PHẦN MỘT: MỞ ĐẦU
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ớt là loại cây đã được con người trồng trọt để thu hái quả từ lâu đời.
Với khơng ít người, ớt là loại gia vị không thể thiếu trong các bữa ăn, giúp
làm tăng cảm giác ngon miệng. Ngồi ra, ớt cịn là vị thuốc rất q trong y học
cổ truyền. Vì vậy, hiện nay diện tích trồng ớt ngày một tăng cao.
Những năm gần đây ở Việt Nam, các nhà chọn tạo giống ớt đã đạt được
một số kết quả đáng khả quan. Song cơ cấu giống ớt của nước ta chưa phong
phú, các giống dùng cho chế biến, xuất khẩu còn quá ít, không đủ cho nhu cầu
sản xuất với qui mô lớn, hơn nữa khả năng chống chịu sâu bệnh kém nên đã
làm giảm đi số lượng và chất lượng các giống ớt. Việc nhập nội các giống
mới, giống lai từ nước ngồi có năng suất, chất luợng tốt vẫn đang là phương
thức chủ yếu để đáp ứng nhu cầu về cơ cấu giống phù hợp với từng vùng sinh
thái và mục tiêu sử dụng khác nhau, nhưng với phương thức nhập nội có giá
thành tương đối cao và khơng chủ động về giống, do đó cơng tác chọn tạo
giống trong nước đang ngày càng trở nên cấp bách.
Trong chọn tạo giống ớt bằng phương pháp truyền thống, để tạo được
dòng thuần cho việc thử khả năng kết hợp chung và kết hợp riêng phải mất từ
4-5 thế hệ (2-3 năm) dẫn đến kéo dài thời gian cho công tác chọn tạo giống,
gây tốn kém kinh phí và sức lao động. Bằng phương pháp nuôi cấy hạt phấn
ớt sẽ khắc phục nhược điểm của phương pháp trên. Cây đơn bội kép tạo ra từ
ni cấy hạt phấn có độ đồng hợp tử tuyệt đối, hồn tồn khơng phân ly trong
các thế hệ sau và có thể tạo ra được trong một thời gian ngắn (1 thế hệ), tiết
kiệm được rất nhiều công sức, tiền của và đặc biệt rút ngắn thời gian cho công
tác chọn tạo giống ớt. Hiện nay ở Việt Nam, việc ứng dụng kỹ thuật đơn bội
mới chỉ tập trung trên lúa, ngô và đã thu được rất nhiều thành cơng. Cho tới
nay chưa có quy trình hồn thiện về ni cấy bao phấn ớt. Vì vậy, vấn đề
chọn tạo giống ớt bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đang là một đòi hỏi cấp
thiết.
1

Tuy nhiên, trong quá trình nghiên cứu và áp dụng kỹ thuật nuôi cấy bao
phấn ở nhiều loại cây trồng, các nhà khoa học đã tìm ra có rất nhiều yếu tố
ảnh hưởng đến khả năng tạo callus và tái sinh cây: kiểu gen, giai đoạn phát
triển bao phấn, môi trường nuôi cấy...Hơn nữa, việc nghiên cứu các yếu tố
ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy bao phấn ở Việt Nam còn hạn chế, tỷ lệ tái
sinh cây xanh chưa cao. Vì vậy, chúng ta cần phải tìm ra những điều kiện tối
ưu cho q trình ni cấy để việc ni cấy bao phấn được áp dụng có hiệu
quả hơn trong chọn tạo giống cây trồng.
Xuất phát từ những vấn đề trên và với mục đích hồn thiện quy trình
ni cấy bao phấn ớt, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu ảnh
hưởng của một số yếu tố ngoại sinh đến khả năng phát sinh callus từ bao
phấn cây ớt (Capsicum annuum L.)"
II. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI
2.1. Mục đích của đề tài
Xây dựng hệ thống tái sinh invitro từ bao phấn cây ớt làm cơ sở phục
vụ cho công tác chọn tạo giống.
2.2. Yêu cầu của đề tài
- Đánh giá được ảnh hưỏng của môi trường cơ bản đến khả năng tạo
callus từ bao phấn cây ớt.
- Xác định được thời gian xử lý lạnh hợp lý để tạo callus từ bao phấn
cây ớt.
- Xác định được chất điều hoà sinh trưởng hợp lý để tạo callus từ bao
phấn cây ớt.

2


PHẦN HAI: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY ỚT (Capsicum annuum L.)


1.1. Nguồn gốc, phân bố địa lý, đặc điểm thực vật học, yêu cầu
ngoại cảnh của cây ớt (Capsicum annuum L.)
1.1.1.Nguồn gốc
Cây ớt có tên khoa học Capsicum annuum L., thuộc họ Cà Solanaceae.
Cây có nguồn gốc địa lý từ Mexico, Trung và Nam Mỹ. Safford đã phát hiện
ớt khô tại một nghĩa địa cũ ở Peru có 2000 năm tuổi. Nguồn gốc thực vật học
của cây ớt là từ một dạng cây ớt cay hoang dại ở Nam Mỹ được thuần hoá và
trồng ở Châu Âu, Ấn Độ cách đây hơn 500 năm.
( />1.1.2. Phân bố địa lý
Cây ớt xuất hiện từ rất lâu song mãi đến tận thế kỷ 16 người Châu Âu
mới biết đến cây ớt. Ớt được Christopher Colombor đưa vào Tây Ban Nha
vào năm 1493 khi ông ghé thăm nước này trong cuộc hành trình vịng quanh
thế giới. Việc gieo trồng được phổ biến từ Địa Trung Hải đến nước Anh vào
năm 1958 và đến Trung Âu vào cuối thế kỷ 16. Sau đó những người Bồ Đào
Nha mang ớt từ Brazil đến Ấn Độ vào năm 1885, ở Trung Quốc vào khoảng
cuối năm 1970…Và việc cây ớt được du nhập vào Việt Nam hiện chưa có tài
liệu nào chính xác song theo một vài tác giả thì cho rằng người Pháp đã có
cơng mang cây ớt sang nước ta.
1.1.3. Đặc điểm thực vật học
+ Thân: Ớt là cây bụi, thân gỗ hai lá mầm, thân thường mọc thẳng, đơi
khi có thể gặp dạng có thân bị nhiều cành, chiều cao trung bình 0.5- 1.5m, có
thể là cây hàng năm hoặc lâu năm nhưng thường được gieo trồng như cây
hàng năm.

3


+ Rễ: Ban đầu ớt có rễ cọc phát triển mạnh với rất nhiều rễ phụ, nhưng
theo thời gian trồng trọt, rễ cọc bị đứt và một hệ rễ chùm khá phát triển vì thế

nên người ta lầm tưởng ớt có hệ rễ chùm.
+ Lá: lá đơn mọc xoắn trên thân chính, lá có nhiều dạng khác nhau
nhưng thường gặp nhất là dạng lá mác, trứng ngược, mép lá ít răng cưa.
+ Hoa: Các hoa hoàn thiện và quả thường được sinh đơn độc trên từng
nách lá, chỉ riêng loài C.chinense có tới 2-5 hoa trên một nách lá. Hoa có thể
mọc thẳng đứng hoặc bng thõng. Hoa thường có màu trắng, một số giống
có màu sữa, xanh lam và tím, hoa có 5-7 cánh hoa, có cuống dài khoảng
1.5cm, đài (5-7) ngắn có dạng chng, dài khoảng 2mm bọc lấy quả. Nhụy
đơn giản có màu trắng hoặc tím. Hoa có 5-7 nhị đực với ống phấn màu xanh
da trời hoặc tím, bao phấn có màu tím với số lượng 4-6 bao phấn/ hoa.
+ Quả: Ớt thuộc loại quả mọng có nhiều hạt, thịt quả nhăn và chia làm
hai ngăn. Tuỳ vào các giống khác nhau có kích thước quả, hình dạng quả, độ
nhọn, màu sắc, độ mềm của thịt quả khác nhau. Quả chưa chín có màu xanh
sau đó chuyển dần sang màu đỏ hoặc vàng khi chín. Hiện nay, nước ta thường
trồng phổ biến một số giống lai F1 của Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan…có
dạng quả hình chng, thịt quả hơi mỏng, quả dạng hình tim dài.
+ Hạt: có dạng thận và màu vàng rơm, hạt có đường kính khoảng
35mm, chiều dài khoảng 3-5mm.
1.1.4. Yêu cầu ngoại cảnh của cây ớt (Capsicum annuum L.)
Cây ớt ưa khí hậu khô và ấm. Cây phát triển tốt ở đất thịt nhẹ, đất pha
cát dễ thoát nước. Hạt ớt nảy mầm ở nhiệt độ từ 25-30oC, dưới 10oC hạt
không mọc. Thời kỳ ra hoa cần nhiệt độ 15- 20oC, nhiều ánh sáng. Cây ớt có
khả năng chịu hạn cao, lúc ra hoa chỉ cần độ ẩm >70%, song không chịu được
ngập úng, pH 5.5-7, tưới tiêu chủ động.

4


1.2. Thành phần dinh dƣỡng, giá trị sử dụng và giá trị kinh tế của
cây ớt (Capsicum annuum L.)

1.2.1. Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng
Ở Việt Nam, cây ớt là một loại rau gia vị có giá trị kinh tế cao, được
trồng chủ yếu tại các tỉnh miền Trung và Nam bộ. Những năm gần đây, một
số tỉnh đồng bằng sông Hồng cũng đã bắt đầu trồng với diện tích lớn, nhằm
cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy, các công ty sản xuất các mặt hàng
thực phẩm để tiêu thụ và xuất khẩu, đem lại lợi nhuận cao.
Ớt rất giàu các loại vitamin, đặc biệt là vitamin A và C. Trong đó, loại ớt
hình chng đỏ có nhiều loại sắc tố khác nhau như: capsanthin và capsorvbin6%, cryptocapsin - 4% và vitamin C khoảng 321mg (Curl, 1962), (Simon,
1960).
Bảng 1: Hàm lƣợng các chất chứa trong ớt ngọt
(trong 100g phần ăn đƣợc)
Thành phần

Hàm lượng

Thành phần

Hàm lượng

Vitamin B+B2

0.02-0.1 mg

Ca

11g

Axit folic

1.3-2.9 mg


Vitamin A

870I.U

Axit nicotinic

6-10 mg

Axit ascorbic

175

Nước

92,4%

Thiamin

0.06 mg

Calo

29

Riboflavin

0.03mg

Protein


1-2g

Niaxin

0.55 mg
Theo Joshi và Sing, 1975

Nhờ chứa một lượng vitamin C tương đối cao: 100g ớt có chứa hơn
120mg vitamin C, tương đương với 75% lượng vitamin C cơ thể cần mỗi
ngày nên ớt có vai trị quan trọng trong việc cung cấp vitamin cho món ăn, dù
là khi để sống trộn với salat hay khi đã nấu chín. Với cùng một lượng ớt,
lượng vitamin A do loại rau này mang lại có thể từ 15-50% tổng lượng
vitamin cung cấp cho cơ thể.

5


Bên cạnh là loại gia vị không thể thiếu trong các bữa ăn, giúp làm tăng
cảm giác ngon miệng, ớt cịn là vị thuốc rất q trong y học cổ truyền, có thể
chữa nhiều căn bệnh hữu hiệu.
Theo y học cổ truyền, ớt có vị cay, nóng, có tác dụng khoan trung, tán
hàn, kiện tỳ, tiêu thực, chỉ thống (giảm đau), kháng nham (chữa ung thư…).
Do vậy, ớt thường dùng để chữa đau bụng do lạnh, tiêu hóa kém, đau khớp,
chữa vết rắn cắn…
Nghiên cứu của y học hiện đại cũng thống nhất với y học cổ truyền về
tác dụng chữa bệnh của ớt. Kết luận nghiên cứu của các nhà khoa học Trung
Quốc cho thấy quả ớt có rất nhiều ích lợi cho sức khoẻ. Trong ớt có chứa một
số hoạt chất: capsicain là một alkaloid chiếm tỷ lệ khoảng 0.05- 2%, được xác
định là acid isodexenic vanilyamit, có đặc điểm bốc hơi ở nhiệt độ cao, gây

hắt hơi mạnh. Ngồi ra, cịn có capsaicin, là hoạt chất gây đỏ nóng, chỉ xuất
hiện khi quả ớt chín, chiếm tỷ lệ từ 0.01- 0.1 %. Capsaicin có tác dụng kích
thích não bộ sản xuất ra chất endorphin, một chất morphin nội sinh, có đặc
tính như thuốc giảm đau, đặc biệt có ích cho những bệnh nhân bị viêm khớp
mãn tính và các bệnh ung thư.
Ngồi ra, ớt cịn giúp ngăn ngừa bệnh tim do chứa một số hoạt chất giúp
máu lưu thơng tốt, tránh được tình trạng đóng vón tiểu cầu dễ gây tai biến tim
mạch. Một số nghiên cứu cho thấy, những loại ớt vỏ xanh, trái nhỏ có hàm
lượng capsaicin nhiều hơn. Ngồi ra, cịn có chứa nhiều loại vitamin: C, B1,
B2, acid citric, acid malic, β caroten…
1.2.2. Giá trị kinh tế của cây ớt (Capsicum annuum L.)
Chính những giá trị to lớn trong lĩnh vực thực phẩm cũng như trong
dược phẩm mà cây ớt mang lại, giá ớt đang có xu hướng tăng mạnh. Trên Sở
giao dịch hàng hoá Quốc gia tại Ấn Độ cho biết giá ớt vào khoảng 4.557
Rupi/ 100Kg. Ước tính, sản lượng vụ tới vào cuối tháng 10 trong năm nay sẽ
đạt 28-30 triệu bao loại 35 Kg, tăng 20-25% so với năm trước. Đồng thời việc
xuất khẩu ớt ở Ấn Độ cũng tăng rất nhanh do nhu cầu tăng từ các nước nhập
6


khẩu như: Malaysia, Srilanka, Mỹ, Bangladet…, chiếm 48% tổng khối lượng
và 28% tri giá xuất khẩu gia vị của nước này.
Cịn ở Việt Nam, ớt là loại mặt hàng có kim ngạch xuất khẩu cao với 448
nghìn USD. Các chủng loại ớt xuất khẩu khá đa dạng bao gồm: ớt tươi, ớt
khô, ớt muối, ớt đông lạnh…Trung Quốc và Hàn Quốc là hai thị truờng nhập
khẩu ớt lớn nhất trong thời gian này, lần lượt chiếm 53.2 và 35.1% tổng kim
ngạch xuất khẩu ớt của cả nước.
Một thực tế cho thấy: tại huyện Mường Khương (Lào Cai), cây ớt là một
trong 3 cây mũi nhọn đem lại hiệu quả kinh tế cao cho người dân. Trước đây,
giá ớt tươi bấp bênh trong khoảng 2000-4000đồng/ kg thì nay giá mua đã ở

mức ổn định 13000- 15000 đồng/kg. Tổng kết vụ ớt năm 2005 của Phịng
kinh tế huyện, năng suất trung bình đạt 8tạ/ha, tính ra giá trị của cây ớt cao
gấp 2-3 lần so với cây ngô hoặc rau màu khác trên cùng 1 đơn vị diện tích
trong khi mức đầu tư lại thấp hơn rất nhiều.
II. GIỚI THIỆU VỀ PHƢƠNG PHÁP NI CẤY BAO PHẤN
TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG:
Ni cấy mô tế bào thực vật luôn là vấn đề được các nhà khoa học
quan tâm nghiên cứu. Năm 1902, Haberlandt - nhà thực vật học đầu tiên
người Đức đã đề xuất phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật để chứng
minh tính tồn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh
vật nào cũng đều mang tồn bộ lượng thơng tin di truyền cần thiết và đầy đủ
của sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát
triển thành một cơ thể hồn chỉnh. Theo thời gian, với sự tiến bộ của kỹ thuật
nuôi cấy tế bào đã tạo ra khả năng tái sinh cây trên phạm vi lớn các cơ quan
thực vật. Việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn đã mở ra tiềm
năng to lớn trong tạo cây đơn bội của cây trồng. Bởi lẽ, các thực vật đơn bội
là những đối tượng rất hữu ích trong các chương trình chọn giống thực vật để
chọn những đặc điểm mong muốn, vì kiểu hình của chúng là biểu hiện của
các bản sao đơn, không bị các gen trội lấn át. Chúng là nguồn vật liệu khởi
7


đầu rất cần thiết trong công tác tạo giống và đồng thời cũng là sản phẩm cuối
cùng của qui trình tạo giống (đối với dòng tự thụ phấn).
Để nhận được các dòng đồng hợp tử từ các thể đột biến và con lai thực
vật, từ xưa đến nay người ta vẫn áp dụng phương pháp cho tự thụ phấn phối
hợp với chọn dịng liên tục qua ít nhất từ 8-16 thế hệ. Thơng thường, người ta
có thể chọn lọc theo hai cách: chọn lọc đơn bội xuất hiện ngẫu nhiên; lai xa và
sau khi một bộ nhiễm sắc thể thoái biến sẽ còn lại bộ nhiễm sắc thể đơn bội.
Rõ ràng là theo phương pháp cổ truyền này, người ta phải mất khá nhiều thời

gian cũng như công sức và chi phí bỏ ra.
Ni cấy bao phấn chính là một phương pháp để tạo ra các dòng đồng
hợp tử trong một thời gian chỉ vài tháng so với yêu cầu nhiều thế hệ khi sử
dụng phương pháp truyền thống (Choo et al, 1985; Morrison & Evans, 1988;
Snape, 1989). Và cây đơn bội chính là sản phẩm cuối cùng của ni cấy bao
phấn, chúng có đặc điểm là có độ đồng hợp tử rất cao và là nguồn vật liệu đa
dạng phong phú cho chọn giống (Knapp, 1991; Michell et al, 1992; Bjonstad
et al, 1993).
Vậy ni cấy bao phấn là gì? Đó là kỹ thuật ni cấy invitro bao phấn
trong có chứa các tiểu bào tử hoặc hạt phấn chưa chín trong mơi trường dinh
dưỡng nhằm mục đích tạo cây đơn bội, giúp ta có thể rút ngắn thời gian chọn
giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc, tăng biến dị cho chọn lọc và giúp giải
quyết vấn đề trong lai xa, đặc biệt là đối với nhiều lồi cây trồng có mức độ dị
hợp tử cao cần phải mất nhiều năm ni trồng cẩn thận mới tạo ra dịng thuần
qua việc tự thụ phấn. Kỹ thuật tạo cây đơn bội invitro thơng qua việc kích
thích tiểu bào tử phát triển thành cây trong ni cấy bao phấn nhanh chóng
tạo ra hàng loạt cây đơn bội đã là một lối thoát kỳ diệu đối với lĩnh vực ứng
dụng đơn bội vào nghiên cứu di truyền và tạo giống cây trồng (Trần Duy
Quý, 1999). Chúng ta có thể hình dung theo sơ đồ sau:

8


Bình thường sự phát triển của tế bào sinh dục đực trong bao phấn đi theo
các giai đoạn sau: từ tế bào mẹ thơng qua q trình phân bào giảm nhiễm hình
thành các tiểu bào tử (đơn bội). Sau đó từ các tiểu bào tử hình thành các giao
tử đực (hạt phấn - cũng đơn bội). Nhưng khi ta đưa bao phấn vào nuôi cấy
trong môi trường nhân tạo, sự phát triển của tiểu bào tử sẽ khác đi. Dưới tác
động của một loạt các yếu tố trong môi trường ni cấy, đặc biệt là các chất
kích thích sinh trưởng trong các tế bào sẽ diễn ra quá trình phản phân hố, từ

đó các tiểu bào tử phân chia hình thành mô sẹo. Các mô sẹo này lúc đầu bao
gồm các tế bào đơn bội. Sau đó tuỳ điều kiện ni cấy chúng có thể là đơn bội
hay bị lưỡng bội hố. Khi cần thiết, cây đơn bội có thể được xử lý colchicine
để chuyển thành lưỡng bội. Tất cả các thể lưỡng bội thu được trong cả hai
trường hợp trên đều là đồng hợp tử (hoàn toàn thuần về phương diện di
truyền) do chúng có nguồn gốc từ một tế bào đơn bội (Phan Phải, Vũ Đức
Quang và cộng sự, 1990). Trong nuôi cấy bao phấn tuỳ theo mỗi loại cây
trồng mà thu được tỷ lệ số cây đơn bội và nhị bội khác nhau, trong một vài
trường hợp cụ thể có thể thu được cây có mức độ bội thể cao hơn (Chu & CS,
1982). Các bao phấn dùng để nuôi cấy thường được lấy từ các cây của quần
thể F1 hoặc F2 nhằm tạo ra sự đa dạng di truyền tối đa trong quần thể những
cây đơn bội.

9


III.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG NI CẤY
BAO PHẤN TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƢỚC
3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy bao phấn trên thế
giới
Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn đã giúp cho các nhà khoa học rút
ngắn thời gian tạo cây đơn bội so với phương pháp truyền thống. Đó là một
lối thốt kì diệu đối với lĩnh vực ứng dụng đơn bào vào nghiên cứu di truyền
và tạo giống cây trồng.
Nuôi cấy hạt phấn thành công đầu tiên vào năm 1950 do Morel (người
Pháp) thực hiện đối với hạt phấn cây khoả tử (cây một lá mầm) bằng nước
dừa tạo thành mô sẹo. Tiếp theo là hai nhà khoa học người Ấn Độ Guha và
Mahe shamari (1964) đã nuôi cấy thành công hạt phấn cây cà độc dược
(Datura inno xia) [13], tạo phôi và từ các phôi này đã cho cây con hồn chỉnh.
Kỹ thuật ni cấy bao phấn đã phát triển và hồn thiện nhờ các cơng trình của

Bouisgin và Nitsch (1967) trên cây thuốc lá (Nicotiana), đặc biệt là Niizeki và
Oono đã nuôi cấy thành công bao phấn lúa (Oryza Sativa) năm 1968, thu
được cây đơn bội, tạo ra một khả năng ứng dụng rất lớn cho công tác chọn tạo
chọn giống lúa.
Sau thành công của Niizeki và Oono (1968), kỹ thuật nuôi cấy bao phấn
được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới. Việc đưa
cây đơn bội vào chương trình tạo giống ở cây lúa mì, lúa mạch, thuốc lá, ngơ,
ớt… đã trở thành phổ biến tại các nước: Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, Pháp,
Triều Tiên… Các tác giả Pháp (E.Teoulé và Y.Demarly, 1998) cho rằng: bình
quân con người đã tiết kiệm được 5 năm khi sử dụng kỹ thuật đơn bội cho
việc tạo giống mới. Tại Trung Quốc công nghệ đơn bội đã được triển khai có
hệ thống trên quy lớn và có định hướng chiến lược rõ ràng. Hơn 1000 cơ sở
nuôi cấy bao phấn đã hoạt động trên toàn quốc từ năm 1970, kết quả cho thấy
đã có hàng chục vạn ha lúa trồng những giống được tạo bằng phương pháp
nuôi cấy bao phấn (Niizeki, 1999; Đỗ Năng Vịnh, 2002). Cũng tại Trung
10


Quốc, kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ngô để thu nhận các dòng đơn bội kép đã
được ứng dụng thành cơng, hơn 100 dịng thuần thu dược từ 30 tổ hợp khác
nhau ( Wu và Cs,1983), một số giống được áp dụng trong tạo giống lai đã
được sử dụng trong sản xuất như: AC 4115, Elite DK 524..(Genovesi,1987).
Tại CHDCND Triều Tiên, bằng kỹ thuật nuôi cấy đã tạo ra 2 giống lúa mới
(Zapata và Cs, 1986). Ở Nhật, những giống cây trồng mới cũng được tạo ra từ
q trình ni cấy bao phấn (Shintashi và Cs, 1996).
Còn đối với cây ớt, tác giả Chunling. Y.Baoun của Trung Quốc cũng đã
phát triển thành công một số giống ớt mới bằng nuôi cấy bao phấn. Hơn 500
cây đơn bội kép đạt được hằng năm có thể sống và chuyển ra cánh đồng.
Giống mới có thể phát triển trực tiếp từ con lai và từ các giống. Cho tới nay, 6
giống từ nuôi cấy bao phấn và 6 con lai cùng với dòng bố mẹ của chúng từ

nuôi cấy bao phấn đã được trồng phổ biến trên khắp đất nước Trung Quốc với
diện tích trên 38.400 ha, kết quả đã làm tăng 100 tỷ từ Ớt xuất khẩu.
Vật liệu ban đầu cho quá trình ni cấy invitro tạo cây đơn bội thường
là: Bao phấn, hạt phấn tách rời, cụm hoa; cứu phôi sau lai xa; thụ tinh giả;
noãn chưa thụ tinh. Trong số các vật liệu trên, bao phấn, hạt phấn tách rời,
noãn chưa thụ tinh là những nguyên liệu quan trọng, được sử dụng phổ biến
hơn để tạo cây đơn bội (Jensen,1977; Hess và Wagner,1974). Kết quả nghiên
cứu của nhiều tác giả cho thấy hạt phấn ni cấy có thể phát triển thành cây
đơn bội hồn chỉnh trong điều kiện ni cấy invitro bằng con đường tạo phôi
trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan.
Rất nhiều báo cáo của các nhà khoa học đã tìm ra những yếu tố quan
trọng ảnh hưởng đến thành công của q trình ni cấy bao phấn như ảnh
hưởng của kiểu gen, giai đoạn phát triển của hạt phấn và các điều kiện môi
trường nuôi cấy. Để đạt được hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn và tạo cây
đơn bội, giai đoạn phát triển của hạt phấn có ý nghĩa vơ cùng quan trọng.
Chẳng hạn đối với giống lúa, các nhà khoa học ở viện lúa quốc tế (IRRI) đã
nghiên cứu 500 bao phấn chọn từ nhiều giống chứa hạt phấn ở các giai đoạn
11


khác nhau, khi nghiên cứu thấy hạt phấn ở giai đoạn từ đơn nhân giữa đến
đơn nhân muộn là tốt nhất (GuZman et ai, 2000), có ý nghĩa là cần lấy hoa khi
khoảng cách giữa tai lá cờ và lá đối diện là 2-4 cm (Zapata,1983). Đối với
ngô, giai đoạn nuôi cấy hiệu quả nhất là giai đoạn tế bào từ đơn nhân sớm đến
đầu giai đoạn hai nhân. Đối với thuốc lá, các nhà khoa học đã xác định được
giai đoạn phát triển của bao phấn tốt nhất khi đài và tràng hoa có chiều dài
tương đương nhau (Sandra M. Reed, 2000). Còn đối với dòng ớt ATZ1 và P0
và con lai của 2 dòng này tác giả Paweb Nowacyk, 2004 cho rằng sự phát
sinh phôi từ bao phấn thành cơng khi nụ hoa với cánh tràng có chiều dài
tương đương nhau hoặc dài hơn một chút so với lá đài.

Ying, 1983 đã nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý lạnh sớm lên hiệu quả
nuôi cấy bao phấn cho thấy: Xử lý lạnh làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo được chứng
minh ở nhiều loài như: thuốc lá, cà độc dược, lúa mạch và lúa nước. Tapia và
cs cũng cho là xử lý lạnh làm chậm sự lão hoá của hạt phấn, làm tăng sự phân
chia của hạt phấn và giúp giải phóng những chất cần cho sự sinh sản đơn tính
đực (Tapia, 2000). Sugimoto lại cho rằng xử lý lạnh làm tăng lượng axitamin
tự do dẫn đến tăng tần số tái sinh cây (Sugimoto, 2000).
Yamaguchi và cs (1999) nhận xét, thời gian tối ưu để xử lý lạnh tuỳ từng
các giống cây trồng khác nhau. Nếu xử lý thời gian dài thì khả năng tạo mơ
sẹo giảm dần, có thể do hạt phấn bị giảm sức sống do giữ lâu trong tủ lạnh.
Đối với lúa, Gooal và cs (1996) cho biết khi xử lý lạnh ở nhiệt độ ôn hoà
100C lên bao phấn trong 11 ngày đã nâng tỷ lệ tạo mơ sẹo từ 12.5% lên
32,8%.
Ngồi ra, Tang và cs cũng cho thấy, tỷ lệ tạo mô sẹo, tỷ lệ tái sinh cây và
tỷ lệ cây xanh phụ thuộc nhiều bởi kiểu gen của cây cho phấn (Tang et
al,1998). Tác giả N.A.Zagorska khi nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen cây
cà chua bao phấn cho thấy: trong số 85 kiểu gen của các giống được đưa vào
nuôi cấy, callus chỉ được tạo ra từ bao phấn của 53 dòng. Sự tái sinh cây chỉ

12


có được từ callus của 15 dịng. Số liệu thu được đã chỉ ra rằng kiểu gen ảnh
hưởng đáng kể đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn.
Môi trường nuôi cấy giữ vai trò quan trọng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả
của nuôi cấy bao phấn, nhiều môi trường đã được xây dựng và sử dụng như
môi trường White (1953), môi trường Miashige và Skoog (1962), môi trường
Nitsch (1969), môi trường Gamborg…Tuỳ theo từng đối tượng nuôi cấy khác
nhau, những môi trường cơ bản này sẽ được cải tiến thành nhiều mơi truờng
khác cho phù hợp. Tuy nhiên cũng có một số qui luật chung: các cây hoà thảo

cần nhiều auxin, đặc biệt là 2.4D ở nồng độ cao để khởi động sự phân chia
đầu tiên. Hàm luợng đường có thay đổi tuỳ đối tượng: Lúa mì từ 60-120g
saccarose/l, cây họ cà chỉ cần 20-40g/l. Dịch chiết khoai tây, nấm men, nước
dừa, dịch thuỷ phân tỏ ra có tác dụng tốt trong nhiều môi truờng nuôi cấy bao
phấn.
Nhiệt độ, ánh sáng cũng có ảnh hưởng lớn đến quả trình ni cấy bao
phấn. Theo Nitsch (1983), sự sống của hạt phấn cũng được nâng cao bằng
cách tăng dần nhiệt độ hàng tuần trong giới hạn cho phép. Thí nghiệm ở ngơ
cho thấy, số luợng bao phấn tạo mô sẹo tăng từ 14,19,23,270C. Nhiệt độ cao
trong nuôi cấy làm tăng số cây bạch tạng. Vì vậy cần phải điều chỉnh nhiệt độ
để đạt tỷ lệ tạo mô sẹo và tái sinh cây xanh cao nhất. Ánh sáng có ảnh hưởng
mạnh tới sự phân hố cơ quan của mơ cịn tuỳ thuộc vào cường độ, chu kỳ và
thành phần quang phổ của ánh sáng. Cuờng độ ánh sáng cao thì mơ sinh
trưởng chậm nhưng lại kích thích ra rễ. Nếu quá cao sẽ làm tổn thương mơ,
cường độ trung bình kích thích tạo chồi. Cường độ thấp lại làm cây tăng chiều
cao và có màu xanh nhạt. Thưịng sử dụng ánh sáng có cường độ 1000-2500
lux là phù hợp (Pierik,1987; Reuter,1988)
Các tác giả Brasiluro, Willadino, Guena (1999) đã tiến hành thí nghiệm
nghiên cứu giai đoạn phát triển của bao phấn và ảnh hưởng của xử lý tia
gamma trên bao phấn cà chua đến sự hình thành callus. Kết quả thí nghiệm
cho thấy, hạt phấn trong tế bào phân chia tiền kỳ I sinh ra nhiều callus nhất.
13


Bao phấn và chiều dài nụ hoa đều có ý nghĩa quan trọng liên quan đến giai
đoạn phát triển bao phấn. Trong thí nghiệm xử lý tia gamma, các tác giả đã xử
lý hạt và nụ hoa cà chua của con lai IPA 5x Rotam4 (F2), IPA6x Rotam4 (F2)
và đem cấy trên mơi trưịng Gresshoff và Doy (1972) có bổ sung các chất
điều hoà sinh trưởng khác nhau. Tuy nhiên trong thí nghiệm này tác giả
khơng tìm thấy sự sai khác có ý nghĩa đến sự hình thành callus.

Đối với cây ớt, trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu ni cấy bao
phấn của nhiều dịng giống ớt khác nhau và đã thu được kết quả khác nhau:
Moonza Kim và cs (2004) đã nghiên cứu nuôi cấy bao phấn của giống
Capsicum annuum L. trên môi trường MS chứa 0.1mg/l NAA và 0.1mg/l
kinetin. Bao phấn được ủ và chịu nhiệt độ tới 31oC và sự phát triển của tiểu
bào tử trong bao phấn ở các giai đoạn khác nhau được quan sát hình thái tế
bào học bằng việc sử dụng chất DAPI. Ớt có đặc điểm là hạt phấn rất không
đồng đều trong bao phấn đơn. Tỷ lệ hạt phấn ở các giai đoạn khác nhau thay
đổi theo các giai đoạn nuôi cấy và tỷ lệ hạt phấn chết tăng mạnh từ ngày thứ
hai sau nuôi cấy. Kết quả cho thấy giai đoạn hạt phấn thích hợp nhất cho sự
phát triển phơi có chứa tỷ lệ lớn (75%) là hạt phấn ở đầu giai đoạn hai nhân.
Tác giả González- García, Juvencio (2004) cũng ni cấy hạt phấn ớt
của sáu mươi cặp lai giữa loài phụ Veracruzano và giống địa phương nhằm
theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của tiểu bào tử. Thí nghiệm được tiến
hành khi hạt phấn ở giai đoạn đơn nhân giữa tới giai đoạn hai nhân và ni
cấy trên mơi trưịng MS gồn 6% đưịng, 0,7% agar, pH là 5,7 có bổ sung các
chất điều tiết sinh trưởng khác nhau như 2,4D, BA, IAA. Kết quả cho thấy,
hiệu quả của nuôi cấy bao phấn phụ thuộc rất lớn vào kiểu gen của cây cho
phấn. Sự phát sinh phôi từ tiểu bào tử tốt nhất trên mơi trường chứa 0.3mg/l
BA và 2 mg/l IAA.
Cịn kết quả nghiên cứu nuôi cấy bao phấn của 4 cặp lai F1 và 13 dòng
giống của ớt ngọt và ớt cay của tác giả X.Qin.Rotino (2002) lại cho rằng sự
phát sinh phôi chỉ xuất hiện trên môi trường chứa 0.5mg/l 6-BAP. Có tổng số
14


268 phôi thu được từ 2937 bao phấn thu được cây đơn bội, nhị bội có tỷ lệ
tương đương nhau.
3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng ni cấy bao phấn ở Việt
Nam

Việt Nam là một trong những nước đang phát triển, cơng nghệ sinh học
cịn rất mới mẻ và đang đi những bước đi đầu tiên. Sau năm 1975, nuôi cấy
mô tế bào được phát triển, phương pháp nuôi cấy bao phấn cũng được nghiên
cứu. Các kết quả đầu tiên nuôi cấy thành công bao phấn lúa được Lê Thị
Muội công bố năm 1978 (Nguyễn Đức Thành, 2000). Cho tới nay, kỹ thuật
nuôi cấy bao phấn lúa, ngô ở Việt Nam đã trở thành tiến bộ kỹ thuật và đang
là công cụ đắc lực cho công tác chọn tạo giống, rất nhiều dòng giống cây
trồng đã được tạo ra bằng phương pháp này.
Năm 1976 tại phân viện công nghệ sinh học Việt Nam, đã tiến hành các
nghiên cứu nuôi cấy bao phấn tạo thành cơng một số dịng đơn bội kép bao
phấn từ các giống lúa IR36, trắng lùn, IR2307 ( Nguyễn Văn Uyển và cộng
sự, 1984) [18]. Ngoài ra kỹ thuật nuôi cấy bao phấn cũng đã được nghiên cứu
và ứng dụng thành công ở nhiều cơ quan nghiên cứu khoa học như : Viện di
truyền nông nghiệp, Viện cây lương thực và cây thực phẩm…Tại Viện di
truyền nông nghiệp đã kết hợp nuôi cấy bao phấn lúa với chọn dòng biến dị
đã tạo 50 bất dụng đực nhân mẫn cảm với nhiệt độ (TGMS) mới, và tạo ra 12
dịng thuần có ưu thế lai gần tương đương con lai F1 là: DT26, DT29, J1,
AC24 ( Đỗ Năng Vịnh, 2002) [19].
Đối với cây ngô, Viện di truyền nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy
bao phấn cũng đem lại nhiều thành cơng, tại đây cũng đã hồn thiện qui trình
ni cấy bao phấn của 2 giống ngơ CM2, CM8 với tần số tái sinh cao (3080%). Với qui trình này, thời gian tạo dịng thuần rút ngắn từ 5-8 thế hệ ngồi
đồng ruộng xuống cịn 8 tháng trong phịng thí nghiệm (Đỗ Năng Vịnh,
2005). Việc khơi phục giống lúa đặc sản tám xoan TX1,TX2 bằng phương
pháp nuôi cấy bao phấn của Bộ môn nuôi cấy tế bào thực vật-Trung tâm
15


Giống cây lương thực- cây thực phẩm đã khắc phục được những nhược điểm
của giống Tám xoan truyền thống ( Báo nông nghiệp Việt Nam, ngày
7/11/2002) và cũng trên đối tượng là cây lúa, Bộ môn công nghệ sinh học của

Viện cây lương thực và cây thực phẩm đã nuôi cấy bao phấn các giống lúa
thuần thành công, giúp cải thiện một số đặc tính nơng học hay phẩm chất lúa:
đặc tính rụng hạt của giống lúa gốc…
Hiện nay kỹ thật đơn bội invitro cũng đang đuợc triển khai mạnh trong
chọn giống ở Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long, Viện Cơng nghệ sinh
học…
Việc nghiên cứu tối ưu hố các điều kiện ni cấy là cần thiết đối với
chương trình nghiên cứu chọn tạo giống. Các nghiên cứu tiến hành tại Viện di
truyền nơng nghiệp cho thấy có thể nâng cao hiệu quả nuôi cấy bao phấn bằng
các phương pháp sau: Nâng cao hiệu quả nuôi cấy bao phấn bằng cải tiến qui
trình ni cấy như: xử lý nhiệt bao phấn trước và sau khi cấy, xử lý mannitol
truớc khi nuôi cấy ở 14oC làm tăng đáng kể số phôi tạo thành, bổ sung chất
điều hoà sinh trưởng như kinetin 1mg/l cho hiệu quả tái sinh cây từ phơi hình
thành trong nuôi cấy bao phấn là cao nhất (8,8%), (Lê Huy Hàm và cs, 2000).
Tác giả Nguyễn Thị Khánh Vân và cs (2000-2001) đã nghiên cứu tạo
dịng ngơ đơn bội kép bằng ni cấy nỗn chưa thụ tinh invitro, kết quả cho
thấy giai đoạn thích hợp nhất cho q trình ni cấy khi bắp có chiều dài râu
đạt 3-7cm.
Khi nghiên cứu vật liệu ban đầu cho nuôi cấy, tác giả Nguyễn Đức
Thành (2000) cho thấy nguyên liệu ban đầu cho ni cấy tạo cây đơn bội có
thể là bao phấn hoặc hật phấn tách rời. Sử dụng bao phấn để nuôi cấy đơn
giản hơn về mặt kỹ thuật và môi trường ni cấy nhưng mơ và cây có thể tạo
thành từ mô sôma của thành bao phấn và như vậy rất khó phân biệt với cây tự
lưỡng bội bắt nguồn từ hạt phấn. Tuy nhiên thành bao phấn lại có vai trò rất
quan trọng trong sự phát triển của hạt phấn. Thành bao phấn cung cấp một số
16


chất dinh dưỡng chủ yếu cho tế bào hạt phấn và đóng vai trị như bể chứa chất
trao đổi cho hạt phấn hấp thu, dự trữ và biến đổi các chất từ môi trường nuôi

cấy. Đối với hạt phấn tách rời sẽ rất khó khăn để ni cấy và mơi trường sẽ
phải cần nhiều dinh dưỡng hơn. (Nguyễn Đức Thành, 2000).
Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tại Việt Nam còn rất hạn chế, chủ
yếu được tiến hành trên các đối tượng: lúa, ngơ cịn đối với đối tượng là cây
rau (cây ớt) thì cho đến nay chưa có cơng trình nào được cơng bố.
IV. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN NUÔI CẤY BAO PHẤN
Các kết quả nghiên cứu trong và ngồi nước cho thấy rằng hiệu quả của
ni cấy bao phấn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: điều kiện sinh lý của
cây mẹ, giai đoạn phát triển của hạt phấn, biện pháp xử lý nhiệt (Bajas, 1983)
đặc biệt là kiểu gen của cây cho bao phấn và thành phần môi trường dinh
dưỡng.
4.1. Kiểu gen của cây cho bao phấn:
Kiểu gen của cây cho bao phấn nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến kết
quả ni cấy khơng những trong phạm vi một chi mà cịn khác nhau giữa các
giống trong một lồi ( Phan Hữu Tơn, 2001). Các kiểu gen khác nhau có phản
ứng khác nhau trong nuôi cấy invitro và sự khác biệt này chịu sự tác động
tương đối giữa kiểu gen và mơi trưịng nuôi cấy (Nguyễn Mạnh Đôn, 1991,
1995).
Kiểu gen là nguyên nhân chính và là yếu tố quyết định sự hình thành
callus và tái sinh cây trong nuôi cấy bao phấn lúa ( Niizeki, 1983). Nhìn
chung, các giống lúa Indica và các con lai của chúng vừa có tần suất hình
thành callus và tái sinh cây thấp, vừa có tỷ lệ cây bạch tạng cao hơn so với
các giống lúa Japonica và các con lai của chúng. Còn đối với các con lai cho
khả năng tạo callus và tái sinh cây cao, cây bạch tạng thấp hơn so với các
giống gốc. Chen và Lin ( 1981) cho rằng tỷ lệ bao phấn tạo callus, khả năng
callus tái sinh thành cây, tỷ lệ cây bạch tạng và số lượng nhiễm sắc thể của
17


cây tái sinh đều có liên quan đến kiểu gen của cây cho bao phấn.Vậy để tăng

hiệu quả nuôi cấy có thể bằng cách lai tạo nhằm cải tiến đặc tính này. Cũng có
ý kiến cho rằng, các nhân tố tế bào chất cũng ảnh hưởng đến nuôi cấy bao
phấn nhưng gần đây, Quimio & Zapata lại khẳng định: "sự hình thành callus
và tái sinh cây bị điều khiển bởi các gen lặn mà khơng liên can gì đến các
nhân tố tế bào chất".
4.2. Điều kiện sinh lý cây cho bao phấn
Theo Chen và Lin (1976), Chen và Tsay (1984) cho rằng bao phấn được
lấy ở những bông trỗ sớm sẽ cho kết quả nuôi cấy tốt hơn bao phấn lấy ở
những bông trỗ muộn. Tỷ lệ tạo callus ở bao phấn lấy từ nhánh cấp 3 thấp hơn
bao phấn lấy ở nhánh mẹ, nhánh cấp 1, cấp 2 (Phan Hữu Tôn, 2001). Kết quả
nuôi cấy bao phấn phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của cây bố, mẹ cho
bao phấn hạt phấn. Tuy nhiên trạng thái của cây lại liên quan đến điều kiện
môi trường mà cây sinh trưởng: quang chu kỳ, cường độ ánh sáng, nhiệt độ và
dinh dưỡng khống. Khả năng thành cơng của ni cấy là cao nhất đối với
những bao phấn trong lần trổ hoa đầu tiên và giảm dần trong những lần trổ
hoa tiếp theo. Nhiều tác giả cho rằng điều kiện ngày dài cho khả năng tạo cây
từ bao phấn kém hơn so với ngày ngắn (Nguyễn Văn Uyển, 1984) [18]. Ảnh
hưởng quan trọng nhất đối với cây trồng cho bao phấn là nhiệt độ. Theo Hu
và cộng sự (1978) cho rằng nhiệt độ tới hạn đối với cây cho bao phấn là 18ºC20ºC. Nếu cây sống trong điều kiện nhà lưới, có nhiệt độ cao (26-28oC) thì sự
hình thành callus và tái sinh cây giảm và tỷ lệ cây bạch tạng sẽ tăng. Nhìn
chung cây trồng nào sinh trưởng khoẻ, điều kiện mơi trường dinh dưỡng tối
ưu, có cường độ ánh sáng mạnh thường cho bao phấn có tỷ lệ tạo callus và tái
sinh cao (Phan Hữu Tôn, 2001, 2004 ) [14], [15].
4.3. Giai đoạn phát triển của bao phấn
Các giai đoạn phát triển của bao phấn ni cấy cũng có ảnh hưỏng quan
trọng đến kết quả nuôi cấy. Bao phấn càng già thì tỷ lệ tái sinh cây càng thấp,
đồng thời tỷ lệ cây bạch tạng tăng.Tuy nhiên không phải bất cứ loài cây trồng
18



nào cũng cho hiệu suất tối ưu ở giai đoạn trước hoặc sau một nhân.Về vấn đề
nàỷ ở các nhà hội thảo có nhiều điểm khác nhau. Theo Niizeki và Oono
(1968) thì giai đoạn đơn nhân muộn là tốt nhất cho ni cấy bao phấn lúa, cịn
theo Claphm(1971) lại cho rằng đại mạch cho hiệu suất tạo cây cao nhất ở
giai đoạn đơn nhân sớm. Một số yếu tố khác hỗ trợ có thể gây lên sự thay đổi
về giai đoạn phản ứng tối ưu, ví dụ đối với lúa giai đoạn phản ứng tối ưu là
trước và giữa giai đoạn hạt phấn một nhân với điều kiện nồng độ đường trong
môi trường nuôi cấy tăng từ 6% đến 9% (Chen, 1978). Để xác định giai đoạn
phát triển của hạt phấn, hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau như:
nhuộm màu rồi soi kính hiển vi, nhưng phương pháp đơn giảm nhất là:
(1)Dựa vào khoảng cách lá đòng và tai lá cạnh lá địng; (2) Dựa vào màu sắc
và kích thước hoa lúa, nhiều tác giả khuyên nên kết hợp hai phương pháp sẽ
chính xác hơn (Phan Hữu Tơn, 2004) [15]. Nguyễn Văn Uyển và cộng sự
(1984) cho rằng giai đoạn phát triển của bao phấn lúa thích hợp nhất cho nuôi
cấy tương ứng với lúc khoảng cách giữa tai lá cạnh lá đòng và lá đòng là 3-5
cm, vỏ hạt lúa có màu xanh nhạt, hạt phấn bên trong có màu vàng nhạt và cao
hơn 1/3 chiều dài hạt lúa.
4.4. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy
Các kết quả nghiên cứu đều cho rằng mơi trường ni cấy có ảnh hưởng
đến kết quả nuôi cấy bao phấn. Thành phần tối ưu của mơi trường tuỳ theo
cây trồng thậm trí tuỳ theo cả kiểu gen. Một số cây yêu cầu môi trường rất
đơn giản chỉ cần chứa đường và một số muối khoáng cần thiết là đủ, một số
cây khác lại yêu cầu thêm cả Auxinvà Cytokynin vào môi trường mới cho kết
quả. Các môi trường khác nhau được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn lúa
gồm MS, MS thay đổi, LS, N6, B5...(Lê Trần Bình và cộng tác viên) [2]. Một
số môi trường khác như He5, SK3 cũng được sử dụng.
Nhiều nghiên cứu cho rằng nếu nồng độ ion NH4 + trong mơi trường cao
sẽ ức chế việc hình thành callus khi nuôi cấy bào tử đại mạch. Chu và cộng
sự( 1975) lại đề xuất khi nuôi cấy bao phấn lúa nên dùng môi trường N6 chứa
19



nồng độ (NH4)2SO4 thấp và KNO3 cao.Thường mơi trường có hàm lượng
nitrat cao và amoniac giảm như B5, LS sẽ cho kết quả thành công hơn (Phan
Hữu Tôn, 2004) [15].
Nguồn cacbon có trong thành phần của mơi trường ni cấy khơng chỉ
cung cấp năng lượng mà cịn kích thích tính thẩm thấu toàn năng. Các loại
đường thường được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn đối với các loại cây
trồng nói chung là: Sucrose, Mannitol, Glucose, Saccharose...Nồng độ đường
cao kích thích khả năng tái sinh cây từ ni cấy bao phấn của nhiều loại cây
trồng, đặc biệt là hoà thảo. Đối với lúa, nồng độ đường tối ưu theo các tác giả
khác nhau có khác nhau. Saccharose là nguồn cácbon được sử dụng có hiệu
quả nhất (Chaleff và cộng sự, 1982; Zapata và cộng sự, 1986). Nồng độ
Saccharose cao làm tăng khả năng tái sinh cây từ callus ở nồng độ 3%( Lê
Trần Bình và cộng sự, 1997) [2].Theo Chen (1978) thì tỷ lệ phối hợp giữa 6%
đường trong mơi trường tạo callus và 3% đường trong môi trường tái sinh cây
sẽ cho tỷ lệ tạo callus và cây xanh cao. Tuy nhiên một số báo cáo khác lại
cho rằng 6% đường là hơi cao nên giảm xuống còn 4-5%( Evan và cộng sự,
1981; Chung, 1982).Glucose ở nồng độ 5g/l làm tăng tỷ lệ cây bạch tạng.
Sucrose có hiệu quả tối thích đến tái sinh cây ở nồng độ 4-6%.
Các nguồn đường khác nhau cũng ảnh hưởng tới kết quả nuôi cấy bao
phấn lúa. Thông thường đường Saccharose được dùng nhiều hơn. Nguồn
Lactose cho tỷ lệ tạo callus cao hơn nhưng tỷ lệ cây bạch tạng lớn (Nguyễn
Thị Thanh Huyền, 2002) [8].
Mơi trường ni cấy là nhân tố chính kiểm sốt q trình gây tạo và phát
triển cây con ngun vẹn. Trong môi trường nuôi cấy bao phấn, chất lượng và
số lượng nguồn nitơ chính là nguyên nhân sử dụng các mơi trường khác nhau.
Một loạt các cơng trình nghiên cứu về sự ảnh hưởng của NH4+ và NO3- trong
môi trường N6 và đi đến kết luận: nồng độ ion Amoni (NH4 +) thấp kích thích
sự hình thành callus trong khi nồng độ cao ức chế quá trình này. Các bao phấn


20


khá nhạy cảm với muối amoni, đồng thời các ion Amoni khơng chỉ ảnh
hưởng đến sự hình thành callus mà cịn ảnh hưởng đến sự tái sinh cây.
Ngồi ra đối với nguồn nitơ như: Glutamin, alanine,casein, hydrolysate,
asparagine cũng có thể được dùng trong nuôi cấy bao phấn (Phan Hữu Tôn,
2001).
Việc phối hợp cân đối giữa đường và các chất điều tiết sinh trưởng là
yếu tố rất quan trọng trong nuôi cấy bao phấn. Nuôi cấy bao phấn lúa trên môi
trường cần thiết phải trải qua 2 bước với sự có mặt của Auxin và Cytokynin
(Lê Trần Bình và cộng sự,1997) [2]. Auxin và Cytokynin vẫn được bổ sung
vào môi trường, mặc dù các bao phấn được cho là rất giàu các chất điều tiết
sinh trưởng thực vật. Những Auxin được sử dụng trong môi trường nuôi cấy
bao phấn là: α- NNA, 2,4-D, IAA. Trong 2,4D ở nồng độ 2mg/l được coi là
thích hợp nhất đối với lúa trong mơi trường tạo mô sẹo (Niizeki, 1999,
Nguyễn Văn Uyển, 1984; Phan Hữu Tôn, 2001) [27], [18], [14]. Nhiều tác giả
thay thế 2,4-D bằng α-NAA cũng cho hiệu quả như nhau. Theo Nguyễn Văn
Uyển thì phối hợp cả 2,4-D, α-NAA, Kinetin sẽ cho kết quả cao nhất, tỉ lệ và
các loại hoocmon còn phụ thuộc vào từng kiểu gen. Ở Trung Quốc người ta
sử dụng môi trường chứa 4mg/l α-NAA + 1mg/l 2,4-D + 1-3mg/l Kinetin cho
loài Faponica với Indica người ta sử dụng môi trường chứa 2mg/l α-NAA +
2mg/l 2,4-D + 3mg/l Kinetin (Niizeki, 1999) [ 27]. Cịn mơi trường tái sinh
cây thì tỷ lệ 2mg/l α- NAA + 1mg/l Kinetin là thích hợp (Phan Hữu Tơn,
2001) [14].
Cytokinin gồm kinetin, zeatin và BA ở những nồng độ cao được coi là
có lợi cho sự tái sinh cây. Sự kết hợp khác nhau của auxin và cytokinin trên
các môi trường đã được nghiên cứu rất nhiều nhưng sự kết hợp tối thích cần
phải được thiết lập cho từng kiểu gen. Bởi vì khơng có mơi trường đơn lẻ nào

biểu hiện tốt nhất cho nhiều kiểu gen ( Karim et al, 1987)
Các chất chuyển hoá và các chất sinh trưởng khác như: ctinomicyn-D và
2-deoxyglucose cũng được nghiên cứu. ABA và DDT được coi là ngăn cản sự
21


phân chia tế bào và kích thích sự hình thành chồi xanh trong ni cấy bao
phấn lúa. Trong khi đó actnomi-D và 2-deo xyglinose lại tăng cường sự hình
thành callus ở lúa mì và lúa gạo. Các chất hoocmon khác chưa được trong
nước dừa, chiết suất nấm men, chiết suất khoai tây cũng có ảnh hưởng có lợi
đến ni cấy bao phấn. Gần đây Zbang, 1982 cho rằng: " dịch chiết từ cây
mướp (Luyacylindncia) kích thích sự hình thành callus và tái sinh cây của
Japonica và Indica." Trạng thái môi trường cũng ảnh hưởng đến sự hình thành
callus và tái sinh cây. Tần suất hình thành callus trên mơi trường lỏng cao hơn
nhiều so với môi trường đặc (Tian và Chen, 1983), nhưng tần suất phân chia
lại thấp hơn trong môi trường lỏng.
pH môi trường cũng ảnh hưởng đáng kể đến nuôi cấy bao phấn, các tác
giả cho rằng ảnh hưởng tích cực của pH đến tiềm năng tái sinh có liên quan
đến vai trị của nó trong sự qui định tính phân hố. pH trong mơi trường ni
cấy bao phấn lúa thường có giá trị là 5,8.
4.5.Các nhân tố lý học
Việc nuôi cấy bao phấn cũng cần phải chú ý đến mật độ bao phấn. Mật
độ 45-50 bao phấn/bình trụ 20 ml mơi trường là thích hợp.
Tuổi của callus cũng ảnh hưởng đến tần suất tái sinh cây. Tần suất các
callus tái sinh chồi cao hơn 50% khi cấy chuyển những callus có 10-15 ngày
tuổi. Khi cấy chuyển những callus tái sinh muộn hơn 60 ngày tuổi thì hiếm
khi tạo được cây con. Khi callus có kích thước q nhỏ (<1mm) thì chóng
chết đi sau khi chuyển sang mơi trường tái sinh. Theo Chen (1983) khẳng
định rằng các callus 10 ngày tuổi hoặc có kích thước 1-2 mm lại tối thích cho
sự tái sinh. Các callus già hơn hoặc non hơn, nhỏ hơn hoặc lớn hơn đều giảm

khả năng tái sinh cây và làm tăng sự xuất hiện cây bạch tạng.
4.6. Xử lý vật liệu trƣớc khi nuôi cấy
Việc xử lý nhiệt độ thấp trước khi nuôi cấy bao phấn được xem là một
phương pháp xử lý sốc hạt phấn có hiệu quả. Theo Tsay và Chen (1984) thì
xử lý lạnh vật liệu trước khi nuôi cấy sẽ làm tăng tỷ lệ tạo callus lên 2 lần so
22


với khơng xử lý. Lin và Tsay (1984) lại có kết luận callus được hình thành từ
bao phấn xử lý lạnh sẽ tạo ra nhiều cây đơn bội và ít cây lưỡng bội hơn là từ
bao phấn không xử lý lạnh, điều kiện lạnh đã kích thích việc tạo callus sớm và
khả năng tái sinh thành cây cao. Thời gian xử lý lạnh dài (8-15 ngày) tốt hơn
2-4 ngày. Tuy nhiên nếu kéo dài quá 15 ngày lại ức chế quá trình hình thành
callus (Chen và cộng sự, 1982). Ngược lại xử lý nhiệt độ quá thấp 4 oC lại là
nhiệt độ lạnh quá mức. Theo Niizeki cho rằng khoảng thời gian xử lý phụ
thuộc vào nhiệt độ xử lý, nhiệt độ thấp thì thời gian xử lý ngắn và ngược lại
nhiệt độ cao thì thời gian xử lý phải dài hơn. Tsay và cộng sự (1988) cho rằng
khả năng hình thành callus được tăng đơi khi xử lý bao phấn chứa bào tử ở
giai đoạn giữa và cuối một nhân trong 7-14 ngày thì tỷ lệ cây xanh giảm.
4.7. Điều kiện nuôi cấy bao phấn
Các điều kiện trong quá trình ni cấy bao phấn như: nhiệt độ, ánh sáng
có ảnh hưởng tới sự phát triển của bào tử (Maheshwari và cộng sự, 1980).
Nhiệt độ tối thích cho hình thành callus là 25 0C trong điều kiện tối hoàn toàn
nhưng khi tái sinh cây thì cần ánh sáng có cường độ 2000-3000 Lux, chu kỳ
chiếu sáng 16 giờ/ ngày đêm (Phan Hữu Tơn, 2001) [14].
Nhìn chung nhiệt độ bình thường từ 25-280C là thích hợp đối với ni
cấy bao phấn lúa và nhiều cây trồng khác (Nguyễn Đức Thành, 2000) [13].
Khi tăng nhiệt độ thì tỷ lệ tạo callus tăng và tỷ lệ tái sinh cây bạch tạng tăng
cũng theo Wang và Sun (1978) khi tăng nhiệt độ nuôi cấy lên đến trên 300C
trong suốt q trình ni cấy thì tỷ lệ tạo callus tăng lên nhiều nhưng các cây

tái sinh ra hầu hết là cây bạch tạng. Chen và cộng sự (1982) đã đưa ra đề xuất
nuôi cấy bao phấn ở nhiệt độ thấp 20-25 0C sẽ thuận lợi cho tái sinh cây
xanh.
4.8.Q trình phân hố callus
Khả năng để callus hạt phấn phân hoá thành cây phụ thuộc rất nhiều vào
chất lượng callus trước khi chuyển sang môi trường tái sinh cây. Chen và
cộng sự (1986) cho rằng những callus được thành sớm sau 30-50 ngày đặt
23


cấy bao phấn thì có khả năng tạo thành cây xanh cao vì những callus hạt phấn
thường mất khả năng phát sinh hình thái trong q trình ni cấy. Oono
(1975) và Chen (1977) đề xuất chuyển càng sớm callus sang mơi trường tái
sinh cây thì càng tốt. Thời gian chuyển tốt nhất là sau khi callus bắt đầu hình
thành được 10 ngày, nếu sớm hơn callus thường bị chết (Wang và cộng sự,
1974; Chen và cộng sự, 1983). Khoảng cách giữa 2 callus trên đĩa bằng 2 cm
là thích hợp để callus phân hoá thành cây. Hẹp hơn sẽ làm giảm khả năng
phân hố.
4.9. Hiện tƣợng cây bạch tạng
Việc hình thành cây bạch tạng là hiện tượng thường gặp khi nuôi cấy bao
phấn cây ngũ cốc. Tỷ lệ cây bạch tạng phụ thuộc vào kiểu gen, mỗi giống có
tỷ lệ nhất định (Chen và Lin, 1981), nó có thể biến động từ 10-100% (Wang
và cộng sự, 1978). Hu và Huang (1982) cho rằng hạt phấn cây lai giữa các
loài thường có tỷ lệ cây bạch tạng cao hơn. Do vậy hiện tượng cây bạch tạng
là một trở ngại lớn nhất khi muốn phục hồi lại những cây tái tổ hợp từ cây lai
xa thông qua môi trường nuôi cấy bao phấn. Tỷ lệ cây bạch tạng cũng liên
quan đến môi trường nuôi cấy bao phấn như các loại hoocmon (Wang et al,
1977). Ngoài ra nhiệt độ cũng liên quan đến tỷ lệ cây bạch tạng. Theo Wang
và Sun (1978) nhiệt độ ở giai đoạn đầu phân hố bào tử có ảnh hưởng rất lớn
đến sự hình thành cây bạch tạng, cịn ở giai đoạn sau khơng có ý nghĩa lớn

trong hiện tượng này (Niizeki, 1999). Wang và cộng sự (1975) thấy rằng khi
tăng nhiệt độ và nồng độ 2,4-D là nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ cây bạch tạng
cao.
PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
I. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

1.1.Vật liệu

24


- Nguồn vật liệu sử dụng cho nghiên cứu là giống ớt lai F1 (Hotchili)
có năng suất cao, chống chịu bệnh thán thư. Trong đó, các bao phấn ớt sử
dụng để nuôi cấy được lấy từ những lứa hoa đợt đầu.
- Các hố chất sử dụng cho ni cấy mơ tế bào gồm: đa lượng, vi
lượng, vitamin, chất hữu cơ, chất điều tiết sinh trưởng.
1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Bộ môn Công nghệ sinh học - Viện Nghiên cứu Rau quả Trâu Quì - Gia Lâm - Hà Nội.
- Thời gian thực hiện: từ tháng 2/2009 đến tháng 5/2009
II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Ảnh hưởng của ngưỡng nhiệt độ và thời gian xử lý lạnh đến khả năng
phát sinh callus từ bao phấn ớt
- Ảnh hưởng của nền môi trường dinh dưỡng đến khả năng phát sinh
callus từ bao phấn ớt.
- Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng phát sinh callus từ bao
phấn ớt
- Ảnh hưởng của nồng độ BAP trong môi trường nuôi cấy đến khả năng
phát sinh callus từ bao phấn ớt.
- Ảnh hưởng của nồng độ kinetin trong môi trường nuôi cấy đến khả
năng phát sinh callus từ bao phấn ớt

- Ảnh hưởng của tổ hợp BAP + αNAA trong môi trường nuôi cấy đến
khả năng phát sinh callus từ bao phấn ớt.
- Ảnh hưởng của tổ hợp BAP+ IAA trong môi trường nuôi cấy đến khả
năng phát sinh callus từ bao phấn ớt.
- Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + BAP + IAA trong môi trường nuôi cấy
đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn ớt.
- Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + BAP + αNAA trong môi trường nuôi
cấy đến khả năng phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn ớt.
25