LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành bài khóa luận tốt nghiệp này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu
sắc tới giáo viên hƣớng dẫn ThS. Nguyễn Thị Thơ, đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ
bảo trong suốt q trình thực hiện khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Viện Công nghệ sinh
học Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ, chỉ bảo hết sức tận
tình cho em khơng chỉ q trình làm khóa luận mà cả quá trình học tập, bồi
dƣỡng tại Trƣờng. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và
ngƣời thân đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuân lợi trong quá trình học
tập, sinh hoạt, làm nghiên cứu khoa học và hoàn thành bài Khóa luận tốt nghiệp
này.
Vì điều kiện thời gian, khả năng của bản thân cịn có những hạn chế nên
bài Khóa luận tốt nghiệp này cịn có những thiếu sót, em rất mong nhận đƣợc ý
kiến đóng góp quý báu của thầy cô giáo, các nhà khoa học cũng nhƣ các bạn
sinh viên để bài khóa luận của em đƣợc hoàn thiện hơn.
Em xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Trần Minh Đức

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 2

1.1 Tổng quan về cây Sói rừng ............................................................................. 2
1.1.1. Phân loại học ............................................................................................... 2
1.1.2. Phân bố ........................................................................................................ 2
1.1.3. Đặc điểm hình thái cây Sói rừng ................................................................. 2
1.1.4. Thành phần hóa học của cây Sói rừng ........................................................ 3
1.1.5. Tác dụng sinh học của cây Sói rừng ........................................................... 4
1.2. Tổng quan về ADN mã vạch (DNA barcode)................................................ 7
1.2.1. Giới thiệu ADN mã vạch ............................................................................ 7
1.2.2. Đặc điểm cơ bản của trình tự mã vạch ........................................................ 9
1.3. Những locus đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp ADN mã vạch ở thực vật ....... 10
1.3.1. Trình tự gen nhân ...................................................................................... 10
1.3.2. Trình tự gen luc lạp ................................................................................... 10
1.3.3. Trình tự gen rbcL ...................................................................................... 12
1.3.4. Trình tự gen matK ..................................................................................... 12
1.3.5. Trình tự gen ycf5 ....................................................................................... 13
1.3.6. Trình tự gen rpoB và rpoC1 ...................................................................... 13
1.3.7. Trình tự hai gen trnH-psbA ....................................................................... 13
1.3.8. Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA) .................................................. 14
1.3.9. Vùng gen mã hóa ribosome....................................................................... 14
1.4. Ứng dụng mã vạch ADN.............................................................................. 15
1.4.1. Ứng dụng ở thực vật nói chung ................................................................. 15
1.4.2. Ứng dụng mã vạch ADN trong nhận biết cây dƣợc liệu .......................... 15
ii


1.4.3. Những ứng dụng quan trọng khác của mã vạch ADN .............................. 17
1.5. Những thành tựu nghiên cứu ADN mã vạch ở thực vật .............................. 18
1.5.1. Những thành tựu nghiên cứu ở Việt Nam ................................................. 18
1.5.2. Những thành tựu nghiên cứu trên thế giới ................................................ 20
1.5.3. Nghiên cứu về phân tử chi Sarcandra ....................................................... 23

CHƢƠNG 2. MỤC TIÊU, VẬT LIỆU, NỘI DUNG, VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 26
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 26
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 26
2.3 Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................. 26
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 26
2.3.2. Hóa chất..................................................................................................... 26
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 27
2.4.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số....................................................... 27
2.4.2. Phƣơng pháp điện di kiểm tra sản phẩm ADN sau khi tách chiết ............ 28
2.4.3. Phƣơng pháp PCR với mồi đặc hiệu ......................................................... 29
2.4.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR ..................................................... 30
2.4.5. Phƣơng pháp giải trình tự.......................................................................... 31
2.4.6. Phƣơng pháp phân tích số liệu .................................................................. 31
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 32
3.1. Tách chiết ADN tổng số ............................................................................... 32
3.2. Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR ....................... 33
3.2.1. Kết quả nhân bản đoạn gen matK ............................................................. 33
3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen rbcL............................................................... 34
3.2.3. Kết quả nhân bản đoạn gen trnH-psbA ..................................................... 34
3.2.4. Kết quả nhân bản đoạn gen ITS2 .............................................................. 35
3.3. Kết quả phân tích trình tự gen ...................................................................... 36
3.3.1. Kết quả so sánh trình tự gen matK ............................................................ 36
3.3.2. Kết quả so sánh trình tự gen rbcL ............................................................. 39
3.3.3. Kết quả so sánh trình tự gen trnH-psbA ................................................... 42
iii


3.3.4. Kết quả so sánh trình tự gen ITS2 ............................................................. 44
3.4. Kết quả so sánh khả năng phân biệt của đoạn trình tự gen matK, rbcL, ITS2

và trnH-psbA ....................................................................................................... 47
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 48
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 48
4.2. Tồn tại........................................................................................................... 48
4.3. Kiến nghị ...................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 49

iv


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Các từ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

bp

Cặp base

CBOL

Consortium for the Barcode of Life

cpDNA

bộ gen lục lạp

Cytb

Cytochrome b


DNA (ADN)

Axit deoxyribonucleic

EDTA

axit ethylenediamine tetraacetic

F-Primer

Mồi xuôi

IGS

vùng liên gen

ITS

vùng DNA nằm giữa các gen

kb

1000 cặp base

NCBI

Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học

PCR


Phản ứng chuỗi polymerase

PVP

Polyvinyl pyrrolidone

R- Primer

Mồi ngƣợc

RAPD

Sự khuếch đại ngẫu nhiên của DNA đa hình

RFLP

Phân tích đa hình trình tự DNA

RNA

Axit ribonucleic

rRNA

ARN ribosome

SR01

Mẫu Sói rừng 01


TAE

Tris-Acetate-EDTA

tRNA

ARN vận chuyển

UV

Tia cực tím

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần và nồng độ các chất sử dụng trong một phản ứng PCR . 29
Bảng 2.2: Trình tự và thơng tin về cặp mồi ........................................................ 29
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR mồi ITS2 .................................... 29
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR mồi matK, rbcL, trnH- psbA ...... 30
Bảng 3.1. Một số lồi có trình tự gen matK tƣơng đồng với trình tự gen matK
của mẫu SR01 trên ngân hàng gen NCBI ........................................................... 37
Bảng 3.2. Một số lồi có trình tự gen rbcL tƣơng đồng với trình tự rbcL của mẫu
SR01 trên ngân hàng gen NCBI .......................................................................... 40
Bảng 3.3: Các vị trí sai khác dùng để phân loại của đoạn gen rbcL................... 41
Bảng 3.4. Trình tự gen trnH-psbA tƣơng đồng với trình tự gen trnH-psbA mẫu
SR01 trên ngân hàng gen NCBI .......................................................................... 43
Bảng 3.5: Một số lồi có trình tự gen ITS2 tƣơng đồng với trình tự gen ITS2 của
mẫu SR01 trên ngân hàng gen NCBI ................................................................. 44

Bảng 3.6: Các vị trí sai khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng gen ITS2 ... 45
Bảng 3.7: Bảng so sánh khả năng phân biệt của các đoạn trình tự gen matK,
rbcL và ITS2 ........................................................................................................ 47

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Đặc điểm cây Sói rừng ........................................................................... 3
Hình 3.1: Kết quả ADN tổng số hai mẫu Sói rừng nghiên cứu .......................... 32
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen matK .................................. 33
Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen rbcL ................................... 34
Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen trnH-psbA ......................... 34
Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen ITS2................................... 35
Hình 3.6: So sánh trình tự giữa SR01 và MH939147.1,AJ581403.1,
GU266593.1 đối với đoạn gen matK ................................................................. 39
Hình 3.7: So sánh trình tự giữa SR01 và MH939147.1, L12663.2, AY236833.1
đối với đoạn gen rbcL ......................................................................................... 41
Hình 3.8: Sự tƣơng đồng giữa trình tự đoạn gen trnH-psbA của mẫu SR01 với
lồi Sarcandra glabra ........................................................................................... 43
Hình 3.9: So sánh trình tự giữa SR01 và MG730169.1

, KJ137956.1,

KJ137954.1 đối với đoạn gen rbcL ..................................................................... 45

vii


ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) là lồi rất giàu dƣợc
tính có khả năng chữa trị các bệnh cảm mạo, viêm phổi, viêm ruột thừa, đau
lƣng và đặc biệt chữa trị một số bệnh ung thƣ nhƣ ung thƣ tụy, ung thƣ dạ dày,
ung thƣ gan, ung thƣ trực tràng... [2]. Tuy nhiên những năm gần đây thƣơng lái
nƣớc ngoài đến thu mua rất nhiều cùng với sự khai thác q mức khiến lồi Sói
rừng đang đứng trƣớc nguy cơ cạn kiệt. [33]. Ở Việt Nam hiện nay khá nhiều
cây thuốc quý đƣợc sử dụng làm nguyện liệu chế biến thuốc nhƣng do bị khai
thác quá mức dẫn đến sự giả mạo các nguyên liệu thảo dƣợc cũng trở thành vấn
đề toàn cầu. Các nguyên liệu thảo dƣợc có thể thay thế bằng các loại thảo mộc
khác có quan hệ họ hàng gần gũi.[34]
Để phục vụ cho việc xác định đúng các loài dƣợc liệu, các chủng loại vật
liệu, kiểm nghiệm các nguồn dƣợc liệu. Một trong các phƣơng pháp hữu hiệu
hiện nay chính là sử dụng ADN mã vạch một trong những phƣơng pháp phục vụ
định danh lồi chính xác.
Xuất phát từ những ngun nhân trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài “ Xác định ADN mã vạch của lồi Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.)
Nakai)” nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch, phục vụ cho giám định
loài và quản lý nguồn tài nguyên sinh vật.

1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây Sói rừng
1.1.1. Phân loại học
Tên khoa học: Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai.
Phân loại:
Giới : Plantae
Bộ: Chloranthales

Họ : Chloranthaceae
Chi: Sarcandra
Loài: S. glabra
Ở Việt Nam cây Sói rừng cịn có tên gọi khác nhƣ: Sói lãng, cửu tiết kim
túc lan, cửu tiết phong, trúc tiết trà, thảo sách hồ, tiếp cốt mộc. [4]
1.1.2. Phân bố
Cây Sói rừng phân bố ở nhiều nƣớc: Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản,
Triều Tiên, Ấn Độ và Malaisya. ở Việt Nam cây mọc hoang ở vùng núi đất, ở
bìa rừng và ven đồi ẩm nhiều nơi nhƣ : Cao Bằng, Lạng Sơn, Hoa Bình đến Kon
Tum, Lâm Đồng.
1.1.3. Đặc điểm hình thái cây Sói rừng
Cây Sói rừng thƣờng cao khoảng 1 – 2 mét, thân tƣơng đối nhẵn khơng có
lơng. Các lá mọc đối nhau, phiến dài hình bầu dục hoặc có hình ngọn giáo. Lá
Sói rừng khá dài từ 7 – 20cm, bề rộng từ 2 – 8cm. Phần răng cƣa mọc ở mép lá
tƣơng đối nhọn kèm với các tuyến.

2


Hình 1.1 Đặc điểm cây Sói rừng
( />
Hoa Sói rừng là hoa kép, ít nhánh tƣơng đối nhỏ và có màu trắng, hoa
thƣờng khơng có cuống, chỉ có 1 nhị. bầu nhụy có hình trứng và khơng có vịi.
Hoa thƣờng nở vào khoảng tháng 6 tháng 7. Cây đậu quả sau đó khoảng 1
– 2 tháng. Quả Sói rừng nhỏ hình trịn, đƣờng kính chỉ khoảng 3 – 4mm. Khi
chín quả chuyển dần từ màu vàng sang màu đỏ hoặc đỏ gạch. Ngƣời ta thƣờng
dùng hoa cây Sói rừng để ƣớp trà, rễ cây đƣợc thu hoạch quanh năm để tƣơi
hoặc phơi khơ làm thuốc. [4],[7],[32]
1.1.4. Thành phần hóa học của cây Sói rừng
Cây Sói rừng chứa các tinh dầu, flavonoid, coumarin, axit fumaric, axit

succinic và các hợp chất sesquiterpen (beta atractylenoit, chloranthalacon E, (-)ITSanbulin A và 2 sesquiterpen lacton mới là 8beta,9alpha-dihidroxyeudesman4(15),7(11)-dien-8alpha, 12-olid và 8beta,9alpha-dihidroxylindan-4(5),7(11)dien-8alpha,12-olid.)
Các thành phần của cây Sói rừng có tác dụng chống oxy hóa, giúp giải
nhiệt, tiêu độc, làm tăng sự sản xuất các tiểu cầu trong máu (từ đó giúp tiêu trừ
các huyết khối), tăng tuần hồn máu và chống viêm. Cũng có các tài liệu cho
rằng S. glabra giúp giảm mệt mỏi trong điều trị ung thƣ và đƣợc đề xuất sử dụng

3


nhƣ một giải pháp thay thế trong điều trị, nhƣng chƣa có thử nghiệm lâm sàng
nào chứng thực điều này.
Cây Sói rừng cịn có tác dụng ức chế đối với tụ cầu khuẩn vàng
staphylococcus aureus, trực khuẩn lỵ, trực khuẩn bacillus coli, trực khuẩn mủ
xanh bacillus pyocyaneus; trực khuẩn thƣơng hàn và phó thƣơng hàn salmonella
typhosa…
Lá cây Sói rừng có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất; rễ và cành tƣơi có
tác dụng mạnh hơn rễ và cành đã khơ. Đối với các loại tụ cầu khuẩn và trực
khuẩn đều có tác dụng ức chế ở mức độ nhất định. Thử nghiệm đối với các bệnh
nhân viêm phổi, viêm phế quản, viêm dạ dày ruột cấp tính, lỵ trực trùng… hiệu
quả đạt tới 75 - 80%. [2]
1.1.5. Tác dụng sinh học của cây Sói rừng
Theo Đơng y, cây Sói rừng có vị đắng cay, tính hơi ấm, có tác dụng hoạt
huyết giảm đau, khử phong trừ thấp, tiêu viêm giải độc. Trong dân gian, rễ cây
đƣợc ngâm rƣợu, uống chữa đau tức ngực. Lá đƣợc sắc uống trị bệnh lao, hoặc
giã đắp chữa rắn cắn, ngâm rƣợu xoa bóp chữa vết thƣơng, mụn nhọt, phong
thấp, đau nhức xƣơng khớp. Ở Trung Quốc, cây đƣợc dùng để chữa một số bệnh
ung thƣ: ung thƣ tụy, dạ dày, trực tràng, gan, lỵ, gãy xƣơng, thấp khớp, đau
lƣng, cảm mạo, kinh nguyệt không đều, hoa đƣợc dùng để ƣớp trà.
Các nghiên cứu khoa học cũng chỉ ra rằng lá cây Sói rừng có tác dụng rất
tốt trong việc kháng khuẩn. Lá và rễ cây tƣơi làm ức chế đối với tụ cầu khuẩn

vàng staphylococcus aueus, trực khuẩn bacillus coli, trực khuẩn có mủ xanh
cũng nhƣ trực khuẩn thƣơng hàn và phó thƣơng hàn,…
Cơng dụng của cây Sói rừng rất tốt trong điều trị ho và suy nhƣợc cơ thể,
viêm khớp, đau nhức xƣơng hay dùng để nắn bó gãy xƣơng, hỗ trợ tăng cƣờng
chức năng tuyến tụy và đau dạ dày. Thực tế cho thấy rất nhiều bài thuốc khẳng
định tác dụng cây Sói rừng chữa ung thƣ biến chứng nhiễm khuẩn rất tốt. Một số
thực nghiệm thấy kết quả khá tốt trong việc điều trị hỗ trợ ung thƣ dạ dày, ung
thƣ gan hay tuyến tụy, bệnh bạch cầu và sarcom lƣới dòng lympho.
4


Do có tác dụng tốt trong việc chống lại oxy hóa giải nhiệt tiêu độc, giúp
tăng lƣợng tiểu cầu trong máu từ đó tăng tuần hồn máu, chống viêm hiệu quả.
Một số tài liệu cho thấy công dụng của cây Sói rừng trong việc giảm mệt mỏi,
tuy nhiên chƣa có thực nghiệm thực tế nào chứng minh vấn đề này.[30]
Cải thiện giảm đau cho bệnh nhân gout cũng là một trong những cơng
dụng tuyệt vời của cây Sói rừng. Phần rễ dùng nấu nƣớc uống hằng ngày giúp
đào thải độc tố trong cơ thể ra ngoài, giảm cơn đau và sƣng cho bệnh gout gây ra
mà không để lại tác dụng phụ. Trên thị trƣờng hiện nay đang có sản phẩm Gout
AZ đƣợc khá nhiều ngƣời tìm kiếm sử dụng và nhận đƣợc kết quả bất ngờ. Có
thành phần chính là cây Sói rừng, kết hợp cùng một số loại dƣợc phẩm khác nhƣ
mỏ quạ hay chuối hột.
Gout AZ là sản phẩm hoàn toàn từ thảo mộc thiên nhiên đƣợc nghiên cứu
qua nhiều năm và áp dụng thành công trong việc điều trị bệnh gout. Với chứng
nhận của bộ y tế và các cơ qua chức năng khác bạn hoàn tồn có thể n tâm sử
dụng và điều trị để duy trì sức khỏe của mình cũng nhƣ những ngƣời thân u.
Ngồi ra dịch chiết từ cây Sói rừng có tác dụng chống viêm đạt hiệu quả
97,6% mà không gây tác dụng phụ, đặc biệt phần lá cây có tác dụng kháng khuẩn
mạnh nhất. Các nhà y học cổ truyền Trung Quốc đã bào chế cây Sói rừng thành dạng
thuốc tiêm bắp để trị bệnh viêm đa khớp dạng thấp một cách hiệu quả.[4]

Theo các tài liệu thu thập đƣợc, các nhà khoa học cịn tìm hiểu tác dụng
lên hệ miễn dịch của cây Sói rừng. Nghiên cứu về tác dụng kháng u, Zhong L và cs
nghiên cứu ảnh hƣởng của Sói Rừng trên phịng và chữa bệnh giảm tiểu cầu sau hóa
trị liệu. Kết quả thí nghiệm đã chứng minh S.glabra có tác dụng rõ rệt trong điều trị
giảm tiểu cầu và có thể ngăn ngừa chứng giảm tiểu cầu gây ra bởi 5-FU.
Wen J. và cộng sự (2003) đã sử dụng dịch chiết Sarcandra glabra
(Thunb.) Nakai tiêm cho chuột đƣợc cấy ghép tế bào ung thƣ gan Hep-A22
đồng thời cũng quan sát tác dụng của dịch chiết trên sự phát triển in vitro của
dòng tế bào này. Kết quả cho thấy dịch chiết đã làm giảm sự phát triển của tế
bào ung thƣ Hep-A22 cả trên in vitro và in vivo
5


Trong một nghiên cứu khác của Zhenzhen Z., chất SGP-2, một
polysaccharide chiết xuất từ Sacandra glabra đã ức chế sự tăng sinh và di căn
của tế bào ung thƣ MG-63 in vitro. Các kết quả nghiên cứu trên đã tạo tiền đề
xây dựng cơ sở khoa học cho những nghiên cứu chống ung thƣ tiếp theo của các
thành phần có hoạt tính sinh học trong cây Sói rừng.
Kang và cộng sự nghiên cứu tác dụng ức chế khối u của dịch chiết S.
glabra và gây chết tế bào theo chƣơng trình của dịng tế bào gây ung thƣ biểu
mơ mũi - họng ở ngƣời. Kết quả cho thấy dịch chiết Sói rừng ngăn cản sự phát
triển khối u invivo.
Xu X.D., Hu X.R. và cộng sự nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của Sói
rừng. Kết quả thực nghiệm cho thấy phân đoạn chloroform và EtOAc của dịch
chiết EtOH tồn cây Sói rừng, có tác dụng kháng khuẩn mạnh. Đồng thời với
nghiên cứu ức chế sự phát triển các tế bào u, các nhà khoa học cịn tìm hiểu tác
dụng lên hệ miễn dịch của cây Sói rừng.
Theo các tác giả He R. (2009) và Sun W. (2015) về tác dụng của dịch
chiết Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai lên hệ miễn dịch của chuột thì dịch chiết
có liên quan tới sự cân bằng của tế bào T, làm tăng phần trăm diệt tự nhiên và

hiệu quả bảo vệ theo kiểu miễn dịch ở chuột bị ung thƣ thông qua sự cải thiện tỉ
lệ và số lƣợng tế bào miễn dịch, tăng trọng lƣợng lách, tuyến ức và tăng số
lƣợng bạch cầu.
Trong một thí nghiệm của tác giả Từ Quốc Lƣợng và cộng sự (2005), dịch
chiết phân đoạn cây Sói rừng làm tăng trọng lƣợng lách, tuyến ức và số lƣợng
tiểu cầu trên chuột xuất huyết giảm tiểu cầu. Nghiên cứu ảnh hƣởng của cây Sói
rừng trên điều trị giảm tiểu cầu do hóa trị liệu.
Trên các bệnh nhân ung thƣ biểu mô mũi họng, điều trị tia xạ kết hợp
uống cao Sói rừng đã làm giảm đƣợc một số tác dụng phụ do tia xạ so với chỉ tia
xạ đơn thuần.
Có rất nhiều bài thuốc dân gian sử dụng cây Sói rừng làm thuốc trong
điều trị viêm khớp, phong thấp. Ngồi ra Sói rừng cịn có mặt trong thành phần
của một số thực phẩm chức năng nhƣ Flamasol, Hoàng Thấp Linh,viên Gout
6


Tâm Bình, Tiêu Khiết Thanh, hỗ trợ điều trị cho ngƣời bị viêm đau khớp, thấp
khớp, viêm khớp dạng thấp, thối hóa khớp, giúp phịng ngừa và giảm các triệu
cứng viêm đƣờng hơ hấp.
Mỗi bộ phận cây Sói rừng lại có những cơng dụng riêng, dƣới đây là một
số bài thuốc phổ biến nhƣ:
 Bài thuốc chữa đau lƣng: dùng cành Sói rừng sắc chung với nƣớc và
rƣợu uống hàng ngày. Lƣu ý lƣợng nƣớc và lƣợng rƣợu phải bằng nhau.
 Chữa viêm xƣơng khớp, đau nhức khớp: Cây Sói rừng tƣơi giã nát, sao
cùng rƣợu và đắp vào chỗ bị đau nhức.
 Dùng cành Sói rừng nấu với nƣớc để rửa vết thƣơng sẽ giúp nhanh lành
và không bị nhiễm trùng.
 Ngƣời bị bỏng có thể dùng lá Sói rừng trộn cùng hạt sở hoặc dầu vàng
bôi vào chỗ bỏng 2 lần mỗi ngày, da non sẽ hình thành nhanh hơn.
 Vào mùa đơng bạn có thể sử dụng khoảng 10 – 15g cây Sói rừng khơ sắc

cùng tía tơ để uống thay trà đề phịng cảm lạnh.
 Để phát huy tác dụng của cây Sói rừng trong hỗ trợ điều trị ung thƣ bạn
có thể kết hợp Sói rừng khơ cùng 30g xạ đen sắc với 1 lít nƣớc và uống 3 lần
trong ngày.[4]
1.2. Tổng quan về ADN mã vạch (DNA barcode)
1.2.1. Giới thiệu ADN mã vạch
Kỹ thuật ADN mã vạch (DNA barcode) là một tên mới cho một khái niệm
cũ. Thuật ngữ “ ADN mã vạch ” lần đầu tiên đƣợc sử dụng vào năm 1993
(Arnon, 1993), trong một bài báo mà không nhận đƣợc sự chú ý nhiều từ cộng
đồng khoa học, và gần đây thuật ngữ này đƣợc sử dụng lại trong nhiều nghiên
cứu. Về cơ bản, kỹ thuật này dựa vào việc sử dụng một khu vực ADN (400-800
bp) nhƣ là một tiêu chuẩn để nhận dạng các lồi một cách nhanh chóng và chính
xác. Kỹ thuật ADN mã vạch giúp các nhà phân loại học trong cơng tác phân loại
và xác định lồi, Nâng cao năng lực kiểm soát, hiểu biết và tận dụng sự đa dạng
sinh học. Ngoài ra, kỹ thuật này có triển vọng nghiên cứu và ứng dụng trong
7


khoa học cuộc sống, trong khoa học pháp y, y tế, nghiên cứu y dƣợc, sản xuất và
kiểm soát chất lƣợng thực phẩm. Phƣơng pháp này vơ cùng có ý nghĩa trong các
trƣờng hợp các mẫu vật sinh học cần giám định loài đã đƣợc qua xử lý, chế biến
nhƣ các dạng chế phẩm thuốc hay thực phẩm đã qua chế biến…
Trên thực tế, ADN mã vạch bắt đầu có tầm ảnh hƣởng từ nghiên cứu của
Hebert và cs (2002), kết quả của nhóm nghiên cứu chỉ ra rằng các cá thể từ bộ
sƣu tập của 200 lồi có quan hệ gần gũi với nhau thuộc bộ cánh vảy có thể xác
định với độ chính xác 100% bằng cách sử dụng gen ty thể Cytochrome c oxidase
tiểu đơn vị I (COI) [25]. Sau đó nhiều nghiên cứu về định danh lồi bằng chỉ thị
ADN đã thành cơng trên động vật nhƣ chim, cá, ốc tiền, nhện và một số loài côn
trùng thuộc bộ Cánh cứng. Gần đây, hệ thống chỉ thị ADN đang đƣợc thiết lập
cho các nhóm sinh vật khác nhƣ thực vật, tảo, nấm, sinh vật nguyên sinh và vi

khuẩn đã thu đƣợc hiệu quả đáng kể.
Để thúc đẩy việc sử dụng ADN mã vạch cho tất cả sinh vật nhân chuẩn
sống trên hành tinh này, CBOL (Consortium for the Barcode of Life) đã đƣợc
thành lập vào tháng 5 năm 2004, gồm hơn 120 tổ chức từ 45 quốc gia. Với mục
tiêu ban đầu là xây dựng một thƣ viện trực tuyến trình tự barcode cho tất cả các
lồi chƣa đƣợc biết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ mẫu ADN
nào. Với sự hỗ trợ của CBOL, ADN mã vạch ngày càng phát triển và trở thành
một phƣơng pháp phân loại và định danh loài mới.
Trong bối cảnh của nền kinh tế phát triển nhanh và hậu quả tác động đến
động vật, thực vật của các quốc gia khác nhau, sự xác định loài sử dụng phƣơng
pháp nhanh là cần thiết để đánh giá đa dạng sinh học của các khu vực này nhằm
bảo vệ các loài đặc hữu quý hiếm và nguy cấp. Tuy nhiên cần lƣu ý rằng ADN
mã vạch không thể thay thế phân loại nhƣng nó là cơng cụ hữu ích để tạo ra
thông tin về đơn vị phân loại chƣa biết. Hiện nay, trên thế giới, kỹ thuật này
đang đƣợc sử dụng chủ yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhà khoa học ở
các lĩnh vực khác nhƣ khảo cổ học, công nghiệp sinh học và chế biến thực
phẩm….
8


1.2.2. Đặc điểm cơ bản của trình tự mã vạch
Đặc điểm cơ bản và quan trọng nhất của ADN mã vạch là phải phổ biến
và đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng. Điều này có nghĩa là các đoạn
gen đƣợc sử dụng nhƣ một mã vạch nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại,
có sự biến đổi giữa các loài nhƣng ổn định và bảo thủ cao bên trong lồi hoặc
biến đổi khơng đáng kể. Do đó, ADN mã vạch lý tƣởng là một đoạn ADN có
trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp đƣợc với cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu để dễ
dàng khuếch đại bằng PCR.
Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với chỉ thị
ADN và hệ gen nhân, vùng ADN nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal

Transcribed Spacer) thƣờng đƣợc sử dụng làm ADN chỉ thị trong một số nghiên
cứu. Trong vòng 5 năm qua, nhiều vùng gen đã đƣợc nghiên cứu và đề xuất là
chỉ thị ADN cho thực vật [10], [16], [24]. Tuy nhiên chƣa có chỉ thị ADN nào
đƣợc đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận. Mặc dù vậy,
các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ
một mà nhiều vùng ADN chỉ thị để định danh loài đối với thực vật [10], [16],
[24].
Theo một số nghiên cứu, hệ thống ADN mã vạch phải đáp ứng các yêu cầu
sau:
 Đầu tiên, đoạn ADN chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa các
loài nhƣng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài.
 Thứ hai, hệ thống định danh bằng ADN phải đƣợc chuẩn hóa, với cùng
một vùng ADN có thể đƣợc sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau.
 Thứ ba, đoạn ADN chỉ thị cần chứa đủ thơng tin phát sinh lồi để có
thể dễ dàng định danh lồi vào các nhóm phân loại (chi, họ,…).
 Thứ tƣ, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thơ, với vị trí cặp mồi
nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình
tự ADN

9


 Đoạn ADN nghiên cứu nên có kích thƣớc ngắn để q trình nhân bản
ADN khơng bị sai lệch. Thơng thƣờng, đoạn ADN nghiên cứu có kích thƣớc
150 bp trở lại, nếu dài hơn sẽ dễ bị sai lầm trong quá trình nhân bản ADN. [24]
1
.3
N
h
ữ

n
g
lo
cu
sđ
ư
ợ
cử
sd
ụ
n
g
trog
p
ư
h
ơ
n
g
p
h
á
A
D
N
m
ã
vạ
ch
ở

tcvậ
ự
t
1.3.1. Trình tự gen nhân
Các trình tự barcode đƣợc nhân bản từ ADN hệ gen của bố mẹ dự kiến sẽ
cung cấp nhiều hơn thông tin về các lồi cần xác định. Tuy nhiên khó khăn trong
việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc có bản
sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lƣợng ADN genome và khả năng
phân biệt dƣới loài do bảo tồn gen chức năng có thể chính là lý do tại sao hạn
chế số lƣợng các gen nhân đƣợc thử nghiệm trong xác định loài bằng phƣơng
pháp ADN mã vạch [25], [29].
1.3.2. Trình tự gen luc lạp
Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử ADN mạch vịng có kích thƣớc
120 - 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large single-copy
region) và bản sao đơn nhỏ (small single-copy region). Hai bản sao đƣợc phân
cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb) có độ dài trung bình 20 - 30 kb.
Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao), các gen
tRNA (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp trong lục lạp
(khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng.

10


B
n
ả
g
1
.T
h

ơ
n
g
tiủ
ca
m
ộ
tsm
ố
iA
ồ
D
N
m
ã
vạ
ch
tiế
kch
oệ
ge
n
lụ
cạ
p
Gen

Mồi

Trình tự 5’→3’


Chiều
hƣớng

rbcL

a-f
a-r

ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC

→
←

matK

matK 1F
matK 1R
matK 2F
matK 2R

GAACTCGTCGGATGGAGTG
GAGAAATCTTTTTCATTACTACAGTG
CGTACTTTTATGTTTACAGGCTAA
TAAACGATCCTCTCATTCACGA

→
←
→

←

rpoB

rpoB 1
rpoB 2
rpoB 3
rpoB 4

AAGTGCATTGTTGGAACTGG
ATGCAACGTCAAGCAGTTCC
CCGTATGTGAAAAGAAGTATA
GATCCCAGCATCACAATTCC

→
←
→
←

rpoC1

rpoC1 1
rpoC1 2
rpoC1 3
rpoC1 4

ycf5
(ccsA)

ycf5 1

ycf5 2
ycf5 3
ycf5 4

GGATTATTAGTCACTCGTTGG
ACTTTAGAGCATATATTAACTC
ACTTACGTGCATCATTAACCA
CCCAATACCATCATACTTAC

→
←
→
←

trnH psbA

trnH2
psbAF
trnH(GUG)
psb A

CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
GTTATGCATGAAAGTAATGCTC
ACTGCCTTGATCCACTTGGC
CGAAGCTCCATCTACAAATGG

→
←
→
←


trnL-c
trnL-d
trnL-e

CGAAATCGGTAGACGCTACG
GGGGATAGAGGGACTTGAAC
GGTTCAAGTCCCTCTTATCCC

→
←
→

trnL-f
trnL-g
trnL-h

ATTTGAACTGGTGACACGAG3’
GGGCAATCCTGAGCCAA
CCATTGAGTCTCTGCACCTATC

←
→
←

trnL-F

Chú thích:

GTGGATACACTTCTTGATAATGG

GGCAAAGAGGGAAGATTTCG
TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC
CCATAAGCATATCTTGAGTTGG

→
←
→
←

→: mồi xi
←: mồi ngƣợc

Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng loài do
vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh
11


loài và phân loại thực vật đƣợc các nhà khoa học rất quan tâm. Dựa trên những
thơng tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu gần đây,
một số locus là đoạn gen hay các gen đƣợc chọn để nghiên cứu làm chỉ thị
barcode tiềm năng cho các loài thực vật trên trái đất. Có khoảng 20 gen lục lạp
có độ dài phù hợp (khoảng 1 kb) đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài.
Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hố và vì vậy phù hợp cho nhiều mức
độ phân loại [25], [29]
1.3.3. Trình tự gen rbcL
Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trƣng nhất, mã hóa các tiểu
đơn vị lớn của rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase
(RUBISCO). rbcL là gen đầu tiên đƣợc giải trình từ thực vật. rbcL đã đƣợc sử
dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn
10000 trình tự rbcL có sẵn trong GenBank. Do sự dễ dàng trong khuếch đại

PCR ở một số nhóm thực vật, CBOL gần đây đã cơng nhận rbcL là một trong
những trình tự gen tiềm năng nhất cho các nghiên cứu ADN mã vạch ở thực vật.
Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài thấp, nên hầu hết các nhóm đều cho rằng
nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, ví dụ nhƣ matK
là hai locus barcode chuẩn cho thực vật [25], [29].
1.3.4. Trình tự gen matK
Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hố nhanh
nhất, có kích thƣớc khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan
đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong q trình phiên mã RNA. Do matK
tiến hố nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã đƣợc sử dụng nhƣ một
chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật.
CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu
thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn
và đề nghị sử dụng matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật
[25].

12


1.3.5. Trình tự gen ycf5
ycf5 mã hóa cho một protein có chứa 330 amino acids. Gen này đƣợc bảo
tồn trên tất cả các vùng thực vật và đã đƣợc kiểm nghiệm cho phù hợp với ADN
mã vạch của một vài nhóm. Tuy nhiên, gen này chƣa đƣợc cơng nhận và sử
dụng nhiều trong vai trò của một ADN mã vạch [25].
1.3.6. Trình tự gen rpoB và rpoC1
Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của RNA
polymerase lục lạp. Khi nghiên cứu họ Dipterocarpaceae, Tsumura và đtg
(1996) đã nhận thấy gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh loài. Hiện
nay rpoB là gen đƣợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh loài và xác định
các loài vi khuẩn, đặc biệt là khi nghiên cứu các chủng có quan hệ gần gũi. Cùng

với gen 16S rRNA, rpoB đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu để xác định loài
vi khuẩn mới, do vậy các gen này đƣợc đề xuất là chỉ thị barcode độc lập hoặc
kết hợp với một số gen khác. Trong các nghiên cứu gần đây, CBOL đã thử
nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt loài cuả đoạn gen rpoC1 là thấp
nhất (43%). Mặc dù vậy, trong nghiên cứu Liu và đtg (2010) đã chỉ ra rpoC1 là
một chỉ thị rất hữu ích khi đƣợc sử dụng để phân biệt các lồi bryophytes. Do
vậy cần có các nghiên cứu tiếp theo để chứng minh sự phù hợp khi sử dụng
rpoB và rpoC1 làm chỉ thị mã vạch trong các nghiên cứu giám định lồi [25].
1.3.7. Trình tự hai gen trnH-psbA
Gen trnH-psbA có kích thƣớc trung bình khoảng 450 bp, nhƣng thay đổi
từ 296 đến 1120 bp, trnH-psbA đƣợc chứng minh là có khả năng xác định lồi
cao. Locus trnH-psbA đã đƣợc khuếch đại thành cơng ở nhiều thực vật hạt kín
và hạt trần. Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có kích thƣớc
rất ngắn (~ 300 bp), kích thƣớc của gen này thay đổi lớn do sự có mặt của gen
rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa cùng gen của hai gen trnH và psbA. Trong
nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng trnH-psbA nhƣ chỉ thị
barcode độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK. CBOL thấy rằng khả năng
phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7 locus đƣợc thử
nghiệm và do đó đề nghị nó nhƣ là chỉ thị barode bổ sung. trnH-psbA có thể sử
13


dụng trong hệ thống barcode ba locus khi hệ thống barcode hai locus không
cung cấp đầy đủ khả năng phân tích [25],
1.3.8. Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA)
Locus trnL (UAA) - trnF (FAA) chứa gen trnL (UAA), vùng intron và
vùng nằm giữa hai gen trnL (UAA) và trnF (GAA). Taberlet và đtg là nhóm
nghiên cứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống học thực vật.
Vùng không mã hố trnL(UAA) và trnF (GAA) khơng phải là vùng có sự biến
đổi lớn nhất của ADN lục lạp nhƣng có ƣu thế nhƣ cấu trúc bậc 2 với vùng biến

đổi và vùng bảo thủ xen kẽ nhau. Điều này tạo thuận lợi cho các nghiên cứu tìm
kiếm trình tự nucleotide ở các vùng bảo thủ để thiết kế mồi và sử dụng kỹ thuật
PCR để khuếch đại các đoạn gen ở vùng biến đổi. Trong nghiên cứu để xác định
trnL (UAA) intron có nên đƣợc sử dụng làm vùng ADN mã vạch , Taberlet
(2007) đã sử dụng 100 loài thực vật và kết luận rằng trnL intron có thể sử dụng
nhƣ là một barcode của thực vật, trnL-trnF là một barcode tiềm năng cho phân
tích, xác định các lồi thực vật [24], [25].
1.3.9. Vùng gen mã hóa ribosome
Gen rADN là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của ribosome. Các gen
ADN ribosome (rADN) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng
thích hợp để phân biệt các loài gần gũi. Trong tế bào, rADN đƣợc sắp xếp nhƣ
các đơn vị đƣợc lặp lại ngẫu nhiên bao gồm ADN mã hóa ribosome 18S, 5,8S,
28S và xen giữa các trình tự khơng mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed
spacers) nằm ở hai bên sƣờn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba gen rADN
đƣợc bảo tồn cao hơn hai vùng ITS. Nhìn chung các đơn vị rADN đƣợc lặp lại
hàng nghìn lần và đƣợc sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể. Một
trong những tính năng đáng chú ý nhất của rADN là từng đơn vị trong hệ thống
đa gen khơng tiến hố độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hố một cách
phối hợp nhờ vậy mà rADN đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhƣng khác biệt
giữa các loài khác nhau.
Hiện tại, nrITS vùng ITS của gen nhân đƣợc xem là một trong những cơng
cụ hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó phổ
14


biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng.
Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản vơ tính cho
thấy một số mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều
nguyên nhân nhƣ lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành
gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó. Trên cơ sở này

nrADN có thể đƣợc sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả thực vật trong
cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu năm, trên cạn,
dƣới nƣớc) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [25], [29]
1.4. Ứng dụng mã vạch ADN
1.4.1. Ứng dụng ở thực vật nói chung
Nghiên cứu mã vạch ADN thực vật đã vƣợt xa nhiệm vụ so sánh các vùng
ADN khác nhau để tiến tới những ứng dụng thực tế hơn. Các ứng dụng này có
thể đƣợc chia thành hai loại:
Thứ nhất, là để cung cấp cái nhìn sâu hơn vào phân loại học ở cấp độ lồi và
đóng góp vào q trình phân loại, nhận diện và phân chia ranh giới giữa các lồi.
Thứ hai, là hỗ trợ q trình nhận diện các mẫu vật không nhận biết đƣợc
hoặc chƣa xác định đƣợc thuộc lồi nào. Mã vạch ADN thực vật có khả năng
cung cấp cái nhìn sâu vào phân loại cấp độ lồi trong những nhóm có hình thái
đơn giản, nhóm có phân bố rất rộng, nhóm có kích thƣớc nhỏ, và hoặc những
nhóm đã đƣợc phân loại nhƣng khơng đầy đủ, chƣa tƣơng xứng với đặc điểm đa
dạng của chúng.
1.4.2. Ứng dụng mã vạch ADN trong nhận biết cây dược liệu
Thực vật dùng làm thuốc thảo dƣợc luôn cần đƣợc xác định ở cấp độ lồi,
vì vậy, xác định chính xác là một bƣớc quan trọng để có thể đảm bảo về chất
lƣợng sản phẩm và có tầm quan trọng trong việc nghiên cứu các đặc tính của sự
đa dạng di truyền, phát sinh loài và phát sinh vùng địa lý cũng nhƣ bảo vệ các
lồi có nguy cơ tuyệt chủng. Cùng với sự phát triển của thị trƣờng thảo dƣợc, sự
giả mạo các nguyên liệu thảo dƣợc thuốc cũng trở thành vấn đề toàn cầu. Các
nguyên liệu thảo dƣợc này có thể đƣợc thay thế bằng các loại thảo mộc khác có
15


quan hệ họ hàng gần gũi, thậm chí từ những nguyên liệu giả mạo. Việc giả mạo
các nguyên liệu thảo dƣợc thƣờng là do:
 Vật liệu không phân biệt đƣợc bằng đăc điểm hình thái.

 Những vật liệu có tên tƣơng tự nhau, và việc thay thế những nguyên liệu
có giá trị kinh tế bằng nguyên liệu khác rẻ tiền hơn.
Tuy nhiên, việc xác định chính xác các nguyên liệu thảo dƣợc làm thuốc
theo phƣơng pháp truyền thống nhƣ sự đánh giá cảm quan và phƣơng pháp hóa
học đơi khi gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là những nguyên liệu có nguồn gốc từ
thực vật đã đƣợc chế biến một phần hoặc ở dạng bột. Vì vậy, phƣơng pháp sử
dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính xác và phổ biến hơn. Việc nhận biết
các nguyên liệu thảo dƣợc sử dụng phƣơng pháp mã vạch ADN có thể bảo vệ
ngƣời dụng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốc giả mạo, đặc biệt
trong nhiều trƣờng hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng.
Dƣới đây trình bày một số mã vạch ADN đã đƣợc nghiên cứu và ứng
dụng trong các cây dƣợc liệu.
Vùng gen ITS cung cấp số lƣợng thông tin đặc trƣng lớn nhất và khả
năng xử lý tốt nhất 6 mẫu của Hedyotis L có họ với Rubiaceae. ITS đã đƣợc sử
dụng thành công để phân biệt 14 loài Hedyotis L, bao gồm cả loài chính thống
trong phƣơng thuốc điều trị khối u “Baihuasheshecao” có nguồn gốc từ H.
diffusa Willd, và cả loài giả mạo có nguồn gốc từ H. corymbosa (L.) Lam.
Vùng gen Maturase K trình tự này đã thành cơng trong việc xác định các
loại thuốc thảo dƣợc "Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum palmatum L
(Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. Ex Regel) Maxim. ex Balf, R. officinale
Baill., và loài gần gũi Rheum L. với mức độ biến đổi nội bộ loài và giữa các lồi
khác nhau là cao. Vì vậy, nó thƣờng đƣợc sử dụng để xác định các nguyên liệu
thảo dƣợc ở những vị trí địa lý khác nhau.
Vùng gen trnH-psbA cho thấy tỷ lệ khuếch đại thành công cao nhất
(100%) và tỷ lệ sai khác là 83% trong số chín locus thử nghiệm, bao gồm cả ITS,
rbcL và matK. Vì vậy, trnH – psbA đƣợc coi nhƣ 1 trình tự hữu ích để phân biệt
các loài thảo mộc với loài giả mạo nó. Nó đƣợc dùng để phân biệt lồi giả mạo
16



Shihu Bulbophyllum odoratissimum (Sm.)Lindl. ex. Hook.f. (Orchidaceae) có
nguồn gốc từ lồi Dendrobium Sw. với tỷ lệ sai khác trong trình tự là từ 2% đến
3,1%.
Tiểu đơn vị lớn của ribulose-bisphosphate carboxylase-rbcL trình tự này
có chất lƣợng cao khi làm thử nghiệm trên 7 locus. Tuy mức độ biến đổi thấp
giữa các loài khác nhau nhƣng rbcL vẫn cho phép nhận biết đƣợc ngun liệu
thảo dƣợc với loại giả mạo nó
Ví dụ, thảo dƣợc dƣơng xỉ "Mianmaguanzhong" có nguồn gốc từ
Dryopteris crassirhizoma Nakai (Dryopteridaceae) có 19 nucleotide là đa hình
trong trình tự rbcL khi đối chiếu với loài giả mạo.
1.4.3. Những ứng dụng quan trọng khác của mã vạch ADN
 Kiểm sốt tác nhân gây hại trong nơng nghiệp:
Sử dụng mã vạch ADN giúp định danh nhanh chóng các lồi gây bệnh ở
giai đoạn tiềm ẩn (giai đoạn ấu trùng), hỗ trợ chƣơng trình kiểm sốt sâu bệnh
bảo vệ cây trồng. Cung cấp thông tin cho các nhân viên hải quan của nhiều quốc
gia để họ có thể xác định và ngăn cản sự lan truyền của trái cây nhiễm sâu bệnh.
Kinh doanh sản phẩm nông nghiệp sẽ đƣợc đẩy mạnh hơn và nhờ đó rút ngắn
thời gian, đạt kết quả trong việc đối phó với sâu bệnh (Anders R., 2012).
 Xác định vật chủ trung gian gây bệnh:
Mã vạch ADN cũng đƣợc sử dụng để nhận diện những vật chủ trung gian
gây bệnh và để hiểu biết thêm những bệnh truyền nhiễm cũng nhƣ phƣơng pháp
điều trị nhằm đạt đƣợc hiệu quả nhanh chóng. Mã vạch ADN cho những vật chủ
gây bệnh đang đƣợc xây dựng và ngày càng phổ biến. Điều này cung cấp cho
các tổ chức và các cơ quan y tế cộng đồng các công cụ và phƣơng pháp hiệu quả
để ngăn cản và hạn chế sự phát triển của ruồi và các côn trùng gây hại (Anders
R., 2012).
 Bảo vệ các loài nguy cấp:
Một thực tế đáng báo động, đa dạng sinh học trên thế giới đang liên tục
giảm sút, trong đó nhiều lồi có nguy cơ tuyệt chủng. Vì vậy, mã vạch ADN có
thể giúp những cơ quan có thẩm quyền chỉ ra thịt có nguồn gốc từ những loài

17


nguy cấp, ngăn chặn săn bắn bất hợp pháp và giúp bảo tồn sự đa dạng sinh học
(Anders R, 2012).
 Duy trì nguồn tài nguyên thiên nhiên:
Mã vạch ADN giúp kiểm sốt hành vi săn bắn trái phép các lồi nguy cấp
mà nó cịn đƣợc ứng dụng trong nơng nghiệp và khai thác lâm nghiệp. Để kiểm
soát khai thác, nhà chức trách phải thiết lập quản lý một cách hiệu quả để kiểm
sốt kinh doanh các sản phẩm nơng nghiệp, biển và lâm nghiệp. Có ít nhất hai
dự án về mã vạch cho cá (fish-BOL) và cây thân gỗ (Tree-BOL) nhằm thúc đẩy
công tác quản lý và bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên (Anders R., 2012).
 Kiểm tra chất lƣợng nƣớc:
Hiện tại nguồn nƣớc bị ô nhiễm cần đƣợc xác định để phịng ngừa và có
biện pháp xử lý. Tuy nhiên, ơ nhiễm càng cao thì càng khó khăn hơn trong việc
xác định các chỉ số ơ nhiễm. Vì vậy, tại thời điểm này các nhà khoa học đang cố
gắng xây dựng thƣ viện mã vạch ADN cho những “chỉ số mập mờ”. Điều này
giúp cho cán bộ quản lý mơi trƣờng tiêu chuẩn hóa các loại chỉ số trong việc
đánh giá nƣớc và thiết lập quy trình đánh giá tiêu chuẩn tốt hơn ở mỗi quốc gia
(Anders R., 2012).
 Ứng dụng trong việc điều tra tội phạm:
Trong lĩnh vực pháp y, chỉ cần một lƣợng mẫu nhỏ, thậm chí vài biến
dạng cũng có thể giúp cảnh sát truy tìm nguồn gốc. Gần đây, cơ sở dữ liệu mã
vạch ADN của chó đã đƣợc các cơ sở pháp y của nhiều quốc gia sử dụng nhằm
hỗ trợ công việc của họ.[35]
1.5. Những thành tựu nghiên cứu ADN mã vạch ở thực vật
1.5.1. Những thành tựu nghiên cứu ở Việt Nam
Năm 2012, Nguyễn Thị Thanh Nga và cộng sự đã đã khuếch đại thành
công hai vùng gen ITS và matK, và kết quả phân tích trình tự ADN và cây phát
sinh chủng loại thu đƣợc, có thể kết luận vùng gen matK có khả năng phân biệt

tốt hơn vùng gen ITS, vùng gen matK có thể đƣợc sử dụng để phân biệt các dƣới
loài của chi Codonopsis. Nghiên cứu này lần đầu tiên ứng dụng mã vạch ADN
trong phân tích đa dạng di truyền các loài Codonopsis ở Việt Nam, và cùng các
18