Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 1/2011

THÔNG BÁO KHOA HỌC

ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP NI CẤY CHỦNG BACILLUS SUBTILIS CB15
SINH PROTEASE TRÊN MÔI TRƯỜNG DỊCH ÉP ĐẦU TÔM
CONDITION SUITABLE FOR PROTEASE PRODUCTION OF
BACILLUS SUBTILIS CB15 STRAIN ON MEDIUM FROM SHRIMP WASTE
Nguyễn Minh Trí
Khoa Chế biến, Trường Đại học Nha Trang
TĨM TẮT:
Bacillus subtilis, là lồi vi khuẩn an tồn cho sử dụng cho người và động vật, có thể sinh protease trên
môi trường từ dịch ép đầu tôm rẻ tiền.
Kết quả thực nghiệm cho thấy đối với chủng sinh protease B. subtilis CB15, điều kiện ni cấy thích
hợp sinh protease: môi trường chứa 40% dịch ép đầu tôm (pH 7), nhiệt độ phòng (28 - 300C), lắc 130 vòng/
phút, nuôi cấy trong 72h, hoạt độ protease đạt trên 1 AU/ml dịch ni cấy. Enzyme thu được có hoạt tính cao
nhất ở 50°C, pH 8.
Từ khoá: Protease, Bacillus subtilis, dịch ép đầu tôm.
ABSTRACT:
Bacillus subtilis, a safe microorganism for human and animal, can produce protease on the medium
prepared from the inexpensive ‘pressing out’ of shrimp waste.
The experiment results showed that for the chosen protease-producing strain, B. subtilis CB15, the
optimal cultural conditions for producing protease were: medium with 40% of the ‘pressing out’ of shrimp
waste (pH of 7); room temperature (28 - 300C), agitation speed at 130 rpm, during 72 hours, protease activity
of the culture was over 1 AU/ml. The optimal pH and temperature of the protease from B. subtilis CB15 were
found to be at 8 and 50°C, respectively.
Keywords: Protease, Bacillus subtilis, shrimp waste.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ

con người [9, 11, 13]. Chúng ta có thể thu nhận

Cơng nghệ enzyme là một phần khơng thể

protease từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó

thiếu được của công nghệ thực phẩm. Trong

người ta chú ý đến việc thu nhận protease từ

giai đoạn đầu, việc sử dụng enzyme trong công

vi sinh vật. Sự phát triển của các enzyme công

nghiệp thực phẩm hạn chế như việc sản xuất

nghiệp phụ thuộc vào việc sử dụng các nguồn

các thực phẩm lên men dựa vào tác động của

vi sinh vật. Các vi sinh vật có ích do sử dụng

các protease nội sinh dưới các điều kiện thích

sản xuất hiệu quả kinh tế hơn nhờ môi trường

hợp [19]. Ngày nay, các phương pháp enzyme

lên men rẻ tiền, thời gian lên men ngắn [3, 4,


có vai trị quan trọng trong quy trình sản xuất

8, 12, 15, 16]. Trong các vi sinh vật B. subtilis

của công nghệ thực phẩm hiện đại để sản xuất

là vi sinh vật được sử dụng rộng rãi cho người

lượng lớn các sản phẩm khác nhau dùng cho

động vật cũng như trong xử lý mơi trường, cho
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ❖ 77


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 1/2011

thấy đây là vi sinh vật an toàn cho việc sản xuất

từ các nguồn khác nhau được phân lập và sơ

cũng như dùng trong công nghiệp thực phẩm

bộ định danh lại dựa theo phương pháp được

[10, 15].

mô tả trong cuốn ‘Sổ tay phân loại vi khuẩn của


Để giảm chi phí trong việc sản xuất, người

Bergey’ [18]. Khả năng sinh protease được kiểm

ta thường nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme trên

tra, tuyển chọn các chủng tạo vịng ly giải protein

các mơi trường thu được từ các phế liệu. Phế

rõ, lớn (Hình 1). Chủng đem thí nghiệm được

liệu đầu tơm được sử dụng để sản xuất chitin.

đánh số theo thứ tự các chủng phân lập được.

Để giảm chi phí hóa chất sử dụng, cũng như

Chủng B. subtilis CB15 cho thấy có khả năng

gánh nặng cho việc xử lý môi trường, người ta

sinh protease mạnh, được tuyển chọn nuôi cấy

thêm công đoạn ép tách dịch đầu tơm trước khi

thí nghiệm.

đưa vào sản xuất chitin. Dịch ép đầu tơm có thể
sử dụng làm thức ăn chăn nuôi hay tinh sạch

thành nguồn đạm bổ sung vào các quá trình sản
xuất sản phẩm như nước mắm hay thức ăn gia
súc [5]. Việc tạo sản phẩm từ nuôi cấy vi sinh
vật trên môi trường phế liệu nhằm tạo ra một
hướng sử dụng phế liệu là việc làm cần thiết.
Sử dụng dịch ép đầu tôm để nuôi cấy sản xuất
protease chưa được quan tâm nghiên cứu, do
vậy chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh
protease của vi khuẩn Bacillus subtilis CB15 và
xác định một số tính chất đặc trưng của protease
thu được.

2.2. Môi trường giữ giống vi khuẩn, nhân
giống vi khuẩn và sản xuất
Chủng vi khuẩn này được duy trì trên ống
thạch nghiêng TSA (1,5% trypticase peptone,
0,5% phytone peptones, 0,5% NaCl, 1,5% agar)
Vi khuẩn nhân lên trong mơi trường TSB,
trong vịng 24 giờ. Sau đó đem cấy vào môi
trường sản xuất, tỷ lệ 10% (v/v) so với thể tích
mơi trường ni cấy.
Mơi trường sản xuất được chuẩn bị từ dịch
ép đầu tôm. Đầu tôm thẻ lấy từ xí nghiệp chế
biến thủy sản, được giữ đơng -20°C để sử dụng
dần. Dịch ép được lọc qua vải để loại cặn lớn,

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

đem đi chuẩn bị môi trường, tiệt trùng 121°C/15


CỨU

phút.

2.1. Chủng vi khuẩn

2.3. Xác định hoạt tính protease

Các chủng Bacillus subtilis được thu thập

Hoạt tính của protease được xác định theo
phương pháp Anson cải tiến. Đơn vị hoạt tính
của enzyme (AU) được xác định theo lượng
enzyme cần để thuỷ phân casein tạo sản phẩm
tương đương 1mmol tyrosine trong thời gian 1
phút. [1, 17]
2.4. Xử lý thống kê
Số liệu trong báo cáo là trung bình cộng của
3 lần phân tích với khoảng tin cậy (95%). Kết
quả được phân tích thống kê và vẽ đồ thị bằng

Hình 1. Vịng ly giải protein sau 48 giờ
ni cấy trên mơi trường chứa 1% casein

78 ❖ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

phần mềm Microsoft Excel. Giá trị của p < 0,05
được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê.



Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 1/2011

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát một số điều kiện nuôi cấy B. subtilis CB15 sinh protease từ môi trường dịch ép
đầu tôm
a. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch ép đầu tôm đến khả năng sinh protease của chủng B. subtilis CB15
Môi trường ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh protease của vi khuẩn, cũng như tốc độ lắc
trong khi nuôi cấy. Dịch ép đầu tôm chứa nhiều đạm (0,9%) [5], do vậy có thể sử dụng để ni cấy
vi khuẩn. Chọn mức độ lắc 100 vịng/phút, khảo sát hoạt độ protease thu được trong dịch nuôi cấy
theo tỷ lệ dịch ép đầu tôm và theo thời gian, kết quả như sau:

Hình 2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch ép đầu tôm và thời gian đến hoạt độ protease
trong mơi trường ni cấy

Qua Hình 2 kết quả tốt nhất ở tỷ lệ dịch ép đầu tôm dùng để pha môi trường là 40%. Tỷ lệ dịch
đầu tôm cao hơn 50% cũng khơng có lợi cho việc sinh protease. Thời gian thu nhận protein tốt nhất
vào 72 giờ, kéo dài thời gian nuôi cấy không tăng lượng enzyme thu nhận được.
b. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh protease của chủng vi khuẩn B. subtilis CB15.
B. subtilis là vi khuẩn hiếu khí, việc cung cấp oxy là quan trọng cho q trình ni cấy. Trong
ni cấy vi sinh tại phịng thí nghiệm cách thường sử dụng là dùng máy lắc. Tiến hành thí nghiệm ở
các tốc độ lắc khác nhau (100-130-160 vòng/phút), khảo sát hoạt độ protease trong môi trường nuôi
cấy theo thời gian (môi trường nuôi cấy chứa dịch ép đầu tôm 40%). Kết quả thu được trình bày trên
Bảng 1, minh họa trên Hình 3.
Bảng 1: Ảnh hưởng của tốc độ lắc và thời gian đến hoạt độ protease (AU/ml)
trong môi trường nuôi cấy.
Thời gian ni cấy (phút)

Tốc độ lắc

(vịng/phút)

48

60

72

84

0 (khơng lắc)
100
130
160

0,19
0,25
0,21

0,05
0,6
0,7
0,56

0,12
0,95
1,22
1,24

0,65

0,9
0,88

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ❖ 79


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 1/2011

Hình 3. Ảnh hưởng của tốc độ lắc và thời gian đến hoạt độ protease
trong môi trường nuôi cấy.

Qua Bảng 1, Hình 3, rõ ràng tốc độ lắc có ảnh hưởng đến protease sinh ra, khi không lắc, lượng
protease sinh ra thấp. Tốc độ lắc từ 130 vòng/ phút trở lên cho kết quả tốt hơn so với tốc độ lắc thấp
100 vịng/ phút, do điều kiện phịng thí nghiệm để an toàn cho thiết bị, tốc độ lắc được chọn là 130
vịng/ phút.
Về thời gian sinh protease trong mơi trường cao nhất sau nuôi cấy 72 giờ, trùng với kết quả thí
nghiệm trên.
c. Ảnh hưởng của casein bổ sung vào môi trường nuôi cấy:
Trong nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh protease của Bacilius subtilis
[6], tác giả nhận thấy casein ở nồng độ 0,5% cho canh cấy có hoạt độ cao nhất. Do vậy, để có thể
tăng sản lượng protease thu được, casein được thêm vào môi trường nuôi cấy ở các tỷ lệ khác nhau
(0,5 %, 1% và 1,5%). Kết quả thu được trình bày trong biểu đồ ở Hình 4.

Hình 4. Ảnh hưởng của casein bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến Protease thu được trong môi trường nuôi cấy

Qua biểu đồ thu được ở hình 4, rõ ràng casein bổ sung vào khơng có tác động tốt đến lượng
protease sinh ra. Điều này có thể giải thích là do hàm lượng protein chứa trong 40% dịch ép đầu


80 ❖ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 1/2011

tơm đã chọn ở thí nghiệm trên, đã cung cấp đủ

ép đầu tơm thích hợp cho việc ni cấy chủng

lượng protein cần thiết có việc sinh protease

vi khuẩn B. subtilis CB5 sinh protease (trên 1

của chủng vi khuẩn B. subtilis sử dụng. Việc bổ

AU/ml) cao hơn nghiên cứu khác trên chủng

sung thêm lượng protein có thể gây ức chế việc

B.subtilis (0,56 AU /ml) [2]

sinh protease. Điều này phù hợp với kết quả
của thí nghiệm trình bày ở phần 3.1.a, khi sử
dụng nồng độ dịch ép đầu tơm 50%, canh cấy có
hoạt độ protease thấp hơn so với nồng độ dịch
ép đầu tôm 40%. Điều này cũng phù hợp với
nghiên cứu về sinh protease trên chủng Serratia
[b], việc tăng nồng độ casein từ 1 - 3% tốc độ


3.2. Một số tính chất của enzyme thu được
Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như nồng độ enzyme, bản chất và
nồng độ cơ chất, nhiệt độ và pH của môi trường,
các ion kim loại và các chất khác... Trong nghiên
cứu này, chúng tôi tiến hành xác định pH và

sinh trưởng và phát triển tăng nhưng sinh tổng

nhiệt độ thích hợp enzyme thu được khi thủy

hợp protease giảm dần.

phân casein. Kết quả nghiên cứu được trình bày

Qua kết quả trình bày trên cho thấy dịch

trong Bảng 2.

Bảng 2: Hoạt tính của enzyme đo được ở các điều kiện nhiệt độ, pH khác nhau
pH

Nhiệt độ
(°C)

6,5

7,0


7,5

8

8,5

40

0,2

0,19

0,23

0,31

0,24

50

0,5

0,7

1,08

1,22

0,92


60

0,4

0,45

0,65

0,67

0,59

70

0,1

0,21

0,33

0,33

0,27

Xử lý thống kê Phân tích phương sai 2 yếu tố, kết quả như sau:
FNĐ = 38,99 > F 0,05 = 3,49
FpH = 6,07 < F 0,05 = 3,26
Vậy trong khoảng khảo sát (nhiệt độ : 40 - 70°C, pH : 6,5 - 8,5) nhiệt độ và pH đều có ảnh hưởng
đến hoạt độ của enzyme một cách có ý nghĩa.
Minh hoạ số liệu trên biểu đồ ở Hình 5.


Hình 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến chế độ thủy phân của protease thu được.

TRƯỜNG ĐẠI HOÏC NHA TRANG ❖ 81


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 1/2011

Qua đồ thị biểu diễn chúng ta thấy rõ hơn

được chọn là chế độ thuỷ phân casein đối với

các vùng biểu diễn hoạt tính enzyme kéo dài

protease thu được canh cấy chủng vi khuẩn B.

theo trục pH, chứng tỏ pH ít ảnh hưởng đến hoạt

subtilis CB15.

tính của enzyme trong khoảng (6,5 - 8,5) so với
ảnh hưởng của nhiệt độ (40 - 70°C).
Nhưng nếu xét trong khoảng pH 7,5 - 8,5
sự khác biệt khơng có ý nghĩa (FpH = 4,40 < F0,05

= 5,14). Điều này cho thấy khả năng ứng dụng

cao trong thực tế, do vấn đề điều chỉnh pH trong

thực tế là khơng dễ dàng như trong phịng thí
nghiệm, khó tạo được độ đồng đều của dịch cơ
chất đem thuỷ phân.
Nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến hoạt động
xúc tác của enzyme (p>0,05). Nhiệt độ 50°C cho
thấy enzyme có hoạt tính cao nhất. Đây là nhiệt
độ tương đối cao, trong thực tế có thể áp dụng
hệ thống năng lượng mặt trời cung cấp nhiệt cho
quá trình này. Đây cũng là nhiệt độ không thuận
lợi đối với một số vi khuẩn gây thối rữa.
Qua kết quả trên, chế độ này (50°C, pH 8)

IV. KẾT LUẬN
Qua số liệu trình bày ở trên, một số kết quả
thu được như sau:
Điều kiện nuôi cấy để thu được lượng
protease cao: Môi trường sản xuất chứa 40% dịch
ép đầu tôm ở pH 7, nuôi cấy ở nhiệt độ phịng,
tốc độ lắc 130 vịng/ phút, thời gian ni cấy 72
giờ, Protease thu được có hoạt độ cao (trên 1
AU/ml mơi trường). Việc bổ sung casein vào mơi
trường khơng có lợi cho việc sản xuất protease,
với kết quả thu được protease giảm nhẹ so với
mẫu đối chứng không bổ sung casein.
Enzyme thu được có hoạt tính cao nhất ở
50°C. Trong khoảng pH từ 7,5 đến 8,5, hoạt độ
của enzyme ít bị ảnh hưởng; ở pH 8 enzyme có
hoạt tính cao nhất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường, (1997). Thực hành hóa sinh. Nhà xuất bản
Giáo dục, Hà Nội.
2. Nguyễn Thị Thảo, Nguyễn Đình Thi, (2004). Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên quá trình sinh
trưởng và sinh tổng hợp protease của chủng Serraia sp.DT3. Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2(2): 205-216.
3. Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, (2007). Một số tính chất hố lý của protease ngoại bào chủng vi
sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6. Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 5(2): 197-203.
4. Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, Lê Thị Thu Hương, (2006). Xác định một số tính chất lý hóa của
protease chủng Serratia sp. DT3. Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 4(2): 195-204.
5. Nguyễn Minh Trí, Lương Thị Xuyến, Nguyễn Thị Thanh Hải, Đỗ Thị Ánh Hồ, (2009), Ép tách protein
từ đầu tơm thẻ (Penaeus vannamei) trong sản xuất chitin và bổ sung vào chượp trong sản xuất nước mắm.
Tạp chí Khoa học-Cơng nghệ Thuỷ sản, Trường ĐH Nha Trang, Số đặc biệt: 141-146.
6. Đỗ Thị Bích Thuỷ, Trần Thị Xơ, (2004). Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh
protease của Bacilius subtilis. Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 12: 1667-68.
7. Đỗ Thị Bích Thuỷ, Trần Thị Xơ, (2006). Nghiên cứu quy trình thu nhận và khảo sát một số tính chất của
chế phẩm protease Bacilius subtilis. Nơng nghiệp và phát triển nông thôn, 1: 41-43.
8. Folders J, Tommassen J, Loon LC, Bitter W., (2000). Identification of a chitin-binding protein secreted by
Bacillus subtilis. J Bacteriol, 182:1257–63.

82 ❖ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản

Số 1/2011

9. Ashie, I. N. A., & Lanier, T. C., (2000). Transglutaminases in seafood processing. In N. F. Haard, & B. K.
Simpson (Eds.), Seafood enzymes (pp. 147–190). NewYork, NY: Marcel Dekker.
10. Denner WHB and Gillanders TGE (1996)., The legislative aspects of the use of industrial enzymes in the
manufacture of food and food ingredients. In: Industrial Enzymology, 2nd ed (Edited by Godfrey T and
West S), pp 397-411. The Macmillan Press Ltd, Basingstoke, UK.

11. Diaz-Lopez, M., & Garcia-Carreno, F. L. (2000). Applications of fish and shellfish enzymes in food and
feed products. In N. F. Haard, & B. K. Simpson (Eds.), Seafood enzymes (pp. 571-618). NewYork, NY:
Marcel Dekker.
12. Gupta A., Roy I.,Khare S.K.,Gupta M.N., (2005). Purification and characterization of a solvent stable
protease from Bacillus subtilis PseA. J Chromato A; 1069:155–61.
13. Gildberg, A., Simpson, B. K., & Haard, N. F., (2000). Use of enzymes from marine organisms. In N. F.
Haard, & B. K. Simpson (Eds.), Seafood enzymes (pp. 619–639). NewYork, NY: Marcel Dekker.
14. Hartree, E.E., (1972). Determination of protein; A modification of the Lowry method that gives a linear
photometric response. Anal. Biochem. 48, 422-427.
15. José Luis Barredo, Microbial Enzymes and Biotransformations, Humana Press Inc., 2005.
16. Najafi M.F., Deobagkar D., Deobagkar D., (2005). Potential application of protease isolated from Bacillus
subtilis PD100. Electron J Biotechnol; 8(2) [online].
17. Rajesh K. Patel, Mital S. Dodia, Rupal H. Joshi, Satya P. Singh, (2006). Purification and characterization
of alkaline protease from a newly isolated haloalkaliphilic Bacillus sp. Process Biochemistry 41, (2006)
2002–2009.
18. Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe E.M., Holt J.G., (1986). Bergey’smanual of systematic bacteriology.
Baltimore: Williams & Wilkins.
19. Stefansson, G., etal. (1990)., Application of enzymes for fish processing in Iceland—present and future
aspects. In Voigt M. N et al., Advances in fisheries technology for increased profitability (pp. 237–250).
Lancaster, PA: Technomic Publication.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ❖ 83