LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành đƣợc khóa luận này, với lịng biết ơn sâu sắc nhất, tơi xin
chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp- Trƣờng
Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình tơi trong q trình thực hiện
khóa luận tại trƣờng, đặc biệt là sự giúp đỡ của các thầy cô bên bộ môn Công
nghệ gen và Di truyền phân tử của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Hà V n Huân và TS

i Th M i

Hƣơng đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi thực hiện đề tài khóa luận
tốt nghiệp Đặ

iệt, kh

luận này nhận đƣợc sự hỗ trợ từ Đề tài cấp Nhà nƣớc

"Xây dựng ơ sở dữ liệu mã vạch DNA (DNA barcode) cho một số loài cây lâm
nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngoài gỗ có giá tr kinh tế" do PGS TS Hà V n Huân
làm Chủ nhiệm.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn hân thành nhất đến

thầy

, gi

đình, ạn bè - những ngƣời đã động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập, rèn
luyện và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Do trong q trình thực hiện cịn có nhiều hạn chế về mặt thời gian, kiến
thức và kinh nghiệm vì vậy khơng tránh khỏi những thiếu sót nhất đ nh. Tơi rất
mong nhận đƣợc những ý kiến đ ng g p ủa thầy cơ và các bạn để khóa luận tốt

nghiệp củ t i đƣợc hồn thiện hơn
Tơi xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, ngày 24 tháng 05 năm 2019
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Kiều Oanh

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................... vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ....................................... 3
1.1 Tổng qu n về đối tƣợng nghiên ứu .............................................................. 3
1.1.1. Nguồn gố và phân ố ủ

h vàng ....................................................... 3

1.1.2. Đặ điểm sinh học. ................................................................................... 4
1.1.3. Giá tr sử dụng. ......................................................................................... 4
1 2 Tổng qu n về N

r od

1 2 1 Giới thiệu về N

1.2.2 C

N mã vạ h ............................................... 5

r od ........................................................................ 5

đặ điểm ơ ản ủ trình tự N

r od ........................................ 6

1 2 3 Một số lo us đƣợ sử dụng trong phƣơng ph p N
1 2 4 Ứng dụng ủ

N

r od ở thự vật . 8

r od trên thự vật ............................................... 11

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 13
2.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 13
2 2 Phƣơng ph p nghiên ứu .............................................................................. 13
2 2 1 Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu ................................................................ 13
2.2.2. Dụng cụ, hóa chất sử dụng ........................................................................ 13
2.2.3. Cách tiến hành ........................................................................................... 15
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 20
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số .................................................................. 20
3.2. Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR ....................... 20
3 3 Phân t h kết quả .......................................................................................... 21
331 X


đ nh và phân tích trình tự DNA trên các vùng gen nghiên cứu......... 21

3.3.2. So sánh khả n ng phân iệt củ đoạn trình tự matK, rbcL và trnH-psbA 32
ii


CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH .................................................... 34
4 1 Kết luận ........................................................................................................ 34
4.2. Kiến ngh ...................................................................................................... 34
TÀI LIỆU TH M KHẢO

iii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Các chữ viết

Nghĩa tiếng Anh

tắt

Nghĩa tiếng Việt

ATP

Adenosin triphosphat

Adenosin triphosphat


BME

β-mereaptoethanol

β-mereaptoethanol

BOLD

Barcode of Life data

Barcode of Life data

Base pair

Cặp

bp
CBOL

Consortium for the Barcode of Consortium for the Barcode
Life

of Life

Convention
CITES

on

International


Trade in Endangered Species of
Wild Fauna and Flora

cpDNA
CTAB

s

tế

n quố

loài nguy ấp

ộ g n lụ lạp

Chloroplast DNA
Cetyl

C ng ƣớ về u n

trimethylammonium Cetyl trimethylammonium

bromide

bromide

Cytochrome b


Cytochrome b

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

Deoxyribonucleotide

Deoxyribonucleotid

triphosphate

triphosphate

EBA

Extraction Buffer A

Đệm t h

EBB

Extraction Buffer B

Đệm t h

Cytb
DNA (DNA)
dNTP


EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

axit

ethylenediamine

tetraacetic

Foward-Primer

Mồi xu i

IGS

Intergenic Spacer

vùng liên gen

ITS

Internal Transcribed Spacer

kb

Kilobase (1000 base)

F-Primer


v ng

N

gen
1000 ặp

iv

nằm giữ
s


mtDNA
NAD(P)H

NCBI

N ty thể

Mitochondrial DNA
Nicotinamide

adenine Nicotinamide

dinucleotide phosphate
National

adenine


dinucleotide phosphate

Center

for

Biotechnology Information

Trung tâm Quố

gi

về

Th ng tin C ng nghệ sinh
họ

ORF

Open Reading Frame

Khung đọ mở

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng huỗi polym r s

PVP


Polyvinyl pyrrolidone

Polyvinyl pyrrolidone

RFLP

Restriction

fragment

length Phân t h đ hình trình tự

polymorphism

DNA

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

rRNA

Ribosomal RNA

ARN ribosome

SDS


Sodium Dodecyl Sulphate

Sodium Dodecyl Sulphate

Reverse primer

Mồi ngƣợ

R-Primer
TAE

Tris-Acetate-EDTA

Tris-Acetate-EDTA

tRNA

Transfer RNA

RN vận huyển

UV

Ti

Untraviolet

v


ự tm


DANH MỤC CÁC BẢNG

Hình 1.1: Cây Bách Vàng ..................................................................................... 4
Bảng 2.1. Thành phần đệm tách A (100ml) ........................................................ 14
Bảng 2.2. Thành phần đệm tách B (100ml) ........................................................ 14
Bảng 3.1. Một số lồi có trình tự gen matK tƣơng đồng với loài Bách vàng
(Cupressus vietnamensis) trên ngân hàng gen NCBI.......................................... 22
Bảng 3.2. Một số lồi có trình tự gen rbcL tƣơng đồng với loài Bách vàng
(Cupressus vietnamensis) trên ngân hàng gen NCBI.......................................... 26
Bảng 3.3. Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tƣơng đồng với loài Bách vàng
(Cupressus vietnamensis) trên ngân hàng gen NCBI.......................................... 30

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1. DNA tổng của 3 mẫu Bách vàng ........................................................ 20
Hình 3 2 Kết quả nhân g n matK, rbcL và trnH-psbH...................................... 21
Hình 3 3 Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn matK tạo bởi NCBI ........... 23
Hình 3 4 Sự sai khác trình tự đoạn gen matK giữa loài Cupressus vietnamensis
và Callitropsis nootkatensis (các v tr s i kh

đƣợ

i đỏ) ............................ 25


Hình 3 5 Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn rbcL tạo bởi NCBI ............ 27
Hình 3 6 Sự sai khác trình tự đoạn gen rbcL giữa lồi Bách vàng (Cupressus
vietnamensis) nghiên cứu với lồi Callitropsis nootkatensis trên NCBI .............. 28
Hình 3 7 Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn trnH-psbA tạo bởi NCBI... 30
Hình 3 8 Sự sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA giữa lồi Bách vàng
(Cupressus vietnamensis) nghiên cứu với loài Callitropsis nootkatensis trên
NCBI ................................................................................................................... 32

vii


ĐẶT VẤN ĐỀ
h vàng Việt N m, Hoàng đàn vàng Việt N m, trắ

Bách vàng hay
Quản

ạ hoặ

ây ché tên gọi đ

phƣơng

h

d nh ph p kho họ : Callitropsis

vietnamensis là một loài ây thân gỗ mới đƣợ ph t hiện trong thời gi n gần
đây trong họ Hoàng đàn (Cupressaceae ,


nguồn gố ở khu vự huyện Quản

ạ, tỉnh Hà Giang thuộ miền ắ Việt N m.
Loài này

gỗ tốt, thơm, kh ng

mối mọt Ngƣời dân đ

phƣơng d ng

gỗ Hoàng đàn vàng làm qu n tài Họ ho rằng m i hƣơng ủ thứ gỗ này
giữ đƣợ x
đã

kh ng

hỏng Vì vậy, những ây lớn sống ở

thể

o độ thấp hầu nhƣ

đốn hạ hoàn toàn, hỉ òn lại những ây nhỏ, ong qu o, ây lớn nhất

đƣờng k nh khoảng 40 cm.
Trên hiện trƣờng thự tế, hoàng đàn vàng

r n n và kết hạt nhƣng


kh ng tìm thấy ây on t i sinh Nhƣ vậy ho d kho nh v ng ảo vệ tốt, loài
này vẫn đứng trƣớ nguy ơ tuyệt hủng Th o tiêu huẩn ủ IUCN thì hiện
trạng ủ lồi này đƣợ xếp ở ấp CR Criti lly End ng r d – Cự kỳ nguy
ấp
Trong

ng t

kiểm nhiệm hiện n y, phƣơng ph p hủ yếu đƣợ sử dụng

dự trên hình th i họ

qu n s t ằng mắt hoặ qu tiêu ản hiển vi Tuy nhiên,

phƣơng ph p này gặp trở ngại s u khi

nguyên liệu thự vật đã qu xử lý

hoặ hình th i gần giống nh u, gây kh kh n trong việ phân loại và nghiên ứu
nhân giống
Hiện n y, việ ứng dụng

g n mã vạ h, x

đ nh

barcode là một phƣơng ph p đ nh d nh, sử dụng một đoạn
nằm trong ộ g nom

đoạn

N

N

huẩn ngắn

ủ sinh vật đ ng nghiên ứu để phụ vụ gi m đ nh loài,

m ng lại hiệu quả

o trong thời gi n ngắn, g p phần kh ng nhỏ vào sự đ nh

d nh và ảo tồn

loại thự vật trên thế giới Phƣơng ph p x

DNA barcode ũng đƣợ

p dụng phổ iến

loài thự

đ nh

gi tr kinh tế

Từ những lý do trên, t i thự hiện đề tài “Nghiên ứu x

đ nh


đoạn
o
đoạn

DNA barcode cho loài cây Bách vàng (Cupressus vietnamensis phụ vụ gi m
1


đ nh loài” sẽ là

n ứ để phân loại, lự

họn và xây dựng dữ liệu g n, quý g p

phần quản lý tài nguyên thiên nhiên, ảo tồn nguồn g n ủ quố gi

2


CHƢƠNG I
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1 Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu.
1.1.1. Nguồn gốc và phân bố của Bách vàng.
Bách vàng đƣợ tìm thấy vào th ng 10 n m 1999, và khi đ đã đƣợ m
tả nhƣ là một hi mới và

d nh ph p kho họ là Xanthocyparis vietnamensis,

qu n hệ họ hàng rất gần với bách Nootka (Callitropsis nootkatensis), là loài
s uđ


ũng đƣợ

huyển s ng hi mới này F rjon & Hiệp N T và những ngƣời

kh , n m 2002 S u đ , Littl và những ngƣời kh

n m 2004

chi ban đầu Callitropsis đã đƣợ lấy th o d nh ph p kho họ
Nootk , vì thế họ lại huyển ây

hỉ r rằng tên
ủ lồi

h

h vàng về hi này Hiện hỉ ịn khoảng 100

cây cịn sống.[21]
Cupressus vietnamensis
Tình trạng bảo tồn

Nguy ấp (IUCN 3.1)[1]
Phân loại khoa học

Giới (regnum)
Ngành (divisio)
Lớp (class)
Bộ (ordo)

Họ (familia)
Chi (genus)

Plantae
Pinophyta
Pinopsida
Pinales
Cupressaceae
Cupressus

Loài (species)

C. vietnamensis

Danh pháp hai phần

Cupressus vietnamensis
(A.FARJON & T.H.NGUYÊN) SILBA, 2005.[21]

3


Hình 1.1: Cây Bách Vàng
(Nguồn:vườn Bách Thảo- Hà Nội. Người lấy: thầy Thanh- Đại học Lâm
Nghiệp- Việt Nam)
1.1.2. Đặc điểm sinh học.
Trên cùng một cây có hai dạng lá khác nhau rõ rệt. Các cành có dạng vảy,
dẹt, nhọn, sắc, mọc xen lẫn với các cành có lá kim dài, dẹt, xếp thành vịng gồm
4 lá. Nón quả tr ng tƣơng tự nhƣ


lồi hồng đàn giả nhƣng lại chỉ có 4 vảy

mọc từ gốc cành lá chứ không phải từ đỉnh ành nhƣ những loài hoàng đàn

l

vảy dẹt. [21]
1.1.3. Giá trị sử dụng.
Bách vàng cho gỗ thẳng, có vân gỗ đẹp, ch u mối mọt. Gỗ thƣờng sử
dụng làm đồ thủ công mỹ nghệ và đồ gỗ cao cấp. Gỗ Bách vàng có chứa tinh
dầu

m i thơm đặ trƣng, tinh dầu trong gỗ có tác dụng xu đuổi Gián, Chuột,

Nhện và chống mối mọt rất hiệu quả [21].

4


. . Tổng quan về DN barcode DN m vạch .
. . . i i thiệu v DNA ba c de
Phƣơng ph p phân loại hình th i

l h sử ph t triển lâu đời và đã xây

dựng đƣợ một hệ thống phân loại sinh vật n i hung và thự vật n i riêng
tƣơng đối đầy đủ và toàn diện Phƣơng ph p phân loại này hủ yếu dự vào sự
kh

iệt hình th i ủ


sinh sản ho
ần x

ơ qu n trong ơ thể thự vật, đặ

iệt là ơ qu n

Tuy nhiên, phƣơng ph p này ũng gặp rất nhiều kh kh n khi

đ nh những mẫu vật đ ng trong gi i đoạn ph t triển

những mẫu

đặ điểm giống nh u do

hoặ kh nhận iết do

hƣ r ho ,

ng th h nghi với điều kiện m i trƣờng

nhiều điểm tƣơng đồng ở ậ phân loại thấp nhƣ loài

và dƣới loài [2] Ngoài r , phƣơng ph p phân loại hình th i thƣờng hỉ đƣợ
thự hiện ởi
gi n và

huyên gi hình th i họ , việ phân loại đ i khi tốn nhiều thời


ng sứ [3].

N m 2003, P ul H

rt, nhà nghiên ứu tại Đại họ Gu lph ở Ont rio,

C n d , đề xuất “ N

r od ” mã vạ h

loài Mã vạ h đƣợ sử dụng là một đoạn

N
N

nhƣ là một

sọ màu đ n đặ trƣng ủ từng loài[4]

th y đổi rất ổn đ nh và

v ng dễ th y đổi trong qu trình tiến h

ự vào

này để đ nh gi sự s i kh

ng nghệ mã vạ h,

nh u và kh ng phân iệt đƣợ

thể phân iệt đƣợ [6] Một

h

v ng t

N

N

loài ằng
r od

mứ độ th y đổi trong trình tự
sinh vật [5] Trong

đ nh

ngắn từ một phần ủ hệ g n và

đƣợ d ng giống nhƣ một m y quét ở siêu th phân iệt đƣợ
nhận diện

h để x

di truyền giữ

thể h i mẫu vật tr ng rất giống

ằng mắt thƣờng, song qu mã vạ h, m y quét

N

r od điển hình phải đ p ứng đƣợ

yêu

ầu s u:


C t nh phổ iến

o để



Trình tự



C khả n ng phân iệt đồng thời đƣợ nhiều loài

t nh đặ hiệu

Điều này ho phép x

thể thự hiện trên nhiều loài thự vật
o và

hiệu suất nhân ản


o

đ nh một số sinh vật tại ất kỳ gi i đoạn ph t triển

từ một m mẫu rất nhỏ, dạng tƣơi h y ảo tồn từ nhiều n m trƣớ Việ đ nh
5


dạng mẫu thự vật ở mứ phân tử x

đ nh

mẫu thự vật

dụng trong nhiều lĩnh vự kho họ và ứng dụng kh
N
h

thể đƣợ

p

nh u Hơn nữ , mã vạ h

ngoài ý nghĩ giúp đ nh d nh mẫu vật òn giúp qu trình phân t h tiến
sinh họ

ủ lồi vậy đ trong tự nhiên[3]

Trong ối ảnh ủ nền kinh tế ph t triển nh nh và hậu quả t

động vật, thự vật ủ

quố gi kh

nh u, sự x

đ nh loài sử dụng phƣơng

ph p nh nh là ần thiết để đ nh gi đ dạng sinh họ
ảo vệ

động đến

ủ

khu vự này nhằm

loài đặ hữu quý hiếm và nguy ấp Tuy nhiên ần lƣu ý rằng

r od kh ng thể th y thế phân loại nhƣng n là
th ng tin về đơn v phân loại hƣ
đƣợ sử dụng hủ yếu ởi
lĩnh vự kh

nhƣ khảo ổ họ ,

. . . Các đặc điể

nhà phân loại họ và nhiều nhà kho họ ở
ng nghiệp sinh họ và hế iến thự phẩm


c b n của t nh t DNA ba c de
N

r od là phải phổ iến và đặ hiệu

iến d và dễ dàng sử dụng Điều này

dụng nhƣ một
giữ

nghĩ là

đoạn g n đƣợ sử

r od nên th h hợp ho nhiều đơn v phân loại,

loài nhƣng ổn đ nh và ảo thủ

đ ng kể

h để tạo r

iết Hiện n y, trên thế giới kỹ thuật này đ ng

Đặ điểm qu n trọng nhất ủ
trong

ng ụ hữu


N

ođ , N

o ên trong loài hoặ

r od lý tƣởng là một đoạn N

sự iến đổi
iến đổi kh ng

trình tự nu l otid

ngắn, ắt ặp đƣợ với ặp mồi đƣợ thiết kế đặ hiệu để dễ dàng khuế h đại
ằng PCR
Với động vật, hệ g n ty thể với
độ đột iến

o hủ yếu là

khiển và kh ng t i tổ hợp đƣợ
tìm r nguồn gố

đặ t nh di truyền th o dòng mẹ, tố

đột iến th y thế trong v ng mã ho , v ng điều
oi là một

loài Thêm vào đ ,


ng ụ hữu hiệu trong nghiên ứu
N

ty thể

số lƣợng ản s o lớn

trong tế ào và ền vững trong thời gi n rất dài, hàng nghìn n m trong khi đ
N nhân hỉ
o vậy phần lớn

một ản s o và nh nh h ng

phân huỷ r ngoài m i trƣờng

nghiên ứu sử dụng một v ng N ngắn ủ g n ty thể mã

hóa cytochrome oxidase subunit I (COI làm hỉ th

6

N

Mặ d

vài trƣờng


hợp ngoại lệ, COI đƣợ


oi là một hỉ th

N điển hình và hung ho

lồi

động vật [7], [8]
Qu trình tìm kiếm một hỉ th

N

hung ho

loài thự vật gặp

nhiều kh kh n Ở thự vật hệ g n lụ lạp m ng nhiều đặ điểm th h hợp đối
với hỉ th

N

và hệ g n nhân, v ng

Int rn l Tr ns ri d Sp

N

nằm giữ

r thƣờng đƣợ sử dụng làm


g n h y òn gọi ITS
N

hỉ th trong một

số nghiên ứu [9], [10], [11] Trong vòng 5 n m qu , nhiều v ng g n đã đƣợ
nghiên ứu và đề xuất là hỉ th
th

N

N

nào đƣợ đ phần

[13] Mặ d vậy,

ho thự vật [12] Tuy nhiên hƣ

hỉ

nhà phân loại họ thự vật hoàn toàn hấp nhận

nhà nghiên ứu ũng đã đi tới một qu n điểm thống nhất

là sẽ ần kh ng hỉ một mà nhiều v ng

N

hỉ th để đ nh d nh loài đối với


thự vật [12].
Th o T
đ p ứng


rl t P và ộng sự 2007 , hệ thống mã vạ h N lý tƣởng phải

yêu ầu s u đây:
Thứ nhất, đoạn N

hỉ th phải đủ độ iến thiên để phân iệt giữ

loài nhƣng ũng phải kh ng kh


Thứ

thể đƣợ sử dụng ho
, đoạn

N

hỉ th

thể dễ dàng đ nh d nh loài vào


thể trong


Thứ h i, hệ thống đ nh d nh ằng N phải đƣợ

một v ng N


nh u qu mứ giữ

Thứ tƣ,

nhân g n

huẩn h , với

nh m phân loại kh

ng

nh u

ần hứ đủ th ng tin ph t sinh loài để

nh m phân loại

khả n ng p dụng với

độ ảo thủ

ng loài

hi, họ,…


mẫu vật th , với v tr

ặp mồi

o, dễ dàng thự hiện phản ứng khuế h đại và đọ trình

tự N


N

Đoạn

kh ng

N

nghiên ứu nên

k h thƣớ ngắn để qu trình nhân ản

s i lệ h Th ng thƣờng, đoạn

150 p trở lại, nếu dài hơn sẽ dễ

N

nghiên ứu


k h thƣớ

s i lầm trong qu trình nhân ản N

7


. . .

t ố

1231

n

C

cu đ

c ử dụng t ng ph

ng pháp DNA ba c de

th c v t

g nn n

trình tự

r od đƣợ nhân ản từ N hệ g n ủ


ung ấp nhiều hơn th ng tin về

loài ần x

ố mẹ dự kiến sẽ

đ nh Tuy nhiên kh kh n trong

việ khuế h đại PCR từ g n nhân vì g n nhân hủ yếu là đơn g n hoặ
s o g n thấp, đặ

iệt từ sự suy tho i và hất lƣợng

phân iệt dƣới loài do ảo toàn g n hứ n ng
hế số lƣợng

N

ản

g nom và khả n ng

thể h nh là lý do tại s o hạn

g n nhân đƣợ thử nghiệm trong x

đ nh loài ằng phƣơng

pháp DNA barcode [8], [14].

1232

ng g n m

o om

Gen rDNA là hệ thống đ g n mã h
DNA ribosome (r N

m ng trình tự vừ

th h hợp để phân iệt

sp

ủ ri osom C

t nh ảo thủ vừ

loài gần gũi Trong tế ào, r N

đơn v đƣợ lặp lại ngẫu nhiên
28S và x n giữ

phần RN

o gồm

trình tự kh ng mã h


N

ảo tồn

t nh đ dạng

đƣợ sắp xếp nhƣ

mã h a ribosome 18S, 5,8S,

ITS1, ITS2 (internal transcribed

rs nằm ở h i ên sƣờn ủ v ng 5,8S V ng mã h

đƣợ

g n

o hơn h i v ng ITS Nhìn hung

ủ

g n rDNA

đơn v r N

đƣợ lặp lại

hàng nghìn lần và đƣợ sắp xếp tập trung tại v ng lớn trên nhiễm sắ thể Một
trong những t nh n ng đ ng hú ý nhất ủ r N là từng đơn v trong hệ thống

đ g n kh ng tiến ho độ lập, th y vào đ tất ả
phối hợp nhờ vậy mà r N đạt mứ ổn đ nh
giữ

loài kh

đơn v tiến ho một

o hơn trong loài nhƣng kh

iệt

nh u

Hiện tại, nrITS vùng ITS ủ g n nhân đƣợ x m là một trong những
ụ hữu

h

ng

h nhất để đ nh gi ph t sinh loài ở ả thự vật và động vật vì n phổ

iến trong tự nhiên, kế thừ từ ố mẹ và iến đổi

o do t hạn hế hứ n ng

Một số nghiên ứu gần đây ở ây sinh sản hữu t nh và ây sinh sản v t nh ho
thấy một số mứ độ iến đổi số


ản s o ủ trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều

nguyên nhân nhƣ l i gần, phân ly, t i tổ hợp, tỷ lệ đột iến cao và hình thành
g n giả ủ

g n hứ n ng dẫn đến những th y đổi đ
8

Trên ơ sở này


nr N

thể đƣợ sử dụng để phân đ nh h nh x

ng loài với đặ điểm l h sử đời sống kh
dƣới nƣớ

và nguồn gố tiến h

1233

n

kh

nh u một n m, lâu n m, trên ạn,

nh u [8], [14] [15]


ạp

Hệ g n lụ lạp ủ thự vật gồm phân tử
120 - 160 k

và hiệu quả thự vật trong

N

mạ h vòng

k h thƣớ

hi làm h i ản s o đơn là ản s o đơn lớn l rg singl -copy

r gion và ản s o đơn nhỏ sm ll singl - opy r gion H i ản s o đƣợ phân
h ởi h i huỗi lặp lại đảo nh u IR và IR
Hệ g n lụ lạp hứ tất ả
35 g n và

tRN

khoảng 100 g n

g n rRN

g n kh

vậy việ sử dụng


mã h

t nh ảo thủ

g n

prot in tổng hợp trong lụ lạp
húng

o và m ng t nh đặ th

sẵn từ

nhà kho họ rất qu n tâm

nghiên ứu về ph t sinh loài và

một số lo us là đoạn g n h y
r od tiềm n ng ho

ủ từng loài do

g n đƣợ

ự trên những

nghiên ứu gần đây,

họn để nghiên ứu làm hỉ th


loài thự vật trên tr i đất C khoảng 20 g n lụ lạp

độ dài ph hợp khoảng 1 k
C

ho

o,

kết quả phân t h hệ g n lụ lạp vào nghiên ứu ph t sinh

loài và phân loại thự vật đƣợ
th ng tin

4 g n ở thự vật ậ

ần thiết ho sự tồn tại ủ

Hệ g n lụ lạp

độ dài trung ình 20 - 30 kb.

đƣợ sử dụng trong nghiên ứu ph t sinh loài

g n này hứ đựng nhiều mứ độ tiến ho và vì vậy ph hợp ho nhiều mứ

độ phân loại [7], [8]
1.2.3.4. Gen rbcL
Trong


g n lạp thể, rbcL là trình tự g n đặ trƣng nhất, mã h

tiểu

đơn v lớn ủ ru ilos -1,5-bisphosphate cacboxylase/oxygenase (RUBISCO).
rbcL là g n đầu tiên đƣợ giải trình từ thự vật rbcL đã đƣợ sử dụng rộng rãi
trong nghiên ứu ph t sinh loài và phân loại thự vật với hơn 10000 trình tự
rbcL

sẵn trong G n

nk

o sự dễ dàng trong khuế h đại PCR ở một số

nh m thự vật, C OL gần đây đã
g n tiềm n ng nhất ho

ng nhận rbcL là một trong những trình tự

nghiên ứu

N

khả n ng phân iệt lồi thấp, nên hầu hết

9

r od ở thự vật Tuy nhiên, do
nh m đều ho rằng nên sử dụng



kết hợp rbcL với
r od

với

hỉ th

r od kh , v dụ nhƣ matK là hai locus

huẩn ho thự vật [8], [14], [16]

1.2.3.5. Gen matK
Trong số
nhất,

g n lụ lạp, matK là một trong những g n tiến ho nh nh

k h thƣớ khoảng 1550 p và mã h

đến qu trình loại ỏ
tiến ho nh nh và

ho nzym m tur s liên qu n

intron loại 2 trong qu trình phiên mã RN

o matK


mặt hầu hết trong thự vật nên đã đƣợ sử dụng nhƣ một hỉ

th trong nghiên ứu mối qu n hệ giữ

loài và ph t sinh loài ở thự vật C OL

đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thự vật và thấy rằng 90% mẫu thự vật hạt
k n dễ dàng khuế h đại trình tự ằng
dụng matK là một trong những lo us
1236

n

h sử dụng một ặp mồi đơn và đề ngh sử
r od

huẩn ho thự vật [8], [15]

g n rpoB và rpoC1

Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 mã h
polym r s lụ lạp Khi nghiên ứu họ

trong 4 tiểu đơn v
ipt ro rp

ủ RN

, Tsumur và đồng t


giả 1996 đã nhận thấy g n rpo là th h hợp để nghiên ứu ph t sinh loài Hiện
nay rpo là g n đƣợ sử dụng nhiều trong nghiên ứu ph t sinh loài và x
loài vi khuẩn, đặ

iệt là khi nghiên ứu

hủng

qu n hệ gần gũi C ng

với g n 16S rRNA, rpo đƣợ sử dụng trong nhiều nghiên ứu để x
vi khuẩn mới, do vậy

g n này đƣợ đề xuất là hỉ th

hợp với một số g n kh

Trong

đ nh

đ nh loài

r od độ lập hoặ kết

nghiên ứu gần đây, C OL đã thử nghiệm 7

lo us và thấy rằng khả n ng phân iệt loài uả đoạn g n rpoC1 là thấp nhất
43% Mặ d vậy, trong nghiên ứu Liu và đồng t


giả 2010 đã hỉ r rpoC1

là một hỉ th rất hữu h khi đƣợ sử dụng để phân iệt
vậy ần
n

ycf5 mã h
tồn trên tất ả
r od

o

nghiên ứu tiếp th o để hứng minh sự ph hợp khi sử dụng rpoB

và rpoC1 làm hỉ th
1237

loài ryophyt s

r od trong

nghiên ứu gi m đ nh loài [8]

g n ycf5
ho một prot in

hứ 330 mino

ids G n này đƣợ


ảo

v ng thự vật và đã đƣợ kiểm nghiệm ho ph hợp với DNA

ủ một vài nh m Tuy nhiên, g n này hƣ đƣợ

nhiều trong v i trò ủ một N

r od [7], [8]
10

ng nhận và sử dụng


1238

n

g n trnH-psbA
k h thƣớ trung ình khoảng 450 p, nhƣng th y đổi

Gen trnH-psb

từ 296 đến 1120 p, trnH-psb

đƣợ

hứng minh là

đã đƣợ khuế h đại thành


cao. Locus trnH-psb

khả n ng x

đ nh loài

ng ở nhiều thự vật hạt k n

và hạt trần Tuy nhiên, trong nhiều thự vật hạt k n trnH-psb lại
rất ngắn ~ 300 p , k h thƣớ
rpS19 hoặ

ủ g n này th y đổi lớn do sự

g n giả nằm giữ

k h thƣớ
mặt ủ g n

ng g n ủ h i g n trnH và psbA. Trong

nhiều nghiên ứu gần đây đã đề xuất việ sử dụng trnH-psb

nhƣ hỉ th

r od độ lập ho thự vật h y kết hợp với matK C OL thấy rằng khả n ng
phân iệt loài ủ trnH-psb

là


o nhất 69% trong số 7 lo us đƣợ thử

nghiệm và do đ đề ngh n nhƣ là hỉ th
dụng trong hệ thống

r od

rod

ổ sung trnH-psb

lo us khi hệ thống

thể sử

r od h i lo us kh ng

ung ấp đầy đủ khả n ng phân t h [8], [17].
1239

n

g n trnL(UAA)-trnF(GAA)

Locus trnL (UAA)-trnF F

hứ g n trnL (UAA), vùng intron và

v ng nằm giữ h i g n trnL (UAA) và trnF G


T

rl t và đồng t

giả là

nh m nghiên ứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống họ thự
vật V ng kh ng mã ho trnL(UAA) và trnF G
iến đổi lớn nhất ủ

N lụ lạp nhƣng

kh ng phải là v ng

ƣu thế nhƣ ấu trú

ậ 2 với v ng

iến đổi và v ng ảo thủ x n kẽ nh u Điều này tạo thuận lợi ho
tìm kiếm trình tự nu l otid ở
thuật PCR để khuế h đại

nghiên ứu

v ng ảo thủ để thiết kế mồi và sử dụng kỹ
đoạn g n ở v ng iến đổi Trong nghiên ứu để

x


đ nh trnL U

intron

T

rl t 2007 đã sử dụng 100 loài thự vật và kết luận rằng trnL intron

sử dụng nhƣ là một
ho phân t h, x
. . .

r od

đ nh

nên đƣợ sử dụng làm v ng
ủ thự vật, trnL-trnF là một

N

r od ,
thể

r od tiềm n ng

loài thự vật [8], [15], [18][14].

ng dụng của DNA ba c de t n th c v t
Mã vạ h


N

thự vật đƣợ x m là một

nhận diện và phân hi r nh giới giữ
diện

sự

ng ụ hữu hiệu trong việ

loài Đồng thời hỗ trợ qu trình nhận

mẫu vật kh ng nhận iết đƣợ hoặ
11

hƣ x

đ nh đƣợ thuộ loài


nào Vì vậy, hƣớng nghiên ứu

N

mã vạ h đ ng đƣợ ph t triển mạnh mẽ và

đƣợ ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vự liên qu n đến việ thự hiện hoặ
sử dụng nhận dạng thự vật nhƣ phân loại họ , sinh th i họ , ảo vệ m i trƣờng,

lâm nghiệp, n ng nghiệp, hải qu n, kiểm d h và trong nhiều tình huống ần x
đ nh “nh m loài”
Sử dụng

N

r od để nhận dạng

nghĩ ngày àng lớn Th o

r od of Lif

đƣợ hơn 1 100 000 N

r od

tìm kiếm

v ng trình tự

nh u Đã

ủ thự vật đƣợ lƣu trữ trong Ngân hàng

g n quố tế và liên kết với hơn 2 000 ài
N

ý

t Syst ms, n m 2011 đã lƣu trữ


r od từ hơn 95 000 đối tƣợng sinh vật kh

hơn 180 000 trình tự N
quố tế và việ sử dụng

loài trên quy m toàn ầu

o kh

nh u Để huẩn h

ở mứ độ

r od , ộng đồng kho họ đã nỗ lự trong việ
N

thể làm mã vạ h

thể phân iệt đồng thời

nhiều loài [2], [5], [6] C khoảng 29 000 loài ây trồng đƣợ
ƣớ CITES, và việ ph t triển

ảo hộ trong C ng

phƣơng ph p hiệu quả để phân iệt loài nằm

trong d nh s h CITES với những loài kh ng nằm trong d nh s h CITES
N


mã vạ h đƣợ sử dụng để t ng ƣờng sự hiểu iết

hạt, hoặ

th ng qu

đ

đ ng g p đến sự kh m ph

d nh[19] Phƣơng ph p tiếp ận mã vạ h
hữu

h về những

loài thự vật

ẩn trong đ

ryothyt s Rêu [20] Ngoài r ,

N

N

loài ẩn

ũng đã ung ấp


dạng loài

ủ

th ng tin

nh m thự

mã vạ h òn đƣợ sử dụng để x

rễ ây, ây giống hoặ gi i đoạn sống hƣ rõ v dụ nhƣ ây

vật
đ nh

ƣơng xỉ

Gametophytes).
Nghiên ứu DNA mã vạ h thự vật đã vƣợt x nhiệm vụ so s nh
N

kh

nh u để tiến tới những ứng dụng thự tế hơn

vạ h N ở một vài sinh vật kh
viện th ng tin,
quý hiếm C

với


mã vạ h đã đƣợ

thể giúp nhận diện loài, x

nhà kho họ đã

r một triển vọng mới ho

ng t

ằng

đ nh

v ng

h so s nh mã

iên soạn trong thƣ

loài mới hoặ

loài

những nghiên ứu, ứng dụng đầy hứ hẹn, mở
đ nh gi , phân loại, quản lý và ảo tồn đ

dạng sinh họ


12


CHƢƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
 Mục tieu nghiên cứu
Xác đ nh đƣợ

đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA của loài Bách vàng

(Cupressus vietnamensis).
 Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá cây Bách vàng.
- Nhân bản

đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA.

-X

đ nh và phân tích các tình tự nucleotide củ đoạn gen.

-X

đ nh mối quan hệ di truyền của cây Bách vàng.

2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Lá cây Bách Vàng đƣợc cô Bùi Th M i Hƣơng ung ấp.
. . Phƣơng pháp nghiên cứu
. . . Đối t


ng, phạm vi nghiên cứu

- Đối tƣợng nghiên cứu: lồi Bách vàng đƣợc cơ Bùi Th M i Hƣơng ung
cấp
- Phạm vi nghiên cứu: Phân lập và x
gen matK, rbcL, trnH-psbA của Bách vàng.
2.2.2. Hóa chất sử dụng
- Các loại đệm tách A và B

13

đ nh trình tự nucleotide củ đoạn


Bảng 2.1. Thành phần đệm tách A (100ml)
STT
1

Thành phần
2%

(w/v)

CTAB

(hexadecyltrimethylammonium

2,0g

bromide)

2

100mM Tris (pH 8,0) (use 1M stock)

10ml

3

20mM EDTA (use 0,5M stock)

1ml

4

1,4M NaCl

8,2g

5

4% (w/v) PVP (polyvinyl pyrrolidone)

4,0g

6

0,1% (w/v) ascorbic acid

0,1g


7

10mM β-mereaptoethanol (BME) (use 14,3M stock)

70μl

Bảng 2.2. Thành phần đệm tách B (100ml)
STT

Thành phần

1

100mM Tris HCl (pH 8,0) (use 1M stock)

10ml

2

50mM EDTA (use 0,5M stock)

2,5ml

3

100mM NaCl

0,6g

4


10mM β-mereaptoethanol (BME) (use 14,3M stock)

70μl

- Các hóa chất khác:
20% SDS (sodium dodecyl sulphate)
5M CH3COOK (bảo quản ở -20°C)
3M CH3COONa (pH 5,2)
70% ethanol
100% isopropanol
- Bộ hóa chất PCR: 2X PCR Master Mix solution và hóa chất sử dụng
trong điện di Redsafe.
- M y PCR, m y điện di, máy ly tâm, bể ủ nhiệt, …và

tr ng thiết b

khác thuộc bộ môn công nghệ gen và di truyền phân tử thuộc Viện công nghệ
sinh học Lâm nghiệp.
14


2.2.3. Cách tiến hành
2.2.3.1. Cách lấy mẫu
- Thu thập 03 mẫu lá Bách vàng đƣơ

i Th M i Hƣơng ung ấp.

- Chất lƣợng mẫu: Mẫu phải đặ trƣng ho từng loại ây, đặ trƣng ho
gi i đoạn phát triển thành thục của cây. Không lấy mẫu biến dạng, mẫu b sâu

bệnh hại, khơng lấy mẫu ở cây cịi cọ

ũng kh ng lấy mẫu ở cây quá tốt hoặc

cây sinh ra từ chồi non.
- Cách thu mẫu:
 Đ o g ng t y và d ng kéo ắt một lƣợng lá vừ đủ (chọn lá bánh tẻ,
sạch, không sâu bệnh, không quá già hay quá non).
 Cho lá vào túi nilon, b t miệng túi
 Đ nh số ký hiệu vào nhãn đ nh dấu và cho vào túi
 Bảo quản ng y trong th ng đ kh
 Khi mang về phịng thí nghiệm, bảo quản mẫu trong tủ lạnh -20°C.
2.2.3.2. Tách chiết DNA tổng số
- Cân 0,2g mẫu lá cho vào cối chày sứ, bổ sung 600µl Đệm tách A,
1800µl EBB và 200µl SDS, nghiền mẫu bằng cối chày sứ để phá vỡ tế bào.
- Hút 1,5ml mẫu cho vào ống eppendorf 1,5ml sạch.
- Ủ mẫu ở 65°C trong bể ổn nhiệt, thời gian 10 phút, 2 phút lắc dều một lần
- Ly tâm 12000vòng/ phút trong 10 phút ở 4°C.
- Hút 1,0ml dung d ch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5ml.
- Bổ sung 410µl CH3COOK. Trộn đều, đặt ống trong đ 5 phút
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C để thu d ch nổi
- Thu d ch nổi và bổ sung isopropanol lạnh theo tỷ lệ Vmẫu :
Visoprop nol = 1:1, đảo nhẹ và ủ ở -20°C trong 20 phút.
- Ly tâm thu tủa 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Loại bỏ d ch nổi,
thu tủa.
- Rửa tủa bằng 500µl ethanol 70% (cồn 70% để rửa các cặn bẩn kết tủa
cùng DNA).
15



- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C, loại bỏ d ch nổi rồi làm
khơ tủa (ít nhất 30 phút).
- Hịa tan tủ trong 100µl đệm elution
- Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 1%.
- Soi gel trên máy soi gel.
- Bảo quản mẫu ở -20°C
2.2.3.3. Tiến hành phản ứng PCR
- Sử dụng bộ kit 2X PCR M st r solution để thực hiện PCR.
- Các cặp mồi sử dụng ho
Vùng

Tên

gen

mồi

matK
rbcL

đoạn gen cần nhân:
Nhiệt độ
Trình tự mồi

gắn
mồi(°C)

mP3F 5’- TTCCATGGCCTTCTTTGCATTTGTTGC-3’

59°C


mP3R 5’- TTCCATGGTTTTTTGAGGATCCGCTGT-3’
rP1F

5’-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’

rP1R

5’-GTAAAATCAAGTCCACCTCG-3’

52°C

trnH- trnHF 5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’

50°C

pbsA pbsAR 5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’

- Chuẩn b các hóa chất theo thành phần của một phản ứng PCR nhƣ s u
STT

Thành phần

Thể tích (µl)

1

Nƣớc cất 2 lần khử ion

7,0


Taq buffer
2

2X PCR

Mg2+

Master Mix

dNTPs

10,0

Taq DNA polymerase
3

Mồi xuôi (F – Primer)

1,0

4

Mồi ngƣợc (R – Primer)

1,0

5

DNA khn


1,0

6

Tổng thể tích

20

16


- Trộn đều các thành phần trên với nh u s u đ

ằng pip t, s u đ làm

lắng hỗn hợp đ
- Lập trình trên m y PCR th o hƣơng trình nhƣ sau:

Nhiệt độ
gắn mồi

Khi thực hiện phản ứng PCR, chạy điện di để kiểm tra, so sánh với thang
chuẩn marker 1 kb.
Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 1%
- Pha gel agarose 1%
Cân 0,5g agarose cho vào 50ml TAE1X
Đun n ng ằng lò vi song
Bổ sung 5µl R ds f s u đ lắ đều
- Điện di

Tra vào mỗi giếng 5µl sản phẩm PCR
Chạy điện di trong dung d ch TAE 1X, 90V trong 30 phút
Soi gel bằng tia UV
Sản phẩm PCR phải đƣợc tinh sạch
2.2.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR
Những sản phẩm s u khi đƣợ khuế h đại thành
ằng kit PCR Purifi tion Kit ủ Norg n C


ng sẽ đƣợ tinh sạ h

ƣớ tinh sạ h nhƣ s u:

ƣớ 1: Thêm một tỉ lệ thể t h là 1:5 ủ

uff r inding vào hồn hợp

PCR để đƣợ một dung d h hoàn hỉnh v dụ ho mỗi 100 µl ủ hỗn hợp phản
ứng, thêm 500 µl uff r inding Trộn đều và trộn kỹ
17


ƣớ 2: Chuyển tối đ 800 µl dung d h từ ƣớ 1 vào ột oll tion



tube. Ly tâm 30 – 60s ở 8000 vòng Loại ỏ


dung d h th ng qu


ột

Lƣu ý: Nếu tổng khối lƣợng vƣợt qu 800 µl, dung d h

thể

đƣợ thêm vào ột thành từng gi i đoạn S u khi ổ sung 800 µl dung d h, ly
tâm ột 30 – 60s và loại ỏ dịng hảy th ng qu

Lặp lại ho đến khi tồn ộ

dung d h đã đƣợ thêm vào màng ột
ƣớ 3: Thêm 500 µl W sh uff r đã đƣợ thêm Eth nol vào ột lọ



collection tube. Ly tâm 30 – 60s ở 1000 vòng/phút Loại ỏ d h qu

ột và đặt

ột lọ trở lại vào ống thu
ƣớ 4: Ly tâm oll tion tu



phần đệm rử
 Lưu

mẫu


òn s t lại
ý:

N


trống thêm 1 phút để hoàn toàn loại ỏ

ƣớ này là điều kiện ần thiết vì th nol ịn s t lại trong

thể ứ

hế

phản ứng s u đ

ƣớ 5: Chuyển oll tion tu

th o trong ộ Kit
oll tion tu

tới một ống 1 5 µl sạ h kh ng kèm

Thêm 50 µl Elution uff r đến trung tâm màng ủ

ột

và ly tâm trong 1 phút ở 13000 vòng/phút


Sản phẩm PCR đƣợ tinh sạ h và đƣ đi x

đ nh trình tự nu l otid

2 2 3 5 Phƣơng ph p đọ trình tự
Xá địn

n

ằng p ương p áp

động: nguyên tắ

hung ủ giải

trình tự g n tự động là dự th o ơ sở ủ phƣơng ph p S ng r nhƣng qu trình
tổng hợp

N

thự hiện nhờ kỹ thuật PCR Mỗi ddNTP đƣợ đ nh dấu ằng

một loại fluo hrom
hợp trong

màu kh

nh u nên

thể tiến hành ả 4 phản ứng tổng


ng một ống nghiệm Đọ kết quả điện di tự động nhờ ti l z và

phần mềm xử l số liệu
2 2 3 6 Phƣơng ph p sử lý số liệu
Phân t h ằng L ST trong NC I
L ST
trú

huỗi

si Lo l

N , huỗi mino

lignm t Tools là hƣơng trình so s nh ấu
id ần phân t h với

huỗi tƣơng ứng lƣu

giữ trong Ngân hàng dữ liệu nhằm tìm kiếm huỗi tƣơng đồng với huỗi kiểm
18