Tangmany SYSOMEPHONE

THIẾT KẾ CẤU TRÚC VECTOR BIỂU HIỆN
MANG GEN MÃ HĨA ENZYME COLUMBAMINE
O- METHYLTRANSFERASE Ở CÂY BÌNH VƠI
(Stephania spp.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN, NĂM 2020


1


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
----------------------------------

Tangmany SYSOMEPHONE

THIẾT KẾ CẤU TRÚC VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN MÃ
HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE

Ở CÂY BÌNH VƠI (Stephania spp.)
Chun ngành: Di truyền học
Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. Phạm Thị Thanh Nhàn

THÁI NGUYÊN, NĂM 2020

2


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn: “Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang
gen mã hóa enzyme columbamine O-methyltransferase ở cây Bình vơi
(Stephania spp.)” là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Mọi kết quả thu
được là trung thực, không sao chép từ kết quả nghiên cứu khác. Tất cả những
tham khảo và kế thừa đều được trích dẫn đầy đủ.
Thái Nguyên, tháng 11 năm
2020
Tác giả luận văn

Tangmany SYSOMEPHONE

i


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin chân thành cảm ơn chính phủ hai nước Lào và Việt Nam đã dành
cho tôi học bổng học tập, để tơi có thể bước chân vào học tập và nghiên cứu
tại Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thị Thanh Nhàn,
người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tơi trong
q trình nghiên cứu và hồn thành luận văn. Tơi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ
trợ của Đề tài cấp Bộ mã số B2019-TNA-09.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, bộ phận Sau đại

học của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã trang bị
cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý giá về các môn học liên quan đến
chuyên ngành của tơi và tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học.
Tôi xin cảm ơn ThS. Trần Thị Hồng, cán bộ phịng thí nghiệm Cơng
nghệ gen và Cơng nghệ tế bào của Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm –
Đại học Thái Nguyên, đã giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong q trình thực hiện thí
nghiệm.
Tơi xin cảm ơn những ý kiến nhận xét của các thầy cô trong Hội đồng
đánh giá luận văn ngày 16 tháng 11 năm 2020.
Tôi xin cảm ơn tồn thể đồng nghiệp, gia đình, bạn bè đã động viên, giúp
tơi vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và sinh
sống tại Thái Nguyên, Việt Nam.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020
Tác giả luận văn

Tangmany SYSOMEPHONE
ii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN............................................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN..................................................................................................................................... ii
MỤC LỤC........................................................................................................................................... iii
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT........................................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH........................................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................................... vii
MỞ ĐẦU............................................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................................... 3
1.1. Cây Bình vơi............................................................................................................................... 3

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học cơ bản của cây Bình vơi

3

1.1.2. Giá trị của cây Bình vơi …………………………………………....

7

1.1.3. Hiện trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen cây bình vơi …………. 12
1.2. Gen CoOMT ở cây Bình vơi và bộ Mao lương……………………… 13
1.3. Vector biểu hiện gen và ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện
hàm lượng dược chất có hoạt tính ở cây thuốc ………………......………......15
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................22
2.1. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................................. 22
2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu................................................................ 23
2.2.1. Hóa chất nghiên cứu........................................................................................................ 23
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu.......................................................................................................... 24
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu....................................................................................................... 24
2.3. Phương pháp nghiên cứu ……....................................................................24
2.3.1. Nhóm phương pháp tạo dòng gen............................................................................ 24
2.3.1.1. Thiết kế mồi colony- PCR........................................................................................ 24

iii


2.3.1.2. Tạo vector pUC19_1113bp tái tổ hợp................................................................ 25
2.3.1.3. Tạo dòng vi khuẩn tái tổ hợp mang vector pUC19_1113bp...................25
2.3.1.4. Tách chiết và tinh sạch plasmid............................................................................ 26
2.3.2. Nhóm phương pháp thiết kế vector biểu hiện mang gen đích...................27
2.3.2.1. Xử lý enzyme cắt giới hạn....................................................................................... 27

2.3.2.2. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR.................................................................. 28
2.3.2.3. Gắn gen CoOMT 1113 bp vào vector pBI121............................................... 28
2.3.2.4. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli bằng phương pháp sốc
nhiệt...................................................................................................................................................... 29
2.3.2.5. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR).........................29
2.3.2.6. Tách chiết plasmid từ tế bào E.coli..................................................................... 30
2.3.2.7. Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới
hạn.......................................................................................................................................................... 31
2.3.2.8. Phương pháp biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens bằng xung
điện......................................................................................................................................................... 31
2.3.2.9. Chọn dòng A. tumefaciens tái tổ hợp.................................................................. 32
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................... 33
3.1. Nghiên cứu lý thuyết về đặc điểm trình tự gen và protein CoOMT..........33
3.2. Kết quả tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang gen nhân tạo
CoOMT................................................................................................................................................ 35
3.3. Kết quả thiết kế vector pBI121-1113 và tạo chủng Agrobacterium
tumefaciens tái tổ hợp mang gen CoOMT......................................................................... 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ....................................................................................................... 40
CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CƠNG BỐ.............................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................................... 42

iv


Chữ viết tắt
DNA
cDNA
CoOMT
Cs/cs
EB

EDTA
EST
Fw
LB
OMT
PCR
Rv
SDS
SMT

SOC

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hình ảnh về cây Bình vơi………..................................................................... 6
Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của palmatin và L-tetrahydropalmatin (rotundin)
................................................................................................................................................................... 11
Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine............14
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121……………………… 16
Hình 1.5. Sự tương tác của Agrobacterium và cơ chế chuyển T-DNA…...

18

Hình 1.6. Cấu trúc Ri-plasmid của A. rhizogenes……………………………

19


Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc vector pUC19……………………………..................22
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc vector pBI121…………… …………………….. 23
Hình 3.1. So sánh trình tự amino acid suy diễn của các enzyme OMT trong
con đường tổng hợp palmatine................................................................................................. 34
Hình 3.2. Mơ hình cấu trúc khơng gian 3D của protein CoOMT...……….....34
Hình 3.3. Cấu trúc thứ cấp của protein CoOMT............................................................ 35
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony- PCR...................................................... 36
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm cắt xử lý vector PUC-1113 và vector
pBI121 với enzyme XbaI và SacI........................................................................................... 37
Hình 3.6. Kết quả chọn dịng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong E. Coli 37
Hình 3.7. Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong
A.tumefaciens.................................................................................................................................... 38

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số lồi thuộc
chi Bình vơi Stephania…………………………………………………………... 10
Bảng 2.1. Cặp mồi đặc trưng của phản ứng colony- PCR......................................... 24
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng nối ghép gen................................................................ 25
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng colony-PCR…………………………….. 26
Bảng 2.4. Thành phần dung dịch tách plasmid …………………………... 27
Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn........................................ 28
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối ghép gen................................................................ 28
Bảng 2.7. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn………………... 31
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng PCR…………………………………….. 32

vii



MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Bình vơi có tên khoa học là Stephanta spp., họ Tiết dê (Menispermaceae),
là một loài cây thân thảo dạng dây leo, phần rễ phát triển thành củ to, bám vào
núi đá, có củ nặng tới hơn 40kg. Vỏ thân củ màu đen, xù xì giống như hòn đá.
Củ còn được gọi là “củ một”, “củ mối trơn”, “ngải tượng”, “tử nhiên”… Cây
Bình vơi thường ưa mọc ở những vùng có núi đá tại tỉnh Hà Giang, Tun
Quang, Hịa Bình, Hà Tây (cũ) … Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất
alkaloid: L-tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin.
Những hợp chất này được sử dụng phổ biến để điều chế các loại thuốc quý có tác
dụng an thần, dưỡng huyết, thanh nhiệt, giải độc, giảm đau, sốt nóng, đau dạ dày,
trị ho có đờm, hen suyễn, khó thở… Hiện nay, cây Bình vơi đang bị khai thác
nhiều, số lượng cây Bình vơi tự nhiên ngày càng giảm mạnh. Bình vôi đã được
ghi trong Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp”

(V) và Danh mục Thực vật rừng quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số
32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ.
Chi Bình vơi (Stephanta) có khoảng trên 45 lồi, cịn ở Việt Nam có từ 14
đến 16 lồi, trong đó một số lồi như Bình vơi hoa đầu (Stephania cepharantha
Hayata), Bình vơi tím (Stephania rotunada Lour), Thiên kim đằng (Stephania
japonica Miers) đang được khai thác, và nhìn chung hàm lượng rotundin của các
lồi Bình vơi là thấp và rất thấp, tùy thuộc từng lồi và điều kiện sinh thái. Do
vậy, định hướng nghiên cứu nhằm tăng hàm lượng rotundin
ở cây Bình vơi được quan tâm, trong đó xác định việc tăng cường biểu hiện
enzyme chìa khóa tham gia trong q trình chuyển hóa tổng hợp rutundin là rất
quan trọng. Columbamine O-methyltransferase (CoOMT) mới được phát hiện là
một enzyme chìa khóa trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp rotundin ở cây thuộc bộ
Mao lương, trong đó có cây Bình vơi [77]. Biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme

CoOMT sẽ làm tăng các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp và hàm lượng
1


rotundin trong cây Bình vơi được nâng cao. Xuất phát từ những lí do trên
chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài: “Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện
mang gen mã hóa enzyme columbamine O- methyltransferase ở cây Bình
vơi (stephania spp.)”.
2.

Mục tiêu nghiên cứu
Thiết kế được cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme

columbamine O- methyltransferase ở cây Bình vơi.
3.

Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu lý thuyết về đặc điểm trình tự gen và protein CoOMT.
- Tạo dịng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang gen nhân tạo CoOMT.
- Thiết kế vector chuyển gen pBI121-1113 và tạo chủng Agrobacterium
tumefaciens tái tổ hợp mang gen CoOMT.

2


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây Bình vơi
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học của cây Bình vơi
Về nguồn gốc, phân loại: Chi Bình vơi hay chi Thiên kim đằng (danh
pháp khoa học: Stephania, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có

hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có
nguồn gốc ở miền đơng và nam châu Á cũng như Australasia. Tên gọi dân dã
trong tiếng Việt là Bình vơi [91].
Về mặt phân loại, cây Bình vơi thuộc:
Giới (regnum):

Plantae

Bộ (ordo):

Ranunculales

Họ (familia):

Menisperrnaceae

Chi (genus):

Stephania Lour [13].

Trên thế giới chi Bình vơi (genus: Stephania) có khoảng 50 lồi, phân bố
ở vùng nhiệt đới, chủ yếu như là các nước châu Á như: Trung Quốc 43 loài, Thái
Lan 18 loài, Indonesia 17 loài, Việt Nam 14-16 loài, Malaysia 17 loài, Ấn

Độ 11 loài, Philippine 8 loài, Papua New Guinea 8 loài, Myanma 5 loài, Nhật
Bản 2 loài, Sri Lanka 2 loài, Lào 2 lồi, Đơng Timor 1 lồi, Nepal 1 lồi.
Ngồi ra cịn có ở châu Úc: Australia 7 lồi và châu Phi 12 lồi [11].
Ở

Việt Nam, các lồi trong chi Bình vơi phân bố rất rộng, trên nhiều địa


phương từ Bắc vào Nam. Song các khu vực có số lồi phong phú, đa dạng và
tập trung hơn cả ở các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Yên Bái, Bắc Cạn,
Tuyên Quang, Phú Thọ, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Lai Châu, Sơn La, Hịa
Binh, Hà Tây, Hà Nam, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh. Một số ít
lồi (S. venosa, S. cambodica, Gagnep, S. pierrei) chỉ gặp ở các tỉnh phía Nam
như: Đắc Lắc, Lâm Đồng, Bình Định, Phú Yến, Ninh Thuận, Khám Hòa, Bà
Rịa-Vũng Tàu và An Giang [8].

3


Đặc điểm sinh học
Các lồi trong chi Bình vơi (Stephania) đều là dây leo, sống lâu năm
hoặc hằng năm. Ở giai đoạn non thân thường nhẵn, màu xanh nhạt, xanh bóng
hoặc xanh đậm. Trên thân già thường có những rãnh dọc, những mụn cóc sần
sùi, màu nâu xám, nâu đen hoặc màu nâu đất. Rễ dạng sợi hoặc phình to tạo
thành rễ củ. Củ rất đa dạng về hình thái, kích thước và màu sắc. Củ thường có
dạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hoặc hình dạng bất định. Có loài rễ củ
thường chỉ nặng 0,5 – 2kg (hoặc 3 kg), nhưng cũng có lồi cho củ có thể nặng
tới 50-70 kg. Tuy thuộc vào từng loài, tuổi cây và điều kiện mơi trường sống
mà hình thái, màu sắc vỏ củ cũng có nhiều thay đổi (nhẵn hoặc xù xì, màu nâu
sáng, nâu đậm, xám tro, đen…). Thịt củ nạc hoặc có lẫn những vằn xơ, màu
trắng ngà, vàng tươi, vàng nhạt hoặc đỏ nâu, đỏ tươi [16].
Lá Bình vơi mọc cách. Cuống lá thường mảnh, dài 2 đến 5 hoặc 15 đến 20
cm và hai đầu phồng lên [8], có khi gấp khúc ở gốc [11]. Cuống lá đính vào lá
thường ở những vị trí cách xa mép dưới của gốc là ở những khoảng cách nhất
định, tùy thuộc vào từng lồi (có thể từ 1/5 đến 1/3 chiều dài phiến lá). Phiến lá
mỏng hoặc dài, nhẵn mỏng hoặc rải rác có lơng, hình khiên, hình tam giác rộng,
hình trứng-tam giác, tam giác tròn hoặc gần tròn; mép lá nguyên hoặc chia thùy;

gân lá dạng chân vịt, gồm 8-9 hoặc 10-12 gân chính cùng xuất phát từ đỉnh
cuống lá. Chóp lá nhọn, thn nhọn, tù hoặc gần trịn; gốc lá gần trịn, phằng
hoặc gần hình tim. Màu sắc của phiến lá tùy thuộc vào từng loài (màu xanh nhạt,
xanh vàng nhạt, xanh đậm, xanh nâu nhạt hoặc đốm tía) [24].
Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực, cái thường mọc từ kẽ lá. Cụm hoa có
dạng tính tán đơn, tán kép, xim tán kép, hình đầu đến tán ngù [8], có cuống đơn
độc hoặc xếp theo kiểu chum ít nhất ở các nhánh tán cấp 1, các nhánh cuống
cùng đôi khi không đều hoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa [13]. Hoa
đực thường có cấu tạo đối xứng tỏa tròn, đài 6-8 rời, xếp thành 2 vịng; 3-4 cánh
hoa, dạng vỏ sị, màu vàng, đơi khi trắng xanh; nhị 2-6, thường
4


4, chỉ nhị dính nhau tạo thành ống hình trụ, đầu nhụy xòe thành đĩa tròn. Hoa
cái thường chỉ gồm 1 lá đài và 2 cánh hoa (rất ít khi có 3-4 lá đài và 3-4 cánh
hoa), bầu hình trứng có 4 đến 6 hoặc 7 núm nhụy hình dùi [24].
Quả hạch, dạng hình gần trịn, hình trứng, trứng bầu, 2 bên dẹt. Ở quả
trưởng thành cuống quả lệch về một phía gần với dấu vết cịn lại của núm
nhụy. Bầu 2 nỗn, nhưng chỉ có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng. Hạt
hình móng ngựa, hình trứng đẹp hoặc hơi trịn, 2 mặt bên lõm, ở giữa có lỗ
thủng hoặc khơng, dọc theo gờ lưng bụng thường có 4 hàng vằn hoặc gai (một
số lồi có 5 hàng [24]. Đặc điểm hình thái của hạt thường đặc trưng cho từng
taxon; nên đây được coi là một trong những dấu hiệu đáng tin cậy để giám
định tên khoa học đối với các lồi chi Bình vơi [8]. Cây mầm có lá mầm ít
nhiều bằng rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ [14].
Sinh thái, sinh trường và phát triển của các lồi Bình vơi
Các lồi thuộc cây Bình vơi thường sinh trưởng trong các rừng nguyên sinh
hay rừng thứ sinh. Chúng thường mọc trên đỉnh hay các sườn núi đá vôi, núi đất
xen lẫn đá, các dài đất ven đường, ven song, đơi khi gặp ở ven bịe biển. Sống
o


thích hợp ở nhiệt độ trung bình năm 21- 23 C, lượng mưa 2000- 2500 mm, ưa
đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH= 6,5- 7. Một số lồi có thể phân bố

ở độ cao tới 2000 – 2800 m so với mực nước biển. Hầu hết các lồi Bình vơi
đều ưa đất có độ ẩm vừa phải và đặc biệt ở giai đoạn ra hoa tạo quả.
Các lồi Bình vơi hiện có ở Việt Nam có 2 thời vụ chồi chính trong năm.
Vụ chồi đông xuân, bao gồm các chồi sớm xuất hiện (trên thân và trên đầu củ)
ngay từ tháng 11- 12. Những chồi này ở trạng thái “chồi ngủ” cho đến mùa
xuân (tháng 1- 2) thì bắt đầu thời kỳ sinh trưởng mạnh. Chỉ trong vòng 1- 2
tháng, chồi đã dài tới hơn 1 m. Chồi đông xuân là lứa chồi quan trọng nhất của
cây Bình vơi, vì trên loài chồi này cây sẽ ra lá, ra hoa, quả và mọc ra lứa chồi
xuân hè (chồi cấp II). Số lá chồi cấp II nhiều hơn cấp bội so với chồi đơng xn
(tính trên cùng một đơn vị chiều dài của chồi). Lá trưởng thành ngay trong mùa
5


hè và sẽ rụng hết khi mùa khô hanh (tháng 10). Sự rụng lá hàng năm cũng là
tập tính quang trọng của cây Bình vơi. Sự tái sinh chồi mạnh mẽ của cây Bình
vơi cịn thể hiện ở khả năng mọc mầm trên các mảnh bổ ra từ củ đem vùi
xuống đất. Những mảnh ở đầu củ (khoảng 1/3 củ trở lên) mọc mầm tốt hơn
những mảnh khác. Có thể áp dụng khả năng này để nhân giống cây Bình vơi.
Trong tự nhiên, hoa Bình vơi được thụ phấn chéo chủ yếu nhờ cơn trùng.
Hạt Bình vơi thường rất nhỏ, khối lượng trung bình của 1000 hạt
thường chỉ khoảng 10- 29g. Hạt phát tán nhờ nước. Các cá thể Bình vôi trồng
từ hạt thường sinh trưởng, phát triển khá nhanh. Chỉ sau 5- 6 tháng tuổi, cây
đã vươn dài tới 50-100) cm, phân cành khỏe. Ở một số loài, cây có thể bắt đầu
ra hoa và cho quả khi mới bước vào giai đoạn 6- 8 tháng tuổi. Trong quá trình
sinh trưởng, rễ chính thường lớn dần tạo thành củ (ở những lồi có củ) hoặc
phân nhánh nhiều tạo thành rễ dạng sợi (ở những lồi chỉ có rễ dạng sợi) [8].


Hình 1.1. Hình ảnh về cây Bình vơi
(Nguồn: />
6


1.1.2. Giá trị của cây Bình vơi
Trong nhân dân củ Bình vơi được sử dụng là một vị thuốc dân gian. Củ
Bình vơi thái nhỏ, phơi khơ được dùng dưới dạng sắc hay ngâm rượu chữa
hen, ho lao, lỵ, sốt, đau bụng.
Theo kinh nghiệm trong y học cổ truyền, Bình vôi được dùng dưới dạng
thuốc sắc, thuốc bột hoặc rượu thuốc để chữa bệnh mất ngủ, sốt nóng, nhức
đầu, đau dạ dày, ho nhiều đờm, hen suyễn khó thở… Liều dùng: 6 - 12 g/ngày
[2], [3]. Thuốc ngâm rượu gồm bột Bình vơi (1 phần) với rượu 40° (5 phần);
mỗi ngày uống 5 - 15 ml rượu, có thể thêm đường cho dễ uống [6]. Để tránh
bị ngộ độc, nên sử dụng liều lượng 0,02 – 0,025g đối với trẻ 1 – 5 tuổi; 0,03 –
0,05g đối với trẻ 5 – 10 tuổi [6], [21]. Trong y học hiện đại, Bình vơi chủ yếu
được dùng làm ngun liệu chiết xuất lấy L-tetrahydropalmatin hoặc
cepharanthin tuỳ theo loài. L-tetrahydropalmatin (Rotundin) được dùng là
thuốc trấn kinh, an thần dùng trong các trường hợp: Mất ngủ, trạng thái căng
thẳng thần kinh, một số trường hợp rối loạn tâm thần [6], [17], [94]. Liều
dùng là 0,05g - 0,10g dưới dạng viên L-tetrahydropalmatin hydroclorid hoặc
sulfat [6], [94].
Trong củ Bình vơi chứa một lượng chất alkaloid: L-tetrahydropalmatin
(rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin. Những hợp chất này được sử dụng
phổ biến để điều chế các loại thuốc. Các alkaloid này thuộc nhóm alkaloid
dẫn xuất của nhân isoquinolin. Trong đó quan trọng nhất là rotundin.
Một số kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính sinh học của alkaloid và
rotudin trong cây như sau:
Alkaloid là một hợp chất hữu cơ chứa nitơ, đa số có nhân vịng, có phản

ứng kiềm, thường gặp ở thực vật và đơi khi trong động vật, có dược lực tính
mạnh và độc, cho kết tủa và phản ứng màu với một số thuốc thử gọi là thuốc
thử của alkaloid. Các alkaloid trong cây tồn tại dưới dạng muối với các hợp
chất hữu cơ như acid succinic, acid oxalic, acid malic, acid meconic [55].
7


Alkaloid thường là các chất có trọng lượng phân tử cao, ở thể rắn ở nhiệt
độ thường. Các alkaloid ở thể rắn thường là các alkaloid không bay hơi, các
alkaloid bay hơi thường ở thể lỏng. Ở thể rắn, chúng dễ kết tinh và có độ chảy
xác định. Một số alkaloid không đo được độ chảy do bị phá hủy ở nhiệt độ
thấp hơn độ chảy. Các alkaloid ở dạng lỏng thường khơng có oxy trong phân
tử (nicotin, spartein). Các alkaloid ở dạng lỏng dưới dạng tự do nhưng khi tạo
muối với acid thì nó có thể chuyển sang thể rắn (spartein ở thể lỏng nhưng
spartein sulfat ở thể rắn). Tuy nhiên có một vài trường hợp ngoại lệ một số
alkaloid có oxy trong phân tử nhưng vẫn ở thể lỏng như arecolin, pilocarpin
[16], [4].
Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất rất
độc. Tác dụng của alkaloid thường khác nhau ở những loại cây khác nhau.
Trên thế giới hiện nay dùng nhiều thuốc tổng hợp nhưng vẫn không bỏ được
các alkaloid lấy từ cây cỏ, vì có chất chưa tổng hợp được, và cũng có nhiều
thuốc sản xuất tổng hợp khơng rẻ hơn chiết xuất hoặc tác dụng của chất tổng
hợp chưa bằng tác dụng của các chất lấy từ cây. Do đó, người ta vẫn dùng
phương pháp chiết xuất từ cây, ví dụ như ajmalin, morphin, reserpin, quinin,
eserin hoặc vừa sử dụng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên vừa tổng hợp vừa
bán tổng hợp, ví dụ như: ajimalisin, theobromin, cafein, ephedrine, atropine,
vincamin [16], [4], [8].
Trước đây, người ta cho rằng nhân cơ bản của các alkaloid là do các chất
đường hay thuộc hợp chất của đường kết hợp với ammoniac để có nitơ mà sinh
ra. Ngày nay bằng phương pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng

xạ) người ta chứng minh được alkaloid tạo ra từ các acid amin. Qua định tính và
định lượng alkaloid trong các bộ phận khác nhau của cây và theo dõi sự thay đổi
của chúng trong quá trình phát triển của cây, người ta thấy nơi tạo ra alkaloid
khơng phải ln ln là nơi tích tụ alkaloid. Nhiều alkaloid được tạo

8


ra ở rễ lại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thực hiện những
biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả hoặc hạt.
Năm 1941, Trần Xuân Thuyết cùng với Đỗ Tất Lợi và P. Bonnet đã phát
hiện ra hỗn hợp alkaloid của củ Bình vơi, đặt tên là rotundin - có tác dụng an
thần gây ngủ, hạ huyết áp, điều hòa tim, giãn cơ trơn, do đó giảm các cơn đau
do co thắt cơ trơn [96].
Năm 1998, Nguyễn Tiến Vững và cs đã tiến hành thăm dò tác dụng của
L-tetrahydropalmatin trên điện não thỏ. Tất cả các thỏ được tiến hành đặt điện
cực vào vùng cảm giác, vận động và thể lưới thân não. Kết quả là sau khi cho
thỏ uống L-tetrahydropalmatin với liều 100 mg/kg thể trọng trong 7 ngày liền,
thành phần các sóng điện não trong vỏ não vùng cảm giác-vận động và trong
thể lưới thân não có những biến động rõ. Sự tăng thành phần sóng chậm denta
và giảm thành phần sóng nhanh beta chứng tỏ rằng L-tetrahydropalmatin có
tác dụng tăng cường quá trình ức chế trong các tế bào thần kinh ở vỏ bán cầu
đại não và thể lưới thân não [14].
Năm 1996, Dương Hữu Lợi thử nghiệm tiêm cho chuột nhắt trắng 0,1 ml
dung dịch L- tetrahydropalmatin ở các nồng độ khác nhau 0,5%, 1%, 2% nhận
thấy đều có tác dụng làm chuột nhắt trắng trấn tĩnh, tác dụng này được duy trì
trong vịng 3-5 giờ [4].
Theo Zhu (1991), D-tetrahydropalmatin và L-tetrahydropalmatin được
phân lập từ nhiều loài thuộc chi Stephania và cây Corydalis ambigua khơng
chỉ có tác dụng giảm đau mà cịn có tác dụng an thần gây ngủ [90].

Năm 1986, Phạm Duy Mai và Phan Đức Nhuận nghiên cứu đã cho thấy
gindarin hydroclorid (L- tetrahydropalmatin hydroclorid) và hỗn hợp alkaloid
chiết từ củ Bình vơi đều tăng cường tác dụng gây ngủ của thiopental một cách
rõ rệt. Gindarin hydroclorid với liều 30 mg/kg thể trọng chuột có khả năng
kéo dài thời gian ngủ lên 1,5 lần. Hỗn hợp alkaloid với liều 100 mg/kg thể
trọng chuột cũng có tác dụng tương đương [18].
9


Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số lồi thuộc
chi Bình vơi Stephania
Hoạt tính
Chống sốt rét

Kháng sinh

Diệt giun sán
Chống virus
Chống ung thư

An thần
Kích đẻ cho phụ sản
Đảo chiều đa kháng
Chống viêm và
giảm đau
Miễn dịch
Chặn kênh Ca2+
Chống oxi hóa



10


Nguyễn Tiến Vững đã thử tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của Ltetrahydropalmatin trên chuột nhắt trắng cho thấy L- tetrahydropalmatin đã
kéo dài giấc ngủ của pentotal rất rõ rệt, liều 40 mg/kg thể trọng chuột (bơm
trực tiếp vào dạ dày) đã làm tăng thời gian ngủ cùa chuột lên 8 lần [14].
Theo Mantsch John R, Li Shi-Jiang. L-tetrahydropalmatin có tác dụng
trong điều trị cai nghiện cocain và trong điều trị cai nghiện oxycodone [56].
Rotundin có tên khoa học là L-tetrahydropalmatin, đây là một alkaloid,
lần đầu tiên thu được vào năm 1902 nhờ phương pháp hydro hóa palmatin
trong quá trình nghiên cứu cấu trúc của palmatin theo phản ứng [50].

Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của palmatin và L-tetrahydropalmatin (rotundin)
Rotundin có cơng thức phân tử: C12H25NO4. Khối lượng phân tử là
M=355,43. Danh pháp quốc tế của rotundin: 5,8,13,13a-tetrahydro-2,3,9,10tetramethoxy-6H dibenzo [a, g] quinolizine.
Đây là một hợp chất hữu cơ gồm 4 vịng kết dính, chứa nhân dị vịng
isoquinolin, vì thế nó thuộc loại isoquinolin alkaloid và đó cũng là một trong
các bộ khung alkaloid rất thường gặp trong một số họ thực vật.
Rotundin là hợp chất ít độc và có nhiều hoạt tính vơ cùng phong phú.
Kết quả nghiên cứu ở Liên Xô (cũ), Rumani, Trung quốc đã chỉ ra rằng Ltetrahydropalmatin rất ít độc. Thí nghiệm cho thấy rằng một liều cao hơn 30
mg/kg cơ thể được tiêm vào mạch máu con thỏ chỉ làm thỏ mệt 1-2 ngày,
đồng tử bị liệt nhất thời rồi hết [16], [6].

11


Rotundin được áp dụng từ năm 1944 và suốt trong cuộc kháng chiến
chống Pháp đã được dùng để điều trị có kết quả một số trường hợp đau tim,
mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần. Rotundin
nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp

thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý. Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không
gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất [10].
Năm 2001, Nguyễn Minh Chính sử dụng thuốc tiêm rotundin sulfat có tác
dụng ức chế thần kinh trung ương, tương tự như diazepam [19]. Phạm Thị Kim,
Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện Dinh dưỡng và Học viện
Quân y đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột (150mg/kg thể trọng), tương
đương với 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dược
điển Trung Quốc-1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được
LD50 đường uống. Điều đó chứng tỏ độ an tồn cao của chế phẩm. Rotundin ít
độc. Khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30 mg/kg, con vật đó tuy bị mệt nhất
thời nhưng lại khỏi sau 1-2 ngày. Ở Trung Quốc, ngồi dạng viên 30mg và
60mg, rotundin cịn có ở dạng tiêm là rotundin sunfat, mỗi ống chứa 2ml
(60mg), dùng làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều trị loét dạ dày,
hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh... [10],

[95].
Chu Hongyuan, Jin Guozhang và cộng sự. nghiên cứu cơ chế
giảm đau
của L-tetrahydropalmatin thấy thuốc có tác dụng ức chế receptor dopamin D2,
ứng dụng này đã được sử dụng trong bài thuốc cai nghiện ở Trung Quốc [35].
Một số sản phẩm của rotundin đã được thương mại hóa tại Việt Nam như:
Rotundin của công ty Dược phẩm TW3 [92], Rotundin của Công ty cổ phần
Dược phẩm TW2 [93].
1.1.3. Hiện trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen cây bình vơi
Lồi Bình vơi có khu phân bố chia cắt, sống ở vùng núi đá vôi, nơi cư trú bị
xâm hại do nạn chặt phá rừng. Cây bị đào rễ để làm thuốc dẫn đến nguy cơ tuyệt
chủng cao. Loài đã được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (2007) với cấp đánh
12



giá “sẽ nguy cấp” (Bậc V) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy
cấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006
của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại [12].
Trước tình hình trên cần áp dụng các biện pháp, kỹ thuật nuôi cấy tạo nguồn
nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc ngày một tăng.
1.2. Gen CoOMT ở cây Bình vơi và bộ Mao lương
Hiện nay, hướng nghiên cứu genome và chức năng của các gen trên đối
tượng cây Bình vơi cịn rất mới mẻ. Số trình tự gen đăng trên Ngân hàng gen
Quốc tế chưa nhiều, chủ yếu là các nghiên cứu trình tự gen mã hóa protein
ribosome S2, S3, S4, S7, S8, S11, S12, S14, S15, S16, S18, S19, 23S, 4.5S,
5S, L14, L16, L20, L22, L23, L33, L36, CP43, NADH dehydrogenase subunit
1, NADH dehydrogenase subunit 2, NADH dehydrogenase subunit 5, NADH
dehydrogenase subunit 6, NADH dehydrogenase subunit 7, cytochrome b và
c, RNA polymerase alpha, RNA polymerase beta, photosystem protein,
envelope membrane protein, acetyl-CoA carboxylase beta, ribulose-1,5bisphosphate carboxylase/oxygenase, ATP synthase, Psa A và B, ATPase,
maturase K, ribosomal RNA, tRNA ở cây Stephania. Bên cạnh đó, hệ gen lục
lạp của loài Stephania japonica cũng được xác định trình tự, kích thước của
trình tự được xác định dài 157719 bp [76].
Thực vật bậc cao có rất nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau, gồm hơn
25000 terpenoid, khoảng 12000 alkaloid và 8000 phenolic [36]. Trong đó nhiều
chất có hoạt tính sinh học cao và được dùng làm thuốc, đặc biệt là các alkaloid.
Methyltransferase là enzyme chìa khóa trực tiếp tham gia nhiều con đường sinh
tổng hợp nhiều hợp chất quan trọng [66]. Mỗi methyltransferase trong quá trình
sinh tổng hợp palmatine (gồm có S-adenosyl-L-methionine: norcoclaurine 6-Omethyltransferase (6OMT) [68], [59], [69], [49], [57]; S-adenosyl-L-methionine:
coclaurine N-methyltransferase (CNMT) [43], [83], [33], [34]; S-adenosyl-Lmethionine: 3’ -hydroxy-N-methylcoclaurine 4’-O-methyltransferase
13


(4’OMT)


[57],

[43];

S-adenosyl-L-methionine:

scoulerine

9-O-

methyltransferase (SMT) [58], [78] và CoOMT) địi hỏi tính đặc thù về cơ
chất chặt chẽ cho dù các cơ chất có sự tương đồng về cấu trúc.

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine [77]
Cơng trình nghiên cứu của Takashi Morishige và cs (2002) là cơng trình
đầu tiên đã xác định được gen mã hóa columbamine O-methyltransferase tham

14