ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
KHOA KHOA HỌC T ự NHIÊN VÀ XÃ HỘI

VŨ THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU CHỌN DÒNG TÊ BÀO CHỊU
HẠN VÀ MẶN CỦA GIỐNG LÚA VIỆT LAI 20

LUẬN VÀN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH : SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN HỌC

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: ThS. NGUYỄN THỊ HẢI YẾN

THÁI NGUYÊN - 2007


Löi cam cm

Em xin bay to long biet on säu säe tori cö giäo ThS. Nguyin Thi Hai Yen
da tän tlnh hirưng dän vä giüp dư em hộn thänh khộ luan tot nghiep nay.
Em xin chän thänh cam on cäc thäy cö trong Bo mon Sinh hoc Khoa Khoa
hoc Tu nhien vä Xä höi da giüp dö vä tao di^u kien cho em trong suot qua
trinh thuc hien khoä luän tot nghiep.
Cuöi cüng em xin gui loi cam on toi gia dinh, ban be, tap the löp Cir nhän
Sinh K l dä quan täm, dong vien em trong suöt qua trinh hoc tap vä nghien cuu
tai khoa.
Trong qua trinh thuc hien, khộ ln cüa em cư the con nhieu sai sot kinh
mong nhän duoc su döng göp y kien tü phia cäc thäy cö giäo vä cäc ban.

Sinh vien

VG Thi Dung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




MỤC LỤC
TÓM TẮT KẾT QUẢ ĐỀ T À I..............................................................................1
MỞ Đ Ầ U ...................................................................................................................2
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN c ú u ....................................4
1.1. Giới thiệu chung về cây lú a .........................................................................4
1.2. Tình hình sử dụng lúa kháng hạn và m ặn ..................................................5
1.2.1. Lúa kháng hạn và mặn trên thế g iớ i.................................................... 5
1.2.2. Lúa kháng hạn và mặn ở Việt N am .....................................................
1.3. Đại cương về tính chịu hạn, mặn của thực v ậ t..........................................

6

6

1.3.1. Đại cương vẻ tính chịu hạn của thực vật..............................................

6

1.3.1.1. Khái niệm về tính chịu h ạ n ............................................................

6


1.3.1.2. Cơ chế chịu hạn..............................................................................7
1.3.1.3. Thiệt hại do hạn gây ra.................................................................

8

1.3.2. Đại cương về tính chịu mặn của thực v ậ t......................................... 10
1.3.2.1. Khái niệm về tính chịu m ặn........................................................ 10
1.3.2.2. Cơ chế chịu mặn............................................................................11
1.3.2.3. Ảnh hưởng của m ặn..................................................................... 12
1.4. Sơ lược nuôi cấy mô tế b ào ........................................................................13
1.5. Lược sử nuôi cấy mô tế bào thực vật.........................................................14
1.6. Chọn dòng tế bào thực vật..........................................................................16
1.6.1. Cơ sở khoa h ọ c .....................................................................................16
1.6.2. Nguyên lý ch u n g ..................................................................................18
1.6.3. Phương pháp chọn d ò n g ......................................................................19
1.6Ế3.1. Chọn trực tiếp.................................................................................19
1.6.3.2. Chọn gián tiế p ............................................................................... 19
1.6.3.3. Chọn tổng th ể .................................................................................19
1

.6.3.4. Chọn lọc sau xử lý đột biến.......................................................... 20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




1.6.4. Thành tựu đạt được trong chọn dòng tế bào thực v ậ t......................20
1.6.4.1. Chọn dịng chịu khơ h ạ n ..............................................................20
1.6.4.2. Chọn dòng chịu m ặn .................................................................... 21

1.6.4.3. Các dòng chống chịu khác...........................................................21
CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨlJ......................23
2.1ẾVật liệu......................................................................................................... 23
2.2. Phương pháp................................................................................................ 23
2.2.1. Tạo mô sẹo từ hạt lúa...........................................................................24
2.2.2. Chọn dịng chịu mặn thơng qua xử lý muối N aC l...........................24
2.2.3. Chọn dịng chịu hạn thơng qua thổi khơ........................................... 24
2.3. Phuơng pháp tính tốn sơ' liệu................................................................... 24
2.3.1. Xác định tỉ lệ tạo mô sẹo ( C i):......................................................... 24
2.3.2. X ác định tỉ lệ tái sinh (Rc) ................................................................ 25
2.4. Phương pháp xử lý số liệu.........................................................................25
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................... 26
3.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố lên q trình tạo mơ sẹo.........................26
3.1.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi c ấ y ................................................. 26
3.1.2. Ảnh hưởng của các kích thích sinh trưởng....................................... 29
3.1.2.1. Ảnh hưởng của 2,4-D................................................................... 29
3.1.2.2. Ảnh hưởng của aN A A ................................................................. 31
3.1.2.3. Ảnh hưởng phối hợp giữa 2,4-D và aN A A .............................. 32
3.1. Chọn dòng tế b à o ........................................................................................ 34
3.2.1. Chọn dòng tế bào chịu m ặn................................................................ 34
3.2.2. Chọn dòng chịu hạn............................................................................. 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ N G H Ị...................................................................................39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




CHỮ VIẾT TẮT
N6


:

MS

:

2,4-D

:

2,4- Dichlorophenoxy acetic acid

aNAA

:

a- naphathalene acetic acid

BAP

:

6

cs

:

Cộng sự


NST

:

Nhiễm sắc thể

PEG

:

Polyetilenglycol

ABA

:

Acid absxixic

Chu et al, 1975
Murashise SKoog

- benzyl amino purin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Vil U n U u n x


Luan vän tot nọhiép

TÓM TẮT KẾT QUẢ ĐỂ TÀI
1. Tên đề tài: “N ghiên cứu chọn dòng tế bào chịu mặn và hạn của giông lúa
Việt Lai 20”.
2. Kết quả nghiên cứu của đề tài:
+ Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình tạo mô sẹo:
Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS là môi trường thích hợp cho tạo
mơ sẹo từ phơi hạt giống lúa Việt lai 20 hơn so với N .
6

Các chất kích thích sinh trưởng: Ảnh hưởng của các phytohormone
khác nhau lên q trình tạo mơ sẹo từ phơi hạt cũng khác nhau. Sau 5 ngày
mơi trường có 2mgA 2,4-D và 3mg/l aNAA cho tỉ lệ mô sẹo cao nhất tương
ứng 60% và 52,5%. Khi phối hợp 2,4-D và aNAA thì tỉ lệ tạo mô sẹo cao hơn
khi bổ sung riêng rẽ (đạt 72,5%).
+ Chọn dòng tế bào:
Chọn dòng chịu hạn: Thời gian thổi khơ tăng thì khả năng tái sinh của
mơ sẹo giảm. 4 giờ là ngưỡng chọn các dịng cây chịu hạn.
Chọn dòng chịu mặn: Khi nồng độ NaCl tăng thì tỷ lệ tái sinh cây
giảm. Nồng độ 1,5% NaCl là ngưỡng là để chọn dịng cây chịu mặn.

1

Sớ hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN





Vu ỊJu uunu

Luân văn tôt nehiêp

MỞ ĐẦU
I. Đặt vấn đề
Lúa là cây lương thực chính cho khoảng 2,7 tỉ người trên thế giới. Lúa
được trồng trên khoảng

1 / 1 0

diện tích đất nơng nghiệp và là nguồn năng lượng

thực phẩm lớn nhất cung cấp cho 1/2 dân số thế giới. Trong hơn 130 triệu ha
đất trồng lúa thì 39 triệu ha bị nhiễm mặn cao, 26 triệu ha bị hạn gây ảnh
hưởng xấu đến sản xuất lương thực. Ở Việt Nam, theo thống kê của Tổ chức
Lương thực thế giới (FAO), trong số 6,58 triệu ha đất trồng lúa thì 2 triệu ha
bị hạn và 1,3 triệu ha bị mặn gây thiệt hại cho năng suất, giảm từ 1 - 2 tấn/ha
[7], Do đó việc tạo cây lúa có khả năng chịu hạn và mặn chống lại điều kiện
ngoại cảnh bất lợi là rất cần thiết.
Sinh học ngày nay đã có nhiều đóng góp có giá trị cho sản xuất nơng
nghiệp đặc biệt là trên lĩnh vực tạo giống thích nghi sinh thái. Một trong
những lĩnh vực của sinh học là về tính chống chịu ở thực vật nhằm làm sáng tỏ
tác động cụ thể của các yếu tố bất lợi, đặc biệt là phản ứng liên quan đến khả
năng chống chịu. Trên cơ sở đó mà đề ra các biện pháp về giống và phương
hướng tạo giống, về kỹ thuật trồng trọt và thâm canh... nhằm hạn chế tối đa
các mặt tiêu cực của sinh thái, tăng cường tính thích nghi của giống góp phần
làm ổn định và gia tăng năng suất cây trồng.
Trước đây, các nhà chọn giống thường tạo giống lúa chịu hạn, mặn
bằng phương pháp truyền thống: chọn lọc và lai tạo nhưng phương pháp này

mất rất nhiều thời gian, tốn kém và hiệu quả không cao. Nhưng hiện nay nhờ
kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào và chọn dòng tế bào các nhà khoa học có thể tiến
hành nghiên cứu ảnh hưởng của các tác nhân bất lợi lên thực vật ở các mức độ
khác nhau như mức mô và cơ quan nuôi cấy phân lập, cây hồn chỉnh. Nhờ đó
có thể nghiên cứu một cách riêng biệt hay tổ hợp theo ý muốn các tác động
mà ngồi tự nhiên khó thực hiện. Qua đó cho phép các nhà nghiên cứu tìm

2

Sớ hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Vu t m u u n a

Luân văn tôt nehiêp

hiểu và xác định bản chất sinh học của tính chống chịu. Hệ thống tế bào và
mơ ni cấy cịn cho phép chọn tạo và thử nghiệm hàng loạt không cần trồng
trọt trên đồng ruộng kết hợp với xử lý đột biến để tìm ra các dịng tế bào và
cây có tính chống chịu thuần khiết.
Xuất phát từ những vấn đề trên mà chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài
“Nghiên cứu chọn dòng tê bào chịu mặn và hạn của giông lúa
Việt Lai 20

n. Nội dung nghiên cứu
+ Tim hiểu ảnh hưởng của một số yếu tố lên giai đoạn tạo mô sẹo của
phôi hạt:
- Ảnh hưởng của môi trường ni cấy.

- Ảnh hưởng của phytohormone.
+ Chọn dịng tế bào chịu hạn và mặn từ mô sẹo thu được.
Đề tài được thực hiện tại Phịng thí nghiệm bộ mơn Sinh học - Khoa
Khoa học Tự nhiên và Xã hội - Đại học Thái Nguyên.

3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Vũ I hi Dune

Luán văn tôt nehiêp

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN

cứu

1.1. Giới thiệu chung về cây lúa
Cây lúa thuộc họ Hịa thảo, là lồi thực vật sống một nãm, có thể cao
hơn vói các lá bản mỏng, hẹp bản (2-2,5cm) và dài (50-100cm). Các hoa nhỏ,
thụ phấn nhờ gió, mọc thành cụm nhỏ, phân nhánh cong hay rủ xuống. Hạt
dài là loại quả thóc. Cây lúa thuộc chi Oryza với nhiều loài khác nhau. Trong
số 23 loài đã được phân loại chỉ có hai lồi là o . glaberrima Sreud. và
O. sativa L. là được trồng. Loài o . glaberrima được trồng chủ yếu ở một số
nước miền Tây Châu Phi. Loài o . sativa L. được trồng khắp thế giới. Nhưng
phần lớn tập trung ở Châu Á và được chia thành 3 lồi phụ: Indica, Japónica

váJavanica [21].
Lồi lúa trồng Oryza sativa L. được thuần hóa từ lúa dại. Tổ tiên của
các loại lúa trồng hiện nay là loài lúa dại Oryza fatua, Oryza zaofciracis,
Oryza minuta. Các nhà khoa học đã đi đến thống nhất là nguồn gốc cày lúa ở
Đơng Nam Châu Á vì đây là vùng có diện tích lúa tập trung lớn nhất thế giới
[1]. Ngày nay, lúa Indica chiếm tới 80% các giống lúa trồng trên thế giới. Lúa
Japónica được trồng chủ yếu ở các nước ơn đới và cận nhiệt đới cịn lúa
Javanica chỉ được trồng ở một vài vùng của Indonesia.
Lúa O. sativa L. có số NST đơn bội n = 12. Đa số các lồi lúa dại và
lúa trồng hiện nay có bộ gene ở trạng thái lưỡng bội và là cây tự thụ phấn ít
khi thụ phấn chéo. Theo GS.Khush (1997) [20], Trên thế giới có khoảng 120
giống lúa được trồng. Từ năm 1960, Viện nghiên cứu lúa quốc tế đã nghiên
cứu, cải tiến những giống lúa tốt, có hạt dẻo ngon và đã phổ biến được khoảng
70% diện tích trồng lúa trên thế giới. Theo thống kê có 15 nước trên thế giới

4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Vu I til Uunu

Ln văn tơt nehiêp

trồng lúa vói diện tích trên 1 triệu ha, trong đó có 13 nước ở Châu Á. Riêng
Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa và 50% sản
lượng lúa tồn cầu. Bangladesh, Indonesia và Thái Lan mỗi nước đều có diện
tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của cả các nước Mỹ La Tinh.

Châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng diện tích trồng lúa của Việt Nam
nhưng sản lượng lúa lại thấp hơn Việt Nam từ hai đến ba lần [12],
Việt Nam có 80% dân số sống bằng nghề nông nghiệp. Lúa không những
cung cấp lương thực cho toàn bộ dân số trong nước mà còn mang lại hiệu quả
kinh tế cao do xuất khẩu gạo ra thị trường quốc tế. Năng suất lúa ở Việt Nam
đạt 20,473 triệu tấn năm 2000, năm 2001 đạt 20,627 triệu tấn và năm 2003 đạt
34 triệu tấn [12].Trong tiến trình cơng nghiệp hóa, hiện đại hóa ở nước ta hiện
nay cải thiện năng suất, chất lượng lúa gạo là một trong những yêu cầu cấp
bách đặt ra.
1.2ệ Tình hình sử dụng lúa kháng hạn và mặn
1.2.1. Lúa kháng hạn và mặn trên th ế giới
Nhu cầu sản xuất giống lúa chống chịu hạn, mặn có từ lâu và các biện
pháp làm tăng tính chịu hạn và mặn đã được thực hiện ở nhiều nước [19]. Năm
1980, Epstein đã mô tả tập hợp một số vấn đề về sinh lý và kỹ thuật liên quan
đến tính chịu mặn. Khả năng chịu mặn rất khác nhau ở các sinh vật đã được
biết. Từ những năm 1930 và những năm đầu thế kỷ 18 người ta đã chọn lọc ra
giống có khả năng chống chịu mặn ở lúa và lúa mạch [ ],[ 15],[ 16].
2

Mặc dù có những phát hiện sớm như vậy nhưng mãi đến năm 1993
Flower và Yeo mới xem xét nghiên cứu và tổng kết có dưới 30 giống có khả
năng chống chịu mặn. Đến năm 1993 mới chỉ có 3 giống kháng mận được
đăng ký. Một giống chịu mặn được đăng ký tại Mỹ và một phương pháp tăng
tính kháng mặn ở ngũ cốc nhờ kết hợp với protein ở phôi hạt [7],[11],[ 13],
[14],[18],[23].

5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN





Vu íh iU u n e

Luán văn tốt nghiên

1.2.2. Lúa kháng hạn và mặn ở Việt Nam
Hiện nay, ở Việt Nam mới chỉ sử dụng các giống lúa có khả năng chịu
hạn và mặn được chọn lựa, thu thập từ các giống lúa địa phương theo phương
pháp truyền thống như các giống Cườm có tính chịu mặn, Lốc có tính chịu
hạn. Một số giống khác được trồng rải rác ở các địa phương có vùng địa lý đặc
trưng hạn và mặn khác nhau nhưng chưa có quy hoạch đồng nhất và các giống
địa phương này được trồng trên diện tích đất còn hạn chế. Hơn nữa, các giống
địa phương này khơng thích ứng với những vùng sinh thái khác nhau do đặc
trưng và phản ứng quang chu kì của mỗi giống là khác nhau. Ngoài ra, một số
giống được chọn tạo bởi các cơ quan, Viện nghiên cứu Nông nghiệp đưa vào
sản xuất chưa có hiệu quả đáp ứng cao với thực tế. Thường các giống chống
chịu này có năng suất thấp, chất lượng lúa không tập trung được những đặc
tính quý như năng suất cao, hạt dẻo, thơm ngon và chống chịu được với sâu
bệnh cỏ dại [17]ế
l ễ3. Đại cương về tính chịu hạn, mặn của thực vật
1.3.1. Đại cương vê tính chịu hạn của thực vật
13.1.1. Khái niệm về tính chịu hạn
Bất cứ loại cây trồng nào cũng cần có nước để duy trì sự sống. Mức độ
cần nhiều hay ít nước là tùy thuộc vào từng loại cây trồng và từng giai đoạn
phát triển của chúng. Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu
nước của thực vật do môi trường gây nên trong suốt cả quá trình hay trong
từng giai đoạn làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển. Mức độ tổn
thương của cây trồng do khô hạn gây ra có nhiều mức khác nhau: chết, chậm

phát triển. Cây cho năng suất tương đối ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là
cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do
thiếu hụt nước gây ra gọi là tính chịu hạn [3],

6

Sớ hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Vu im Uunu

Luán văn tốt nehiêp

Tuy nhiên, khó có thể xác định được thế nào là một trạng thái hạn đặc
trưng vì mức độ hạn do mơi trường gây nên khác nhau theo từng mùa, từng
năm, từng vùng địa lý và khơng thể dự đốn trước được [3].
1.3.1.2. Cơ ch ế chịu hạn
Về khả năng chịu hạn của cây trồng có hai cơ chế chính được thảo luận
tới nhiều:
Vai trị của bộ rễ: Bộ rễ có hình thái khỏe, mập, dài, có sức xuyên sâu
giúp cho cây hút được nước ở những vùng sâu, vùng xa. Sự phát triển của
những nhánh rẽ phụ hoặc sự gia tăng chiều dài bộ rẽ ảnh hưởng nhiều đến khả
năng đẻ nhánh của lúa trong điều kiện khô hạn. Khả năng thu nhận nước và
cung cấp đủ nước thông qua rễ tới các bộ phận của cây trong điều kiện khó
khăn về nước được coi là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tính chịu hạn [7],
Hình thái và chức nàng của bộ rễ thường liên quan nhiều đến khả nãng chịu
hạn của cây trồng trong đó có các giống lúa cạn [ ].
1


Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu: Khả năng điều chỉnh áp suất
thẩm thấu của tế bào thực vật, đặc biệt là những tế bào có liên quan trực tiếp
đến khả năng cạnh tranh nước giữa tế bào rễ cây và đất. Trong điều kiện hạn,
áp suất thẩm thấu được điều chỉnh tăng lên giúp cho tế bào rễ thu nhận được
những phân tử nước ít ỏi có trong đất. Bằng cơ chế như vậy thực vật có thể
vượt qua được tình trạng hạn cục bộ. Đối với những giống lúa nước tính chịu
hạn cục bộ có ý nghĩa quan trọng cho những vùng chưa chủ động được tưới
tiêu.
Có khá nhiều nghiên cứu tập trung tìm hiểu cơ chế của tính chịu hạn.
Trong đó khơng ít nghiên cứu đề cập đến vai trò của ABA và của prolin đối
với khả năng chịu hạn của thực vật nói chung và cây trồng nói riêng. ABA
giúp mơ tăng khả năng chống chịu mất nước do làm khô, do muối hoặc do
lạnh gây ra. Nhìn chung, khi tế bào bị mất nước dần dần, trong tế bào chất
nhằm chống lại việc giảm tiềm năng nước và tăng khả năng giữ nước của

7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Vũ I til Uune

Luân văn tỗt nehiêp

nguyên sinh chất bằng cách tích lũy các chất hịa tan. Các chất hịa tan có liên
quan bao gồm: các loại đường, các acid hữu cơ, các loại chất hòa tan hữu cơ,
các loại acid amin, các loại rượu đa chức hay các ion (chủ yếu là K+). Hầu hết

các chất hòa tan hữu cơ có tác dụng điều chỉnh áp suất thẩm thấu được sinh ra
ngay trong q trình đồng hóa và trao đổi chất [3].
Trong tự nhiên khi phôi phát triển đến giai đoạn hạt chín thường chuyển
sang trạng thái ngủ, lượng nước trong tế bào phơi và trong hạt giảm tói mức
tối thiểu, đây là trạng thái thiếu nước sinh lý. Có khá nhiều gene tham gia vào
bảo vệ phơi ở trạng thái thiếu nước sinh lý. Như nhóm gene LEA (late
embryogene abundant protein) tạo ra hàng loạt protein trong giai đoạn phơi
muộn của q trình hình thành phơi, v ề vai trò sinh học của các protein này
bước đầu đã được nêu ra là các gene dehydrin (DH) có khả năng bảo vệ tế bào
chất khi bị mất nước [ ],
1

Ngoài ra màng cuticula (cấu trúc bao gồm sáp và các phân tử cutin)
cũng tham gia bảo vệ cho tế bào bên trong của thực vật không bị mất nước.
Lớp sáp vỏ ngồi cùng (epicuticular war) có vai trị làm giảm sự thoát hơi
nước qua màng cutin giúp cây trồng cân bằng được nước trong điều kiện khô
hạn. Sự thay đổi của lớp vỏ sáp là do kiểu gene và môi trường quyết định.
Trong các loại cây đã nghiên cứu thì lớp vỏ sáp ở lúa mỳ là có hiệu quả cao
nhất [3].
13.1.3. Thiệt hại do hạn gây ra
Nước là yếu tố giới hạn đối với cây trồng, nước vừa là sản phẩm khởi
đầu, trung gian và cuối cùng của các q trình chuyển hóa sinh hóa, vừa là
mơi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra, vì vậy việc cung cấp đủ nước
cho cây trồng canh tác và hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây
trồng là mục tiêu tạo giống thường xuyên được quan tâm.
Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì ảnh hưởng càng xấu đến quá trình
sinh trưởng và phát triển của cây. Thiếu hụt nước nhẹ thì giảm tốc độ sinh

Sớ hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN





u 1 tu Liunk

Luánvăn tôt nehiêp

trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm
tăng cường q trình hóa già tế bào. Khi bị khô hạn kiệt nước nguyên sinh
chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào mô bị tổn thương và chết. Ngồi ra nước
cịn tham gia cấu tạo nên chất nguyên sinh (tạo thành màng nước thủy hóa
xung quanh keo nguyên sinh) và tham gia điều hòa thân nhiệt tăng cường khả
năng chống chịu cho cơ thể thực vật [3].
Đối với cây trồng nói riêng và thực vật nói chung, hạn ảnh hưởng nhiều
nhất tới

2

giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây đó là: giai đoạn cây non

và giai đoạn ra hoa. Trên thế giới có khoảng 40 - 60% diện tích đất trồng bị
hạn, trong đó 35% diện tích bị khơ hạn và nửa khơ hạn, 25% bị khơ hạn trong
thời gian khác nhau.
Nước ta có địa hình đa dạng và diễn biến phức tạp, lượng mưa phân bố
khơng đều giữa các vùng và các thời kì trong năm nên hạn hán có thể xảy ra
trong bất kì vùng nào, mùa nào. 4/5 lãnh thổ là đồi núi, đất canh tác của khu
vực này thường xuyên bị đe dọa. Trong điều kiện như vậy nên thành phần thổ
nhưỡng của các khu vực này rất khác nhau. Các yếu tố đó chi phối mạnh mẽ
mực nước ngầm và khả năng giữ nước của đất. Theo ước tính ở nước ta, năng
suất lúa bị thiệt hại do hạn hán là đáng kể: Diện tích lúa bị hạn hàng năm lên

tới 0,4 triệu ha; riêng năm 1989, năm 1990 sản lượng lúa của đồng bằng sông
Hồng giảm 20 - 28% so với mức trung bình, chủ yếu là do hạn hán [3], Hay
các năm 1998, 1999 ở Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị năng suất đã bị giảm tới
4/5 ở những diện tích bị hạn trong giai đoạn lúa làm địng. Vụ đông xuân
2003, hàng ngàn ha lúa của các tỉnh miền Trung và Tây nguyên bị khô cháy
không cho thu hoạch. Các diện tích lúa trồng cạn năng suất trung bình đạt
5-7 tạ/ ha. Người ta cho rằng, khơ hạn là một trong những hạn chế chủ yếu để
mở rộng diện tích trồng lúa ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam.
Để nâng cao và ổn định sản lượng lúa trong điều kiện khô hạn, việc nghiên
cứu chọn tạo các giống lúa có khả năng chịu hạn và có đặc tính chống chịu

9

Sớ hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Vu I m uuna

Luân văn tôt nehiép

khác (phèn, mặn, lạnh...) đã trở thành một trong những nội dung quan trọng
của các chương trình nghiên cứu tạo giống lúa trên thế giới và Việt Nam [3].
1.3.2. Đại cương vê' tính chịu mặn của thực vật
13.2.1. Khái niệm về tính chịu mặn
Nước biển chứa 3 - 4% muối. Biển và đại dương chiếm 75% bề mặt
hành tinh chúng ta, 25% diện tích đất bị nhiễm mặn. Hiện nay, có khoảng 230
triệu ha đất nhiễm mặn. Riêng ở Đơng Nam Á ước tính có khoảng 54 triệu ha
bị nhiễm mặn và 27 triệu ha đất có tiềm năng trồng lúa ở vùng nhiệt đới Châu

Á khơng thể canh tác vì bị nhiễm mặn. Việt Nam là một nước có bình qn
diện tích đất canh tác trên đầu người vào loại thấp nhất thế giới: 0,14 ha
đất/ người ở nông thôn, ở đồng bằng sơng Hồng con số này chỉ cịn 0,06 ha
đất/ người. Bên cạnh tính chất khan hiếm đất cịn chất lượng kém. Ngoại trừ
đất ở vùng châu thổ sông Hồng và sông cửu Long, đất đai ở hầu hết các khu
vực khác đều có chất lượng kém. Đa số đất feralit đỏ vàng ở trung du và miền
núi chứa nhiều Al3+, Fe3+ vùng phù sa cổ thì bị bạc màu khoảng 3 triệu ha đất
đai châu thổ các sông bị nhiễm mặn, kiềm hóa và ngập lụt. Chính vì thế việc
nghiên cứu khả năng chịu mặn ở lúa và một số cây trồng khác có ý nghĩa thực
tiễn đặc biệt quan trọng đối với sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam, khơng
những tăng năng suất ở vùng nhiễm mặn mà cịn có thể mở rộng diện tích
canh tác sang những vùng lâu nay vẫn bị bỏ hoang vì nhiễm mặn [3].
Thực vật thích nghi sống được trong những đất thừa muối gọi là
galofyte (thực vật chịu muối). Do chữ galos - muối, phyton - thực vật,
galofyte tự bảo vệ khỏi nồng độ muối cao bằng 3 biện pháp chủ yếu :
1. Hút lượng muối và tập trung chúng vào dịch không bào dẫn đến tăng áp
suất thẩm thấu.
2. Thải muối đã hấp thụ ra khỏi tế bào cùng với nước nhờ các tuyến muối
chuyên hóa và loại bỏ lượng muối dư thừa cùng với lá rụng. Một trong

10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Vli I ni uuna

Luán văn tô t n eh iê p


SỐ các biến dạng của biện pháp đó là tập trung muối đã hấp thụ được
vào không bào của các tế bào đầu, cuối của các lơng hút chun hóa
sau đó rụng đi.
3. Các tế bào rễ hạn chế sự hút muối [4].
1.3.2.2. Cơ c h ế chịu mặn
Những nghiên cứu về tác động của muối lên sinh trưởng và phát triển
của cây trồng như lúa mạch, tế bào cam nuôi cấy, về trao đổi ion ở lúa cho
thấy cây trồng có khả năng thích ứng trong một giới hạn nhất định với tác
động của muối trong môi truờng đất và nước. Tuy nhiên mức độ đó rất phụ
thuộc vào kiểu gene của đối tuợng nghiên cứu [ ],
1

v ể khả năng chịu mặn của thực vật, trước hết nói đến cơ chế tích lũy và
duy trì nồng độ cao các chất hòa tan trong tế bào nhằm đảm bảo sức cạnh
tranh với nước, với môi trường nhiễm muối và chống lại hiện tượng hạn sinh
lý. Một số tác giả cho rằng khi bị nhiễm mặn thực vật thường hạn chế khả
năng thẩm thấu nước của màng tế bào khiến cho nước khơng dễ dàng thẩm
thấu ra.
ở các lồi thực vật sống thường xuyên trên nền đất nhiễm mặn
(chịu mặn) khả năng thu nhận và tích tụ Na+ và c r cao hơn nhiều so với thực
vật không chịu mặn. Đây là cơ chế chính chịu mặn trong thế giới cây cỏ có
khả nâng sống trên đất nhiễm mận [3].
Người ta đã tìm thấy các protein lạ sau khi cây bị xử lý muối, PEG hoặc
KC1. Các protein nhóm này cũng đã được tìm thấy trong tế bào thuốc lá nuôi
cấy, cà chua, đậu xanh và cây đinh lăng sau khi xử muối. Hoạt động của một
số enzyme như polyphenoloxydase và catalase tăng lên ở hạt lúa nảy mầm
trong điều kiện mận.
Betain và glycinbetain là sắc tố nội bào khi bổ sung từ bên ngồi vào
cũng có tác dụng làm tăng tính chịu mặn.


11

Sớ hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




^Il I m uuna

Luân văn tốt nehiêp

Mối liên quan giữa ABA, tính chịu mặn và sự tổng hợp các protein đặc
biệt là điểm mấu chốt khởi đầu cho những nghiên cứu sâu hơn, vì nó liên hệ
giữa stress của mơi trường bên ngoài với những đặc điểm sinh lý và phân tử
bên trong tế bào. Những nghiên cứu về sau vói những kỹ thuật phân tử có
được đã liên kết nhanh chóng các sự kiện này để xác định các vùng NST đặc
biệt của gene liên quan đến sự vận chuyển các ion [ ].
1

Nhiều cơng trình đã thơng báo rằng hàm lượng prolin đã tăng trong các
dòng chịu mặn. Vai trò của prolin đối với khả năng chịu mặn của thực vật
trước hết được nghiên cứu khía cạnh tích lũy khi cây gặp mặn. Việc bổ sung
prolin

ngoại

sinh

và


glycinebetain

vào

môi

trường

nuôi

cấy

Hordeum vugare L. đã làm tăng chiều dài chồi dưới tác dụng của NaCl. Các
đột biến sản xuất prolin nhiều hơn bình thường thì có thể chịu mặn tốt hơn.
Bên cạnh đó người ta thấy những cây chịu mặn tốt cịn có những đặc tính
riêng. Đó là khả năng tăng hàm lượng acid hữu cơ khá lớn trong điều kiện đất
mặn, ở một số cây lượng acid hữu cơ có thể đạt tới 25% trọng lượng chất khô
của cơ thể, các acid hữu cơ này có tác dụng bảo vệ cơ thể bằng cách nó liên
kết với ammoniac hạn chế độc cho cây [ ],
1

Về mặt hoạt động sinh lý, người ta thấy thơng thường các q trình
quang hợp, hơ hấp trao đổi chất ở những cây chịu mặn thấp hơn so với những
cây kém chịu mặn. Song nó tương đối điều hịa khi hàm lượng muối cao [3].
1.3.2.3. Ảnh hưởng của mặn
Ở thực vật không chịu mặn tế bào nhạy cảm với muối bị chết trong
dung dịch chứa 1 - 1,5% NaCl, còn cây chịu mặn được nồng độ muối lớn hơn
hoặc bằng %. Lúa là loại cây rất nhạy cảm với mặn. Thừa muối trong đất làm
6


cho cây không chịu mặn bị chết, đặc biệt là cây bị mặn vào pha sinh trưởng
mạnh và ra hoa. Mặn gây hại trước hết là ức chế pha sinh trướng kéo dài của
tế bào và ở mức ít hơn với pha phân chia. Thừa muối phá hoại sự trao đổi nitơ
làm tăng tích lũy các sản phẩm phân giải trung gian đặc biệt là các acid amin

12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Vu Llíi uuna

Ln văn tơt nehiêp

và NH3. Những hợp chất này có thể gây hại nặng đối với cây. Mặn phá hoại sự
cân bằng hấp thu Na, K, Mg. Hấp thụ nhiều Na làm giảm sự thâm nhập của K
và Mg vào tế bào. Mặn cản trở sự thâm nhập nước vào cây, trên nền mặn
sunfat tích lũy nhiều sản phẩm của q trình oxy hóa các acid amin chứa lưu
huỳnh, chúng là các chất độc cho cây.
Mặn làm cho tăng nồng độ các muối Clo là tác nhàn ngăn cách q
trình oxy hóa và photphoryl hóa. Điều đó làm giảm khả nãng cung cấp năng
lượng cho cây. Mặn phá hủy cấu trúc tế bào đặc biệt là lục lạp. Ở điều kiện
mặn, tính thấm chọn lọc của tế bào bị hư hại. Trong các cơ quan của cây hệ rễ
bị mặn gây hại mạnh nhất, các tế bào của hệ mạch dãn trong thân cũng bị mặn
gây tổn thương mạnh [3].
1.4. Sơ lược ni cấy mó tê bào
Mọi cơ thể sinh vật đều gồm nhiều đơn vị cơ bản là tế bào và các tế bào

đã phân hóa đều mang trong đó một lượng thơng tin di truyền đủ để mã hóa
cho việc hình thành nên một cơ thể mới. Cũng chính vì vậy việc ứng dụng
cơng nghệ này trong thực tiễn rất đa dạng và phong phú. Nuôi cấy mô, tế bào,
dung hợp tế bào trần, kỹ thuật AD N,... Nhằm tạo giống mới, giống sạch bệnh,
tạo các dịng chống chịu với điều kiện mơi trường và đặc biệt là trong lĩnh vực
nuôi cấy mô tế bào in vitro trong việc chọn giống và nhân giống vơ tính cây
trồng. Các tế bào được nuôi trong môi trường nhân tạo ở điều kiện thích hợp,
dưới tác dụng của các phytohormone chúng có thể phân hóa, xảy ra q trình
phát sinh phơi vơ tính, phát sinh cơ quan và hình thành nên cơ thể mới [

1 0

].

Với kỹ thuật nhân giống bằng ni cấy mơ có thể tạo ra một quần thể
cây trồng đồng đều, giữ nguyên đặc tính của cây mẹ, có hệ sơ' nhân giống cao,
sớm cho hiệu quả kinh tế cao khơng tốn diện tích nhân giống,... Phương pháp
này tỏ ra ưu việt với các loài cây khó nhàn giống bằng con đường hữu tính,
cũng như với các cây quý hiếm, có lượng giống ban đầu hạn chế, nhưng lại
yêu cầu nhân nhanh [

1 0

].

13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN





Vu im uuna

Ln văn tơt nehiêp

Hiện nay đã có rất nhiều giống cây trồng mới được tạo ra nhờ nuôi cấy
mơ, tế bào có năng suất cao phẩm chất tốt vượt xa các giống ban đầu. Công
nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã mở ra một hướng đi mới cho các nhà di
truyền học, hóa sinh học, vi sinh vật học và sinh lý thực vật.
1.5ề Lược sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1938, hai nhà sinh vật học người Đức là Schleiden và Schwann đã
để xướng thuyết tế bào và nhấn mạnh: Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều được
cấu tạo từ nhiều tế bào. Các tế bào đã phân hóa đều mang thơng tin có trong tế
bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, nó là những đơn vị độc lập từ đó có
thể xây dựng lại tồn bộ tế bào [9].
Gotieb Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng
đầu tiên cho ni cấy mơ tế bào thực vật. Ơng đưa ra giả thiết về tính tồn
năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách
rời”. Theo ông mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang tồn
bộ thơng tin di truyền của cơ thể đó và có khả năng phát triển thành cơ thể
hồn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Nhưng ông đã gặp thất bại trong ni
cấy các tế bào đã phân hóa tách từ lá một số cây một lá mầm như:
Erythromum, Ornithogalum, Tradescantia.
Năm 1922, Kotte học trò của Haberlandt và Robbins (Mỹ) đã lập lại
thực nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hịa
thảo. Trong mơi trường lỏng gồm có muối khống và glucose, đầu rễ sinh
trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh
trưởng như vậy chỉ tồn tại một thời gian sau đó chậm dần và ngừng lại [9].
Năm 1934, White (Mỹ) nuôi cấy thành công trong một thời gian dài

đầu rễ cà chua (Lycopersycum esculentum) với thiamin (vitamine Bl),
piridoxin (vitamine B ) và nicotinacid. Từ đó việc ni cấy đầu rễ trong thời
6

gian vơ hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau với một mơi trường lỏng
chứa muối khống glucose và dịch chiết nấm men. Sau đó ít lâu, White chứng

14

Sớ hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Vu n u uuna

Ln văn tơt nehiêp

minh là có thể thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamine
nhóm B.
Went và Thirmann phát hiện chất sinh trưởng thực vật đầu tiên: acid a
indolaxetic (IAA) và Gautheret xác nhận tác dụng kích thích sinh trưởng mơ
sẹo của IAA và ba nhóm vitamine do White đề nghị.
Năm 1941, Overbeck (Mỹ) đã chứng minh tác dụng kích thích sinh
trưởng của nước dừa trong nuôi cấy cây họ cà {Datura). Steward và Miles
(1952) cũng xác nhận tầm quan trọng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo và
phát sinh phôi ở cà rốt. Trong thời gian này nhiều chất kích thích sinh trưởng
thuộc nhóm auxin được nghiên cứu và tổng hợp thành công: aNAA,
2,4-D ... Nhiều nhà nghiên cứu nhận thấy cùng với nước dừa, aNAA và 2,4-D
đã giúp tạo mô sẹo thành công ở nhiều đối tượng mà truớc đây khó ni cấy.

Năm 1954, Skoog (Mỹ) đã tình cờ thấy nếu thêm một ít chế phẩm đã để
lâu của acid deoxyribonucleic lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường ni cấy
các mảnh mơ thân cây thuốc lá thì tác dụng kích thích sinh trưởng trở nên rõ
rệt. Sau này chất này được xác nhận là kinetin. Việc phát hiện ra vai trò của
IAA, aNAA, 2,4-D và kinetin cùng với việc phát hiện vai trò của các vitamine
và nước dừa là những bước tiến rất quan trọng trong lịch sử nuôi cấy mô thực
vật, là tiền đề kĩ thuật cho việc xây dựng các môi trường xác định bề mặt hóa
học và cho việc làm các thí nghiệm ổn định [9].
Năm 1957, Skoog mà Miller công bô' các kết quả nghiên cứu về ảnh
hưởng của tỉ lệ kinetin/auxin trong môi trường ni cấy đối với sự hình thành
cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm thấp tỉ lệ kinetin/auxin mơ sẹo có
khuynh hướng phát triển rễ, ngược lại nếu tỉ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến
khuynh hướng tạo chồi ở mơ sẹo. Hiện tượng này góp phần điều khiển sinh
trưởng và phát sinh cơ quan của mô tế bào ni cấy.
Năm 1960, Bergman cơng bơ' có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để
thu được một huyền phù không có các tế bào kết cụm mà gồm hầu hết các tế

15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Vu I Hl Duna

Luán vãn tôt nehiẻp

bào đơn. Các tế bào đơn có thể gieo trên mơi trường trong các hộp lồng tiếp
tục sống, phân chia và tái tạo lại mô sẹo [9].

Cùng với lã thuật gieo tế bào của Bergman nhiều tác giả khác đã thành
công trong việc tạo được cây hoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh một cách
tốt đẹp tính tồn năng của tế bào thực vật.
Việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống được
Nozeman nâng lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của các chồi
nách cây nho và cây khoai tây đem nuôi cấy và cấy truyền nhiều lần trong ống
nghiệm.
Các nghiên cứu vể protoplast thực vật đầu tiên được bắt đầu bởi những
cơng trình của Cooking (1960). Tác giả đã dùng enzyme để tách bỏ màng
cellulose của tế bào nhu mô mảnh lá và thu được một tế bào trần gọi là
protoplast.
Năm 1972, Karson đã thành cơng trong việc lai vơ tính hai lồi thuốc lá
Nicotiana glance và Nicotiana langsdorffii với số NST là 24 và 18. Họ đã
nhận được cây lai vói số NST là 42 và có những tính trạng hồn tồn giống
cây lai hữu tính. Cịn vể mặt hình thái thì cây lai này nằm giữa cây bơ' và cây
mẹ. Cơng trình này đã thúc đẩy mạnh mẽ công tác nghiên cứu tế bào soma và
protoplast thực vật. Năm 1974, Melchers và Labbit đã thành cơng trong việc
lai vơ tính protoplast tách từ bao phấn [

1 0

].

Đó là một số mốc chính của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Ngày nay đã có rất nhiều quy trình nghiên cứu hồn thiện cho các giống cây
trồng khác nhau. Nó đã được ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn chọn tạo giống
thực vật.
l ẻ6. Chọn dòng tế bào thực vật
1.6.1. C ơ sở khoa học
Cơ sở khoa học đầu tiên của chọn dòng tế bào thực vật là tế bào thực vật

mang tính tồn năng. Đây là một vấn đề quan trọng trong chọn dịng và đến

16

Sớ hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Vu I ni u una

Luân văn tôt nehièp

nay danh sách các lồi đã tái sinh thành cây từ mơ hoặc tế bào nuôi cấy
in vitro ngày một tăng. Tuy nhiên mỗi lồi có khả năng tái sinh khác nhau.
Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số
lượng các tế bào không đồng nhất. Vì thế quần thể tế bào ni cấy có thể xem
như quần thể thực vật, ở đấy cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gene, kiểu
hình và tuổi. Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện những thay
đổi đó ở mức độ cơ thể. Thậm chí những quần thể tế bào phát triển từ một
quần thể tế bào ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển
tế bào đến khi hình thành một cơ thể hồn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi
về di truyền do ảnh hưởng của các yếu tố trong môi trường nuôi cấy, đặc biệt
là các chất điều hịa sinh trưởng. Mặt khác cũng có các quẩn thể tế bào đồng
đều về mặt sinh lý, di truyền và phát triển những quần thể tế bào này là nhũng
đối tượng hết sức lý tưởng trong việc sử dụng các chất gây đột biến để thu
nhận các đột biến có ý nghĩa. Trong ni cấy mơ và tế bào, có thể quan sát
thấy hai loại thay đổi kiểu hình. Một là kết quả của sự thay đổi kiểu gene, cịn
loại kia khơng liên quan đến những thay đổi về gene được gọi là biến đổi
ngoài gene [ ].

8

Ngoài các vấn đề trên, ni cấy mơ tế bào cịn gặp một hiện tượng phổ
biến là: một phần đáng kể mô hoặc cây tái sinh từ cụm tế bào thậm chí từ một
tế bào có thể thay đổi một số đặc điểm mà không cần áp dụng các phương
pháp chọn lọc nào. Những biến đổi di truyền tự phát xảy ra trong q trình
ni cấy mơ hoặc tế bào được Larkin và Scowcroft (1982) gọi là “biến dị sinh
dưỡng” hay “biến dị soma”. Theo Skirvin và cs (1994), sự xuất hiện biến dị
soma có thể là do rối loạn trong phân bào nguyên nhiễm gày ra bời các chất
kích thích sinh trường hoặc sự có mặt của một số chất trong môi trường nuôi
cấy [24],[22],[6],

17

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Vu 1m Ouna

Luân văn lòt nehiêp

1.6.2. Nguyên lý chung
Tế bào ni cấy in vitro có tỉ lệ biến dị di truyền lớn (10'5 - 10"8) vì thế
có thể lựa chọn được các cá thể đột biến nhanh hơn và có hiệu quả hơn so với
các phương pháp chọn lọc giống thông thường khác áp dụng trên cây nguyên
vẹn. Nếu kết hợp với gây đột biến thì tần suất càng cao hơn. Ở mức độ tế bào
nhất là tế bào đơn bội hầu như những đặc điểm đột biến được thể hiện ngay.
Kỹ thuật ni cấy mơ, tế bào cịn cho phép làm giảm bớt đáng kể thời gian

cần thiết để chọn được những tính trạng theo ý muốn.
Kỹ thuật chọn dòng tế bào đã ra đời rất sớm trong nghiên cứu vi sinh
vật. Nhưng đối với các đối tượng thực vật bậc cao, kỹ thuật này mới được ứng
dụng từ những năm 70 của thế kỉ trước.
Có thể tiến hành xử lý và chọn lọc tế bào thực vật ở 3 mức độ khác
nhau:
•

Mơ sẹo.

•

Tế bào đơn.

•

Tế bào trần.

Mục đích chọn lọc có thể ở những điểm sau:
•

Chọn dịng tế bào chống chịu điều kiện bất lợi của ngoại cảnh phi sinh
học như nóng, lạnh, phèn, mặn, h ạn...

•

Chọn dịng tế bào kháng các độc tố do các tác nhân sinh học gây ra như
độc tố do nấm và vi khuẩn gây bệnh tiết ra, các loại kháng sinh do vi
sinh vật sản sinh ra.


•

Chọn dịng sản suất dư thừa các loại sản phẩm chủ yếu là acid amin
nhằm mục tiêu xây dựng quy trình sản xuất quy mơ cơng nghiệp các
loại sản phẩm đó.

•

Chọn dịng mang những đặc điểm đánh dấu để nghiên cứu di truyền [ 1].

18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN




Vu I m uuna

Luân văn tôt nehiêp

1.6.3. Phương pháp chọn dịng
1.6.3.1. Chọn trực tiếp
Thơng qua ưu thế về sinh trưởng hay sự khác biệt thấy được về màu sắc
có thể chọn được dòng tế bào từ quần thể tế bào.
Một số dịng có khả năng chịu kháng sinh, chịu các chất tương tự acid
amin hoặc muối cũng có thể chọn trực tiếp quần thể tế bào. Điều kiện chọn
lọc ở đây là các dược chất với nồng độ khác nhau gây tác động trực tiếp lên
sinh trưởng của tế bào. Những tế bào có khả năng phân chia trong điều kiện
chứa độc tố với nồng độ tăng dần từ lần cấy chuyển này đến lần cấy chuyển

khác được sàng lọc dần. Hoặc có thể đưa cả quần thể tế bào vào điều kiện mơi
trường ức chế sinh trưởng hồn tồn để chọn ra những tế bào sống sót.
Thơng thường người ta trộn tế bào vào môi trường thạch chứa dược tố
và chờ những tế bào sống sót phân chia thành cụm mơ sẹo hoặc cũng có thể
cấy trực tiếp lên mơi trường chọn lọc chứa dược tố. Dịng chống chịu thường
xuất hiện từ một phần của khối tế bào nuôi cấy này.
1.6.3.2. Chọn gián tiếp
Trong trường hợp này đặc điểm của dòng được chọn là kết quả biểu
hiện khuyết tật của tế bào. Thí dụ điển hình là chọn dịng thiếu enzyme
nitratreductase. Trên môi trường chứa CIO những tế bào có nitratreductase sử
3

dụng C10 như NO và khử thành clorit. Clorit tác dụng như một độc tơ' cho
3

3

nên chỉ có những tế bào khơng có nitratreductase mới sống sót.
1.6.3.3. Chọn tổng thể
Các tế bào dị thường thực vật thường được chọn bằng phương pháp xử
lý đột biến và nuôi trên mơi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần thiết có khi
lại chính là yếu tố gây đột biến, ví dụ đột biến lặn chịu được
S-2-aminoethylcystein xuất hiện sau khi xử ký đột biến phôi nuôi cấy.

19

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN





ỵ_u 1 m u u n n

Luân văn tôt nehiêp

1.6.3.4. Chọn lọc sau xử lý đột biến
Các dạng biến dị chọn được trong nuôi cấy in vitro thường xuất hiện với
tần số 10 - 10 khi không xử lý đột biến. Nếu xử lý sẽ tăng được tần số đó
‘5

lên khoảng

'8

1 0

lần.

Những đột biến thu được phải là kết quả rõ ràng của sự thay đổi cấu
trúc bậc một của ADN được di truyền dẫn đến những biến đổi về tính trạng.
Thơng thường trong ni cấy mơ tế bào đột biến được chọn thơng qua
thay đổi tính trạng của tế bào. Nhưng những thay đổi về tính trạng tế bào có
thể là kết quả thay đổi hoạt tính gene. Thay đổi tính trạng do đột biến phải là
những tính trạng di truyền được qua thế hệ sau bằng sinh sản hữu tính. Đột
biến của nitratreductase nhân sẽ phân ly theo định luật Mendel sau khi lai, còn
đột biến ADN cơ quan tử như lục lạp và ti thể có thể di truyền theo dòng mẹ.
Cho tới lúc lai xong, tốt nhất chỉ nên gọi các dòng vừa phân lập được là các
dịng tế bào hoặc các dạng thay đổi tính trạng [ ].
1


1.6.4. Thành tựu đạt được trong chọn dòng tê bào thực vật
1.6.4.1. Chọn dịng chịu khơ hạn
Thích nghi với điều kiện ngoại cảnh bất lợi như hạn hán là đặc điểm của
thực vật, trong đó có cả cây trồng tuy nhiên tính thích nghi dần dần địi hỏi
phải qua nhiều thế hệ và cũng chỉ đạt được giói hạn nhất định.
Kỹ thuật chọn dòng chịu hạn được thực hiện trên nhiều mức độ khác
nhau: Dùng cây con hoàn chỉnh: ở ngô, ở cây đậu tương; dùng đoạn cành
giâm ở khoai tây. Song ở mức tế bào việc chọn lọc thành công hơn cả là ở cây
thuốc lá, ở cao lương, ở cây anh đào và đặc biệt là ở lúa nước bằng tế bào có
nguồn gốc là protoplast. Khi chọn tế bào chịu hạn có thể sử dụng các chất gây
áp suất thẩm thấu cao như PEG hay trực tiếp thổi khô [3].

20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN