DE TAI THU Y

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (177.26 KB, 15 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm não Nhật Bản (VNNB) là một bệnh nhiễm trùng cấp tính do một loại siêu vi
trùng thuộc nhóm Arbovirus có ái tính với tế bào thần kinh. Virus lây truyền qua người
nhờ trung gian của loại côn trùng là muỗi. Bệnh có thể xảy ra rải rác hay thành dịch.

Tùy theo mức độ và vị trí bị tổn thương tại hệ thần kinh trung ương, lâm sàng sẽ
có biểu hiện triệu chứng của nơi bị xâm phạm như: viêm não, viêm màng não, viêm
sừng trước tủy sống hoặc bệnh cảnh phối hợp: viêm màng não, viêm não, màng não tủy
sống. Heo là động vật cảm nhiễm cao nhất (so với các lồi động vật có vú và chim),
đóng vai trò quan trọng trong tàng trữ và truyền mầm bệnh cho người và nhiều lồi
động vật khác ( Võ Cơng Khanh.2008)

Trên lồi heo, virus thường khơng gây ra triệu chứng mà chỉ nhiễm trùng thầm
lặng, trừ những trường hợp nặng : Trên heo nái: Sẩy thai, heo con sinh ra chết ( đôi khi
thai khô). Trên heo nọc : Giảm hoặc mất tính hăng, giảm lượng tinh trùng (Trần Thanh
Phong .1996)

Trên người, bệnh viêm não NB thường xảy ra ở trẻ em, virus tác động đến hệ thần
kinh trung ương với những biểu hiện : co giật , gây viêm não, gây tử vong cao, hoặc
dẫn đến tàn tật suốt đời ( Võ Công Khanh.2008)

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

diện và tỷ lệ nhiễm virus VNNB ở heo thịt trên địa bàn huyện Cần Đước , tỉnh Long An.
Được sự phân công của trường Đại Học Nông Lâm TPHCM, khoa chăn nuôi thú y,
cùng với sự hướng dẫn của thầy Lê Anh Phụng, chúng tôi tiến hành đề tài “ Khảo sát
tình hình nhiễm virus viêm não Nhật Bản trên heo nuôi thịt tại địa bàn huyện Cần Đước –
Tỉnh Long An ”

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU
1.2.1 Mục đích

Điều tra tỷ lệ nhiễm và những yếu tố liên quan đến tỷ lệ nhiễm virus viêm não
Nhật Bản trên heo thịt tại địa bàn huyện Cần Đước, nhằm để làm cơ sở cho việc đề xuất
một số biện pháp phòng bệnh

1.2.2 Yêu cầu

Dùng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) để tìm kháng thể chống lại virus
VNNB trên heo thịt của hộ chăn nuôi và heo trang trại. Từ đó khảo sát một số yếu tố
ảnh hưởng lên tình trạng nhiễm virus VNNB của heo thịt tại địa bàn khảo sát

Xác định hiệu giá kháng thể của các mẫu huyết thanh dương tính.

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM

2.1.1Thời gian : từ tháng 12/ 2010 đến tháng 3/2011
2.1.2 Địa điểm

Địa điểm lấy mẫu các xã: Tân Trạch, Phước Vân, thuộc huyện Cần Đước, tỉnh
Long An

Địa điểm xét nghiệm mẫu : Phịng thí nghiệm vi sinh, khoa chăn nuôi Thú Y
trường Đại Học Nơng Lâm TPHCM

2.2 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM

2.2.1 Mẫu khảo sát

Huyết thanh heo thịt của 2 nhóm đối tượng trại chăn nuôi và hộ chăn nuôi
Huyết thanh heo thịt từ 2-3 tháng, 4-5 tháng và trên 5 tháng

2.2.2 Hồng cầu ngỗng

Ta chọn ngỗng đực trắng ( ngỗng thuần hay không bị lai ) đã trưởng thành không
trong tình trạng thay lơng

2.2.3 Kháng ngun viêm não Nhật Bản

Là kháng nguyên chết, được chiết với acetone- ether từ não chuột được tiêm virus.
Kháng nguyên này thuộc chủng Nakayama được viện Pasteur TPHCM cung cấp

2.2.4 Hóa chất và dụng cụ

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

Dung dịch ACD ( acid citrat dextrose )
Dung dich DGV ( dextrose gelatin veronal )

Kaolin 25% . trộn Kaolin với nước cất theo tỉ lệ 1:3
Cồn sát trùng 70 độ, chất tẩy rửa

Dụng cụ: máy li tâm, máy lắc, tủ lạnh , thùng đựng đá, ống nghiệm , ống
eppendorf, bơng gịn, nhãn dán mẫu, syringe và kim , micropipet, vĩ 96 giếng

2.3 Nội dung khảo sát

Thu thập mẫu huyết thanh heo thịt từ các hộ chăn nuôi và trại chăn ni, trên địa
bàn huyện Cần Đước. Sau đó dùng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) phát

hiện kháng thể trên heo bị nhiễm

So sánh tỉ lệ nhiễm theo tuổi của heo thịt

So sánh tỉ lệ nhiễm của heo hộ chăn nuôi và trại chăn nuôi
So sánh tỉ lệ nhiễm trên heo ở địa bàn các xã

Hiệu giá kháng thể kháng virus VNNB của các mẫu huyết thanh heo thịt theo các
hạng tuổi

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Bố trí lấy mẫu huyết thanh

Mẫu huyết thanh heo được lấy từ các hộ chăn nuôi và trại chăn nuôi thuộc địa bàn
xã: Tân Trạch, Phước Vân.

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

Hộ chăn nuôi: chọn ngẫu nhiên 30 hộ cho mỗi xã trên danh sách theo thứ tự abc,
một hộ lấy 1 mẫu huyết thanh

Bảng2.1 . Bố trí lấy mẫu huyết thanh heo thịt
S

TT Xã

Hô chăn nuôi Trại chăn nuôi Tổng cộng
2-3

tháng

4-5
tháng

Trên
5tháng

2-3
tháng

4-5
tháng

Trên
5tháng

1 Tân Trạch 10 10 10 10 10 10 60

2 PhướcVân 10 10 10 10 10 10 60

Tổng 20 20 20 20 20 20 120

2.4.2 Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu

*Cách lẫy mẫu

Lấy máu ở tĩnh mạch tai, số lượng lấy từ 2-3ml

Chắt lấy phần huyết thanh khoảng 1ml cho vào ống eppendort.
Ghi ký hiệu mẫu và thông tin mẫu vào sổ theo dõi.

* Bảo quản mẫu

Bảo quản mẫu ở nhiệt độ 40C – 80C cho đến khi xét nghiệm

Mẫu huyết thanh đạt yêu cầu là mẫu không bị dung huyết.

2.4.3 Các bước chuẩn bị xét nghiệm

2.4.3.1 Chuẩn bị hồng cầu ngỗng

Lấy máu ngỗng theo tỷ lệ 1,5ml dung dịch ACD (acid citrat dextrose) 8,5ml máu
ngỗng. Rửa hồng cầu 04 lần trong dung dịch DGV (dextrose gelation veronal) theo tỷ lệ
1/3. Mỗi lần rửa ly tâm 2500 vòng/ phút, thời gian 10 phút, chắt bỏ nước trong.

</div>
(6)<div class='page_container' data-page=6>

Rửa lần 2, 3, 4: Thể tích DGV gấp 3 lần thể tích máu cịn lại sau mỗi lần rửa. Sau
lần rửa 4, xác định thể tích hồng cầu bằng phương pháp Hematocrit.

Pha loãng hồng cầu thành huyễn dịch 8% bằng dung dịch DGV, bảo quản ở 40C.

Khi sử dụng từ huyễn dịch hồng cầu 8% sẽ được pha lỗng 1/24 với dung dịch VAD
(virus adjusting diluent) có pH: 6,2 sẽ có huyễn dịch hồng cầu 0,33% dùng trong phản
ứng HI (Haemagglutination Inhibition).

2.4.3.2 Xử lý huyết thanh

Trước khi làm phản ứng phải xử lý huyết thanh để loại bỏ chất kìm hãm gây
ngưng kết hồng cầu khơng đặc hiệu.

* Hấp thụ với Kaolin

Lấy huyết thanh trộn với dung dịch Borat pH = 9 và dung dịch Kaolin 25% theo tỷ
lệ 1:4 :5

Lắc kỹ sau mỗi 5 phút (lắc 2 – 3 lần), để tiếp xúc ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
Đem ly tâm 2.500 vòng/phút – trong 10 phút, chiết lấy huyết thanh bên trên. Bảo quản
trong ngăn mát tủ lạnh.

(Huyết thanh sau khi xử lý có độ pha lỗng 1/10).

* Hấp thụ với hồng cầu

Cho 1ml huyết thanh đã xử lý với Kaolin vào ống nghiệm, để trong nước đá tan,
cho thêm 1 giọt hồng cầu đặc (50l), để tiếp xúc 20 phút, lắc nhẹ sau mỗi 5 phút.

Ly tâm 2500 vòng/ phút – trong 10 phút.
Chiết lấy huyết thanh và bảo quản ở 40C.

2.4.4 Chuẩn độ kháng nguyên ( phản ứng HA: Haemagglutination ).

2.4.4.1Mục đích

</div>
(7)<div class='page_container' data-page=7>

2.4.4.2Nguyên lý

Virus VNNB có khả năng gây ngưng kết hồng cầu nhờ các phân tử enzym
haemagglutinin (H). Trong hỗn dịch có chứa hồng cầu, nếu có sự hiện diện của virus
này, ta sẽ quan sát thấy hiện tượng hồng cầu bị ngưng kết. Trường hợp ngược lại thì
hồng cầu sẽ tự lắng xuống và tạo nên hiện tượng đóng nút. Phản ứng ngưng kết hồng
cầu (HA) được dùng để chuẩn độ virus có khả năng gây ngưng kết hồng cầu và tìm ra
độ pha loãng của huyễn dịch virus dùng để thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng
cầu (HI).

* các thành phần tham gia phản ứng
Dung dịch Borat pH : 9

Kháng nguyên virus ( chủng Nakayama)
Huyễn dịch hồng cầu 0,33%

2.4.4.3phương pháp thực hiện

Cho 50µl dung dịch Borat pH :9 vào vĩ nhựa 96 giếng có đáy hình chữ U, từ giếng
thứ nhất đến giếng thứ 12

Cho 50µl dung dịch kháng nguyên vào giếng thứ nhất, pha loãng bậc 2 trong dung
dịch Borat pH : 9 từ giếng thứ nhất đến giếng thứ 11. Bỏ di 50µl ở giếng thứ 11. Giếng
thứ 12 dùng làm đối chứng

Cho 50µl huyễn dịch hồng cầu pha loãng 0,33% (từ huyễn dịch hồng cầu 8% trong
dung dịch VAD) vào tất cả các giếng (1- 12) và để ở nhiệt độ phòng 30 phút, sau đó đọc
kết quả.

2.4.4.4 Đọc kết quả

Dương tính ++++ : hồng cầu tạo một lớp mỏng che kín đáy giếng

</div>
(8)<div class='page_container' data-page=8>

Dương tính ++ : đại đa số hồng cầu tụ lại đáy giếng thành cụm, xung quanh có một
ít hồng cầu ngưng kết lấm tấm.

Hiệu giá ngưng kết kháng nguyên là độ pha loãng cuối cùng của kháng nguyên
còn khả năng ngưng kết ở mức độ “++++” hay “ +++”. Ở độ pha loãng này, ta gọi là 1
đơn vị ngưng kết hồng cầu (1 đơn vị HA).

Bảng 2.2 Cách thực hiện phản ứng HA 
Giếng

Thành phần

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Dung dịch

Boat pH: 9 (l) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
KN đặc (l) cho

vào giếng 1 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

Độ pha loãng

của KN 1/2 1/4 1/8 … … … …

1/
2048
HC ngỗng

0,33% (l) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

Trộn đều. Để nhiệt độ phòng trong 30 phút.

( KN : kháng nguyên; HC : hồng cầu)

2.4.5 Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI: Haenagglutination Inhibition)

2.4.5.1 Mục đích

Tìm kháng thể kháng virus VNNB.

Định tính và định lượng hiệu giá kháng thể trong huyết thanh.

</div>
(9)<div class='page_container' data-page=9>

Trong phản ứng HI có sự tham gia của hồng cầu, kháng nguyên virus và kháng thể
đặc hiệu.

Kháng thể đặc hiệu này sẽ kết hợp với virus và làm cho virus không thể gắn với
hồng cầu, hồng cầu tự do sẽ lắng xuống tạo nên hiện tượng đóng nút ( HI dương tính).

Nếu khơng có kháng thể tương ứng với kháng nguyên virus, kháng nguyên sẽ có
phản ứng kết hợp với hồng cầu và gây nên hiện tượng ngưng kết hồng cầu ( HI âm tính)

*Các thành phần tham gia phản ứng HI

Dung dịch Borat có pH: 9

Huyết thanh đã xử lý ( pha loãng 1/10)
Kháng nguyên virus (chủng Nakayama)
Huyễn dịch hồng cầu 0,33%

* Phương pháp thực hiện

Tương tự phản ứng HA, phản ứng HI được tiến hành như sau , hút lấy 25µl dung
dịch Borat pH:9 cho vào mỗi giếng ( từ giếng thứ nhất đến giếng thứ 11 theo hàng
ngang), trên vĩ 96 giếng có đáy hình chữ U. Riêng giếng 12 cho 50µl dung dịch Borat
pH : 9

Kế đến cho 25µl huyết thanh đã xử đã xử lý vào giếng thứ nhất và trộn đều rồi pha
loãng bậc 2 từ giếng thứ nhất đến giếng thứ 9, bỏ đi 25µl từ giếng 9. Cho thêm 25µl
huyết thanh đã xử lý vào giếng thứ 10 để làm đối chứng huyết thanh

Tiếp tục cho 25µl kháng ngun ( có 8 đơn vị HA) vào mỗi giếng từ giếng thứ
nhất đến giếng thứ 9 và vào giếng 11 lắc đều. Giếng thứ 11 dùng làm đối chứng kháng
nguyên

Để tiếp xúc ở nhiệt độ phòng tối thiểu 1 giờ hoặc qua đêm ở 4 độ c

</div>
(10)<div class='page_container' data-page=10>

2.4.5.3 Các giếng đối chứng được thực hiện ( giếng10,11,12)

Đối chứng kháng nguyên : cho 25µl kháng nguyên có ( 8 đơn vị HA), vào giếng
thứ 10 để chứng tỏ kháng ngun có đầy đủ tính gây ngưng kết hồng cầu ngỗng.

Đối chứng huyết thanh: cho 25µl huyết thanh (đã xử lý) vào giếng thứ 11 để chứng
tỏ huyết thanh đã loại hết những chất gây ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu

Đối chứng hồng cầu : Giếng thứ 12 dùng để chứng tỏ hồng cầu còn khả năng lắng tụ tốt
( đống nút), khơng ngưng kết

Tính hiệu giá của phản ứng HI

Tính hiệu giá phản ứng HI: Hiệu giá của phản ứng HI được tính theo độ pha loãng
huyết thanh ở giếng cuối cùng cho kết quả dương tính ( hồng cầu đóng nút)

+ Dương tính giếng 1 tương ứng với hiệu giá 1/20
+ Dương tính giếng 2 tương ứng với hiệu giá 1/40
+ Dương tính giếng 3 tương ứng với hiệu giá 1/80

………..
Dương tính giếng 9 tương ứng với hiệu giá 1/5120

Bảng2.3 Cách thực hiện phản ứng HI

Giế
ng

Thà
nh
phầ
n

Giế
ng
xét
ngh
iệm

</div>
(11)<div class='page_container' data-page=11>

H
T
K
N
H
C

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Dun
g

dịch
Boa
t
pH:
9
(l)

25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50

HT
đã
xử
lý
(pha
loãn
g
1/10
(l)

25 25 25 25 25 25 25 25 25 25

Độ
pha
loãn
g
huy
ết
than
h
1/2

0 1/40 1/80 … … … … …

1/
512
0
KN
pha
8
đơn
vị
HA
(l)

25 25 25 25 25 25 25 25 25 25

</div>
(12)<div class='page_container' data-page=12>

HC
ngỗ
ng
0,33
%
(l)

50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

Để ở 40C trong vòng 1 giờ.

(HT: Huyết thanh, KN: Kháng nguyên virus, HC: Hồng cầu)

2.5 Các chỉ tiêu theo dõi

- Tỷ lệ nhiễm virus VNNB trên heo thịt theo khu vực xã.

- Tỷ lệ nhiễm virus VNNB trên heo thịt của hộ chăn nuôi và của heo trang trại
- Tỷ lệ nhiễm virus VNNB của heo thịt theo nhóm tuổi

- Hiệu giá kháng thể virus VNNB của các mẫu huyết thanh heo thịt

Tỷ lệ nhiễm virus là phần trăm số mẫu đem xét nghiệm có phản ứng ngăn trở

ngưng kết hồng cầu (phản ứng HI) dương tính.

Tỷ lệ
nhiễm ( % )=

Số mẫu có phản ứng HI dương tính x 100
Tổng số mẫu đem xét nghiệm

2.6. Phương pháp xử lý số liệu:

Phần mềm Excel được sử dụng để lập bảng và vẽ biểu đồ so sánh các tỷ lệ bằng
trắc nghiệm X2 (chi-square) thuộc phần mềm Minital

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

</div>
(13)<div class='page_container' data-page=13>

Số mẫu khảo sát Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%)
120

Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm virus VNNB của heo thịt trên từng địa bàn khảo sát

Thôn Tổng số mẫu Số mẫu nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%)

Tân Trạch 60

PhướcVân 60

Tổng 120

Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm virus VNNB trong hộ chăn nuôi và trại chăn ni

Nhóm heo Số mẫu xét nghiệm Số mẫu nhiễm Tỷ lệ %

Hộ chăn nuôi 60

Trại chăn nuôi 60

Bảng 3.4 Tỷ lệ nhiễm virus VNNB theo tháng tuổi heo thịt trong hộ chăn nuôi

Tuổi Số mẫu xét nghiệm Số mẫu nhiễm Tỷ lệ

nhiễm( %)

2-3 tháng 20

4-5 tháng 20

Trên 5 tháng 20

Tổng 30

</div>
(14)<div class='page_container' data-page=14>

Tuổi Số mẫu xét nghiệm Số mẫu nhiễm Tỷ lệ
nhiễm( %)

2-3 tháng 20

4-5 tháng 20

Trên 5 tháng 20

Tổng 60

Bảng 3.6 Hiệu giá kháng thể chống virus VNNB trên heo thịt

Mẫu 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 Tổng

Số mẫu (+)
Tỷ lệ %

Tài liệu tham khảo

1. Nguyễn Văn Hải, 2010. “ Khảo sát tình hình nhiễm virus viêm não Nhật Bản ở heo 
nái và heo thịt”. Khóa luận tốt nghiệp trường Đại Học Nông Lâm TPHCM.

2. Huỳnh Thị Thu Hương, 2002. Điều tra tình hình nhiễm virus viêm não Nhật Bản trên
đàn heo huyện Củ Chi

3. Võ công khanh, 2008. Bệnh VNNB trên người. Trung tâm Bệnh Nhiệt Đới
tp HCM

4. Trần Thanh Phong, 1996. Giao trình bệnh truyền nhiễm do virus trên heo. Tủ sách
trường Đại Học Nông Lâm TPHCM

5. Lê Anh Phụng, Trần Thị Bích Liên, 1999. Giáo trình virus thú y chuyên biệt. Tủ sách
trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM

</div>
(15)<div class='page_container' data-page=15></div>