Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản

Số 3/2013

THÔNG BÁO KHOA HỌC

ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH NHIỄM VIRUT LAEM SINGH BẰNG KỸ THUẬT
RT-PCR TRÊN TÔM SÚ NUÔI (Penaeus monodon) Ở KHÁNH HÒA
SURVEY ON LAEM SINGH VIRUS IN FARMED BLACK TIGER SHIRMP
(Penaeus monodon) IN KHANH HOA PROVINCE USING RT-PCR
Đặng Thúy Bình1, Nguyễn Viết Dũng2, Nguyễn Thị Anh Thư3, Văn Hồng Cầm4
Ngày nhận bài: 10/01/2013; Ngày phản biện thông qua: 20/5/2013; Ngày duyệt đăng: 10/9/2013

TĨM TẮT
Trong nghiên cứu này chúng tơi sử dụng phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase chain reaction)
để khảo sát tình hình nhiễm virut Laem-Singh (LSNV) trên tơm sú giống và thương phẩm tại địa bàn tỉnh Khánh Hòa.
13 mẫu (16,25%) trong tổng số 80 mẫu tôm (thu ngẫu nhiên từ 11/2011 - 5/2012 tại các chợ, các trại ni tơm ở khu vực
huyện Vạn Ninh, Ninh Hịa, Cam Ranh và Nha Trang - tỉnh Khánh Hòa) được xác định nhiễm LSNV. Trong đó, tơm sú
thương phẩm có dấu hiệu chậm lớn nhiễm LSNV là 36,67% (11/30). 8% (2/25) tơm sú thương phẩm nhiễm LSNV tuy bề
ngồi khơng có biểu hiện chậm lớn. Nghiên cứu chưa phát hiện có sự hiện diện của LSNV trên tôm sú giống (0 /25 mẫu
tơm giống).
Từ khóa: RT-PCR, LSNV, MSGS, Penaeus monodon, Khánh Hòa

ABSTRACT
In this research, RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase chain reaction) method was used to identify the
proportion of Laem-Singh virus infection in post-larvae and marketed shrimp in Khanh Hoa province. A survey of 80
P. monodon collected from 11/2011 to 5/2012 from markets, farms around Van Ninh, Ninh Hoa, Cam Ranh and Nha
Trang (all belonged to Khanh Hoa Province) revealed that 16.25% (13 of 80) was infected by Laem-Singh virus (LSNV).
Among these, 36,67% market shrimps with slow growth syndrome gave positive result with LSNV. In addition, 8% (2/25)
commercial shrimp got LSNV infection without signal associated with disease or slow growth. There was no evidence of
LSNV infection in post-larvae.

Keywords: RT-PCR, LSNV, MSGS, Penaeus monodon, Khánh Hòa

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Virus Laem-Singh (LSNV) lần đầu tiên được
phát hiện trên tơm sú Penaeus monodon có dấu hiệu
chậm lớn ở tỉnh Laem Singh, Thái Lan năm 2003.
Sittidilokratna và cs (2009) điều tra tình hình nhiễm
LSNV trên tơm sú thu từ 1998 đến 2007. Kết quả
cho thấy có đến 46/81 mẫu bị nhiễm LSNV ở Andhra
Prades Ấn Độ; ở Malaysia và Indonesia chỉ có 1/6
mẫu nhiễm LSNV; ở Việt Nam là 2/6 và ở Thái Lan
39/40 mẫu tôm sú nuôi nhiễm LSNV. Theo Nguyễn
Viết Dũng và cs (2011) tần xuất bắt gặp sự hiện diện
của LSNV trên các mẫu tơm có biểu hiện chậm lớn ở

các mẫu thu tại tỉnh Sóc Trăng (7/2008) và Kiên Giang
(3/2008) là rất cao chiếm 63% số mẫu phân tích.
Tơm bệnh MSGS có 3 trong số 5 đặc điểm sau:
tôm tối sậm màu bất thường, kém ăn, hoạt động
yếu; có đốm vàng sáng bất thường trên thân tơm,
đốt bụng tơm có dạng thân đốt tre; râu tôm dễ bị đứt
gãy; tốc độ tăng trưởng trung bình < 0,1g/ngày trong
4 tháng làm kéo dài vụ thu hoạch ao tôm nuôi .
Nghiên cứu này áp dụng phương pháp RT-PCR
một bước để xác định sự hiện diện của LSNV trên
tơm sú ở khu vực tỉnh Khánh Hịa nhằm bước đầu
khảo sát tình hình nhiễm LSNV trên địa bàn tỉnh.

TS. Đặng Thuý Bình, 2 Nguyễn Viết Dũng, 3 Nguyễn Thị Anh Thư, 4 Văn Hồng Cầm: Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường Trường Đại học Nha Trang
1


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 7


Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng và phương pháp thu mẫu
Mẫu tôm sú (Penaeus monodon) gồm: 25 mẫu
tôm giống, 30 mẫu tơm thương phẩm có dấu hiệu
chậm lớn (Monodon Slow Growth Syndrome MSGS) và 25 mẫu tôm thương phẩm khỏe mạnh
được thu ngẫu nhiên tại các chợ thành phố Nha
Trang, các trại nuôi ở khu vực huyện Vạn Ninh,
Ninh Hòa và thành phố Cam Ranh - tỉnh Khánh Hịa,
từ tháng 11/2011 tới tháng 5/2012. Mẫu tơm được
thu sống và bảo quản trong thùng đá, vận chuyển
nhanh về phòng thí nghiệm và bảo quản ở -400C.
Tơm có dấu hiệu chậm lớn được thu ở giai đoạn
từ 16 đến 104 ngày tuổi (trọng lượng trung bình
5,5 ± 0,3g và chiều dài trung bình 5,5 ± 0,5cm,
n = 30). Những mẫu tơm này đều có dấu hiệu giảm
lượng tiêu thụ thức ăn, bơi vào bờ bất thường.
Tơm phát triển bình thường cũng được thu ở giai
đoạn từ 16 đến 104 ngày tuổi (trọng lượng trung bình
6,8 ± 0,3g và chiều dài trung bình 7,4 ± 0,5cm, n = 25).
Mẫu chứng dương LSNV được cung cấp bởi
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 (RIA2).
2. Tách chiết RNA tổng số
RNA tổng số của tôm sú P. monodon được tách
chiết dựa trên phương pháp của Chomczynski và
Sacchi (2011). Mẫu tôm (100-150mg từ mang của

tôm thương phẩm hoặc 30-50 cá thể tôm giống
được nghiền nhuyễn với các tác nhân biến tính
mạnh (Guanidine 14M và phenol). Sau khi đã bổ
sung dung dịch: phenol chloroform, ly tâm để loại bỏ
các thành phần không mong muốn trong mẫu đồng
thời để tách RNA hòa tan trong pha nước ra khỏi pha
phenol. Tiếp đó, RNA được kết tủa bởi isopropanol
và rửa hai lần với ethanol 75%. Cuối cùng hòa
tan RNA với 100µl nước tinh khiết (DEPC-Diethyl
pyrocarbonate). Trước khi tiến hành phản ứng
RT-PCR, dung dịch RNA tổng số được biến tính ở
700C trong 10 phút và làm lạnh nhanh trong đá.
3. Phát hiện virut LSNV bằng phương pháp
RT-PCR
Phản ứng RT-PCR phát hiện virut LSNV được
tiến hành theo Sritunyalucksana và cs (2006) và
được hiệu chỉnh bởi Nguyễn Viết Dũng và cs (2011).
Dung dịch tách chiết ARN đã biến tính được
dùng cho phản ứng RT-PCR một bước để khuếch đại
đoạn gen RdRp (RNA dependent RNA polymerase)
sử dụng cặp mồi 20AF (5’- TTGCCTTCTCCCGAGTGGTC - 3’) và 20AR (5’- CCGGCTGAGGTAGCTGCTTG - 3’) (Sritunyalucksana và cs, 2006).
Phản ứng được tiến hành với tổng thể tích
25µl (gm 2àl khuụn ARN, 35pmol mi mi),

8 ã TRNG I HỌC NHA TRANG

Số 3/2013
đệm Colorless GoTaq® Flexi 1X, 0,2 mM dNTPs,
2mM MgCl2, 5U AMV Reverse trancriptase, 1,25U
Gotaq® Hotstart Polymerase (Promega, Mỹ). Phản

ứng được chạy trên máy luân nhiệt Icycler (Bio-rad)
theo chương trình nhiệt độ: Bước tổng hợp cDNA
tại 440C trong 40 phút; tiếp theo là là bước biến tính
DNA tại 950C trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ tổng
hợp DNA bắt đầu ở 940C trong 40 giây, 600C trong
20 giây, 720C trong 30 giây, cuối cùng là bước kéo
dài tại 720C trong 10 phút.
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di
kiểm tra trên gel agarose 1,5% nhuộm ethidium
bromide. Kết quả được ghi nhận sử dụng hệ thống
ghi ảnh gel tự động Geldoc và phần mềm Quantity
One (Bio-rad).
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
1. Dấu hiệu bệnh lí
Mẫu tơm sú thương phẩm có dấu hiệu chậm
lớn (30 mẫu), trong đó 8/30 có dấu hiệu lỏng vỏ
(LSS - loose shell syndrome); 5/30 mẫu tôm bị bệnh
đốm trắng (WSSV - White Spot Syndrome Virus);
3/30 mẫu tôm bị bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và
cơ quan biểu mô (IHHNV - Infectious Hypodermal
and Hematopoietic Necrosis Virus). Tơm khỏe mạnh
có trọng lượng và chiều dài trung bình lớn hơn tơm
có dấu hiệu chậm lớn (Trọng lượng của tôm khỏe
mạnh: 7,4 ± 0,5cm và trọng lượng của tôm chậm
lớn: 6,8 ± 0,3g, n = 25; Chiều dài của tôm khỏe
mạnh: 5,5 ± 0,5cm và chiều dài của tôm chậm lớn:
5,5 ± 0,3g, n = 30). Dấu hiệu bệnh lý và sự khác biệt
kích thước được mơ tả ở hình 1.

Hình 1. Tơm sú thả nuôi sau 104 ngày được thu từ cùng

một ao nuôi tôm ở xã Vạn Thạnh, huyện Vạn Ninh

A. Tơm khỏe mạnh; B. Tơm có dấu hiệu chậm lớn; C. Tơm có dấu hiệu chậm lớn và
lỏng vỏ


Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản

Số 3/2013

2. Khuếch đại sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR khuếch đại bởi mồi 20AF và 20AR có kích thước 197 bp phù hợp với tính tốn lý thuyết
(hình 2). Kết quả cũng phù hợp với nghiên cứu của Sritunyalucksana và cs (2006) và Nguyễn Viết Dũng và
cs (2011).

Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm của quy trình RT-PCR chẩn đốn bệnh LSNV trên tôm sú
Giếng M: thang chuẩn DNA 100bp (GeneRulerTM); giếng 1, 2: Mẫu dương tính LSNV trên tơm khỏe mạnh; giếng 3, 4: mẫu dương tính LSNV trên tơm MSGS;
giếng 5, 6: mẫu dương tính LSNV trên tơm có dấu hiệu lỏng vỏ; giếng 7, 8: mẫu dương tính LSNV trên tôm bị bệnh đốm trắng; giếng 9, 10: Mẫu dương tính với LSNV trên tơm
bị bệnh IHHNV; giếng 11, 12: Mẫu âm tính trên tơm giống; giếng 13: Đối chứng âm; giếng 14: Đối chứng dương.

3. Tình hình nhiễm LSNV ở Khánh Hịa
Kết quả phân tích cho thấy có 13/80 mẫu tơm sú thương phẩm bị nhiễm virus LSNV, không phát hiện mẫu
tôm giống nhiễm LSNV. Kết quả phân tích tỷ lệ nhiễm trên các mẫu tơm sú thu thập được thể hiện ở bảng 1.
Bảng 1. Kết quả khảo sát nhiễm LSNV mẫu tôm sú giống
và nuôi thương phẩm tại khu vực tỉnh Khánh Hịa
Tơm giống

Mẫu dương
tính


Tơm thương phẩm MSGS

Số mẫu

Tỷ lệ

0/25

0%

Tổng
Kết quả nghiên cứu không phát hiện có sự hiện
diện của LSNV trên tơm giống (0/25 mẫu nghiên
cứu). Ở Việt Nam đã phát hiện ra tôm sú giống bị
nhiễm LSNV chiếm tỷ lệ 1%. Kết quả nghiên cứu
này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Viết Dũng
và cs (2011), điều này cho thấy xác xuất phát hiện
bệnh LSNV trên tôm giống là khá thấp.
Tần suất bắt gặp của virus LSNV trên tơm sú có
dấu hiệu chậm lớn ở khu vực ni tỉnh Khánh Hịa
là 36,67%. Tơm thương phẩm có dấu hiệu chậm lớn
được thu ở các chợ và đìa tại Nha Trang, Ninh Hịa
và Cam Ranh. Trong đó, 3/8 mẫu tơm có dấu hiệu
chậm lớn và lỏng vỏ (LSS); 3/5 mẫu tơm có dấu
hiệu chậm lớn và dương tính với bệnh đốm trắng
(WSSV); và 2/3 mẫu tơm có dấu hiệu chậm lớn và
dương tính với bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ
quan biểu mô (IHHNV) đều phát hiện dương tính
với LSNV.
Ở Thái Lan năm 2007, 39/40 mẫu tơm sú có

dấu hiệu chậm lớn đã được phát hiện có nhiễm
virus LSNV. Ở Việt Nam, 63% mẫu phân tích từ tơm
có dấu hiệu chậm lớn phát hiện có sự hiện diện của
LSNV tại tỉnh Sóc Trăng. Kết quả nghiên cứu của
chúng tôi cho thấy trên các mẫu tơm có dấu hiệu

Số mẫu

11/30

Tơm thương phẩm phát triển
bình thường

Tỷ lệ

Số mẫu

Tỷ lệ

36,67%

2/25

8%

13/80 (16,25%)
chậm lớn ở khu vực trong tỉnh có tỉ lệ nhiễm LSNV
thấp hơn so với mẫu ở Sóc Trăng - Việt Nam và
mẫu ở Thái Lan, tuy nhiên tần suất 36,67% nhiễm
LSNV trên địa bàn tỉnh là một con số đáng báo

động. Nghiên cứu của Prakasha và cs (2007) cũng
phát hiện 3 mẫu dương tính với LSNV có dấu hiệu
lỏng vỏ (LSS); 2 trong 3 mẫu khác dương tính với
LSNV cũng nhiễm virus đốm trắng (WSSV) và virus
gây bệnh còi (MBV). Rõ ràng rằng nhiễm LSNV trên
quần thể tơm có dấu hiệu chậm lớn có tỷ lệ khá
cao, điều này cho thấy có mối quan hệ giữa tơm có
dấu hiệu chậm lớn (MSGS) và nhiễm LSNV, cũng
như tốc độ tăng trưởng chậm có thể ảnh hưởng bởi
các bệnh lý khác (như LSS, WSSV, MBV, IHHNV
hay HPV…).
Các mẫu tơm sú phát triển bình thường trên địa
bàn tỉnh bị nhiễm LSNV là 8%. Sự xuất hiện của
virus LSNV trên cả tơm có dấu hiệu chậm lớn và
tơm phát triển bình thường cũng đã từng được ghi
nhận trước đây. Ở Ấn Độ, tỉ lệ nhiễm virus LSNV
trên các ao ni cơng nghiệp là 5,4% trong 56 mẫu
phân tích ngẫu nhiên. Năm 2007 cũng tại Ấn Độ tỷ
lệ nhiễm LSNV trên tơm khơng có dấu hiệu chậm
lớn đã được ghi nhận cao hơn (56% trong 81 mẫu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 9


Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản
nghiên cứu). Trong khi đó, tỷ lệ nhiễm LSNV trên
các mẫu tơm thu ngẫu nhiên tại khu vực đồng bằng
sông Cửu Long là 10,6%. Kết quả nghiên cứu của
chúng tôi ghi nhận sự hiện diện của virus LSNV
trong hệ thống tôm nuôi ở khu vực tỉnh Khánh Hòa.

Kết quả khảo sát cũng cho thấy tỷ lệ nhiễm
LSNV trên tơm sú có dấu hiệu chậm lớn (36,67%)
cao hơn tơm sú phát triển bình thường (8%). Điều
này chứng tỏ có mối liên hệ giữa virus LSNV và hiện
tượng tôm chậm lớn trên tôm nuôi ở Việt Nam đồng
thời cũng phù hợp với kết luận của Panphut và cs
(2011), virus LSNV là điều kiện cần chứ chưa phải
là điều kiện đủ để gây ra bệnh chậm lớn trên tôm sú.
Do virus LSNV đã được xác định hiện diện trên
tơm sú và có khả năng lây nhiễm ở các lồi giáp xác
quanh khu vực ni (Kumar và cs, 2011) nên có thể
ảnh hưởng đến sự lan truyền đến hệ thống canh

Số 3/2013
tác, mặt khác LSNV liên quan đến bệnh chậm lớn
vì vậy nếu kéo dài thời gian nuôi sẽ làm giảm năng
suất, gây thiệt hại cho người ni vì phải kéo dài
thời gian chăm sóc, phát sinh thêm chi phí thức ăn
và thuốc men cho tơm. Vì vậy, việc áp dụng phương
pháp RT- PCR để giám sát virus LSNV là cần thiết
để nâng cao chất lượng tơm sú tại khu vực tỉnh
Khánh Hịa.
IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Virus LSNV đã hiện diện trong hệ thống nuôi tơm
sú ở tỉnh Khánh Hịa. Tỷ lệ tơm sú ni thương phẩm
có dấu hiệu chậm lớn nhiễm LSNV cao hơn trên tơm
sú phát triển bình thường. Chưa phát hiện tơm giống
nhiễm LSNV. Vì vậy, cần xây dựng hệ thống kiểm
sốt bệnh LSNV để cảnh báo cho người nuôi tôm
nhằm nâng cao chất lượng tôm sú thương phẩm.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1.

Nguyễn Viết Dũng, Trần Thị Phương Tú, Phạm Hùng Vân, Nguyễn Văn Hảo. Phát hiện virus Laem singh bằng kỹ thuật
RT- PCR trên tôm sú nuôi (Penaeus monodon) ở đồng bằng sông Cửu Long. Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, ISSN
0866-7020, 2011: 86-90.

2.

Chomczynski P and Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform
extraction. Analytical Biochemistry, 1987. 162(1): 156-159.

3.

Krishnan P, Makesh M, Chaudhari A, Purushothaman CS and Rajendran KV. Natural host-range and experimental
transmission of Laem-Singh virus (LSNV). Diseases of Aquatic Organisms, 2011. 96(1): 21-27.

4.

Panphut W, Senapin SS, Sriurairatana SS, Withyachumnarnkul B and Flegel TW. A novel integrase-containing element may
interact with Laem-Singh virus (LSNV) to cause slow growth in giant tiger shrimp. BMC Veterinary Research, 2011. 7(1): 18.

5.

Prakasha BK, Ramakrishna RP, Karunasagar I and Karunasagar I. Detection of Laem-Singh virus (LSNV) in cultured
Penaeus monodon from India. Diseases of Aquatic Organisms, 2007. 77(1): 83-86.

6.


Pratoomthai B, Sakaew W, Sriurairatana S, Wongprasert K and Withyachumnarnkul B. Retinopathy in stunted black tiger
shrimp Penaeus monodon and possible association with Laem-Singh virus (LSNV). Aquaculture, 2008. 284(1–4): 53-58.

7.

Pratoomthai B, Wongprasert K, Flegel WT and Withyachumnarnkul B. Infection by Laem-Singh Virus in the fasciculated
zone and organ of Bellonci of the eyes of small Penaeus monodon from Monodon slow-growth syndrome pond.
Asian-Pacific Aquaculture, 2007. 199.

8.

Sittidilokratna N, Dangtip S, Sritunyalucksana K, Babu R, Pradeep B, Mohan CV, Gudkovs N and Walker PJ. Detection of
Laem-Singh virus in cultured Penaeus monodon shrimp from several sites in the Indo-Pacific region. Diseases of Aquatic
Organisms, 2009. 84(3): 195-200.

9.

Sritunyalucksana K, Apisawetakan S, Bono-nat A, Withyachumnarnkul B and Flegel TW. A new RNA virus found in black
tiger shrimp Penaeus monodon from Thailand. Virus Research, 2006. 118(1–2): 31-38.

Tiếng Anh

10 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG