ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRIỆU THỊ KIM
Tên đề tài:

NGHIÊN CƢ́U QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ NHÂN SINH KHỚI
NẤM LIM XANH Ganoderma lucidum THU THẬP TẠI THANH HÓA

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Cơng nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2013 - 2017

Thái Nguyên – năm 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRIỆU THỊ KIM
Tên đề tài:

NGHIÊN CƢ́U QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ NHÂN SINH KHỚI
NẤM LIM XANH Ganoderma lucidum THU THẬP TẠI THANH HÓA

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Cơng nghệ sinh học

Lớp

: K45 – CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2013 - 2017

Ngƣời hƣớng dẫn 1 : ThS. Nguyễn Thị Tình

Ngƣời hƣớng dẫn 2 : ThS. Vi Đại Lâm

Thái Nguyên – năm 2017


i

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian thực tập tại phịng thí nghiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công
nghệ Thực Phẩm,Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên,cùng với sự cố gắng của
bản thân và sự giúp đỡ của mọi ngƣời em đã hồn thành khóa luận tốt luận tốt
nghiệp của mình.
Trƣớc hết, em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới Th.S. Nguyễn Thị Tình,
giảng viên Khoa CNSH – CNTP,đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ em hồn thành
khóa luận này,ngƣời hƣớng dẫn em cách thao tác thực hành và chỉ ra cho em những
sai lầm giúp em hoàn thành tốt khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa CNSH – CNTP,
Trƣờng Đại học Nơng Lâm Thái Ngun đã tận tình chỉ bảo,giúp đỡ em trong q
trình học tập và hồn thành khóa luận này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những ngƣời đã ln ở
bên cạnh động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2017
Người thực hiện

Triệu Thị Kim


ii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CD

Corn Detrose

CDA

Corn Detrose Agar

PD

Potato Detrose

PDA

Potato Detrose Agar


iii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3. 1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu. .................................................15
Bảng 3. 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng của độ pH đến khả năng phát triển hệ sợi nấm. .20
Bảng 3. 3: Nghiên cứu ảnh hƣởng của loại đƣờng đến khả năng phát triển hệ sợi
nấm Lim xanh. ..........................................................................................................20
Bảng 3. 4: Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của hàm lƣợng cao nấm men đế n khả năng phát
triể n hê ̣ sơ ̣i từ nấ m tƣ̀ mô thit.̣ ...................................................................................21
Bảng 3. 5: Nghiên của ảnh hƣởng của hàm lƣợng Pepton đến khả năng phát triển hệ

sợi nấm từ mô thịt. ....................................................................................................21
Bảng 3. 6: Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của tố c đô ̣ lắ c đế n khả năng nhân sinh khối của
hê ̣ sơ ̣i nấ m Lim xanh. ................................................................................................22
Bảng 4. 1: Đƣờng kính sinh trƣởng của hệ sợi nấm Lim xanh trên các môi trƣờng
PDA và PDA + 10% nƣớc dừa. ................................................................................28
Bảng 4. 2: Đƣờng kính sinh trƣởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các điều kiện pH
khác nhau...................................................................................................................30
Bảng 4. 3: Đƣờng kính sinh trƣởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các loại đƣờng khác
nhau. ..........................................................................................................................32
Bảng 4. 4: Đƣờng kính sinh trƣởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các mơi trƣờng có
bổ sung cao nấm men với tỷ lệ khác nhau. ...............................................................34
Bảng 4. 5: Đƣờng kính sinh trƣởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các mơi trƣờng có
bổ sung pepton với tỷ lệ khác nhau. ..........................................................................36
Bảng 4. 6: Sinh khối nấm thu đƣợc trên các môi trƣờng khác nhau. ........................39
Bảng 4. 7: Sinh khối nấm thu đƣợc trên các tốc độ lắc khác nhau. ..........................40
Bảng 4. 8: Ảnh hƣởng của dung môi tới hiệu quả trích ly polysaccharide trong
nấm Lim xanh. ..........................................................................................................42
Bảng 4. 9: Ảnh hƣởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu quả trích ly
polysaccharide trong nấm Lim xanh. ........................................................................43
Bảng 4. 10: Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hiệu quả trích ly polysaccharide trong
nấm Lim xanh. ..........................................................................................................45


iv

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Hình thái quả thể nấm Lim xanh thu nhận từ Thanh Hóa và ni trồng tại
trƣờng Đại học Nơng Lâm Thái Ngun ....................................................................5
Hình 3.1: Quy trình phân lập giống nấm Lim xanh. .................................................18

Hình 3.2: Sơ đồ quy trình ni sinh khối hệ sợi nấm Lim xanh ...............................22
Hình 3.3: Sơ đồ quy trình trích ly polysaccharide từ sinh khối nấm Lim xanh. .......25
Hình 4. 1: Nấm lim xanh phát triển trên một số môi trƣờng cơ bản(sau 13 ngày ni
cấy). ...........................................................................................................................27
Hình 4. 2: Biểu đồ thể hiện sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Lim xanh trên mơi trƣờng
PDA và PDA + 10% nƣớc dừa .................................................................................29
Hình 4. 3: Biểu đồ thể hiện sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các điều kiện
pH khác nhau. ............................................................................................................30
Hình 4. 4: Sự sinh trƣởng của nấm Lim xanh trên 3 mơi trƣờng có pH lần lƣợt là 4;
6,5; 8 (sau 12 ngày ni cấy). ...................................................................................32
Hình 4. 5: Biểu đồ thể hiện sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các loại
đƣờng khác nhau. ......................................................................................................33
Hình 4. 6: Sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các loại đƣờng khác nhau (sau
12 ngày nuôi cấy). .....................................................................................................33
Hình 4. 7: Biểu đồ thể hiện sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các mơi
trƣờng có bổ sung cao nấm men với tỉ lệ khác nhau.................................................34
Hình 4. 8: Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của hàm lƣợng cao nấm men đế n khả năng phát
triể n hê ̣ sơ ̣i từ nấ m tƣ̀ mô thiṭ (sau 6 ngày ni cấy). ...............................................35
Hình 4. 9: Biểu đồ thể hiện sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các mơi
trƣờng có bổ sung Pepton với tỉ lệ khác nhau ...........................................................36
Hình 4. 10: Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của hàm lƣợng Pepton đế n khả năng phát
triể n hê ̣ sơ ̣i từ nấ m tƣ̀ mô thiṭ (sau 6 ngày ni cấy). ...............................................37
Hình 4. 11: Sơ đồ quy trình kiểm tra giống nấm Lim xanh đã phân lập ..................37
Hình 4. 12: Hình thái quả thể nấm Lim xanh đƣợc thu thập từ Thanh Hóa và nấm


v

Lim xanh đƣợc nuôi trồng tại trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên .........................38
Hình 4. 13: Biểu đồ thể hiện đƣờng cong sinh trƣởng của sinh khối nấm Lim

xanh trên các mơi trƣờng khác nhau. ........................................................................39
Hình 4. 14: Sự sinh trƣởng của sinh khối nấm Lim xanh trên các môi trƣờng
khác nhau (sau 6 ngày ni cấy). ..............................................................................40
Hình 4. 15: Biểu đồ thể hiện đƣờng cong sinh trƣởng của sinh khối nấm Lim
xanh trên các tốc độ lắc khác nhau............................................................................41
Hình 4. 16: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của dung môi đến q trình trích ly
polysaccharide trong nấm Lim xanh. ........................................................................42
Hình 4. 17: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của tỉ lệ ngun liệu/dung mơi đến hiệu
quả trích ly polysaccharide trong nấm Lim xanh. .....................................................44
Hình 4. 18: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hiệu quả trích ly
polysaccharide trong nấm Lim xanh. ........................................................................45
Hình 5. 1: Sơ đồ quy trình phân lập giống nấm Lim xanh........................................47
Hình 5. 2: Sơ đồ quy trình ni cấy sinh khối giống nấm Lim xanh ........................49
Hình 5. 3: Sơ đồ quy trình trích ly polysaccharide từ sinh khối nấm Lim xanh. ......50


vi

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................... ii
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... iv
MỤC LỤC ................................................................................................................. vi
PHẦN 1 MỞ ĐẦU .....................................................................................................1
1.1.Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2. Mục đích nghiên cƣ́u ............................................................................................2
1.3. Yêu cầ u .................................................................................................................2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................4
2.1. Nấm Lim xanh......................................................................................................4
2.1.1. Nguồ n gố c và phân loa ̣i nấm Linh xanh. ..........................................................4
2.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ...........................................................................5
2.1.3. Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm Lim xanh .................................6
2.1.4. Tác dụng của nấ m Lim xanh. ............................................................................6
2.2. Giới thiệu về polysaccharide ................................................................................7
2.3. Tổng quan về phân lập. ........................................................................................9
2.4. Nuôi cấy sinh khối nấm Lim xanh trong môi trƣờng lỏng. .................................9
2.4.1. Nuôi cấy hệ sợi nấm Lim xanh trong môi trƣờng lỏng .....................................9
2.4.2. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy lỏng tới sự phát triển của hệ sợi nấm Lim
xanh. ..........................................................................................................................11
2.5. Tình hình nghiên cứu nấm Lim xanh trong và ngồi nƣớc................................12
2.5.1. Tình hình nghiên cứu nấm Lim xanh ngồi nƣớc. ..........................................12
2.5.2. Tình hình nghiên cứu nấm Lim xanh trong nƣớc. ..........................................13
Phần 3 ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............15
3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................15


vii

3.2. Điạ điể m và thời gian nghiên cƣ́u ......................................................................15
3.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................16
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................16
3.4.1.Phƣơng pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật phân lâ ̣p giố ng nấ m
Lim xanh Thanh Hóa ta ̣i trƣờng Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm Thái Nguyên . .........................16
3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nhân sinh
khớ i sơ ̣i nấ m Lim xanh bằ ng hê ̣ thố ng nuôi cấ y lỏng . ..............................................21
3.4.3. Phƣơng pháp nghiên cứu nội dung 3: Nghiên cứu thu tách chiế t
polysaccharides trong dich

̣ huyề n phù tế bào nấ m Lim xanh (thu sinh khối từ bào tử
nấm lim xanh trong môi trƣờng lỏng). ......................................................................23
3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ..................................................................................26
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................27
4.1 Nghiên cứu kỹ thuật phân lâ ̣p giố ng nấ m Lim xanh Thanh Hóa ta ̣i trƣờng Đa ̣i
học Nông Lâm Thái Nguyên .....................................................................................27
4.1.1. Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của môi trƣờng đế n khả năng tạo hê ̣ sơ ̣i nấ m tƣ̀ mô
thịt nấm......................................................................................................................27
4.1.2. Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của độ pH đế n khả năng phát triể n hê ̣ sơ ̣i từ nấ m tƣ̀
mô thit.̣ ......................................................................................................................30
4.1.3. Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của loại đƣờng đế n khả năng phát triể n hê ̣ sơ ̣i từ nấ m
tƣ̀ mô thit.̣ ..................................................................................................................32
4.1.4. Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của hàm lƣợng cao nấm men đế n khả năng phát triể n
hê ̣ sơ ̣i từ nấ m tƣ̀ mô thit.̣ ...........................................................................................34
4.1.5. Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của hàm lƣợng Pepton đế n khả năng phát triể n hê ̣ sơ ̣i
từ nấ m tƣ̀ mô thit.̣ ......................................................................................................35
4.1.6. Kiểm tra giống, chất lƣợng giống nấm Lim xanh đã phân lập. ......................37
4.2. Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nhân sinh khối sợi nấm Lim xanh bằng hệ thống
nuôi cấ y lỏng. ............................................................................................................38
4.2.1. Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của môi trƣờng đế n khả năng nhân sinh khố i của hê ̣
sơ ̣i nấ m Lim xanh. .....................................................................................................38


viii

4.2.2. Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi
nấ m Lim xanh. ..........................................................................................................40
4.3. Nghiên cứu thu tách chiế t polysaccharides trong dich
̣ huyề n phù tế bào nấ m
Lim xanh (thu sinh khối từ bào tử nấm lim xanh trong môi trƣờng lỏng) ................41

4.3.1. Khảo sát dung môi phù hợp ...........................................................................41
4.3.2. Khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liệu. .............................................................43
4.3.3. Khảo sát nhiệt độ chiết xuất. ...........................................................................44
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................46
5.1 Kết luận ...............................................................................................................46
5.2. Kiến nghị. ...........................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................52
PHỤ LỤC


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1.Đặt vấn đề
Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều dạng môi trƣờng sống
khác nhau,đa phần sống ở trên cạn,nhƣng một số loài lại chỉ tìm thấy ở mơi trƣờng
trong nƣớc. Dựa theo tỷ lệ giữa số loài nấm với số loài thực vật ở cùng một mơi
trƣờng, ngƣời ta ƣớc tính giới nấm có khoảng 1,5 triệu lồi. Hiện nay có khoảng
80000 lồi nấm đã đƣợc các nhà phân loại học phát hiện và định danh. Giới nấm
ngày càng có ý nghĩa to lớn trong nền kinh tế quốc dân,trong khoa học cũng nhƣ
trong vịng tuần hồn vật chất. Nấm đã đƣợc sử dụng trong dân gian từ hàng ngàn
năm nay và một số có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống con ngƣời.
Linh chi là loài dƣợc liệu đã đƣợc chứng minh có nhiều đặc tính q,rất tốt
cho phịng và chữa bệnh. Các chế phẩm từ nấm linh chi (Ganoderma) đƣợc dùng để
hỗ trợ điều trị nhiều bệnh nhƣ bệnh gan,tiết niệu,tim mạch,ung thƣ,AIDS. Các hoạt
chất tách chiết từ nấm lim xanh đƣợc dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh gan, tiết
niệu,tim mạch,ung thƣ,AIDS và không gây dị ứng đối với cơ thể ngƣời và động vật.
Thanh hóa là tỉnh có diện tích rừng lớn, có khu bảo tồn Pù Hu, Quan Hóa,
Mƣờng Lát, Thanh Hóa, Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên, Khu bảo tồn thiên nhiên

rừng sến,... đây là tỉnh đƣợc đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao, tại đây có
chứa đựng nguồn lợi lớn giá trị kinh tế và giá trị trong nghiên cứu khoa học từ các lồi
động thực vật. Trong đó có nguồn lợi lớn về nấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên
liệu tốt cho các ngành công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm.
Nấ m Linh chi mo ̣c trên

gỗ lim ngƣời ta thƣờng go ̣i là Nấ m Lim

. Trong tƣ̣

nhiên, nấ m Lim xanh mo ̣c ở nơi rƣ̀ng râ ̣m , ít ánh sáng , đơ ̣ ẩ m cao và thƣờng xuấ t
hiê ̣n vào mùa mƣa . Nấ m Lim xanh là loài thƣờng niên , tai nấ m chỉ phát triể n trong
mô ̣t mùa . Vì vậ y sớ lƣơ ̣ng q̀ n thể nấ m Lim xanh rấ t ha ̣n chế

, Các hoạt chất từ

Ganoderma lucidum có hiệu lực chống khối u cao, chúng đƣợc sử dụng trong điều
trị ung thƣ: ƣng thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ dạ dày,...


2

Do có chứa nhiều hoạt chất quý cùng với số lƣợng hạn chế và viê ̣c khai thác
quá nhanh trong thời gian ng ắn đã dẫn đế n tình tra ̣ng nguy cấ p của loài nấ m này
trong tự nhiên và đã đƣợc liệt kê vào danh sách loài cần đƣợc bảo tồn và nghiêm
cấm khai thác - trích lu ̣c sách đỏ Việt Nam - 2007.
Để bảo tồn loài nấm này việc phân lập giữ giống và phát triển là rất cần
thiết. Việc gây trồng các giống nấm đã đƣợc nghiên cứu ở Việt Nam từ những
năm 80 của thế kỷ XVI tuy nhiên để đáp ứng nhu cầu dƣợc liệu của đất nƣớc
hàng năm Việt Nam vẫn phải nhập hàng nghìn tấn nấm khơng kiểm định đƣợc

chất lƣợng từ các nƣớc nhƣ Nhật Bản, Hàn Quốc, Triều Tiên, Trung Quốc và và
một số lƣợng lớn nấm nhập khẩu theo con đƣờng khơng chính thống nhƣ hàng
hóa sách tay mang về Việt Nam. Để phát triển các sản phẩm nấm của Việt Nam
thành các sản phẩm chức năng có giá trị và đƣợc thực hiện ở quy mơ lớn thì
ngồi việc ni trồng theo phƣơng pháp truyền thống việc nhân nhanh sinh khối
để tách các hoạt chất có giá trị là cần thiết. Việc thu hoạt chất có giá trị từ sinh
khối là công nghệ mới đã đƣợc ứng dụng ở các nƣớc có trình độ sản xuất nấm
tiên tiến nhƣ: Nhật, Hàn Quốc, Đài Loan,…tuy nhiên công nghệ này chƣa đƣợc
nghiên cứu ở Việt Nam. Bằng các nghiên cứu chúng tơi thấy phƣơng pháp này
có nhiều tính ƣu việt nhƣ: Có khả năng kiểm sốt đƣợc chất lƣợng, hàm
lƣợng, thành phần hoạt chất do kiểm soát chặt chẽ đƣợc các điều kiện dinh
dƣỡng và môi trƣờng nuôi cấy. Chính vì vậy chúng tơi đã thực hiện đề tài:“
Nghiên cƣ́u quy trình phân lập và nhân sinh khố i nấ m Lim xanh Ganoderma
Lucidum thu thập tại Thanh Hóa” .
1.2. Mục tiêu c ủa đề tài
1.2.1. Mục tiêu tổng qt
Xây dựng thành cơng quy trình phân lập và nhân sinh khối nấm Lim xanh
Ganoderma Lucidum thu thập tại Thanh Hóa.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Xây dựng đƣơ ̣c quy trình phân lâ ̣p nấ m Lim xanh.
- Xây dựng đƣợc quy trình nhân sinh khớ i sơ ̣i nấ m Lim xanh trong dung
ịchdlỏng.


3

- Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết polysaccharide từ dịch huyền phù
nấm Lim xanh.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Giúp sinh viên củn g cố và hê ̣ thố ng la ̣i

kiế n thƣ́c đã ho ̣c vào thƣ̣c tiễn

.

Đồng thời tiếp cận công tác nghiên cứu khoa học phục vụ cho việc nghiên cứu
và công tác sau này .
- Biế t đƣơ ̣c phƣơng pháp nghiên cƣ́u m ột vấn đề khoa học , xƣ̉ lý , phân tić h sớ
liê ̣u, trình bày một báo cáo tốt nghiệp.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Kế t quả nghiên cƣ́u của đề tài giúp xây dƣ̣ng đƣơ ̣c quy trin
̀ h phân lâ ̣p và thu
hoạt chất polysaccharide từ sinh khố i nấ m L im xanh Ganoderma Lucidum . Góp
phầ n bảo tờ n lồi n ấm quý có giá trị của Việt Nam và ta ̣o ng̀ n vâ ̣t liê ̣u có ý nghĩa
trong cơng tác nghiên cứu nấm.
- Phát triển và thƣơng mại hóa sản phẩm chức năng có giá trị.


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nấm Lim xanh.
2.1.1. Nguồ n gố c và phân loại nấm Linh xanh.
* Nguồn gốc
Linh Chi (Ganoderma) là loại nấm gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, có hàng
trăm các lồi khác nhau, trong đó có 2 nhóm lớn là: Cổ Linh Chi và Linh Chi [12].
Linh Chi rất phong phú về chủng loại, ƣớc tính trên tồn thế giới có 200 lồi
Linh Chi. Riêng Trung Quốc có 84 lồi, trong đó có 12 lồi đƣợc dùng làm thuốc

nhƣ Xích Linh Chi, Tử Linh Chi, Hắc Linh Chi [14],[16].
Theo sách bản thảo cƣơng mục của Lý Thời Trần (1959) thì đại danh y của
Trung Quốc đã phân loại Linh Chi theo màu sắc thành 6 loại:
Thanh chi hay Long chi: màu xanh, vị chua, tính bình, khơng độc.
Hồng chi, Xích chi hay Đơn chi: màu đỏ vị đắng, tính bình, khơng độc.
Hồng chi hay Kim chi: màu vàng, vị ngot, tính bình, khơng độc.
Bạch chi hay Ngọc chi: màu trắng, vị cay, tính bình, khơng độc.
Hắc chi hay Huyền chi: màu đen, vị mặn, tính bình, khơng độc.
Tử chi hay Mộc chi: màu tím, vị ngọt, tính ơn, khơng độc.
Trong đó nấm Lim xanh thuộc nhóm Hồng chi có tên khoa học là
Ganoderma lucidum, Hồng Chi có lồi mọc trên giá thể gỗ Keo, Bồ Đề,
Phƣợng Vĩ,… có cả những lồi mọc trên thân gỗ Lim đã mục, ngƣời ta gọi là
nấm Lim xanh.
* Phân loại
Nấm Lim xanh có vị trí phân loại đƣợc thừa nhận rộng rãi hiện nay [6],[7].
Tên khoa học: Ganoderma lucidum
Ngành: Eumycota
Ngành phụ: Basidiamyctina
Lớp: Hymenomycetes
Lớp phụ: Hymenomycetidae
Bộ: Aphyllophorales
Họ: Ganodermataceae


5

Họ phụ: Ganodermoidae
Chi: Ganoderma
2.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
- Nấm Lim xanh là một trong những loại nấm phá gỗ, nó thƣờng ký sinh trên

các cây gỗ lâu năm, một số loài cây chết mục, thƣờng gặp chúng trên cây Lim. Nấm
thƣờng có ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong tự nhiên, nấm thƣờng chỉ có ở
nơi rừng rậm, ít ánh sáng và có độ ẩm cao [12].
- Lim xanh có cấu tạo 2 phần: Phần cuống và mũ nấm. Cuống nấm biến dị rất
lớn, từ rất ngắn (0,5cm), rất mảnh (0,2cm) cho đến dài cỡ hàng 5-10 cm hoặc rất dài
20-25cm. Cuống có thể đính ở bên hoặc đính gần tâm do q trình lên tán mà thành.
- Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đơi khi x hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng.
Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu vàng nâu, vàng
cam, đỏ cam, đỏ nâu, nâu tím hoặc nâu đen, nhẵn bóng nhƣ láng vecni. Kích thƣớc
tán biến động từ 2 - 30cm, dày 0,8 - 2,5cm.
- Thịt nấm dày từ 0,4 - 1,8cm, màu vàng kem, nâu nhạt. Nấm mềm, dai khi tƣơi và
trở nên chắc cứng và nhẹ khi khô, đầu tận cùng của sợi phình hình chuỳ, màng rất dày đan
khít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mũ và bao quanh cuống [14].

Nấm Lim xanh đƣợc thu thập
từ Thanh Hóa

Nấm Lim xanh đƣợc ni trồng tại
Trƣờng ĐH Nơng Lâm Thái Nguyên

Hình 2.1: Hình thái quả thể nấm Lim xanh thu nhận từ Thanh Hóa và
ni trồng tại trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên


6

2.1.3. Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm Lim xanh
Các nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm Linh Chi đầu tiên đƣợc tiến
hành vào đầu thế kỷ XX, khi các nhà khoa học nghiên cứu đến lớp vỏ láng của nấm
và đã phát hiện các chất nhƣ: esgosterol, các enzyme phenoloxidase và peroxidase.

Theo phân tích của G. Bing Lin thì thành phần hố học của Ganoderma
lucidum gồm các chất: Nƣớc(12 - 13%), cellulose (54 - 56%), lignin (13 - 14%),
monosaccharide (4,5 - 5%), lipid (1,9 - 2,0%), protein (0,08 - 0,12%), sterol (0,14 0,16%), các nguyên tố vô cơ nhƣ: Ag, Br, Ca, Fe, K, Na, Mg, Mn, Zn, Bi…[12].
Hiện nay ngƣời ta đã tìm đƣợc các hoạt chất sinh học trong nấm Lim xanh
nhƣ: Hoạt chất Beta–D-glucan,D-6,… trong nhóm polysaccharide và hoạt chất
ganoderic acid, oleic acid, lucidenol,…trong nhóm triterpenoid [12].
2.1.4. Tác dụng của nấ m Lim xanh.
Vai trò dƣợc lý của nấm Lim xanh rất lớn nhờ sự có mặt của các hoạt chất sinh
học. Nấm Lim xanh đƣợc sử dụng nhƣ một dƣợc liệu quý, để chữa trị nhiều bệnh.
Cho đến nay, kết quả nghiên cứu dƣợc lý học hiện đại cho thấy, Lim xanh có tác
dụng dƣợc lý khá phong phú. Tác dụng trên hệ tuần hoàn [19],[21],[22]. Tác dụng
trên hệ miễn dịch và chống ung thƣ [25]. Chế phẩm nấm Lim xanh làm gia tăng q
trình sản xuất Interleukin-1 & 2, có tác dụng hạn chế sự phát triển của nhiều loại mơ
có hại [22]. Tác dụng phịng, chống bệnh tiểu đƣờng [21], cholesterol và đƣờng
trong máu [19]. Làm giảm đƣờng huyết và điều chỉnh rối loạn lipid máu. Nấ m Lim
xanh có chấ t Polysaccharides làm khôi phu ̣c tế bào tiể u đảo tuyế n tu ̣y và tƣ̀ đ ó thúc
đẩ y quá triǹ h tiế t insulin [12], Tác dụng ngăn chặn q trình lão hóa, giúp cơ thể
tráng kiện. Trong thành phần nấm lim xanh có chứa Acid ganoderic (dẫn chấ t
triterpenoid) có tác dụng nhƣ một chất oxy hóa khử các gốc tự do trong cơ

thể

chớ ng laõ hóa. Ổn định và cải thiện chức năng sinh lý của màng tế bào, tăng cƣờng
năng lực tổng hợp DNA, RNA và protein [26]. Nhóm steroid trong nấm Lim xanh
có tác dụng giải độc gan , bảo vệ gan ngƣng tổng hợp cholesterol , ức chế nhiều loa ̣i
vi khuẩ n gây bê ̣nh nên có hiê ̣u quả tố t đố i với bê ̣nh về gan, mâ ̣t nhƣ: Viêm gan mãn
tính, viêm gan cấ p tiń h, xơ gan, gan nhiễm mỡ ... [12]. Nấ m Linh Chi giúp bài tiế t


7


các độc tố trong cơ thể , có tác dụng loại bỏ các sắc tố la ̣ trên da, làm cho da dẻ đẹp ,
hồ ng hào, chố ng la ̣i các bê ̣nh ngoài da nhƣ di ̣ƣ́ng, trƣ́ng cá... [23].
2.2. Giới thiệu về polysaccharide
Polysaccgaride là một hợp chất hữu cơ có chứa trong thực vật: quả, củ hoặc
thân cây. Trong thực vật, polysaccharide tồn tại dƣới hai dạng: dạng khơng tan và
dạng hịa tan. Polysaacharide có trong thành phần một số thực vật điển hình nhƣ:
nhân sâm, nấm lim xanh, nấm hƣơng,… hợp chất cao phân tử có chứa hàng trăm
thậm chí hàng nghìn mắt xích monoscacchride trong mỗi phân tử.
Polysacharide là những polime đƣợc tạo ra từ thiên nhiên hoặc nó có thể là
sản phẩm của phản ứng trùng ngƣng các andozo hoặc xentozo. Polysacharide tồn tại
ở các loại mạch nhƣ mạch hở, mạch không nhánh hoặc có nhánh, mạch vịng hay
uốn khúc.
Polysacharide thƣờng đƣợc phân loại thành hai loại là homopolysacchride và
heteropolysacchride. Homopolysacchride đƣợc tạo thành từ một loại monosacchride
nhƣ tinh bột, xenlluose, glycogen,… Heteropolysacchride đƣợc thành từ hai loại
monosacchride trở lên nhƣ pectit, aga, hemixenllulose….
Trong dƣợc tính của nấm nói chung và nấm linh chi nói riêng thì hoạt tính
dƣợc học của polysaccharide là quan trọng và đƣợc nghiên cứu nhiều nhất.
Thành phần polysaccharide hoạt tính sinh học chủ yếu thuộc nhóm β-Glucan.
Các chất này trong nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ tự nhiên,
là loại chất có khả năng điều chỉnh đáp ứng sinh học. Là tác nhân điều hòa hệ thống
bảo vệ miễn dịch tự nhiên quan trọng nhất, β - Gluccan từ nấm không giống với các
loại sản phẩm từ tự nhiên khác mà β- Gluccan từ nấm đƣợc tinh khiết duy trì tác
dụng sinh học cho phép chúng có hiệu quả ở mức độ phân tử và tế bào [20].
Năm 1980, tại Nhật Bản β- Gluccan trong nấm linh chi đã chứng minh đƣợc
khả năng kích thích máu tƣơng tự chủ yếu tố kích thích các bạch cầu hạt đơn nhân.
Các thí nghiệm đều cho thấy rằng, hiệu quả tác dụng vào tế bào ung thƣ rất tốt, có
thể làm giảm 70-95% trọng lƣợng khối u so với chúng. Tuy vậy, kết quả cho khả
năng kháng, tác động tích cực tới khối u khi sử dụng kết hợp với chất kháng chống



8

ung thƣ, cịn nếu sử dụng riêng lẻ thì khơng thể làm khối u biến mất. Qua đó, βGluccan có thể làm giảm sự phát triển của khối u, ngăn chặn khối u di căn. Trái
ngƣợc với vi sinh vật, tế bào khối u cũng nhƣ các tế bào vật chủ khác, β- Gluccan là
một thành phần không thể thiếu là một thành phần bề mặt để kích hoạt thụ thể bổ
sung bắt đầu gây độc tế bào và giết chết tế bào khối u. Điều này chỉ xảy ra khi có
mặt β- Gluccan [20],[28].
Các hoạt tính của Polysaccharide có tác dụng kháng virus và điều hòa miễn
dịch là do có ligmin, các chất kháng sinh; Lentinan là một polysaccharide có tác
dụng phục hồi tế bào Lympho T, tăng sản xuất interferol [8].
Hoạt tính tăng khả năng miễn dịch.
Hoạt chất Polysaccharide còn đƣợc nghiên cứu trong nấm hƣơng, kết quả
nghiên cứu cho thấy có khả năng hoạt hóa miễn dịch tế bào thúc đẩy quá trình sinh
trƣởng và phát triển tế bào Lympho T, Lympho B từ đó góp phần tăng cƣờng hệ
miễn dịch ở bệnh nhân bị bệnh gan, giúp bệnh gan nhiễm mỡ máu chóng hồi phục
các tế bào bị tổn thƣơng nhanh chóng hơn [20].
Polysaccharide JSL-18 có trong nấm hƣơng là tăng hoạt tính đại thực bào,
tăng tiết IL-6 (Interleakin-6). Bên cạnh đó, trong nấm hƣơng cịn chứa các chất
nhƣ Lentinacin, dezoxy lentinacin, 5’ –GMP, 5’ –AMP có tác dụng chống đơng
máu. Ngồi ra, cịn có chất eritadenine có hiệu quả làm giảm hàm lƣợng
cholesterol trong máu [5].
Với nhiều tác dụng nhƣ vậy việc tách chiết Polysaccharide đƣợc quan tâm và
nghiên cứu ở nhiều loài nấm trong đó có nấm linh chi. Các nghiên cứu cho thấy
Polysaccharides trong nấm tồn tại nhƣ một thành phần cấu trúc của vách tế bào nấm
và việc lựa chọn phƣơng pháp trích ly phụ thuộc về cấu trúc tế bào. Một số phƣơng
pháp trích ly thu polysaccharides thơng thƣờng nhƣ: Chiết bằng dung mơi, bằng sử
dụng nƣớc nóng, giải pháp kiềm và phlyethylene glycol; và các phƣơng pháp sử
dụng sóng siêu âm. Ngồi ra Polysaccharide cịn chiết bằng nƣớc, kết tủa bằng

etanol với quy trình nhƣ sau: Quả thể nấm T. microcaspus tƣơi (1kg) rửa sạch bằng
nƣớc. Sau đó đun sơi nấm quả thế trong 250ml nƣớc cất trong 12 giờ. Hỗn hợp dịch


9

chiết đƣợc để qua đêm tại 4 độ C và đƣợc lọc qua vải lọc. Sau đó, ly tâm ở 8000
rpm trong 45 phút tại 6 độ C để thu nhận dịch chiết sạch tạp chất. Thu nhận lấy
phần dịch nổi (200ml) và kết tủa trong ethanol theo tỉ lệ (1:5, v/v) ở nhiệt độ phòng.
Để kết tủa qua đêm tại 4 độ C, sau đó ly tâm ở 6 độ C trong 1 giờ. Phần kết tủa thu
đƣợc rửa sạch với nƣớc cất và thẩm tách qua ống thẩm tách trong 6 giờ để loại bỏ
các vật liệu có trọng lƣợng phân tử thấp. Phần còn lại đem băng khô.
2.3. Tổng quan về phân lập.
Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thu Hằng và Lê Xuân Thám trong
phân lập nấm Vân chi, có nhiều cách để phân lập tạo giống gốc nhƣng hiệu quả nhất
là phân lập từ quả thể. Vì đây là phƣơng pháp nhân giống vơ tính, trong khi tách hệ
sợi nấm thì khơng rõ có đúng là nấm cần phân lập hay nấm mốc, nấm dại khác. Cịn
dùng bào tử nấm cũng khơng đơn giản vì đây là giai đoạn sinh sản hữu tính, nên
nấm hình thành có thể thay đổi đặc tính. Ngồi ra phƣơng pháp phân lập từ quả thể
hạn chế đƣợc hiện tƣợng bị lẫn hay nhiễm tạp các loại vi sinh vật khác do sử dụng
trực tiếp các mô thịt nấm. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là chọn tai nấm điển
hình ở giai đoạn trƣởng thành để đánh giá chất lƣợng giống. Mơ thịt nấm tách ở
những vị trí kín đáo, ít tiếp xúc với các nguồn bệnh nhất.
Môi trƣờng phân lập là môi trƣờng dinh dƣỡng bao gồm ba thành phần cơ
bản: Đƣờng: 2 – 3 %, thạch: 2% và chất bổ sung: Nƣớc chiết (lấy từ các nguồn
tự nhiên nhƣ khoai tây, nƣớc giá, cà rốt…) và hóa chất (chủ yếu là các chất
khống N, P, K…).
Khi có đƣợc giống thuần, cấy sợi nấm từ môi trƣờng phân lập vào ống nghiệm chứa
môi trƣờng thạch nghiêng để giữ giống. Mơi trƣờng giữ giống có thể giống với mơi
trƣờng phân lập. Khi giữ giống, bảo quản ống nghiệm trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 đến

10 độ C và mỗi tháng cấy lại một lần [3],[15].
2.4. Nuôi cấy sinh khối nấm Lim xanh trong môi trƣờng lỏng.
2.4.1. Nuôi cấy hệ sợi nấm Lim xanh trong môi trường lỏng
Phƣơng pháp lên men chìm đối với vi sinh vật.


10

Khái niệm: Là q trình nhân ni vi sinh vật trong mơi trƣờng lỏng có sục
khí để bổ sung thêm oxy hoặc nuôi tĩnh. Giống vi sinh vật sau khi cấy vào mơi
trƣờng lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) rồi chuyển sang
phát triển qua pha lũy (pha log). Trong pha lũy thừa, vi sinh vật phát triển nhanh
chóng và đạt cực đại, lƣợng vi sinh vật ngày càng tăng lên nhƣng dinh dƣỡng trong
môi trƣờng nuôi cấy nếu không đƣợc bổ sung thêm vào đó ở giai đoạn này thành
phần mơi trƣờng dinh dƣỡng giảm nhanh, nhu cầu oxy tăng, nhiệt độ tạo ra cao
đồng thời bề mặt mơi trƣờng có thể trào ra khỏi bình men, làm mất bớt dịch và tăng
khả năng nhiễm vi sinh vật lạ không mong muốn.
Vi sinh vật trong quá trình lên men phát triển theo 4 pha: pha tiềm phát (pha
lag) pha lũy thừa (pha log), pha ổn định, pha suy vong.
Pha tiềm phát: Khi cấy các tế bào sinh vật từ môi trƣờng này sang môi
trƣờng khác, khoảng thời gian đầu số tế bào không thay đổi. Trong giai đoạn này vi
sinh vật làm quen với mơi trƣờng để thích nghi dần với điều kiện môi trƣờng mới.
Pha log: Cuối pha tiềm phát các tế bào đã thích nghi với điều kiện sống mới
và bắt đầu phát triển mạnh mẽ, quần thể vi sinh vật chuyển sang lũy thừa, pha phát
triển số lƣợng vi sinh vật mạnh nhất.
Pha ổn định: Sau khi đồng hóa các chất dinh dƣỡng hay sau khi tích lũy các
sản phẩm trao đổi chất, sinh trƣởng của vi sinh vật giảm xuống hay hoàn toàn
ngừng lại. Trong pha ổn định này sinh khối có thể cịn tăng chậm hoặc khơng đổi.
Pha suy tàn: Đặc trƣng của pha này là các chất dinh dƣỡng đã bị cạn kiệt.
Lƣợng chất dinh dƣỡng trong mơi trƣờng bị suy giảm, có thể thiếu một số chất dinh

dƣỡng, trong khi chất thải từ vi sinh vật thải ra ngày càng tăng mà không đƣợc bổ sung
thêm chất dinh dƣỡng vào môi trƣờng nuôi cấy, do đó các tế bào vi sinh vật chết dần.
Lên men bổ sung ứng dụng cho các trƣờng hợp sau: Nồng độ cơ chất khá
thấp nhƣng lại cần ổn định, nồng độ cơ chất cần khá cao và không đổi, cần bổ sung
chất dinh dƣỡng liên tục.
Môi trƣờng nuôi cấy hệ sợi nấm Lim xanh trong môi trƣờng lỏng
Môi trƣờng dinh dƣỡng cần cho nấm Lim xanh và hệ sợi nấm Lim xanh phát
triển cần một số nguồn dinh dƣỡng thiết yếu nhƣ sau:


11

Về nguồn Cacbon: Nấm Lim xanh có thể đồng hóa rộng rãi nhiều nguồn
cacbon khác nhau nhƣ đƣờng đơn, đƣờng kép, đƣờng đa [4].
Về nguồn nitơ, nấm Lim xanh có thể sử dụng ni tơ hữu cơ nhƣ protein,
peptide, acid amin hay ure hoặc đạm vô cơ nhƣ các muối amon[4].
Tỷ lệ C : N trong môi trƣờng ở giai đoan nuôi sợi nên dùng tỷ lệ 25-40:1.
Nhƣng tỷ lệ C : N tối ƣu cho sự phát triển của hệ sợi nấm là 30:1. Theo nghiên cứu
của nhóm tác giả Rossi và CS khi sử dụng môi trƣờng rỉ đƣờng thì tỷ lệ C : N là
107:1, cịn khi bổ sung thêm 40% cám gạo thì tỷ lệ C:N là 38:1.
Về nhu cầu yếu tố khống, ngồi Mg, S, P, K nấm Lim xanh còn cần một số
nguyên tố khống vi lƣợng nhƣ Fe, Zn, Mn…Mỗi lít dung dịch nuôi cấy nên bổ
sung thêm khoảng 2mg đối với từng loại Fe, Zn, Mn [16].
Các môi trƣờng nuôi cấy để ni hệ sợi cũng phải có đầy đủ nguồn cacbon,
nito, chất khoáng…đáp ứng cho sự phát triển của hệ sợi nấm [16].

2.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng tới sự phát triển của hệ sợi
nấm Lim xanh.
Nấm Lim xanh thuộc nhóm nấm hoại sinh và hiếu khí, vì vậy trong q
trình ni hệ sợi nấm Lim xanh nên bổ sung oxy bằng thiết bị lắc, khuấy hay

sục khí. Bào tử nấm sau khi đƣợc cấy vào môi trƣờng lên men thì bắt đầu phát
triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) khoảng 24 giờ, rồi chuyển sang phát triển
trong pha lũy thừa (pha log). Cuối pha lag các bào tử nấm đã thích nghi với
điều kiện sống mới và bắt đầu phát triển mạnh mẽ. Ở giai đoạn này thành phần
môi trƣờng dinh dƣỡng giảm nhanh, nhu cầu oxy tăng, nhiệt lƣợng tạo ra cao
đồng thời bề mặt môi trƣờng tạo thành bọt và lớp bọt tăng. Nên phải cấp khí
oxy bằng cách lắc ở quy mơ phịng thí nghiệm và dùng thiết bị sục khí nhƣ
khuấy, sục khí ở quy mơ sản xuất để tăng hiệu suất lên men cao tạo sinh khối
sợi nấm Lim xanh.
Bào tử nấm Lim xanh nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 22oC-26oC. Trong điều kiện
khô hạn ở 70oC bào tử đảm của nấm sẽ bị chết sau 5 giờ. Nếu ở 80oC thì sẽ chết chỉ sau
10 phút. Nhiệt độ có ảnh hƣởng lớn đến sự phát triển của hệ sợi nấm Lim xanh.


12

2.5. Tình hình nghiên cứu nấm Lim xanh trong và ngồi nƣớc.
2.5.1. Tình hình nghiên cứu nấm Lim xanh ngoài nước.
Trung Quốc đƣợc coi là cái nôi phát hiện nấm Linh Chi. Quốc gia này là
trung tâm lớn nhất thế giới về nuôi trồng và sản xuất nấm Linh Chi. Hàng năm, trên
thế giới sản xuất 4300 tấn nấm Linh Chi, riêng Trung Quốc chiếm 3000 tấn, còn lại
là Hàn Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Thái Lan, Mỹ, Malaysia, Việt Nam, Indonesia và
Srilanka. Đến nay có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về giá trị dƣợc liệu của nấm
Linh Chi. Trƣớc những lợi ích to lớn từ Linh Chi, nhiều cơ sở nuôi trồng nấm Linh
Chi đã đƣợc xây dựng đặc biệt là Linh Chi đã đƣợc nuôi trồng trên quy mơ cơng
nghiệp ở Mỹ. Ngồi ra tai Mỹ, Viện nghiên cứu nấm Linh Chi quốc tế đã đƣợc
thành lập ở New York [27].
Nấm Linh Chi, từ nhiều ngàn năm nay đã đƣợc trọng dụng ở Á Đông, hiện
nay Linh Chi là một trong những đề tài nghiên cứu và ứng dụng đang đƣợc quan
tâm của ngành y dƣợc Âu Mỹ. Nấm Linh Chi đƣợc xếp vào nhóm thuốc bổ có khả

năng giúp tăng lực sau khi sử dụng nấm Linh Chi. Điều này không chỉ căn cứ vào
cảm giác chủ quan của ngƣời dùng, mà dựa trên các tiêu chuẩn khoa học khách
quan và theo kết quả của hàng trăm cơng trình nghiên cứu từ châu Á sang châu Âu.
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạt chất
sinh học trong nấm Linh Chi. Theo cơng trình nghiên cứu, thành phần chủ yếu của các
loại Linh Chi có: Acid amin, protid, steroid, polysaccharide, germanium, acid
ganodenic [27].
Gần đây, theo tác giả Betra (2013) đã tiếp tục thử nghiệm các kỹ thuật nuôi cấy
chìm để ni cấy sợi nấm và thu hàm lƣợng polysaccharide Linh chi. Kết quả cho thấy,
sinh khối nấm Linh chi cho kết quả tốt nhất ở ni cấy chìm, đã thu đƣợc 12,4 g/L sinh
khối nấm khô sau 48 ngày.
Theo tác giả Hyun Mi Kim (2006) đã nghiên cứu điều kiện tối ƣu hóa mơi
trƣờng ni cấy chìm Ganoderma resinaceum để tăng cƣờng sản xuất sinh khối và
exopolysaccharide (EPS). Sự tăng trƣởng sợi nấm tối đa và sản xuất EPS trong mơi
trƣờng có chứa 10g/l glucose, pepton 8g/l đậu nành và MnCl2 tại pH ban đầu 6,0 và
nhiệt độ 31oC.Năm loại EPS khác nhau với trọng lƣợng phân tử khác nhau, từ 53.000


13

đến 5.257.000 g/mol thu đƣợc ở một trong hai giai đoạn tủa với ethanol. Nồng độ tối
đa của sợi nấm sinh khối (42,2 g/l) và EPS (4,6 g/l) thu đƣợc vào ngày thứ 6 với hàm
lƣợng đƣờng bổ sung vào mơi trƣờng là 50g/l.
2.5.2. Tình hình nghiên cứu nấm Lim xanh trong nước.
Từ thập niên 80, nấm Linh Chi mới thực sự ni trồng nhiều ở Việt Nam.
Ngồi ra, cịn thấy 15 loài nấm Linh Chi mọc hoang dại ở rừng Bắc Kạn, Thái
Nguyên, Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Lâm Đồng, Đồng Nai, Bình Phƣớc, Gia
Lai, Đăk Lắc. Tại hội nghị kết quả công tác chuyển giao công nghệ nuôi trồng nấm
ăn và nấm dƣợc liệu, theo tài liệu đã đƣợc cơng bố tới nay có 32/61 tỉnh thành có cơ
sở ni trồng nấm dƣợc liệu (tháng 12/2001). Hiện nay có rất nhiều Viện, Trung

tâm nghiên cứu về nấm Linh Chi ở cả Bắc và Nam nhằm lựa chọn những chủng có
năng suất cao, phẩm chất tốt, phù hợp với khí hậu và đặc biệt có thể phổ biến đại trà
cho các cơ sơ nuôi trồng ở một số nơi để tận dụng nguồn nguyên liệu cellulose có
sẵn, tăng thu nhập cho ngƣời lao động. Nhƣng sản lƣợng nấm và sản phẩm nấm đã
qua chế biến không đáp ứng đủ nhu cầu do Việt Nam mới chỉ tập trung vào điều tra,
sƣu tập, nêu đặc điểm phân loại, điều kiện sinh thái, các hoạt chất chính có trong
nấm và chƣa quan tâm nhiều đến kỹ thuật ni trồng ,trích ly các hoạt chất sinh học
có giá trị trong nấm linh chi và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.
Hiện nay, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, các Trung tâm, viện
nghiên cứu, doanh nghiệp sản xuất nấm đã đi sâu vào nuôi trồng, sản xuất
thực phẩm chức năng từ nấm linh chi nhƣ: Bộ Nông nghiệp và phát triển
Nơng thơn đã đƣa chƣơng trình nấm quốc gia với mạng lƣới lan rộng trong cả
nƣớc và kinh phí đầu tƣ xấp xỉ 70 tỷ đồng từ ngân sách nhà nƣớc để hoàn
thiện bộ giống nấm quốc gia và các quy trình sản xuất, chế biến nấm.
Viện Di truyền là một trung tâm nghiên cứu nấm mạnh nhất cả nƣớc, hiện tại
viện đã phân lập và tạo ra nhiều giống nấm có giá trị cũng nhƣ làm chủ nhiều quy
trình ni trồng. Các giống nấm của viện đã đƣợc thƣơng mại hóa trên tồn quốc.
Hiện nay trong nƣớc cũng rất quan tâm và có khá nhiều nghiên cứu về trích
ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi.


14

Nhóm nghiên cứu Viện Cơng nghệ thực phẩm của T.S Trƣơng Thị Hịa
trong nghiên cứu “Trích ly hoạt chất sinh học từ nấm Linh Chi” đã đã xác định
đƣợc phƣơng pháp trích ly các hoạt chất sinh học sử dụng cho cơng nghệ sản xuất
rƣợu bổ. Phƣơng pháp trích ly bằng ethanol với tỷ lệ dung môi / nguyên liệu là 1/10
đạt hiệu suất cao (8,8%) khi chiết lần 1 bằng ethanol 960, lần 2 bằng ethanol 700, lần
3 bằng ethanol 450. Ngồi ra cịn sử dụng enzyme Novozyme 342 (hỗn hợp của
enzyme cellulase và hemicellulase) đạt hiệu suất cao nhất (10,2%) ở điều kiên nhiệt

độ 600C, nồng độ enzyme 0,21% trong 120 phút. Ƣu điểm của phƣơng pháp trích lý
bằng enzyme là cho hiệu suất trích ly cao, thời gian trích ly ngắn, nhiệt độ trích ly
thấp, khơng ảnh hƣởng tới một số hoạt chất sinh học mẫn cảm với nhiệt độ cao [9].
Theo kết quả của Nguyễn Thị Minh Tú trong nghiên cứu “Quy trình tách
chiết các hoạt chất sinh học từ nấm Linh Chi ” với dung mơi là nƣớc q trình chiết
đạt tối ƣu ở nhiệt độ 800C, thời gian chiết 7h, tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi là 1/20 thì
hàm lƣợng chất chiết thu hồi đạt 6,91% [12].


15

Phần 3
ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tƣợng: Nấm Lim xanh thu thâ ̣p tƣ̀ tỉnh Thanh Hóa .
Vật liệu nghiên cứu:
- Mô thịt nấm Lim xanh đƣợc tách ra từ quả thể và cuống nấm.
- Hệ sợi nấm sau khi phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy.
3.2. Điạ điể m và thời gian nghiên cƣ́u
Phịng thí nghiệm ni cấy mô tế bào thực vật , Bô ̣ môn Công nghê ̣ sinh ho ̣c
Khoa CNSH – CNTP, Trƣờng Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm Thái Nguyên.
Thời gian: Từ tháng 11/2016 đến tháng 05/2017.
Hóa chất và thiết bị nghiên cứu.
Hóa chất
Bảng 3. 1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu.
Tên hóa chất

Xuất xứ

Pepton


Trung Quốc

Cao nấm men

Trung Quốc

HCl

Trung Quốc

NaOH

Trung Quốc

Agar

Việt Nam

Đƣờng Saccharose

Việt Nam

Đƣờng Lactose

Việt Nam

Đƣờng Glucose

Việt Nam


Cồn

Việt Nam

Thiết bị
-

Nồi hấp thanh trùng

-

Bể ổn nhiệt

-

Máy ly tâm
Tủ sấy
Tủ ấm
Cân phân tích
Máy đo pH

-

Tủ cấy vô trùng
Máy lắc
Bể siêu âm
Tủ lạnh