VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TẠ THỊ ĐÔNG

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN codA MÃ HÓA ENZYME SINH TỔNG
HỢP GLYCINE BETAIN DƯỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER
CẢM ỨNG KHÔ HẠN rd29A VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)
Mã số: 60 42 01 14

Người hướng dẫn: PGS. TS. CHU HỒNG HÀ
Đơn vị: Viện Cơng nghệ sinh học,Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam

Hà Nội, 10/2017


i

LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới
sự hướng dẫn của PGS. TS. Chu Hoàng Hà. Các nội dung nghiên cứu, kết quả
trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai cơng bố dưới bất kỳ hình
thức nào.
Luận văn sử dụng thơng tin, số liệu và hình ảnh từ các bài báo và nguồn tài
liệu của các tác giả khác đều được chú thích và trích dẫn đầy đủ.
Nếu có bất kỳ sự gian lận nào, tơi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về nội
dung luận văn.

Hà Nội, tháng 10 năm 2017
Học viên

Tạ Thị Đông


ii

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Chu Hồng Hà đã tận tình
hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt q trình học
tập, làm việc và hồn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Bích Ngọc, Ths. Nguyễn Văn Đoài, cùng
tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, học viên Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật,
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam đã
nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian
thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo và Ban đào tạo Viện Sinh
thái và Tài nguyên sinh vật đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong
suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đến bạn bè và gia đình đã giúp đỡ và chia sẻ,
động viên trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn.
Hà Nội, tháng 10 năm 2017
Học viên

Tạ Thị Đông



iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ..............................................................vi
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... viii
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
NỘI DUNG......................................................................................................................2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................2
1.1.

CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX) GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ

DỤNG .............................................................................................................................. 2
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ........................................................................................ 2
1.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................................ 3
1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương............................................. 4
1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam .................................. 5
1.2.

HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG .......................... 7

1.2.1. Tác động của hạn đến hệ rễ .................................................................................. 8
1.2.2. Tác động của hạn đến khả năng cố định đạm ....................................................... 8
1.2.3. Tác động của hạn đến hình thái lá ...................................................................... 10
1.3.


GLYCINE BETAINE (GB) VÀ CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP GB ......... 10

1.3.1. Cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường ở thực vật .................. 10
1.3.2. Các con đường sinh tổng hợp GB ...................................................................... 12
1.3.3. Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp GB tăng cường khả năng chống chịu điều
kiện môi trường bất lợi .................................................................................................. 14
1.4.

PROMOTER VÀ PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN RD29A ................... 20

1.4.1. Cấu trúc và chức năng của promoter .................................................................. 20
1.4.2. Promoter cảm ứng khơ hạn RD29A ................................................................... 20
1.5.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG BIẾN ĐỔI GEN ...... 21

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 28
2.1.

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................ 28


iv

2.1.1. Vật liệu thực vật.................................................................................................. 28
2.1.2. Chủng vi khuẩn và vector ................................................................................... 28
2.1.3. Hóa chất thiết bị .................................................................................................. 29
2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 29


2.2.1. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen pIBTII- rd29A-codA .................. 29
2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium .............. 34
2.2.3. Phương pháp đánh giá cây thuốc lá chuyển gen codA ....................................... 34
2.2.4. Phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen ...................................................... 34
2.2.5. Phương pháp phân tích cây đậu tương chuyển gen bằng phản ứng PCR........... 36
2.2.6. Phương pháp phân tích cây đậu tương chuyển gen bằng Phosphinothricin ....... 36
2.2.7. Xây dựng đường chuẩn xử lý hạn ở giống đậu tương ĐT22.............................. 37
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................38
3.1.

KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN CODA DƯỚI

SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN RD29A..................... 38
3.1.1. PCR nhân promoter rd29A từ cây Arabidopsis với mồi RD29A-HindIII-F và
RD29A-Xbal-R. .............................................................................................................. 38
3.1.2. Tách dòng rd29A bằng vector pBT, cắt pBT-rd29A và pIBTII-35S-codA với
HindIII và Xbal .............................................................................................................. 38
3.1.3. Nối rd29A với pIBTII-codA, biến nạp vào E.coli, chọn dòng băng phản ứng
cloni PCR với mồi RD29A-HindIII-F và RD29A-XbaL-R ........................................... 39
3.1.4. Biến nạp pIBTII-rd29A-codA vào Agrobacterium chọn dòng băng phản ứng
colony PCR với mồi RD29A-HindIII-F và RD29A-Xbal-R .......................................... 40
3.2.

KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CODA VÀO THUỐC LÁ THÔNG QUA VI

KHUẨN AGROBACTERIUM. ...................................................................................... 41
3.2.1. Kết quả chuyển cấu trúc pIBTII-rd29A-codA vào giống thuốc lá K326. ........... 41
3.2.2. Kết quả đánh giá và phân tích các dịng thuốc lá chuyển gen ............................ 42
3.2.3. Kết quả đánh giá khả năng chống chịu của các dòng thuốc lá chuyển gen........ 43

3.3.

KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CODA VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 ......... 44

3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn A. Tumefacien sử dụng cho biến nạp đến khả
năng cảm ứng tạo chồi ................................................................................................... 44
3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ ppt (Phosphinothricin) đến hiệu quả chuyển gen ...... 45


v

3.3.3. Kết quả chuyển cấu trúc pIBTII-rd29A-codA vào đậu tương ............................ 46
3.4.

PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC DỊNG ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN .. 49

3.4.1. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0, T1 chuyển cấu trúc rd29A - codA
bằng phản ứng PCR ....................................................................................................... 49
3.4.2. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0 và T1 chuyển cấu trúc rd29A-codA
bằng ppt ......................................................................................................................... 50
3.4.3. Kết quả xây dựng đường xử lý hạn ở giống đậu tương DT22 ........................... 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 58
PHỤ LỤC ......................................................................................................................68


vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU


AS

Acetosyrigone

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

BAP

6-benzyladenine purin

GB

Glycine Betain

bp

Base pair

CCM

Cocultivation medium

DNA

Deoxyribonucleic acid

E. coli


Escherichia coli

GA3

Gibberellic acid

GM

Germination medium - Môi trường nảy mầm

IAA

Indoleacetic acid

IBA

Indole-3-butyric acid

MS

Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)

NAA

α-Naphthaleneacetic acid

OD

Optical density


PCR

Polymerase Chain Reaction

PPT

Phosphinothricin

RM

Rooting medium - Môi trường ra rễ

SIM

Shoot induction medium - Môi trường tạo chồi

SEM

Shoot elongation medium - Môi trường kéo dài chồi

T-DNA

Vùng DNA plasmid chuyển vào thực vật

T0, T1

Các thế hệ cây đậu tương chuyển gen

YEP


Yeast extract peptone


vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Sản lượng đậu tương Việt Nam (2011-2015) .................................................6
Bảng 1.2. Một số loài cây trồng chuyển gen mã hóa enzyme tham gia sinh tổng hợp
GB, tăng khả năng chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi. .................................18
Bảng 1.3 Tổng hợp nghiên cứu chuyển gen vào nốt lá mầm đậu tương trên thế giới ..23
Bảng 1.4 Tổng hợp nghiên cứu chuyển gen vào nốt lá mầm đậu tương ở Việt Nam..26
Bảng 2.1 Các cặp mồi dung cho phản ứng PCR đậu tương ..........................................28
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR ............................................................................29
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR nhân promoter rd29A .......................................30
Bảng 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối promoter rd29A với vector tách dòng pBT .30
Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme HindIII và XbaI .............................. 31
Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nối với nhờ enzyme T4 ligase ...................................31
Bảng 2.7 Thành phần phản ứng phản ứng colony PCR ................................................32
Bảng 2.8 Thành phần dung dịch đệm tách chiết ........................................................... 33
Bảng 2.9 Chu trình nhiệt của PCR ................................................................................33
Bảng 3.1. Tỷ lệ sống sót của các mảnh thuốc lá biến nạp qua các giai đoạn chọn lọc 41
Bảng 3.2 Kết quả gây hạn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen .............................. 43
Báng 3.3 Ảnh hưởng cuả nồng độ khuẩn đến khả năng cảm ứng tạo chồi...................45
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ ppt đến khả năng tạo chồi ......................................46
Bảng 3.5. Kết quả biến nạp vector chuyển gen vào mảnh lá mầm đậu tương ..............47
Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra các dòng T1 bằng Phosphinothricin 250mg/l ....................52
Bảng 3.7 Sự phát triển của thân và rễ các cây đậu tương ĐT22 thí nghiệm ...............54


viii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (2011-2015) .........6
Hình 1.2 Sinh tổng hợp GB ở thực vật bậc cao ........................................................... 13
Hình 1.3 Sinh tổng hợp GB ở A. globiformis ............................................................. 13
Hình 2.1 Sơ đồ khái quát thí nghiệm tái sinh cây đậu tương qua đa chồi từ nách lá
mầm hạt chín .................................................................................................................35
Hình 3.1 Kết quả PCR nhân promoter rd29A từ cây Arabidopsis ............................... 38
Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR được xử lý bởi HindIII / XbaI ...................39
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm colony – PCR ......................................................40
Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm colony – PCR với cặp mồi đặc hiệu....................41
Hình 3.5 Các giai đoạn của quá trình chuyển gen ở thuốc lá. ......................................42
Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng thuốc lá .........................................42
Hình 3.7 Kết quả gây hạn nhân tạo các dịng thuốc lá chuyển gen .............................. 44
Hình 3.8 Các mảnh lá mầm trên môi trường chọn lọc với nồng độ ppt khác nhau ......46
Hình 3.9 Các giai đoạn của quá trình chuyển gen ở đậu tương. ...................................48
Hình 3.10 Kết quả kiểm tra cây T0 bằng PCR ............................................................. 49
Hình 3.11 Kết quả kiểm tra cây T1 bằng PCR ............................................................. 50
Hình 3.12 Kết quả kiểm tra các dòng Đậu Tương T0 bằng Phosphinothricin .............50
Hình 3.13 Kết quả kiểm tra các dịng đậu tương T1 bằng Phosphinothricin ...............51
Hình 3.14 Sinh trưởng của giống DT22 sau 3,6,9,12 thí nghiệm .................................53
Hình 3.15 Sự phát triển thân và rễ ở giống DT22 ........................................................54
Hình 3.16 Các cây được phục hồi sau 3, 6, 9,10, 11 ngày gây hạn nhân tạo ...............55


1

MỞ ĐẦU
Đậu tương là cây trồng quan trọng cho nền nông nghiệp thế giới, là một loại cây
trồng được sử dụng làm nguồn thức ăn cho con người và vật ni, cũng như trong

cơng nghiệp… Hạt đậu tương có chứa hàm lượng protein và dầu cao, ngồi ra, cịn có
các chất khác như carbohydrate, vitamin và các khoáng chất. Do vậy, đậu tương trở
thành đối tượng cho các nghiên cứu về nâng cao các tính trạng số lượng, chất lượng và
khả năng chống chịu. Hiện nay, chuyển gen đang là một trong những phương pháp
ứng dụng trong nghiên cứu chọn giống cây trồng nói chung và đậu tương nói riêng.
Cây đậu tương là một trong những loại cây trồng quan trọng bậc nhất ở nhiều
quốc gia với vị trí chỉ đứng sau lúa, ngơ và lúa mì, có khả năng thích nghi rộng với các
điều kiện khí hậu và sinh thái khác nhau nên đậu tương được trồng rộng rãi trên cả
năm châu lục, tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ tiếp đến là Châu Á. Bình quân hàng
năm trên thế giới có khoảng 91 triệu ha đậu tương được gieo trồng với năng suất bình
quân khá cao 22-23 tấn/ha. Mỹ là nước có diện tích gieo trồng cũng như sản lượng đậu
tương lớn nhất thế giới, tiếp theo là Brazil, Achentina, Trung Quốc. Trong năm 2014
sản lượng đậu tương của brazil đạt 90.700.000 ha. Ngày 11/4/17, IBGE- Viện Địa lý
và Thống kê Brazil dự báo sản lượng đậu tương nước này trong năm nay sẽ đạt mức
kỷ lục 110,9 triệu tấn tăng 15,9% so với năm 2016
Bước vào thời kỳ hiện tại, biến đổi khí hậu đang ảnh hưởng tới năng suất và
chất lượng của cây trồng, các yếu tố bất lợi của môi trường đang là những thách thức
lớn cho mục tiêu duy trì phát triển bền vững cho sản xuất lương thực cho con người,
trong đó hạn mặn là hai trong số những yếu tố quan trọng kìm hãm sự phát triển sản
xuất nơng nghiệp. Những năm gần đây, thế giới cũng như Việt Nam thường xuyên
phải gánh chịu những biến động lớn. Sự gia tăng của hạn hán, lũ lụt, xói mịn, thối
hóa đất gây ảnh hưởng đến cây trồng.
Đậu tương là cây trồng chịu hạn kém khi thiếu nước ở các thời kỳ khác nhau
đều có ảnh hưởng xấu đến năng suất. Như vậy, việc chọn tạo được các giống đậu
tương có khả năng chống chịu hạn là một nhu cầu cần thiết trong sản xuất và được
xem như định hướng nghiên cứu phát triển cây đậu tương ở Việt Nam.


2


NỘI DUNG
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX) GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ

SỬ DỤNG
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Dựa vào sự đa dạng về hình thái của hạt, Fukuda và nhiều nhà khoa học đã
thống nhất rằng cây đậu tương có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu (Trung Quốc, xuất
phát từ một loại đậu tương dại, thân mảnh, dạng dây leo, có tên khoa học là Glycile
Soja Sieb và Zucc[26]. Từ Trung Quốc đậu tương được lan truyền dần ra khắp thế giới.
Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản vào khoảng 200 năm trước công nguyên, đậu
tương được đưa vào Triều Tiên và sau đó phát triển sang Nhật đến giữa thế kỷ 17 đậu
tương được nhà thựcvật học người Đức Engellbert Caempler đưa về Châu Âu và đến
năm 1954 đậu tương mới được du nhập vào Hoa Kỳ. Sau chiến tranh thế giới thứ hai,
đậu tương phát triển mạnh ở Mỹ, Brazin và Canada. Ở nước ta đậu tương có lịch sử
phát triển lâu đời nhưng trải qua thời gian dài cây đậu tương vẫn chiếm một vị trí rất
khiêm tốn trong nền sản xuất của nông nghiệp Việt Nam. Đậu tương được trồng lấy
hạt, là loại cây thực phẩm quan trọng sau lúa mì, lúa nước và ngơ. Đậu tương được
trồng nhiều nhất ở Châu Mỹ trên 70%, tiếp đến là Châu Á. Ở nước ta hiện nay có 6
vùng sản xuất đậu tương: vùng Đông Nam Bộ 26,2%, miền núi Bắc Bộ 24,7%, đồng
bằng Sông Hồng 17,5%, đồng bằng Sông Cửu Long 12,4%, hai vùng còn lại trồng
đậu tương với tỷ lệ thấp hơn là đồng bằng ven biển miền Trung và Tây Nguyên.
Cây đậu tương thuộc bộ Phaseoleae, họ đậu Fabaceae, họ phụ cánh bướm
Papilionoideae chi Glycine với tên khoa học là Glycine max. Căn cứ vào đặc điểm
hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể thì Hymowit và Newell
(1984) cho rằng ngồi chi Glycine cịn có chi phụ Soja[35]. Chi Glycine được chia
thành 7 lồi hoang dại lâu năm, chi Soja gồm 2 loài trong đó có lồi đậu tương
trồng Glycine max [1].



3

1.1.2. Đặc điểm sinh học
Đậu tương là cây hai lá mầm, thân thảo. Thân cây có nhiều lơng nhỏ, khi cịn
non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển màu nâu nhạt. Màu sắc của thân cây
cho ta biết màu của hoa sau này, nếu thân có màu xanh hoa sẽ có màu trắng, nếu thân
có màu tím thì sau hoa sẽ có màu tím đỏ, chiều cao của thân từ 0,3 - 1m tùy theo
giống.
Cây đậu tương có ba loại lá: lá mầm, lá đơn, lá kép. Mỗi lá kép thường có 3
thuỳ (lá chét), lá kép mọc so le, trên phiến lá có nhiều lơng tơ. Hình dạng của lá thay
đổi theo giống, những giống có lá dài và nhỏ chịu hạn tốt, nhưng cho năng suất thấp,
những giống lá to thường cho năng suất cao hơn nhưng cũng chịu hạn kém hơn.
Hoa đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa mọc
thành chùm, mỗi chùm thường có từ 3 - 5 hoa. Hoa lưỡng tính nên đậu tương là cây tự
thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chỉ chiếm 0,5 - 1%.
Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, dài từ 2 - 7cm. Mỗi quả thường có 2 - 3
hạt. Hạt đậu tương có hình trịn, bầu dục… những giống có hạt màu vàng có giá trị
thương phẩm cao. Khối lượng 1000 hạt dao động trung bình từ 100 - 200g. Hình dạng
và màu sắc của rốn hạt đặc trưng cho mỗi giống.
Bộ rễ đậu tương gồm rễ chính và rễ phụ. Trên rễ có rất nhiều nốt sần, đó là kết
quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Nốt sần có thể dài
1cm, đường kính 5 - 6mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt
nhất nốt sần có màu hồng. Nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu từ 0 - 20cm, có
vai trị quan trọng trong việc cố định đạm từ nitơ khơng khí, với lượng đạm cung cấp
cho cây khoảng 30 - 60 kg/ha.
Dựa vào thời gian sinh trưởng, đậu tương được chia thành các loại: chín rất
sớm: thu hoạch sau 80-90 ngày; chín sớm: thu hoạch sau 90 - 100 ngày; chín trung
bình: thu hoạch sau 100 - 110 ngày; chín muộn trung bình: thu hoạch sau 110 - 120

ngày; chín muộn: thu hoạch sau 130 - 140 ngày; chín rất muộn: thu hoạch sau 140 150 ngày [1].


4

1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương
Đậu tương là cây thực phẩm ngắn ngày, giàu dinh dưỡng, có giá trị kinh tế cao,
sản phẩm của nó được dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc,
nguyên liệu cho công nghiệp, làm hàng xuất khẩu và là loài cây cải tạo đất trồng rất
tốt.
Giá trị dinh dưỡng: Trong hạt đậu tương có các thành phần hố học sau protein
(40%), lipid (12-25%), glucid (10-15%); các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S;
các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose. Trong đậu tương có
đủ các acid amin cơ bản isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan,
valin. Ngoài ra, đậu tương được coi là một nguồn cung cấp protein hồn chỉnh vì chứa
một lượng đáng kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể. Các thực phẩm
làm từ đậu tương được xem là một loại "thịt khơng xương" vì chứa tỷ lệ đạm thực vật
dồi dào, có thể thay thế cho nguồn đạm từ thịt động vật. Thậm chí, lượng đạm
(protein) trong 100 g đậu tương có thể tương đương với lượng đạm trong 800 g thịt bò.
Tại các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc, 60% lượng đạm tiêu thụ hằng ngày là do
đậu tương cung cấp. Hàm lượng chất đạm chứa trong đậu tương cao hơn nhiều so với
lượng chất đạm chứa trong các loại đậu khác.
Giá trị về mặt thực phẩm: Hàm lượng protein trong đậu tương cao hơn trong cá,
thịt và cao gấp 2 lần các loại đậu đỗ khác, protein trong hạt đậu chiếm khoảng 35 50% (phụ thuộc vào giống và điều kiện chăm sóc), dễ tiêu hóa hơn thịt và khơng có
thành phần tạo cholesterol. Đậu tương cịn được xem là cây cung cấp dầu thực vật
quan trọng, lipit đậu tương chứa thành phần các axit béo không no cao, tổng số chất
béo chiếm khoảng 18%. Trong hạt đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin, đáng kể là
các vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin E,… Ngồi ra, nó cịn chứa sắt, canxi,
photpho và các thành phần giúp ích cho sức khỏe con người như phytosterol, lecithin,
isoflavon, phytoestogen và những sản phẩm ức chế phân hủy protein[1].

Giá trị về mặt công nghiệp: Hiện nay trên thế giới, đậu tương là cây đứng đầu
về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% dầu thực vật, dầu đậu
tương khô chậm, chỉ số iốt cao 120 - 127, nhiệt độ ngưng tụ -15 đến -18°C và từ dầu
người ta có thể làm nến, xà phịng, nilon,…Đậu tương còn là nguyên liệu của nhiều


5

ngành công nghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo,
chất đốt lỏng[1].
Giá trị về mặt nơng nghiệp: Tồn bộ cây đậu tương cả khi tươi và khơ đều có
thể dùng làm thức ăn cho gia súc. Đậu tương có vai trị quan trọng trong cải tạo đất
trồng, một ha đậu tương nếu sinh trưởng và phát triển tốt sẽ để lại trong đất 30 - 60 kg
nitơ, thân và lá với hàm lượng đạm cao có thể dùng để bón cho đất thay cho phân hữu
cơ. Việc luân canh đậu tương với cây trồng khác có thể xem là biện pháp cải tạo đất
trồng hữu hiệu.
1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam
Thế giới: Nhận thấy với những giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao của cây đậu
tương, nên đây được xem là một trong những loại cây trồng quan trọng bậc nhất ở
nhiều quốc gia với vị trí chỉ đứng sau lúa, ngơ và lúa mì. Do có khả năng thích nghi
rộng với các điều kiện khí hậu và sinh thái khác nhau nên đậu tương được trồng rộng
rãi trên cả năm châu lục, tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ, tiếp đến là Châu Á. Bình
qn hàng năm trên thế giới có khoảng 91 triệu ha đậu tương được gieo trồng với năng
suất bình qn khá cao 22-23 tấn/ha. Mỹ là nước có diện tích gieo trồng cũng như sản
lượng đậu tương lớn nhất thế giới, tiếp theo là Brazil, Achentina, Trung Quốc. Trong
năm 2014, 82% (90.700.000 ha) trong số 111 triệu ha đậu tương trồng trên toàn cầu là
đậu tương chuyển gen.
Việt Nam: Đậu tương được gieo trồng từ rất sớm, nó được trồng trước cây đậu
xanh và đậu đen. Tuy nhiên với các phương pháp canh tác truyền thống, bộ giống năng
suất thấp, sản xuất nhỏ lẻ, giá thành cao, lãi suất thấp, giá thành đậu tương trong nước

khơng có khả năng cạnh tranh với đậu tương nhập khẩu là nguyên nhân khiến cho
nông dân không mặn mà với cây đậu tương. Vì vậy, diện tích và sản lượng đậu tương
của nước ta phát triển chậm. Năm 2012, sản lượng đậu tương nước ta giảm 34,3% so
với cùng kỳ năm trước, xuống cịn 175,2 nghìn tấn do thời tiết lạnh khác nghiệt vào
cuối năm 2011 và đầu năm 2012 khiến cho năng suất và diện tích gieo trồng giảm
mạnh. Quy mơ sản xuất vẫn còn tương đối nhỏ và tiếp tục không đáp ứng được nhu
cầu tiêu thụ trong nước. USDA dự báo diện tích trồng đậu tương năm 2013 nước ta
tăng khoảng 180 nghìn ha so với năm 2011 và sản lượng đạt ở mức 270.000 tấn. Theo


6

số liệu thống kê chính thức, đậu tương đang được trồng tại 25 trong số 63 tỉnh thành cả
nước, với khoảng 65% tại các khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực phía Nam.
Thủ tướng Chính phủ cũng đã phê duyệt Quy hoạch tổng thể phát triển sản xuất ngành
nơng nghiệp đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030. Theo đó, diện tích đất quy
hoạch khoảng 100 ngàn ha, tận dụng tăng vụ trên đất lúa để năm 2020 diện tích gieo
trồng khoảng 350.000 ha, sản lượng 700.000 tấn; vùng sản xuất chính là đồng bằng
sơng Hồng, trung du miền núi phía Bắc, Tây Nguyên. Theo Hiệp hội chăn nuôi Việt
Nam (VNFA), đậu tương sản xuất trong nước có mức giá bán kém cạnh tranh so với
đậu tương nhập khẩu. Ví dụ, đậu tương sản xuất trong nước hiện có giá từ 16.000
VND – 17.000 VND/kg (tương đương 0,77 – 0.82 USD/kg), trong khi giá đậu tương
nhập khẩu chỉ khoảng từ 14.600 – 15.000 VND/kg (tương đương 0,70 – 0,71
USD/kg).
Bảng 1.1 Sản lượng đậu tương Việt Nam (2011-2015)
2011
Diện tích gieo trồng (nghìn ha)
Năng suất (tấn/ha)
Tổng sản lượng (nghìn tấn)


2012

2013

2014*

2015*

181,1

119,6

117,8

120

130

1,47

1,45

1,43

1,47

1,48

266,9


173,7

168,4

176,4

192,4

Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn, *số liệu dự báo của USDA
Hình 1.1 Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (2011-2015)

Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam, *số liệu dự báo
Nguồn: Tổng Cục thống kê Việt Nam, *số liệu 2011: ước tính của FAS


7

1.2.

HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG
Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước do môi trường gây

nên làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây. Những cây có khả năng duy
trì và cho năng suất ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn. Khả năng của
thực vật có thể làm giảm mức độ tổn thương do thiếu nước gây ra gọi là tính chống
chịu hạn.
Có 2 loại hạn cơ bản: hạn thật (gồm hạn đất, hạn khơng khí, hạn tồn diện) và
hạn sinh lý hạn đất là do lượng nước trong đất giảm làm hệ rễ cây không thể lấy nước
từ đất vào tế bào, đã đến cây có hiện tượng bị héo lâu dài. Hạn khơng khí thường đặc

trưng ở nhiệt độ cao (39oC - 42 oC) và độ ẩm thấp hơn 62%. Hạn khơng khí thường
gây ra hiện tượng héo tạm thời, vì rễ khơng hút đủ nước mà q trình thoát hơi nước
xảy ra quá nhanh do nhiệt độ cao. Hạn sinh lý khác với 2 loại hạn trên ở chỗ môi
trường vẫn đầy đủ nước nhưng do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trường tế
bào và mơi trường bên ngồi rễ nên rễ cây khơng có khả năng hút nước [10].
Khi gặp các điều kiện bất lợi về nước, thực vật có những phản ứng để có thể
thích ứng, sinh trưởng và phát triển. Các cơ chế này khá đa dạng nhưng có thể chia
thành ba cơ chế chủ đạo bao gồm: cơ chế trốn thoát điều kiện hạn (drought escape),
cơ chế tránh hạn (drought avoiandgce) và cơ chế chống chịu hạn (drought tolerance).
Cơ chế trốn thốt điều kiện hạn cho phép cây có thể hồn thành chu kì sống của mình
trong giai đoạn được cung cấp đủ nước trước khi hạn xảy ra. Các giống đậu tương
ngắn ngày được trồng khá phổ biến ở khu vực Nam Mỹ chủ yếu sử dụng cơ chế này để
thích ứng với các điều kiện bất lợi về nước. Các giống này có tính chín sớm và bắt đầu
nở hoa vào cuối tháng 4 và tạo quả trong tháng 5, chính vì thế mà các giống này
có thể hồn thành chu kì sinh sản của mình trước khi tình trạng khan hiếm về nước
xảy ra từ tháng 6 tới tháng 8. Đối với cơ chế tránh hạn thì các giống đậu tương sẽ có
các cơ chế để duy trì lượng nước trong cơ thể trong giai đoạn hạn thông qua việc
tăng khả năng hấp thu nước từ rễ hoặc giảm q trình thốt hơi nước ở các bộ phận
khác nhau của cây. Ở các giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, thì cây có
thể duy trì sức căng của các mơ và tế bào, chính vì thế các q trình trao đổi chất có
thể diễn ra bình thường trong điều kiện lượng nước bên ngồi mơi trường xuống rất


8

thấp. Sức căng của các mô và tế bào của cây được duy trì thơng qua việc tổng hợp
mạnh các chất chống áp suất thẩm thấu, các chất trao đổi [79].
1.2.1. Tác động của hạn đến hệ rễ
Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy
nước cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật. Ở cây đậu

tương sự thích nghi với các điều kiện hạn hán chủ yếu thông qua việc phát triển rễ trụ
để có thể tìm kiếm các nguồn nước từ các lớp đất sâu [80]. Bên cạnh đó hệ thống rễ
sợi phát triển cũng giúp cho cây có thể vươn tới các lớp đất có độ ẩm cao và tìm kiếm
các chất dinh dưỡng. Một trong những nhân tố chính ảnh hưởng đến độ sâu của rễ đậu
tương là tỉ số kéo dài rễ trụ (taproot elongation rate). Do rễ trụ được hình thành đầu
tiên ở đậu tương, chính vì thế việc xác định các giống đậu tương có đặc tính kéo dài rễ
trụ nhanh sẽ cho phép xác định khả năng đâm sâu của rễ. Sự khác nhau về tính trạng
kéo dài bộ rễ ở các giống đậu tương đã được nghiên cứu khá chi tiết ở trong điều kiện
nhà lưới [81]. Đánh giá 105 giống đậu tương khác nhau cho thấy tỉ số kéo dài rễ trụ
khác nhau giữa các giống vào khoảng 1,3cm/ngày. Những nghiên cứu tiếp theo trên
các giống có tỉ số kéo dài rễ trụ cao cho thấy những giống này có thể lấy nước ở chiều
sâu trên 120cm so với các giống còn lại. Một vài nghiên cứu cũng đã được thực hiện
đối với hệ thống rễ nhánh của cây đậu tương cho thấy trong điều kiện hạn số lượng rễ
nhánh trên đơn vị chiều dài rễ trụ tăng đáng kể, nhưng chiều dài và đường kính rễ trụ
khơng thay đổi. Hạn chế về nước ở cây đậu tương thường làm tăng sinh khối của rễ, từ
đó làm tăng tỉ lễ rễ : thân. Ở cây đậu tương khơng được tưới nước thì bộ rễ có chiều
dài hơn hẳn ở cây đậu tương được tưới nước [82].
Ngoài ra các nhà khoa học cũng nhận thấy mối tương quan rất chặt chẽ đối với
nhiều tính trạng rễ như khối lượng khô, chiều dài tổng số, cấu trúc và số lượng rễ
nhánh ở các giống chịu hạn. Những tính trạng này thường được dùng như các chỉ tiêu
quan trọng để đánh giá và nhận dạng các giống đậu tương có tính chịu hạn.
1.2.2. Tác động của hạn đến khả năng cố định đạm
Các loài cây họ đậu thường rất nhạy cảm đối với tình trạng nước ở trong đất.
Trong điều kiện hạn, cây đậu tương không chỉ giảm khả năng cố định CO2, giảm sự
phát triển lá mà khả năng cố định nitơ cũng bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Kết quả này


9

làm giảm sinh tổng hợp protein [83]. Nhiều nhân tố hạn chế khả năng cố định nitơ

trong điều kiện hạn đã được xác định ở cây đậu tương bao gồm khả năng sử dụng O2
giảm, nguồn carbon tới các nốt sần giảm, hoạt tính của enzyme sucrose synthase giảm,
hàm lượng ure và axit amin tự do tăng [84]. Đặc biệt, mối quan hệ về thế năng nước
của lá và nốt sần đã được xác định ở cây đậu tương trong điều kiện hạn. Hoạt tính của
enzym nitrogenase giảm 70% trong 4 ngày đầu tiên khi cây gặp hạn, trong khi đó q
trình quang hợp giảm khoảng 5%. Ngồi ra, sự thiếu hụt về nước cũng ảnh hưởng trực
tiếp đến hoạt tính của nốt sần thơng qua sự tăng cường tính kháng đối với khả năng
khuyếch tán oxy. Tình trạng thiếu nước ở trong đất cũng dẫn tới sự tích lũy ure ở lá
của cây đậu tương và hậu quả này chính là một nhân tố ức chế q trình hình thành nốt
sần.
Sự thay đổi về di truyền cũng được xác định ở các cá thể nhạy cảm với khả
năng cố định nitơ trong điều kiện hạn. Khi so sánh các giống đậu tương có hoặc khơng
có khả năng duy trì tính căng mơ (tissue turgidity) dưới điều kiện hạn ở giai đoạn sinh
trưởng sinh sản cho thấy, giống có khả năng duy trì tính căng mơ tốt hơn có năng suất
hạt tốt hơn với những giống còn lại (Hàm lượng ure ở cuống lá cũng là một trong
những chỉ tiêu để sàng lọc các dịng cây đậu tương có khả năng tích lũy nitơ tốt hơn
trong điều kiện khơ hạn. Bằng việc sàng lọc số lượng lớn (>3000) dòng đậu tương dựa
vào chỉ tiêu này, 8 dịng đậu tương có khả năng cố định nitơ tốt mang tính chịu hạn tốt
hơn. Nghiên cứu sâu hơn các dòng đậu tương này [85] tìm ra rằng q trình dị hóa ure
khơng phụ thuộc vào Mn tồn tại ở 6 trong số 8 dòng nghiên cứu. Giống đậu tương
Jackson, giống kháng hạn và có khả năng cố định nitơ cao, đã được dùng làm thể bố
mẹ trong các cặp lai để tạo ra giống đậu tương có năng suất cao ở các điều kiện hạn.
Hai dòng con lai từ các cặp lai này là nguồn gen tốt được dùng để cải thiện khả năng
cố định nitơ và năng suất trong các điều kiện ngập úng.
Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn chưa thể giải thích được liệu khả năng cố
định nitơ trong điều kiện hạn có được điều hịa ở mức độ cơ thể của cây đậu tương hay
khơng hay q trình này chỉ tồn tại khu trú trong nốt sần. Chúng ta đã biết rằng, tín
hiệu điều hịa q trình cố định nitơ là do cơ chế phản hồi bởi nitơ (nitrogen feedback
mechanism) bao gồm cả trạng thái nitơ ở thân và lá.[84].



10

1.2.3. Tác động của hạn đến hình thái lá
Lơng tơ lá thường là một đặc điểm phổ biến của thực vật chịu hạn, cũng như
một vài loại cây trồng, trong đó có đậu tương. Thơng thường, độ dày lơng tơ lá gia
tăng hệ số phản xạ từ lá, dẫn đến giảm nhiệt độ của lá trong điều kiện chiếu sáng cao.
Độ dày lơng tơ lá là đặc điểm thích ứng quan trọng cho cây đậu tương dưới điều kiện
khô hạn. Lông tơ dày đặc được tăng cường sức sinh trưởng, rễ dày đặc hơn và mở rộng
xuống sâu hơn. Sự gia tăng độ dày lơng tơ lá có thể làm tăng lớp ranh giới chống lại
stress lên tới 50%, giảm nhiệt độ của lá, hạn chế thoát hơi nước và tăng cường quang
hợp. Hơn nữa, sự gia tăng độ dày lơng tơ có thể làm giảm đi đáng kể phạm vi ảnh
hưởng bệnh khảm virus của đậu tương [86].
1.3.

GLYCINE BETAINE (GB) VÀ CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP GB

1.3.1. Cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường ở thực vật
Điều kiện bất lợi từ môi trường sống - stress (điều kiện bất lợi phi sinh học như
mặn, hạn, lạnh, nhiệt độ cao, băng giá, v.v.) dẫn đến hàng loạt các thay đổi về hình
thái, tính chất vật lý, hóa sinh, phân tử, điều đó ảnh hưởng xấu đến sự sinh trưởng và
phát triển của thực vật. Để đảm bảo tính tồn vẹn và sống cịn, nhiều lồi thực vật có
các chiến lược đối phó với những bất lợi phi sinh học khác nhau. Sự phản ứng của cơ
thể sống với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào từng lồi, kiểu gen, thời gian tác động
và tính khốc liệt của yếu tố cực đoan, độ tuổi và giai đoạn phát triển, dạng đặc thù của
các cơ quan hoặc tế bào và phần ngoại vi của chúng. Khi bị tác động bởi các yếu tố bất
lợi của môi trường, thực vật sẽ tạo ra một số chất kích thích, protein giải độc hoặc
hormone giúp chúng có khả năng thích ứng. Hiện nay, các nghiên cứu về cơ chế chống
chịu các điều kiện bất lợi từ môi trường ở thực vật đang được tập trung vào hướng
nghiên cứu làm tăng cường các chất giúp bảo vệ áp suất thẩm thấu của tế bào khỏi sự

mất cân bằng về nước. Sự tăng cường các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu được phát
hiện trong nhiều trường hợp môi trường bất lợi như hạn hán, muối mặn và lạnh giá
[42], [67]. Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính rất quan trọng của tế
bào khi bị mất nước do lạnh, muối hoặc hạn. Những thực vật sống trong môi trường
thiếu nước bị mất cân bằng về áp suất thẩm thấu trong tế bào địi hỏi phải có khả năng
chống chịu lại điều kiện khắc nghiệt đó.


11

Một trong những phương thức của thực vật chống lại sự mất cân bằng về áp
suất thẩm thấu đó là dựa trên sự thay đổi trong chuyển hóa tế bào chất dẫn đến sự xuất
hiện và tích lũy các chất hịa tan tương thích, protein hoặc các axit amin đặc hiệu [16].
Hiện tượng này xảy ra rất nhanh khi tế bào bị mất nước. Sự tích lũy các chất này
khơng làm ảnh hưởng đến hoạt động bình thường của các enzyme nội bào. Ngược lại,
sự tích lũy lượng lớn các chất hòa tan trong tế bào sẽ điều chỉnh áp suất thẩm thấu
bằng tác động tổng thể mà chúng có khả năng giữ và lấy nước vào tế bào. Ngoài ra,
chúng có thể thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng hóa sinh, tương tác với lipit
hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng tế bào và các phức hệ protein.
Về mặt hóa học, chúng thường là những phân tử trung hịa về điện, có kích thước rất
nhỏ, đóng vai trị quan trọng giúp các phân tử protein và màng tế bào chống lại sự biến
tính dưới tác động của các điều kiện bất lợi phi sinh học [10]. Chất bảo vệ áp suất
thẩm thấu hay các chất hịa tan tương thích được chia làm 4 nhóm chất sau đây: (1) GB
là dẫn xuất methyl hóa nhóm nitơ của axit amin, (2) proline và ectoine (axit amin), (3)
polyols và trehalose (là một hợp chất polyme không phải đường) và (4) các loại đường
tan: glucose, sucrose, fructan, manitol và pinitol. GB, proline và các nhóm đường thực
hiện chức năng như các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu và bảo vệ tế bào khỏi bị mất
nước. Quá trình này liên quan đến một số enzyme chức năng đã được phân lập và phân
tích về mặt sinh hóa như các enzyme chủ chốt tham gia sinh tổng hợp và chuyển hóa
các chất điều hịa áp suất thẩm thấu, các enzyme giải độc và các loại protease khác.

Protein vận chuyển nước qua màng, chất vận chuyển các đường đơn, proline và GB
được xem như có chức năng chuyển nước, proline, GB, các chất đường đơn qua màng
nguyên sinh chất và màng không bào để điều chỉnh áp suất thẩm thấu khi gặp điều kiện
môi trường cực đoan.
GB một hợp chất amoni bậc bốn, là một trong những chất hịa tan tương thích
hiệu quả nhất và được tìm thấy trong một phạm vi rộng của các loài động vật, vi khuẩn
và một số lồi thực vật hạt kín chịu hạn hán và chịu mặn [36]. Trước đây GB đã được
đề xuất, tăng tích lũy các betaine trong các lồi thực vật đóng một vai trị sinh lý quan
trọng làm giảm bớt căng thẳng thẩm thấu [70]. Trong tự nhiên, rau bina, ngơ, củ cải
đường và lúa mạch, nhanh chóng tích lũy GB xảy ra trong q trình cây bị stress với
muối, hạn hán và nhiệt độ thấp [19]. GB bảo vệ cây bằng cách hoạt động như một chất


12

hữu cơ có ảnh hưởng đến thẩm thấu (osmolyte), duy trì cân bằng nước giữa các tế bào
thực vật và môi trường, ổn định các đại phân tử dưới điều kiện khơ hạn và nồng độ
muối cao[51].
GB tích lũy ở nồng độ cao không gây cản trở chức năng của tế bào chất và có
tác dụng đảm bảo tính ổn định cấu trúc và chức năng của các đại phân tử. GB xuất
hiện như một yếu tố quyết định tới khả năng chống chịu điều kiện bất lợi ở cây trồng.
Chất này có hiệu quả lớn và liên quan mật thiết đến khả năng sinh trưởng của cây
trồng trong điều kiện môi trường hạn hán và nhiễm mặn. Mức độ tích lũy GB tương
quan với khả năng chống chịu điều kiện bất lợi. GB được tích lũy chủ yếu trong lục
lạp, nó đóng vai trị quan trọng trong điều chỉnh và duy trì màng thylacoid, do đó duy
trì hiệu quả quang hợp[74].
Trong nhiều lồi cây trồng, sự tích lũy tự nhiên của GB đủ để cải thiện tác động
tiêu cực của tình trạng mất nước gây ra bởi những vấn đề mơi trường khác nhau. Bên
cạnh đó, một số lồi cây trồng như lúa, khoai tây, cà chua, thuốc lá, v.v. tự nhiên
không sản xuất GB trong điều kiện stress hoặc khơng stress. Các ứng dụng của GB

ngoại sinh có thể giúp giảm thiểu tác động tiêu cực của môi trường bên ngồi. GB
ngoại sinh có thể thâm nhập qua lá và được vận chuyển đến các cơ quan nơi nó sẽ góp
phần tăng cường khả năng chịu đựng stress. Ngoài ra, những loài cây này là mục tiêu
tiềm năng cho việc ứng dụng kỹ thuật di truyền của quá trình sinh tổng hợp GB [47].
Với kiến thức ngày càng hiểu biết sâu rộng về genomics và proteomics cùng với các
cơng nghệ kỹ thuật gen, một số lồi thực vật đã được chuyển các gen mục tiêu liên
quan đến con đường sinh tổng hợp GB, các cây chuyển gen đã được chứng minh
tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện stress phi sinh học [60].
1.3.2. Các con đường sinh tổng hợp GB
Sinh tổng hợp GB ở thực vật: Ở thực vật bậc cao, GB được tổng hợp từ serine
qua ethanolamine, choline và betaine aldehyde. Quá trình sinh tổng hợp GB ở thực vật
trải qua hai bước như sau: (1) Đầu tiên, tiền chất choline được chuyển thành betaine
aldehyde (một hợp chất trung gian độc với thực vật) nhờ sự xúc tác của choline
monooxygenase (CMO); (2) tiếp theo, betaine aldehyde được chuyển thành glycine
betaine dưới hoạt động của betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) [58]. Mặc dù,


13

con đường tổng hợp GB trực tiếp từ sự N-methyl hóa glycine cũng được biết đến,
nhưng sự tích lũy GB ở tất cả các loài thực vật được xác định là con đường tổng hợp
từ choline.

Hình 1.2 Sinh tổng hợp GB ở thực vật bậc cao [58]
Sinh tổng hợp GB ở vi khuẩn Arthrobacter globiformis và Arthrobacter
panescens: Ngược lại, con đường sinh tổng hợp GB ở Arthrobacter globiformis và A.
panescens rất đơn giản, choline được chuyển hóa thành GB chỉ cần xúc tác bởi một
enzyme choline oxidase (COD) (Hình 1.). Kết quả là từ tiền chất choline chuyển hóa
thành sản phẩm trực tiếp là GB không thông qua hợp chất trung gian [38].


Hình 1.3 Sinh tổng hợp GB ở A. globiformis [38]
Từ các con đường sinh tổng hợp GB ở các đối tượng sinh vật khác nhau như
nêu ở trên, nhận thấy con đường sinh tổng hợp GB ở A. globiformis và A. panescens là
đơn giản nhất. Từ tiền chất choline được chuyển hóa thành GB chỉ cần xúc tác bởi
enzyme choline oxidase (COD) được mã hóa bởi gen codA nên chúng tôi chọn gen
codA làm gen mục tiêu để nghiên cứu.
Gen codA có kích thước phân tử là 1641 bp, mã hóa cho choline oxidase có
kích thước phân tử 547 amino acid, trọng lượng 60 kDa. Choline oxidase là một
enzyme chìa khóa giữ vai trị quan trọng đối với q trình sinh tổng hợp GB ở
Arthrobacter. Choline oxidase có khả năng xúc tác phản ứng oxi hóa 4 electron của
choline để tạo ra sản phẩm trực tiếp là GB mà không qua các hợp chất trung gian.


14

Enzyme này có ý nghĩa quan trọng bởi vì khi tích lũy hàm lượng cao GB trong tế bào
giúp cho tế bào chống lại sự khử nước và hiện tượng co nguyên sinh trong điều kiện
môi trường bất lợi.
1.3.3. Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp GB tăng cường khả năng chống
chịu điều kiện môi trường bất lợi
Theo số liệu báo cáo của ISAAA năm 2016, tổng diện tích gieo trồng cây trồng
biến đổi gen trên toàn thế giới ước tính khoảng 86,5 triệu hecta, trong đó diện tích
trồng đậu tương biến đổi gen chiếm 50% (tương đương 33,87 triệu hecta) tổng diện
tích gieo trồng. Theo báo cáo, đậu tương kháng thuốc diệt cỏ được gieo trồng với diện
tích lớn ở tốp 5 nước trồng cây biến đổi gen nhiều nhất thế giới là Brazil, Mỹ, Ac-henti-na, Paraguay và Canada, chiếm 94% (tương đương 31, 84 triệu hecta) tổng diện tích
gieo trồng đậu tương. Cùng với đó, việc phát triển cây trồng biến đổi gen mang đa tính
trạng, đặc biệt là mang thêm các tính trạng chống chịu đang có xu hướng tăng lên. Cụ
thể theo báo cáo của ISAAA, diện tích gieo trồng cây trồng biến đổi gen mang nhiều
tính trạng tăng từ 58,5 triệu hecta vào năm 2015 lên 75,4 triệu ha vào năm 2016, tăng
16,9 triệu hecta, tương đương 29%. Một số nước như Băng-la-đét đưa việc phát triển

cây trồng biến đổi gen chống chịu các điều kiện bất lợi vào kế hoạch năm năm lần thứ
bảy (2016-2020), Mỹ, Kenya, Uganda, Tanzania, Mơ-zăm-bích, Cơng hịa Nam Phi
với dự án WEMA phát triển giống ngô chịu hạn [87].
Với những hiểu biết sâu sắc về con đường sinh tổng hợp GB ở sinh vật, cùng
với sự phát triển mãnh mẽ của lĩnh vực công nghệ gen, đặc biệt là kỹ thuật tạo cây
trồng biến đổi gen, các nhà khoa học đã phân lập được các gen: codA (COD), COX,
BADH, betA (CDH), CMO, GSMT và SDMT từ nhiều nguồn khác nhau, mã hóa cho
các enzyme tham gia vào q trình sinh tổng hợp GB. Các gen này đã được thiết kế
với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và chuyển thành cơng vào nhiều lồi cây
trồng, các lồi cây trồng biến đổi gen đã được phân tích có sự tích lũy GB dẫn đến
tăng cường được khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường như mặn muối,
khô hạn, lạnh, băng giá, nhiệt độ cao và tác nhân oxy hóa.
Cây lúa chuyển gen CDH và codA phân lập từ vi khuẩn có khả năng tích lũy
một lượng lớn chất GB trong tế bào đã được báo cáo [68]; [61]). Cây lúa chuyển gen


15

cho thấy có sự tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện bị stress muối, lạnh và
hạn. Sự cải thiện khả năng chịu mặn đã được quan sát thấy ở các cây lúa chuyển gen
COX, hàm lượng GB tích lũy thậm chí thấp hơn so với hàm lượng GB tích lũy ở cây
lúa chuyển gen CDH và codA [66]. Kết quả tương tự cũng được công bố ở cây lúa
chuyển gen CMO biểu hiện tích lũy GB ở lục lạp [65]. Những kết quả này cho thấy
rằng, mặc dù hàm lượng GB tổng hợp và tích lũy ở cây chuyển gen là khá thấp, nhưng
cây lúa chuyển gen tăng cường khả năng chịu mặn. Có thể, ở cây lúa sự vận chuyển
choline từ tế bào chất tới lục lạp hiệu quả hơn, nơi GB tích lũy được sử dụng hiệu quả
để giảm thiểu các tác hại của muối lên bộ máy quang hợp.
Thiếu nước hoặc hạn hán là một trong những hạn chế nghiêm trọng nhất của
môi trường đến sản xuất nông nghiệp. Những nghiên cứu gần đây đã tiết lộ rằng, ứng
dụng GB ngoại sinh và kỹ thuật di truyền, chuyển gen tham gia sinh tổng hợp GB đều

tăng cường khả năng chịu hạn của cây trồng[56] báo cáo, cây ngơ chuyển gen CDH
biểu hiện và lích lũy GB ở trong lục lạp có khả năng chịu hạn. Ngô chuyển gen cho
thấy cải thiện khả năng chịu hạn ở các giai đoạn phát triển khác nhau, năng suất hạt
của cây chuyển gen cao hơn đáng kể so với các cây đối chứng không chuyển gen. Cây
bông chuyển gen CDH cho thấy cải thiện khả năng chịu hạn[45]. Các cây bơng biến
đổi gen tích lũy hàm lượng GB lên đến 2,3 - 2,9 lần cao hơn so với các cây đối chứng
không chuyển và cho thấy khả năng chịu hạn của cây chuyển gen cao hơn hẳn so với
cây không chuyển gen từ giai đoạn cây con đến giai đoạn cây ra hoa. Tương tự như
vậy, cây lúa chuyển gen codA cũng tăng cường tích lũy GB và cải thiện khả năng chịu
hạn [64]. Hơn nữa, một vài thí nghiệm cho thấy những tác động tích cực của việc ứng
dụng GB ngoại sinh trên các loài thực vật bị stress về nước. Hiệu quả tương tự cũng
được tìm thấy ở cây hướng dương và cây thuốc lá dưới điều kiện hạn hán (Iqbal et al.,
2005[39];[46]. Ứng dụng GB ngoại sinh cải thiện tình trạng stress nước, kết quả sản
xuất sinh khối tăng lên trong các loài thực vật này.
Nhiệt độ thấp là một yếu tố môi trường giới hạn phân bố địa lý và mùa sinh
trưởng của nhiều loài thực vật và thường ảnh hưởng xấu đến chất lượng cây trồng và
năng suất [69]. Các tác hại của stress nhiệt độ thấp đối với nhiều loài cây trồng là làm
giảm tốc độ tăng trưởng, giảm năng suất và thậm chí làm chết cây [48]. Các kết quả
nghiên cứu đã chứng minh rằng ứng dụng GB ngoại sinh giúp bảo vệ thực vật bậc cao


16

chống chịu tốt với điều kiện môi trường bị stress nhiệt độ thấp [37]. Ứng dụng kỹ thuật
di truyển về sinh tổng hợp GB trong một số loài cây trồng đã cho thấy tăng cường tính
chống chịu với điều kiện môi trường bị stress nhiệt độ thấp ở tất cả các giai đoạn khác
nhau của sự phát triển của cây chuyển gen. Cây Arabidopsis chuyển gen codA, tăng
cường chịu stress lạnh đã đạt được trong quá trình nảy mầm [14]. Cây chuyển gen cho
thấy tỷ lệ nảy mầm tăng cao so với cây đối chứng không chuyển gen. Kết quả tương tự
cũng được báo cáo ở cây lúa chuyển gen codA và cây thuốc lá chuyển gen BADH [19];

[33].
Trong cây cà chua chuyển gen codA, mặc dù hàm lượng GB tích lũy rất thấp
nhưng cây cà chua biến đổi gen biểu hiện tăng cường khả năng chịu lạnh ở tất cả các
giai đoạn phát triển, từ hạt giống nảy mầm đến giai đoạn sinh sản. Tăng cường khả
năng chịu lạnh trong sự hiện diện của mức độ rất thấp GB có thể là do mức ngưỡng rất
thấp GB nội sinh (0,1 mmol/g trọng lượng tươi) là đủ để cung cấp bảo vệ đầy đủ
chống lại stress lạnh trong cà chua biến đổi gen [52]. Thêm vào đó, cây cà chua
chuyển gen codA nhắm mục tiêu tích lũy GB ở trong tế bào chất và trong lục lạp, cho
thấy một mối tương quan giữa tích lũy GB trong các khoang này với khả năng chịu
nhiệt độ thấp, muối và oxy hóa [53]. Cây cà chua chuyển gen codA hướng mục tiêu
tích lũy GB ở trong tế bào chất (cytosolic) cho thấy sự tích lũy GB tăng gấp 5 - 6 lần
so với cây cà chua chuyển gen codA hướng mục tiêu tích lũy GB ở trong lục lạp. Mặc
dù, sự tích lũy GB thấp ở cây chuyển gen codA hướng mục tiêu lục lạp nhưng vẫn cho
thấy cây chuyển gen tăng cường khả năng chịu lạnh, muối và các căng thẳng về oxy
hóa.
Stress nhiệt độ thấp gây ra rối loạn chức năng màng tế bào hoặc biến tính
protein, gây ra một sự xáo trộn trong hệ thống vận chuyển điện tử vào trong màng ty
lạp thể hoặc chloroplastic và dẫn đến việc sản xuất chất oxy phản ứng (ROS) [49].
Nồng độ ROS cao trong tế bào sẽ gây tổn hại, ảnh hưởng đến các thành phần tế bào và
cũng cản trở việc sửa chữa phức hợp PSII bằng cách ức chế sinh tổng hợp de novo
protein [30]. Park và đtg (2007a) cho rằng một trong những lý do có thể bảo vệ tốt hơn
chống lại stress nhiệt độ thấp ở cây cà chua chuyển gen codA hướng mục tiêu tích lũy
GB trong lục lạp có thể là cải thiện khả năng vận chuyển oxy của phức hợp PSII do
các sửa chữa được cảm ứng bởi GB[53]. Một lý do khác, có thể là GB ổn định toàn