyme cắt. Trình tự mồi đƣợc thêm các
nucleotide chọn lọc nhằm giảm bớt số lƣợng quá lớn các mảnh cắt.
Phát hiện đa hình DNA trên gel biến tính polyacrylamid và phóng xạ
hoặc nhuộm bạc.
* Ứng dụng của kỹ thuật AFLP
- Đây là loại chỉ thị trội đƣợc ứng dụng nhiều trong nghiên cứu đa
dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gene.
- Chỉ thị AFLP đƣợc ứng dụng trong kỹ thuật cloning, kỹ thuật finger
printing.
- Lập bản đồ gene cho các loài, tìm gene chống chịu mặn và gene vƣơn
bóng (Krish Napong,1998) [5].
1.3.2.4. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat)
SSR là kỹ thuật khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản, hay còn gọi là
phƣơng pháp vi vệ tinh.
Bộ gene Eukaryote có nhiều đoạn DNA lặp lại, các đoạn lặp DNA có
kích thƣớc dài ngắn khác nhau tùy từng loài.

18



Nguyên lý của SSR
Đây là chỉ thị dựa trên phản ứng PCR, sử dụng các mồi có trình tự bổ trợ
với hai đầu đoạn lặp lại đơn giản để khuếch đại các đoạn DNA lặp lại. Từ kết quả
thu đƣợc về độ dài các đoạn lặp DNA khác nhau, số lƣợng đoạn lặp khác nhau ta
có thể xác định mức độ đa dạng di truyền của các mẫu nghiên cứu.
Ứng dụng của chỉ thị SSR
SSR đƣợc sử dụng rất nhiều trong phân tích genom, lập bản đồ di
truyền. Sử dụng SSR để phân nhóm di truyền của lúa mùa địa phƣơng (Lang
va cs 2002). [5], xây dựng bản đồ gene rầy nâu (Lang va cs 2001) [5] .
1.3.2.5. Chỉ thị phân tử STS (Sequence Tagged Sites).
Trong nghiên cứu lập bản đồ gene ở ngƣời năm 1989 Olson và cs đã
nêu ra ý tƣởng sử dụng những vị trí đánh đấu trình tự STS [14].
Chỉ thị phân tử STS là đoạn các vị trí liên kết nằm trên các chuỗi chỉ thị
(RAPD, AFLP, RFLP) trong bản đồ phân tử đã đƣợc thiết lập. Kỹ thuật STS
đƣợc dùng để nhân các đoạn DNA xác định trên bản đồ nhờ phản ứng PCR,
với các mồi đƣợc thiết kế dựa vào trình tự đã biết nằm ở đầu các dấu phân tử
tƣơng ứng. Các đoạn mồi STS thƣờng chứa khoảng 20 nucleotid.
STS đƣợc sử dụng nhiều trong lĩnh vực chọn giống. Dựa vào các dấu
phân tử STS để tìm kiếm các gene quan tâm trong quần thể cây lai, cây đột
biến và trong phân tích nguồn gene. Ngồi ra STS cịn đƣợc dùng để phát
hiện tính đa hình và xây dựng bản đồ di truyền [14].
1.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử RAPD trong nghiên cứu đa dạng di truyền
và chọn giống cây lâm nghiệp
Ngay từ khi mới đƣợc phát hiện, chỉ thị phân tử RAPD đã đƣợc áp
dụng vào trong nghiên cứu cây lâm nghiệp với các hƣớng chính sau:
1.4.1. Đánh giá cấu trúc di truyền quần thể.
Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử là đánh giá
cấu trúc di truyền và mức độ đa dạng di truyền của quần thể. Phân tích cấu
trúc di truyền hiện tại của các loài cây rừng sẽ đƣa cho chúng ta một cái nhìn

19


tổng thể về quá trình phát triển của sự khác biệt giữa các quần thể. Các nhân
tố nhƣ quá trình chọn lọc, đột biến, phân li di truyền, tác động của con ngƣời
sẽ làm ảnh hƣởng đến sự khác biệt di truyền trong một số loài nhất định.
Chỉ thị phân tử RAPD đã đƣợc sử dụng một cách hữu dụng trong việc
nghiên cứu này. Năm 1995, Bucci và cs đã đánh giá biến dị di truyền của các
cây tại quần thể cây vân sam (Picea abies) ở Italia. Feimei và cs (2008) đã sử
dụng các chỉ thị RAPD để đánh giá mức độ đa dạng di truyền và cấu trúc 5
quần thể tự nhiên của cây Pinus tabulaeformis tại Trung Quốc.
Mức độ biến dị giữa 20 quần thể của cây Sorbus torminalis tại Úc cũng
đã đƣợc Belletii và cs. (2008) đánh giá bằng 5 chỉ thị RAPD. Kết quả cho
thấy, đa số biến dị di truyền đƣợc tùm thấy trong quần thể chiếm tỷ lệ
61.78%. Kết quả cũng cho thấy các quần thể cách xa nhau có khoảng cách di
truyền lớn và mức độ khác biệt di truyền cũng lớn.
1.4.2. Sử dụng trong bảo tồn nguồn gen cây rừng
Trong lĩnh vực bảo tồn nguồn gen cây rừng, chỉ thị RAPD cũng đã
đƣợc sử dụng để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của các loài cây quý
hiếm và đang bị đe dọa. Tại Pakistan, bằng sử dụng 20 chỉ thị RAPD, Husain
và cs (2008) đã phân loại đƣợc Cẩm lai (Dalbergia) thành 2 nhóm có mầu
xanh thẫm và mầu xanh vàng. Tại Malaysia, để đánh giá mức độ khai thác
chặt phá rừng đến giảm nguồn tài nguyên di truyền, Le và cs (2002) đã đánh
giá mức độ đa dạng di truyền của cây Ƣơi (Scaphium macropodum) tại các
rừng tự nhiên. Kết quả cho thấy, việc khai thác quá loài cây Ƣơi đã dẫn đến
xói mịn di truyền (tỷ lệ Shanon diversity giảm 31.5%). Tại Việt Nam, các chỉ
thị RAPD cũng đã đƣợc sử dụng để đánh giá mức độ quan hệ họ hàng của các
loài cây bản địa: Lim xanh (Erythrophloeum fordii Oliv.); Sở (Canellia, sp)
[15].


20


CHƢƠNG 2
MỤC TIÊU, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu chung
- Đánh giá đa dạng di truyền các quần thể cây mẹ tuyển chọn bằng kỹ
thuật chỉ thị phân tuyển tử RAPD làm cơ sở cho quá trình chọn giống.
2.1.2. Mục tiêu cụ thể
- Tách chiết DNA tổng số của các xuất xứ Cọc rào.
- Tối ƣu hóa chƣơng trình chạy RAPD sử dụng trong nghiên cứu.
- Thực hiện phản ứng PCR – RAPD với 5 mồi RAPD đã tối ƣu.
- Mã hóa số liệu từ kết quả chạy điện di sản phẩm RAPD.
- Chạy phần mềm NTSYS 2.2 với số liệu đã mã hóa để cho ra bảng hệ số
tƣơng đồng giữa các mẫu thuộc cùng xuất xứ và giữa các xuất xứ vói nhau.
Thơng qua đó có những đánh giá về quan hệ di truyền của các quần thể nghiên
cứu.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Trong khn khổ khố luận này chúng tôi đã sử dụng mẫu lá của 80 cá
thể cây Cọc rào từ 8 xuất xứ khác nhau đƣợc trình bầy trong bảng 2.1.
Bảng 2.1 Các xuất xứ Cọc rào được sử dụng trong nghiên cứu
STT
1
2
3
4
5

6
7
8

Tên mẫu
Nghệ An
Hịa Bình
Hà Tĩnh
Thái Lan
Bn Ma Thuật
Mexico
Trung Quốc
Ấn Độ

Số lƣợng cây
10
10
10
10
10
10
10
10
21

Ký hiệu
NA 1 - 10
HB 11 - 20
HT 21 - 30
TL 31 - 40

BMT 41 - 50
MXC 51 - 60
TQ 61 - 70
AĐ 71 - 80


2.2.2. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu
Các mồi sử dụng trong nghiên cứu đƣợc cho trong bảng 3.2.
Bảng 2.2 Danh sách và trình tự 5 mồi RAPD được sử dụng trong nghiên cứu
STT

Tên mồi

Trình tự mồi (5’ – 3’)

1

OPAB6

GTGGCTTGGA

2

OPAB5

CCCGAAAGCGA

3

OPAL8


GTCGCCCTCA

4

OPAK14

CTGTCATGCC

5

OPA4

AATCGGGCTG

2.2.3.Hố chất sử dụng trong nghiên cứu
2.2.3.1. Hoá chất sử dụng dể tách chiết DNA
- Dung dịch đệm chiết: (cho 12 mẫu tách)
- Đệm chiết: 25 ml
Trƣớc khi sử dụng để trong bể 65oC cho đệm chiết tan hoàn toàn, lấy
thể tích cần dùng, cho thêm PVP 3% và -MercaptoEthanol 0,3% sau đó để
lại bể 65oC đến khi sử dụng. Cụ thể thành phần đệm chiết đƣợc cho trong
bảng 2.3.
Bảng 2.3 Thành phần đệm chiết sử dụng trong tách chiết DNA
STT

Hoá chất

Nồng độ stock


Nồng độ sử dụng

Thể tích

1

CTAB (w/v)

Bột

3.5 %

1,4 g

2

NaCl

5M

1,5 M

12 ml

3

EDTA pH 8

0,5 M


25 mM

2 ml

4

Tris-HCl pH 8

1M

150 mM

6 ml

5

PVP (w/v)

Bột

3%

1,2 g

5

-MercaptoEthanol

0,3%


120 ul

Thêm nƣớc đến thể tích cuối cùng:

22

40 ml


- Dung dịch đệm CTAB (CTAB buffer) bao gồm:
+ Tris HCl 0,2M, pH = 7.
+ EDTA 0,05M, pH = 8.
+ NaCl 2M.
+ 2% (w/v) CTAB.
- Dung dịch Isopropanol.
- Ethanol 70%.
- Chloroform : isoamyl alcohol (24:1)
- Rnase (10mg/ml).
- Nƣớc cất vô trùng (Gibco).
2.2.3.2. Hoá chất chạy điện di
- Agarose.
- TBE 1X.
- Ethydium bromide 10mg/ml.
- 10X Loading buffer (cho 100ml).
+ 0.16g Bromhenol blue 40%.
+ 0.16 Xylen cyanol FF 40%.
+ 50% (vv) Glycerol.
+ Thêm nƣớc cất đến 100ml.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Thu mẫu và tách DNA tổng số của 8 quần thể Cọc rào.

- Xác định hàm lƣợng và độ sạch của DNA tổng số.
- Tối ƣu hố chƣơng trình chạy RAPD.
- Thực hiện phản ứng PCR- RAPD với 5 mồi đƣợc chọn trong các mồi
đã thử.
- Mã hóa và xử lý số liệu.
- Phân tích sản phẩm PCR- RAPD.

23


2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Kỹ thuật thu và bảo quản mẫu lá
- Mẫu nghiên cứu là lá cây Cọc rào sạch bệnh, không quá non và không
quá già (lá bánh tẻ). Tại mỗi xuất xứ lá Cọc rào đƣợc lấy ở các cây khác nhau
và ngẫu nhiên với số lƣợng 10 mẫu/1xuất xứ.
- Mẫu lá sau khi lấy về sử dụng ngay hoặc bảo quản ở nhiệt độ - 200
cho tới khi sử dụng.
2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ các mẫu lá Cọc rào
Tách DNA theo phƣơng pháp CTAB version 4 có cải tiến.
1. Cắt 0.4 g lá, loại bỏ gân lá.
2. Nghiền thành bột mịn trong cối chày sứ bằng nitơ lỏng.
3. Để mẫu nguội hồn tồn, bổ sung 3 ml đệm chiết, hịa trộn đều với bột
bằng chầy.
4. Hút 1m dịch chiết cho vào ống 2 ml bằng đầu côn 1000 ul cắt vát. Ủ ở
650C trong 45 phút.
5. Làm nguội ở nhiệt độ phịng.
6. Thêm thể tích tƣơng đƣơng của CIA và lắc đều từ 20-25 phút.
7. Ly tâm 14000 rpm trong 15 phút tại 50C.
8. Chuyển phần nổi sang ống 1.5 ml mới.
9. Lặp lại bƣớc 6 đến 8 .

10. Thêm 0.6 thể tích của Isopropanol, trộn đều và ủ ở -30oC trong 1
tiếng.
11. Ly tâm 14000 rpm trong 15 phút tại nhiệt độ phòng.
12. Loại bỏ phần nổi.
13. Rửa tủa bằng 750 ul 70% Ethanol, ly tâm 14000 rpm trong 5 phút tại
nhiệt độ phòng.
24


14. Loại bỏ dịch nổi.
15.

Làm khô tủa trong 30 -45 phút.

16.

Hòa tan DNA bằng 50 ul nƣớc tại 4oC qua đêm.

17.

Sáng hôm sau, thêm 2 ul RNnase A (10 mg/ml), ủ ở 37oC trong 1giờ.

18.

Đo nồng độ DNA và kiểm tra chất lƣợng DNA.

2.4.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ sạch của DNA
2.4.3.1. Điện di trên gel agarse
- Chuẩn bị gel:
+ Đong 40 đệm TBE 1X vào bình tam giác sau đó cân 2g agarose cho

vào bình tam giác có chứa đệm chuẩn bị ở trên.
+ Đun trong lị vi sóng cho tới khi agarose tan hết (khoảng 3 phút).
+ Để nguội đến khoảng 600C rồi thêm 3µl Ethydium bromide (nồng độ
10mg/1ml) và lắc đều.
+ Đổ dung dịch agarose vào khay đã cài lƣợc sao cho không để lại bọt
khí, gel đơng đặc sau khoảng 30 phút.
- Chạy điện di
Lấy khay gel đã chuẩn bị cho vào bể điện di, thêm dung dịch đệm TBE
1X vào cho tới khi dịch ngập bản gel, sau đó nạp mẫu DNA đã trộn vói dung
dịch Loading buffer vào các giếng trên bản gel (3µl DNA + 5µl Loading
buffer).
Chạy điện di ở hiệu điện thế 90V và 100mA trong thời gian 20 phút
(khi DNA chạy ra khỏi giếng khoảng 2 ÷ 4 cm là đƣợc, sau đó soi dƣới ánh
sáng tia UV và chụp ảnh.
- Đánh giá chất lượng DNA
Độ nguyên vẹn của DNA đƣợc xác định bằng độ nét của băng DNA
sau khi chạy điện di trên gel agarose 1%. Dƣới ánh sáng tia UV các băng
DNA đƣợc nhận biết dƣới dạng băng sáng. Nếu băng đó gọn thì DNA có chất
lƣợng tốt, khơng bị gẫy. Nếu băng đó khơng gọn và phía trên theo chiều điện
di (từ giếng đi ra) tạo thành vệt kéo dài thì DNA có chất lƣợng không tốt và bị
đứt gẫy.
25