LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành đƣợc khóa luận này, với lịng biết ơn sâu sắc nhất, tơi xin
chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình tơi trong suốt q
trình thực hiện khóa luận tại trƣờng, đặc biệt là sự giúp đỡ của các thầy cô
bên bộ môn Công nghệ gen và Di truyền phân tử của Viện Công nghệ sinh
học Lâm nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hà Văn Huân, TS. Bùi Thị Mai
Hƣơng đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tơi trong q trình hồn thành khóa
luận. Đặc biệt, Khóa luận này nhận đƣợc sự hỗ trợ từ Đề tài cấp Nhà nƣớc
"Xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch ADN (DNA barcode) cho một số loài cây
lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngồi gỗ có giá trị kinh tế" do PGS.TS. Hà Văn
Huân làm Chủ nhiệm. Với những kiến thức và kỹ năng thầy và cô truyền dạy
khơng chỉ giúp tơi hồn thành khóa luận mà cịn là tài sản quý báu theo giúp
tôi sau này.
Cảm ơn các anh chị thuộc Viện Công nghệ sinh học đã quan tâm giúp đỡ
tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè luôn động viên và hỗ trợ tôi trong
suốt thời gian qua.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hồn thành bài khóa luận một cách hồn
chỉnh nhất, song vẫn khơng thể tránh khỏi những thiếu sót. Do vậy, tơi rất
mong đƣợc sự góp ý của các thầy cơ và các bạn để kiến thức của tơi đƣợc
hồn thiện hơn.
Xn Mai, ngày 08 tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Đinh Kim Ngân

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i

MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 2
1.1. Tổng quan về Sƣa đỏ.................................................................................. 2
1.1.1. Phân loại khoa học .................................................................................. 2
1.1.2. Phân bố, sinh thái .................................................................................... 2
1.1.3. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 3
1.1.4. Giá trị sử dụng ......................................................................................... 4
1.2. Tổng quan về DNA barcode ...................................................................... 5
1.2.1. Giới thiệu về mã vạch DNA barcode ...................................................... 5
1.2.2. Một số DNA barcode đƣợc sử dụng ....................................................... 7
1.2.3.Tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật..................................... 14
CHƢƠNG 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 20
2.1. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 20
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 20
2.3. Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ........................ 20
2.3.1.Vật liệu nghiên cứu ................................................................................ 20
2.3.2. Hóa chất................................................................................................. 20
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 22
2.4.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................ 22
2.4.2. Phƣơng pháp nhân bản gen đích của kỹ thuật PCR .............................. 25
2.4.2.1. Các bƣớc tiến hành phản ƣng PCR .................................................... 25
ii


Thể tích mỗi phản ứng PCR mỗi mẫu là 50 l. .............................................. 25

2.4.3. Tinh sạch sản phẩm PCR ...................................................................... 27
2.4.4. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide ............................................ 27
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 28
3.1. Kết quả tách chiết DAN tổng số .............................................................. 28
3.2. Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR ................... 29
3.3. Phân tích kết quả ...................................................................................... 29
3.3.1. Xác định và phân tích trình tự DNA trên các vùng gen nghiên cứu..... 29
3.3.2. So sánh khả năng phân biệt của các đoạn trình tự ................................ 47
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 49
4.1. Kết luận .................................................................................................... 49
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
TT

Chữ viết
tắt

Nghĩa tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

1

ATP


Adenosin triphosphat

Adenosin triphosphat

2

BME

β-mereaptoethanol

β-mereaptoethanol

3

BOLD

Barcode of Life data

Barcode of Life data

4

Bp

Base pair

Cặp base

5


CBOL

Consortium for the Barcode Consortium for the
of Life
Barcode of Life

6

CITES

Convention on International
Trade in Endangered
Công ƣớc về buôn bán
Species of Wild Fauna and quốc tế các loài nguy cấp
Flora

7

cpDNA

Chloroplast DNA

8

CTAB

Cetyl trimethylammonium
bromide

Cetyl trimethylammonium

bromide

9

Cytb

Cytochrome b

Cytochrome b

10

DNA
(ADN)

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

11

dNTP

Deoxyribonucleotide
triphosphate

Deoxyribonucleotid
triphosphate

12


EBA

Extraction Buffer A

Đệm tách A

13

EBB

Extraction Buffer B

Đệm tách B

14

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic
acid

15

F-Primer

Foward-Primer

Mồi xuôi


16

IGS

Intergenic Spacer

vùng liên gen

bộ gen lục lạp

iv

axit ethylenediamine
tetraacetic


17

ITS

Internal Transcribed Spacer

vùng DNA nằm giữa các
gen

18

Kb

Kilobase (1000 base)


1000 cặp base

19

mtDNA

Mitochondrial DNA

DNA ty thể

20

NAD(P)H

Nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate

Nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate

NCBI

National Center for
Biotechnology Information

Trung tâm Quốc gia về
Thông tin Công nghệ sinh
học


22

ORF

Open Reading Frame

Khung đọc mở

23

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi
polymerase

24

PVP

Polyvinyl pyrrolidone

Polyvinyl pyrrolidone

25

RFLP

Restriction fragment length

polymorphism

Phân tích đa hình trình tự
DNA

26

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

27

rRNA

Ribosomal RNA

ARN ribosome

28

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

Sodium Dodecyl Sulphate

29


R-Primer

Reverse primer

Mồi ngƣợc

30

TAE

Tris-Acetate-EDTA

31

tRNA

Transfer RNA

ARN vận chuyển

31

UV

Untraviolet

Tia cực tím

21


v

Tris-Acetate-EDTA


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại khoa học cây Sƣa đỏ ......................................................... 2
Bảng 1.2. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục
lạp .................................................................................................................... 11
Bảng 2.1. Kí hiệu các mẫu Sƣa đỏ sử dụng cho nghiên cứu .......................... 20
Bảng 2.2. Thành phần đệm tách A (100ml) .................................................... 21
Bảng 2.3. Thành phần đệm tách B (100ml) .................................................... 21
Bảng 2.4. Thành phần đệm TE (100ml).......................................................... 21
Bảng 2.5. Trình tự và thơng tin của các cặp mồi đƣợc sử dụng ..................... 25
Bảng 2.6. Thành phần của một phản ứng PCR ............................................... 26
Bảng 3.2. Một số lồi có trình tự gen matK tƣơng đồng với loài Dalbergia
tonkinensis Prain trên ngân hàng gen NCBI ................................................... 32
Bảng 3.3. Một số loài có trình tự gen rbcL tƣơng đồng với lồi Dalbergia
tonkinensis Prain trên ngân hàng gen NCBI ................................................... 36
Bảng 3.4. Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tƣơng đồng với loài
Dalbergia tonkinensis Prain trên ngân hàng gen NCBI .................................. 39
Bảng 3.5. Một số lồi có trình tự gen ITS tƣơng đồng với loài Dalbergia
tonkinensis Prain trên ngân hàng gen NCBI ................................................... 43
Bảng 3.6. Một số lồi có trình tự gen ITS2 tƣơng đồng với loài Dalbergia
tonkinensis Prain trên ngân hàng gen NCBI ................................................... 46
Bảng 3.7. Bảng so sánh khả năng phân biệt của Các đoạn trình tự matK,
rbcL, trnH-psbA .............................................................................................. 48
Bảng 3.8. Bảng so sánh khả năng phân biệt của các đoạn trình tự ITS, ITS2 ......48


vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình thái lá và quả cây Sƣa đỏ ......................................................... 3
Hình 1.2. Hình thái cây Sƣa đỏ ......................................................................... 3
Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 3 mẫu Sƣa đỏ .............................. 28
Hình 3.2. Kết quả PCR gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS, ITS2 của 3 mẫu
Sƣa đỏ .............................................................................................................. 29
Hình 3.3. Sự khác biệt ở cấp độ lồi theo đoạn gen matK của lồi Dalbergia
tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen của lồi Dalbergia hainanensis
......................................................................................................................... 31
Hình 3.4. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn matK tạo bởi NCBI ....... 33
Hình 3.5. Sự khác biệt ở cấp độ loài theo đoạn gen rbcL của loài Dalbergia
tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen của lồi Dalbergia hainanensis
......................................................................................................................... 35
Hình 3.6. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn rbcL tạo bởi NCBI ........ 37
Hình 3.7. Sự khác biệt ở cấp độ loài theo đoạn gen trnH-psbA của lồi
Dalbergia tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen của lồi Dalbergia
hainanensis ...................................................................................................... 38
Hình 3.8. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn trnH-psbA tạo bởi NCBI
......................................................................................................................... 40
Hình 3.9. Sự khác biệt ở cấp độ loài theo đoạn gen IST của loài Dalbergia
tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen của lồi Dalbergia odorifera
voucher GD2 ................................................................................................... 42
Hình 3.10. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn ITS tạo bởi NCBI ........ 44
Hình 3.11. Sự khác biệt ở cấp độ loài theo đoạn gen IST2 của lồi Dalbergia
tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen của lồi Dalbergia odorifera
voucher GD2 ................................................................................................... 45
Hình 3.12. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn IST2 tạo bởi NCBI ...... 47


vii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Sƣa đỏ (hay còn gọi là cây Huỳnh Đàn lõi đỏ, Huê, Trắc thối…) tên
khoa học là Dalbergia Tonkinensis Prain thuộc họ Đậu (Fabaceae). Là cây
gỗ nhóm IA (đƣợc xếp vào loại cực kì quý hiếm, cấm khai thác và sử dụng
với mục đích thƣơng mại năm 1994). Chủ yếu phân bổ ở Việt Nam và đƣợc
tìm thấy rải rác tại Hải Nam, Trung Quốc [25].
Gỗ Sƣa cho mùi thơm quyến rũ thoảng nhẹ kiểu hƣơng trầm, đặc biệt gỗ
thớ mịn có vân bốn mặt chứ khơng chỉ hai mặt nhƣ các loại gỗ khác, khi đƣa
ra ánh sáng óng ánh bảy màu. Sƣa là lồi cây gỗ quý có giá trị kinh tế và sử
dụng cao. Mặc dù đã đƣợc luật pháp và các cơ quan chức năng tích cực bảo
vệ nhƣng đến nay lồi cây này đã bị khai thác theo kiểu tận diệt trong tự
nhiên. Các cây hiện còn hầu hết đều ở dạng tuổi nhỏ đƣợc gây trồng với nhiều
mục đích rất khác nhau và từ những nguồn giống rất khó xác định và quản lý.
Tuy vậy, cho đến nay những thông tin về lồi cây này tại đây cịn rất ít [8].
Hiện nay, nó là lồi đang bị đe dọa do mất mơi trƣờng sống. Tại Việt Nam
chính phủ xếp vào nhóm cây cần bảo vệ nghiêm ngặt, cho phép trồng khoanh
nuôi.
Trong công tác kiểm nghiệm hiện nay, phƣơng pháp chủ yếu đƣợc sử
dụng dựa trên hình thái học (quan sát bằng mắt hoặc qua tiêu bản hiển vi).
Tuy nhiên, phƣơng pháp này gặp trở ngại sau khi các nguyên liệu thực vật đã
qua xử lý hoặc hình thái gần giống nhau, gây khó khăn trong việc phân loại
và nghiên cứu nhân giống.
Hiện nay, sử dụng phƣơng pháp mã vạch ADN là một trong những công
cụ hữu hiệu phục vụ định danh lồi chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng
cách sử dụng một vùng ADN chuẩn hay còn gọi là chỉ thị mã vạch DNA.
Chính vì vậy, tơi thực hiện đề tài nghiên cứu “Xác định mã vạch ADN

cho cây Sƣa đỏ (Dalbergia tonkinensis Prain) phục vụ giám định loài”.

1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Sƣa đỏ
1.1.1. Phân loại khoa học
Bảng 1.1. Phân loại khoa học cây Sưa đỏ
Giới (Regnum)

Plantae

Bộ (Ordo)

Fabales

Họ (Familia)

Fabaceae

Phân họ (Subfamilia)

Faboideae

Tơng (Tribus)

Dalbergieae

Chi (Genus)


Dalbergia

Lồi (Species)

D. tonkinensis

1.1.2. Phân bố, sinh thái
Mùa hoa từ tháng 5 - 7, quả chín từ tháng 9 - 12. Cây tái sinh bằng hạt
và bằng chồi ở nơi có độ che phủ dƣới 50%. Cây mọc rải rác trong rừng, trên
đất có tầng dày, giàu chất dinh dƣỡng, ở độ cao từ thấp tới 600 - 700 m, đôi
khi tới 1000 m.
Trong nƣớc, Sƣa đỏ thƣờng phân bố ở các khu vực nhƣ: Đà Nẵng,
Quảng Nam (Hiên, Giàng, Phƣớc Sơn), Kontum (Đắk Tô, Sa Thầy), Gia Lai,
Đắk Lắk, Lâm Đồng, Bình Dƣơng, Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu,
Kiên Giang. Trên thế giới thƣờng phân bố ở các nƣớc: Thái Lan, Lào,
Campuchia [25].

2


1.1.3. Đặc điểm sinh học

Hình 1.1. Hình thái lá và quả cây Sưa đỏ

Hình 1.2. Hình thái cây Sưa đỏ
Là cây gỗ nhỡ, rụng lá theo mùa, cao từ 6 - 12 m (cũng có thể cao tới
15m), sinh trƣởng trung bình. Thân cây dạng hợp trục, dáng phân tán. Vỏ thân
cây màu vàng nâu hay xám, nứt dọc. Cành non màu xanh, có lơng mịn thƣa.
Lá mọc cách, cấu tạo lá dạng kép lông chim lẻ, mỗi là kép có từ 9 - 17 lá chét

đính so le trên cuống chính. Lá chét hình xoan thn, đầu nhọn hoặc có mũi
3


ngọn, đi trịn, mặt dƣới phiến lá thƣờng có màu tái trắng. Kích thƣớc lá chét
dài từ 6 - 9 cm, rộng từ 3 - 5 cm, lá ché đính ở đầu cuống kép thƣờng có kích
thƣớc lớn hơn các lá cịn lại. Cuống chính và các cuống lá chét khơng lơng,
phiên lá chét khơng lơng. Có lá kèm nhỏ không lông, sớm rụng [25].
Hoa mọc ra từ nách lá, thƣờng xuất hiện trƣớc khi lá mọc đầy đủ. Hoa tự
tán gồm nhiều bơng màu trắng, có kích thƣớc 7 - 9 mm, mùi thơm nhẹ. Mùa
hoa vào tháng 2 - 3. Quả dạng đậu hình trứng thn dài, dài 5 - 7,5 cm, rộng
khoảng 2 - 2,5 cm. Quả chứa 1 - 2 hạt, mỗi hạt có đƣờng kính khoảng 8 - 9
mm, hình thân dẹp. Quả khi chín không tự nứt [25].
Gỗ Sƣa cho mùi thơm quyến rũ thoảng nhẹ kiểu hƣơng trầm. Khi đốt tàn
có màu trắng đục, mùi khó chịu nên đƣợc gọi là Trắc thối.
1.1.4. Giá trị sử dụng
Gỗ chỉ dùng phần lõi những cây trên trăm tuổi. Gỗ sƣa thớ mịn, vừa
cứng lại vừa dẻo, có nhiều hoa văn đẹp. Thời phong kiến vua chúa dùng gỗ để
đóng đồ nội thất cao cấp trong cung đình vì nó vừa là hƣơng liệu vừa là dƣợc
liệu. Những năm gần đây, giới nhà giàu nƣớc ngoài đổ xơ săn lùng trắc thối
để đóng quan tài hoặc ƣớp xác nhƣ các vị hoàng đế. Ngƣời ta cho là quan tài
đóng bằng gỗ trắc thối có khả năng giữ đƣợc xác lâu, không bị phân hủy [25].
Do đặc điểm hoa trắng, có mùi thơm, tán rộng, cho nên ngƣời ta có thể trồng
làm cảnh tại các đƣờng phố. Nghe nói theo Giáo sƣ Đỗ Tất Lợi thì gỗ cây này cịn
đƣợc sử dụng cùng với dạ dày nhím làm vị chính trong đơn thuốc chữa bệnh đau
dạ dày. Có nơi cịn chiết suất một số chất có trong gỗ sƣa này để chế thuốc chữa
ung thƣ dạ dày. Do đó mà sƣa đƣợc thổi lên giá rất cao [25].
Hiện nay gỗ sƣa đang bị tận diệt khai thác. Theo IUCN thì cấp đe dọa
của nó hiện nay là VU A1cd = sắp nguy cấp (năm đánh giá 1997). Ở Việt
Nam, gỗ sƣa thuộc nhóm 1A là nhóm đặc biệt quý hiếm. Vì vậy việc bảo vệ

cây gỗ sƣa tại Việt Nam đang là một việc rất đáng lo ngại. Cây gỗ sƣa nhân
giống khơng khó nên hàng chục vạn cây đã đƣợc nhân giống tại nhiều nơi để
bán cho ngƣời trồng [25].
4


1.2. Tổng quan về DNA barcode
1.2.1. Giới thiệu về mã vạch DNA barcode
Phƣơng pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây
dựng đƣợc một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng
tƣơng đối đầy đủ và tồn diện. Phƣơng pháp phân loại này chủ yếu dựa vào
sự khác biệt hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt lá cơ
quan sinh sản (hoa). Tuy nhiên, phƣơng pháp này cũng gặp rất nhiều khó
khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển (chƣa ra
hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện
mơi trƣờng hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tƣơng đồng ở bậc phân loại
thấp nhƣ loài và dƣới loài [5]. Ngoài ra, phƣơng pháp phân loại hình thái
thƣờng chỉ đƣợc thực hiện bởi các chun gia hình thái học, việc phân loại
đơi khi tốn nhiều thời gian và công sức [4].
Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân
tử, một phƣơng pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình
thành và đƣợc gọi là phƣơng pháp phân loại học phân tử. Phƣơng pháp này
dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (DNA) trong và ngoài nhân hoặc các
sản phẩm của chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tƣợng nghiên cứu,
ngƣời ta có thể lựa chọn các gen (đoạn DNA) khác nhau hoặc các sản phẩm
khác nhau của hệ gen. Trong phƣơng pháp phân loại phân tử, các kỹ thuật
thƣờng đƣợc ứng dụng để nghiên cứu tính đa dạng sinh học, mối quan hệ tiến
hóa giữa các lồi, xây dựng cây phát sinh chủng loại cũng nhƣ giúp nhận
dạng đến cấp phân loại loài hoặc chi [1].
Ở thực vật, một số phƣơng pháp chỉ thị phân tử đƣợc sử dụng để nhận

dạng loài cũng nhƣ sử dụng enzyme giới hạn kết hợp với lai DNA (RFLP),
dấu vân tay DNA (DNA fingerprinting), phản ứng chuỗi trùng hợp PCR và
đặc biệt việc sử dụng các kỹ thuật mã vạch DNA (DNA barcode) ngày càng
trở nên phổ biến. Các phƣơng pháp này đều dựa trên thực tế rằng cấu trúc hóa

5


học của DNA từ mọi loài là giống nhau và sự khác biệt duy nhất giữa chúng
là trình tự các cặp base.
Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,
Canada, đề xuất “mã vạch ADN” (DNA barcode) nhƣ là một cách để xác định
loài [3]. Mã vạch đƣợc sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ một phần của hệ
gen và đƣợc dùng giống nhƣ một máy quét ở siêu thị phân biệt đƣợc các sản
phẩm bằng cách nhận diện các sọc màu đen đặc trƣng của từng sản phẩm.
Trong cơng nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất giống nhau và không
phân biệt đƣợc bằng mắt thƣờng song qua mã vạch, máy quét có thể phân biệt
đƣợc.
DNA barcode là một trình tự nucleotide của một chuỗi DNA ngắn của
một gen đã biết, trong đó có vùng ít bị thay đổi và vùng dễ thay đổi trong q
trình tiến hóa. Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự DNA này để đánh giá
sự sai khác di truyền giữa các sinh vật [6].
DNA barcode là một cơng cụ mới, rất có hiệu quả cho các nghiên cứu về
phân loại, giám định sinh vật, gồm cả động vật, thực vật, vi sinh vật và virus.
Việc xác định lồi bằng DNA mã vạch có hiệu quả cao trong việc phân biệt
các loài sinh vật khi những quan sát hình thái, sinh trƣởng và phát triển chƣa
đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài.
Việc giải mã toàn bộ hệ gen của sinh vật gặp nhiều khó khăn, tốn kém
nhiều cơng sức và kinh phí nên khơng phải phịng thí nghiệm nào cũng có thể
thực hiện đƣợc. Vì vậy việc xác định một đoạn DNA đã biết, đặc trƣng cho

lồi (thậm chí cá thể) để làm căn cứ phân biệt cá thể này với cá thể khác, loài
này với loài khác. ADN mã vạch đƣợc xem là một cơng cụ quan trọng trong
phân tích, đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen, xác định nguồn gốc, xuất xứ
của sinh vật, bản quyền các sản phẩm sinh học. Vì vậy, hƣớng nghiên cứu
AND mã vạch đang đƣợc phát triển mạnh mẽ và đƣợc ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực khác nhau: nghiên cứu về đa dạng sinh vật, giám định

6


loài, giám định mẫu vật, xét nghiệm bệnh, bản quyền sản phẩm (giống cây
trồng, vật nuôi, sản phẩm nông - lâm - thủy sản,…).
Việc sử dụng DNA barcode để nhận dạng các lồi trên quy mơ tồn cầu
có ý nghĩa ngày càng lớn. Theo barcode of Life Data Systems, năm 2011 đã
lƣu trữ đƣợc hơn 1.100.000 DNA barcode từ hơn 95.000 đối tƣợng sinh vật
khác nhau. Đã có hơn 180.000 trình tự DNA barcode của thực vật đƣợc lƣu
trữ trong Ngân hàng gen quốc tế và liên kết với hơn 2.000 bài báo khác nhau.
Để chuẩn hóa ở mức độ quốc tế về việc sử dụng DNA barcode, cộng đồng
khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự DNA có thể làm mã
vạch có thể phân biệt đồng thời nhiều loài [10], [11], [12], [14].
Một DNA barcode điển hình phải đáp ứng đƣợc các yêu cầu sau:
- Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều lồi thực vật.
- Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao.
- Có khả năng phân biệt đồng thời đƣợc nhiều lồi [13].
Đến nay, có rất nhiều đoạn DNA đƣợc sử dụng làm DNA barcode, tùy
thuộc nhóm sinh vật mà đoạn DNA đƣợc sử dụng làm mã vạch khác nhau.
1.2.2. Một số DNA barcode được sử dụng
1.2.2.1. Mã vạch ADN ở động vật
Việc lựa chọn các vùng DNA barcode liên quan đến việc lựa chọn một
hoặc một vài locus có thể thu đƣợc trình tự thƣờng xuyên và đáng tin cậy

trong bộ mẫu lớn và đa dạng, đƣa ra dữ liệu so sánh một cách dễ dàng giúp
phân biệt các loài với nhau, hay có thể nói đây là vùng thơng tin di truyền có
ý nghĩa thực sự có thể cung cấp thơng tin nhận dạng: nó thƣờng phải đủ dài
để chứa đủ thơng tin để có thể phân biệt giữa các lồi nhƣng đủ ngắn để thuận
tiện cho phân tích. Mã vạch DNA locus gen CO1 ở động vật thƣờng đƣợc
dùng rộng rãi do đáp ứng đƣợc tiêu chí này [13].
Đây là một gen đơn bội, đƣợc di truyền từ mẹ và cho mức độ phân biệt
cao, là một vùng gen mã hóa cho protein có mặt với nhiều bản sao trong mỗi
tế bào. Ở động vật, nó có tính bảo thủ với những vùng đảo ngƣợc nhỏ, hoặc
7


thƣờng xuyên lặp đi lặp lại đơn nucleotide. Những đặc điểm này kết hợp với
cặp mồi đƣợc thiết kế tốt, hiệu quả sử dụng gen CO1 để phân biệt nhiều mẫu
động vật có cùng tổ tiên đƣợc ghi nhận tốt, thậm chí hiệu suất sử dụng cao
ngay với các mẫu đã đƣợc lƣu giữ qua thời gian dài. Chẳng hạn các lồi linh
trƣởng, hệ gen mỗi tế bào có khoảng 4 tỷ cặp bp, mã vạch gen ty thể CO1 chỉ
có kích thƣớc 648 bp, nhƣng từ ngƣời tới tinh tinh và các loài vƣợn khác, sự
khác biệt CO1 vừa đủ để phân biệt giữa mỗi loài. Loài ngƣời khác hai lồi
cịn lại ở một hoặc hai cặp base trong vùng mã vạch, nhƣng khác biệt ở cả hệ
gen ngƣời với tinh tinh là khoảng 60 vị trí và với khỉ đột là 70 vị trí.
Đối với cơng nghệ mã vạch DNA, hệ gen ty thể cũng tỏ ra đặc biệt phù
hợp so sự khác biệt giữa các loài nhiều hơn so với DNA hệ gen nhân. Do đó,
một số đoạn ngắn mtDNA có thể đƣợc dùng để phân biệt các lồi. Ngồi ra,
DNA ty thể có nhiều bản sao hơn so với DNA nhân, vì vậy dễ phục hồi từ các
mẫu vật, đặc biệt là từ các mẫu với lƣợng nhỏ hoặc các mẫu đã bị xuống cấp.
Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thử nghiệm và đƣa ra hiệu quả của mã vạch CO1
trong phân loại các nhóm động vật đa dạng, phân bố trên đất liền cũng nhƣ
dƣới biển, từ các vùng cực đến các vùng nhiệt đới, giúp phân biệt đƣợc
khoảng 98% các loài với nhau. Trong phần cịn lại, nó xác định hẹp đến các

cặp hoặc bộ nhỏ của các lồi có mối quan hệ gần gũi, các loài chỉ vừa mới
tách ra hoặc các loài lai thƣờng xuyên [15].
Ngoài locus gen CO1, các đoạn gen ty thể Cytb, gen ribosome 12S, 16S
cũng đƣợc dùng nhƣ DNA mã vạch trong nhận dạng ở động vật [13].
1.2.2.2. Mã vạch DNA ở thực vật
Khơng giống nhƣ động vật, ngồi bộ gen nhân và ty thể, thực vật cịn có
một bộ gen bổ sung là bộ gen lục lạp (cpDNA). DNA nhân, ty thể và lục lạp
đều đƣợc sử dụng trong phân tích phát sinh lồi. Tùy vào mức độ phân tích
mà mỗi vùng gen và mỗi phƣơng pháp đƣợc áp dụng thích hợp. Do tính phức
tạp và lặp đi lặp lại, chỉ có một số gen thuộc DNA hệ gen nhân nhƣ 18S, 26S,
vùng ITS,… đƣợc sử dụng. Vùng 18S và 5,8S thƣờng đƣợc sử dụng để xác
8


định ở mức bộ hoặc họ, vùng 26S thƣờng đƣợc sử dụng để xác định ở mức
dƣới họ cho đến loài, vùng ITS và vùng 5S spacer thƣờng đƣợc dùng để phân
tích ở mức lồi cho tới mức dƣới lồi.
Nếu nhƣ các gen ty thể nhƣ CO1 và Cytb đƣợc dùng rộng rãi cho động
vật và tảo thì khi chúng đƣợc áp dụng cho các loài thực vật trên cạn lại biểu
hiện tính bảo thủ cao nên khơng phù hợp làm DNA mã vạch. Thay vào đó,
các vùng rời rạc trong hệ gen lạp thể đã đƣợc dùng trong các nghiên cứu phát
sinh loài (nhƣ các vùng exon của các gen rbcL, atpB, ndhF, matK và vùng
intron của các gen trnL, trnL-F).
Những vùng DNA này giống nhƣ mã vạch bởi tính bao thủ trong phạm
vi mỗi lồi nhƣng đa hình giữa các lồi. Một vùng trình tự thơng thƣờng khác
cho nghiên cứu phát sinh loài thực vật trên cạn là ribosome ITS nhân (vùng
đệm của tiểu đơn vị lớn RNA ribosome), tuy nhiên vùng này không đạt hiệu
quả cao ở một số nhóm thực vật do các yếu tố khác liên quan đến các diễn
biến tiến hóa phức tạp của các vùng lặp lại cao trong hệ gen nhân [13]. Tính
đến năm 2009, có khoảng 8 locus gen đƣợc sử dụng làm mã vạch DNA ở các

loài thực vật, bao gồm cả hệ gen nhân và hệ gen lục lạp.
a. Trình tự gen nhân
Các trình tự barcode đƣợc nhân bản từ DNA hệ gen của bố mẹ dự kiến
sẽ cung cấp nhiều hơn thơng tin về các lồi cần xác định. Tuy nhiên khó khăn
trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc
có bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lƣợng DNA genome và
khả năng phân biệt dƣới lồi do bảo tồn gen chức năng có thể chính là lý do
tại sao hạn chế số lƣợng các gen nhân đƣợc thử nghiệm trong xác định loài
bằng phƣơng pháp DNA barcode [9], [20].
b. Vùng gen mã hóa ribosome
Gen rDNA là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của ribosome. Các gen
DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng
thích hợp để phân biệt các loài gần gũi. Trong tế bào, rDNA đƣợc sắp xếp
9


nhƣ các đơn vị đƣợc lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S,
5,8S, 28S và xen giữa các trình tự khơng mã hóa ITS1, ITS2 (internal
transcribed spacers) nằm ở hai bên sƣờn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba
gen rDNA đƣợc bảo tồn cao hơn hai vùng ITS. Nhìn chung các đơn vị rDNA
đƣợc lặp lại hàng nghìn lần và đƣợc sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm
sắc thể. Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị
trong hệ thống đa gen khơng tiến hố độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị
tiến hố một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong
loài nhƣng khác biệt giữa các loài khác nhau.
Hiện tại, nrITS vùng ITS của gen nhân đƣợc xem là một trong những
cơng cụ hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì
nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế
chức năng. Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản
vơ tính cho thấy một số mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và

ITS2 do nhiều nguyên nhân nhƣ lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao
và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó. Trên
cơ sở này nrDNA có thể đƣợc sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả
thực vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm,
lâu năm, trên cạn, dƣới nƣớc) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [9], [20], [24].
c. Trình tự gen lục lạp
Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử DNA mạch vịng có kích thƣớc
120 - 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large single - copy
region) và bản sao đơn nhỏ (small single - copy region). Hai bản sao đƣợc
phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb) có độ dài trung bình 20
- 30 kb. Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao),
các gen tRNA (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp
trong lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng.

10


Bảng 1.2. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế
cho hệ gen lục lạp
Gen

Mồi

Trình tự 5’→3’

rbcL

a-f
a-r


ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC

→
←

matK

matK 1F
matK 1R
matK 2F
matK 2R

GAACTCGTCGGATGGAGTG
GAGAAATCTTTTTCATTACTACAGTG
CGTACTTTTATGTTTACAGGCTAA
TAAACGATCCTCTCATTCACGA

→
←
→
←

rpoB

rpoB 1
rpoB 2
rpoB 3
rpoB 4


AAGTGCATTGTTGGAACTGG
ATGCAACGTCAAGCAGTTCC
CCGTATGTGAAAAGAAGTATA
GATCCCAGCATCACAATTCC

→
→
←
←

rpoC1

rpoC1 1
rpoC1 2
rpoC1 3
rpoC1 4

GTGGATACACTTCTTGATAATGG
GGCAAAGAGGGAAGATTTCG
TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC
CCATAAGCATATCTTGAGTTGG

→
→
←
←

ycf5
(ccsA)


ycf5 1
ycf5 2
ycf5 3
ycf5 4

GGATTATTAGTCACTCGTTGG
ACTTTAGAGCATATATTAACTC
ACTTACGTGCATCATTAACCA
CCCAATACCATCATACTTAC

→
→
←

trnH psbA

trnH2
psbAF
trnH(GUG)
psb A

CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
GTTATGCATGAAAGTAATGCTC
ACTGCCTTGATCCACTTGGC
CGAAGCTCCATCTACAAATGG

→
←
→
←


trnL-c
trnL-d
trnL-e

CGAAATCGGTAGACGCTACG
GGGGATAGAGGGACTTGAAC
GGTTCAAGTCCCTCTTATCCC

→
←
→

trnL-f
trnL-g
trnL-h

ATTTGAACTGGTGACACGAG
GGGCAATCCTGAGCCAA
CCATTGAGTCTCTGCACCTATC

←
→
←

trnL-F

→: mồi xuôi; ←: mồi ngƣợc

11



Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng lồi do
vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát
sinh loài và phân loại thực vật đƣợc các nhà khoa học rất quan tâm. Dựa trên
những thơng tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu
gần đây, một số locus là đoạn gen hay các gen đƣợc chọn để nghiên cứu làm
chỉ thị barcode tiềm năng cho các loài thực vật trên trái đất. Có khoảng 20 gen
lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng 1 kb) đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phát
sinh loài. Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hố và vì vậy phù hợp
cho nhiều mức độ phân loại [19], [20], [22].
Các locus khác nhau đã đƣợc đề xuất về điều tra nhóm, mồi thích hợp
cho các gen này đƣợc trình bày trong bảng 1.2.
d. Trình tự gen rbcL
Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trƣng nhất, mã hóa các
tiểu đơn vị lớn của rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase
(RUBISCO). rbcL là gen đầu tiên đƣợc giải trình từ thực vật. rbcL đã đƣợc sử
dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn
10.000 trình tự rbcL có sẵn trong GenBank. Do sự dễ dàng trong khuếch đại
PCR ở một số nhóm thực vật, CBOL gần đây đã công nhận rbcL là một trong
những trình tự gen tiềm năng nhất cho các nghiên cứu DNA barcode ở thực
vật. Tuy nhiên, do khả năng phân biệt lồi thấp, nên hầu hết các nhóm đều
cho rằng nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, ví dụ
nhƣ matK là hai locus barcode chuẩn cho thực vật [20], [21], [22].
e. Trình tự gen matK
Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hố nhanh
nhất, có kích thƣớc khoảng 1550 bp và mã hóa cho Enzyme maturase liên
quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong q trình phiên mã RNA.
Do matK tiến hố nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã đƣợc sử
dụng nhƣ một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh

loài ở thực vật. CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy
12


rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng
một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng matK là một trong những locus barcode
chuẩn cho thực vật [20], [24].
f. Trình tự gen rpoB và rpoC1
Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của RNA
polymerase lục lạp. Khi nghiên cứu họ Dipterocarpaceae, Tsumura và đồng
tác giả (1996) đã nhận thấy gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh
loài. Hiện nay rpoB là gen đƣợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh
loài và xác định các loài vi khuẩn, đặc biệt là khi nghiên cứu các chủng có
quan hệ gần gũi. Cùng với gen 16S rRNA, rpoB đƣợc sử dụng trong nhiều
nghiên cứu để xác định loài vi khuẩn mới, do vậy các gen này đƣợc đề xuất là
chỉ thị barcode độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác. Trong các nghiên
cứu gần đây, CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt
loài cuả đoạn gen rpoC1 là thấp nhất (43%). Mặc dù vậy, trong nghiên cứu
Liu và đồng tác giả (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị rất hữu ích khi đƣợc
sử dụng để phân biệt các lồi bryophytes. Do vậy cần có các nghiên cứu tiếp
theo để chứng minh sự phù hợp khi sử dụng rpoB và rpoC1 làm chỉ thị
barcode trong các nghiên cứu giám định lồi [20], [22].
g. Trình tự gen ycf5
Gen ycf5 mã hóa cho một protein có chứa 330 amino acids. Gen này
đƣợc bảo tồn trên tất cả các vùng thực vật và đã đƣợc kiểm nghiệm cho phù
hợp với DNA barcode của một vài nhóm. Tuy nhiên, gen này chƣa đƣợc cơng
nhận và sử dụng nhiều trong vai trò của một DNA barcode [19], [20].
h. Trình tự hai gen trnH-psbA
Gen trnH-psbA có kích thƣớc trung bình khoảng 450 bp, nhƣng thay đổi
từ 296 đến 1120 bp, trnH-psbA đƣợc chứng minh là có khả năng xác định loài

cao. Locus trnH-psbA đã đƣợc khuếch đại thành cơng ở nhiều thực vật hạt kín
và hạt trần. Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có kích
thƣớc rất ngắn (~ 300 bp), kích thƣớc của gen này thay đổi lớn do sự có mặt
13


của gen rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa cùng gen của hai gen trnH và psbA.
Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng trnH-psbA nhƣ chỉ
thị barcode độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK. CBOL thấy rằng khả
năng phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7 locus đƣợc
thử nghiệm và do đó đề nghị nó nhƣ là chỉ thị barode bổ sung. trnH-psbA có
thể sử dụng trong hệ thống barcode ba locus khi hệ thống barcode hai locus
không cung cấp đầy đủ khả năng phân tích [17], [20].
i. Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA)
Locus trnL(UAA)-trnF(FAA) chứa gen trnL(UAA), vùng intron và vùng
nằm giữa hai gen trnL(UAA) và trnF(GAA). Taberlet và đồng tác giả là
nhóm nghiên cứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống học
thực vật. Vùng khơng mã hố trnL(UAA) và trnF(GAA) khơng phải là vùng
có sự biến đổi lớn nhất của DNA lục lạp nhƣng có ƣu thế nhƣ cấu trúc bậc 2
với vùng biến đổi và vùng bảo thủ xen kẽ nhau. Điều này tạo thuận lợi cho
các nghiên cứu tìm kiếm trình tự nucleotide ở các vùng bảo thủ để thiết kế
mồi và sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các đoạn gen ở vùng biến đổi.
Trong nghiên cứu để xác định trnL(UAA) intron có nên đƣợc sử dụng làm
vùng DNA barcode, Taberlet (2007) đã sử dụng 100 loài thực vật và kết luận
rằng trnL intron có thể sử dụng nhƣ là một barcode của thực vật, trnL - trnF
là một barcode tiềm năng cho phân tích, xác định các lồi thực vật [18], [20],
[24].
1.2.3. Tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật
1.2.3.1. Những thành tựu trên thế giới
Trọng tâm nghiên cứu barcode ở thực vật chủ yếu là về đánh giá hiệu

quả tƣơng đối của của các đoạn gen chỉ thị đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
phát sinh lồi. Đối với thực vật, q trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung
cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn. Hệ gen ty thể ở thực vật thƣờng quá
bảo thủ nên không đƣợc dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại
mang nhiều đặc điểm mong muốn đối với chỉ thị DNA nhƣ ở hệ gen ty thể ở
14


động vật. Ở hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS
(Internal Transcribed Spacer) cũng đƣợc sử dụng làm DNA chỉ thị trong một
số nghiên cứu [9], [16], [19].
Mặc dù một vài locus trong hệ gen lục lạp và gen nhân đã đƣợc nghiên
cứu làm chỉ thị trong nghiên cứu DNA barcode song kết quả thu đƣợc vẫn có
những hạn chế. Điều này cho thấy việc cần thiết sử dụng kết hợp các locus để
bổ sung cho nhau đem lại hiệu quả cao hơn trong đánh giá, phân loại các loài
thực vật. Trên thực tế từ lâu rbcL đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phát sinh
lồi, bên cạnh đó trình tự gen matK có tỷ lệ tiến hóa cao nhất trong các gen
lạp thể cũng có khả năng phân biệt lồi cao. Trên cơ sở đó CBOL đã kết hợp
hai locus của rbcL và matK mang lại hiệu quả cao (70% sự phân biệt loài) và
giảm nhiều chi phí cho các điều tra về xây dựng mối quan hệ cũng nhƣ phân
loại đánh giá các loài thực vật. Hiệu quả kết hợp giữa hai gen này thích hợp
cho các nghiên cứu nhƣ là điều tra tƣơng tác thực vật - động vật, xác định các
loài cây đƣợc bảo vệ, các cuộc khảo sát đa dạng sinh học quy mô lớn và phân
biệt cây giống trong các chƣơng trình tái sinh rừng phân biệt và cho mục đích
xác định lồi và phân loại [20].
Spooner sau khi xem xét hiệu quả của psbA- trnH, matK, nrITS trên 63
lồi khoai tây dại đã chỉ ra rằng trình tự của psbA-trnH, matK và nrITS không
cung cấp đầy đủ các thơng tin về lồi cụ thể. Gen lạp thể khơng cho thấy đầy
đủ sự khác biệt, trong khi các trình tự nrITS cho thấy sự khác biệt trong loài
cao. Những khó khăn đó cũng gặp phải trong chi Magnolioideae, họ

Magnoliaceae và trong họ Lauraceae khi giải thích những mối quan hệ trong
loài. Từ những nghiên cứu cụ thể trên ba nhóm thực vật khác nhau, thực vật
hạt kín, hạt trần và rêu các nhà phân loại kết luận rằng việc kết hợp các locus
hệ gen lạp thể nhƣ rbcL + rpoC1 + matK + trnH-psbA mang lại hiệu quả cao
nhƣ một hệ thống barcode duy nhất cho xác định các nhóm lồi rộng. Vì vậy,
trong các dự án nhƣ giám định loài sử dụng các chỉ thị barcode, việc đề xuất
barcode hai locus tiêu chuẩn là không đủ do sự phân ly trong loài và quần thể
15


ở nhiều thực vật hạt kín là rất lớn. Đặc biệt trong cùng khu vực phân bố trải
qua giao phối và giao phối cận huyết, sự thay đổi của một hoặc hai trình tự
gen lạp thể khơng đủ để đánh dấu ranh giới loài. Các vấn đề sinh học nhƣ đa
bơi thể, dị bội, sinh sản vơ tính, chuyển gen, chọn dịng, phân ly và tiến hóa
nhanh hình thái học dẫn đến sự khó khăn trong xác định lồi. Do vậy không
thể sử dụng cùng một vùng DNA để xác định cho các loài khác nhau mà cần
lựa chọn các vùng DNA khác nhau cho xác định ở các loài khác nhau [21],
[22].
Hiện nay hệ thống DNA barcode cho thực vật chƣa hồn chỉnh. Tuy
nhiên với các trình tự DNA barcode này, các nhà khoa học đã có những
nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn cho xác định loài ở thực vật, mở ra một
triển vọng mới cho cho công tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinh
học.
1.2.3.2. Những thành tựu nghiên cứu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, đến nay đã có một số cơng trình nghiên cứu về mã vạch
DNA đƣợc triển khai ở một số cơ sở nghiên cứu. Tuy nhiên, các nghiên cứu
này vẫn còn rất nhỏ lẻ, trên một vài đối tƣợng sinh vật, chƣa có tính hệ thống,
đồng bộ nên chƣa thể xây dựng đƣợc cơ sở dữ liệu về mã vạch DNA. Một số
đề tài đã và đang đƣợc triển khai tại các viện nghiên cứu và trƣờng đại học
trong cả nƣớc, nhƣ:

Tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, nhiều đề tài liên
quan đã đƣợc thực hiện ở các đơn vị trực thuộc (Viện Công nghệ sinh học,
Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện sinh học
nhiệt đới, Bảo tàng thiên nhiên v.v.), nhƣ:
Đề tài "Nghiên cứu mối quan hệ di truyền một số loại cây gỗ quý thuộc
chi trắc (Dalbergia) bị đe dọa tuyệt chủng bằng chỉ thị phân tử", đề tài "Góp
phần xác định các lồi thuộc chi tre (Bambusa Schreb) ở Việt Nam bằng
phƣơng pháp DNA hỗ trợ phƣơng pháp phân loại hình thái truyền thống", đặc
biệt là đề tài cấp nhà nƣớc TN3/T15, 2012 - 2015 "Nghiên cứu tính đa dạng
16


nguồn gen di truyền và thành phần hóa học một số loài lá kim ở Tây Nguyên,
đề xuất giải pháp bảo tồn, sử dụng và phát triển bền vững" do PGS.TS Đinh
Thị Phòng; Đề tài "Đánh giá đa dạng di truyền hai lồi Dầu nƣớc
(Dipterocarpus alatus) và Dầu mít (D. costatus) họ Dầu (Dipterocarpaceae)
đang bị đe doạ trong hệ sinh thái rừng nhiệt đới Nam Việt Nam" do TS.
Nguyễn Minh Tâm ở Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam làm chủ nhiệm, có thể
nói đây là những cơng trình nghiên cứu đầu tiên và bài bản về lĩnh vực ứng
dụng công nghệ DNA trong nghiên cứu đa dạng di truyền, xác định loài ở
Việt Nam. Kết quả của đề tài đã tạo tiền đề quan trọng cho các nghiên cứu
tiếp theo (Đinh Thị Phòng, 2011, 2014; Vũ Thị Thu Hiền, 2009).
Kết hợp phƣơng pháp sinh học phân tử và hình thái trong nghiên cứu
phân loại các họ Thiên lý (Asclepiadaceae) và Trúc đào (Apocynaceae) ở Việt
Nam (2009 - 2010, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật); Nghiên cứu đánh
giá đa dạng di truyền của cây dó bầu tại Việt Nam bằng kỹ thuật chỉ thị DNA
nhằm bảo tồn, hỗ trợ và nâng cao hiệu quả sản xuất trầm hƣơng (2010 - 2011,
Viện Công nghệ sinh học); Định loại phân tử để giám sát thƣơng mại và
thƣơng mại hóa các lâm sản ngoài gỗ ở Campuchia, Lào và Việt Nam (2010 2012, Viện Công nghệ sinh học, Viện nghiên cứu hệ gen); Nghiên cứu xây
dựng mã vạch DNA (DNA barcode) phục vụ cho việc định danh sâm Ngọc

Linh và cây Bá bệnh (2012 - 2013, Viện Công nghệ sinh học) (Nguyễn Thị
Thu Hiền, 2012; Đinh Thi Phòng, 2011, 2014). Bƣớc đầu, một số kết quả
cơng bố đã chỉ ra có thể sử dụng gen 18S rRNA để phân loại các loài thuộc chi
Bình vơi (Stephania) (Huỳnh Thị Thu Huệ và cộng sự, 2003), để xác định
mức độ quan hệ họ hàng giữa Sa mộc (Cunninghamia lanceolata Lamb.)
nhập từ Trung Quốc và Sa mộc dầu (Cunninghamia konishii Hayata) mọc tự
nhiên (Nguyễn Thị Phƣơng Trang và cộng sự, 2009), để phân loại 9 loài thuộc
họ Hoàng đàn (Cupressaceae) ở Việt Nam (Nguyễn Minh Tâm và cộng
sự, 2012). Nguyễn Đức Thành và nhóm nghiên cứu (2007) đã sử dụng một số
gen ở lục lạp để nghiên cứu đa dạng di truyền và xuất xứ một số loài cây lâm
17


nghiệp. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra, các chỉ thị gen lục lạp là công cụ hữu
hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xuất xứ các loài cây lâm nghiệp.
Đề tài giám định phân tử và di truyền quần thể của các rừng gỗ Pơ Mu
(Fokienia hodginsii) tại Việt Nam (2010 - 2011, Trƣờng Đại học Công nghệ Đại học Quốc gia Hà Nội); Đánh giá đa dạng di truyền của chi Lan huệ ở
Việt Nam bằng chỉ thị phân tử (2010 - 2011, Trƣờng Đại học Nông nghiệp I);
Nghiên cứu hệ thống phân loại và bảo tồn các loài cây thuộc họ Dầu
(Dipterocarpaceae) tại Việt Nam (2010 - 2012, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp).
Nhóm nghiên cứu của Trần Hoàng Dũng và cộng sự đã tiến hành xác định
một số đoạn DNA đặc trƣng để làm mã vạch cho một số nhóm thực vật quý
hiếm, đặc hữu, có giá trị kinh tế và dƣợc tính nhƣ: Lan Hài (Paphiopedilum),
Hoàng Thảo (Dendrobium), Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis), Củ Hoài
Sơn (Discorea persimilis), Ngải sậy hoang An Giang họ Gừng Zingiberaceae,
hoặc nấm dƣợc liệu nhƣ Linh Chi (Ganoderma), nấm gây bệnh
(Phytothphora); động vật quý hiếm đặc hữu Việt Nam (Nguyễn Hoàng Dũng,
2014). Nguyễn Thị Thanh Nga và cộng sự (2012) đã tiến hành nghiên cứu
đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dƣợc liệu Việt Nam thuộc chi
Đảng Sâm (Codonopsis sp) bằng kỹ thuật DNA barcode, kết quả nghiên cứu

đã khuếch đại thành công hai vùng gen ITS và matK và phân tích đƣợc sự đa
hình trên mỗi vùng gen. Nghiên cứu đã ứng dụng mã vạch ADN trong phân
tích đa dạng di truyền các lồi Codonopsis ở Việt Nam và cùng các kết quả
nghiên cứu trƣớc đây trên thế giới đã khẳng định vùng gen ITS và matK có
thể giúp nhận diện lồi và dƣới lồi nhƣ một mã vạch phân tử, đồng thời có
thể đƣợc dùng cho các nghiên cứu tiếp theo về tiến hóa học phân tử và nghiên
cứu bảo tồn nguồn gen của loài dƣợc liệu quý. Hoàng Đăng Hiếu và cộng sự
(2012), đã sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng cà
định dạng của tập đồn cây Dó Bầu (Aquilaria SP.) tại Hà Tĩnh, kết quả
nghiên cứu đã tách chiết và tinh sạch đƣợc ADN tổng số của 18 mẫu dó bầu
trong đó có 3 lồi của Lào, 4 mẫu thu tại Phú Quốc và 11 mẫu thu tại Hà
18