BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THỊ MỸ DUNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN I
TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT
SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)
Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất
Mã số: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Hướng dẫn khoa học:
TS. CHƯƠNG NGỌC NÃI
PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018

.


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong
bất kỳ cơng trình nghiên cứu khác.

Trần Thị Mỹ Dung

.


MỤC LỤC
Trang
TRANG BÌA PHỤ
LỜI CAM ĐOAN

i

MỤC LỤC

ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

viii

MỞ ĐẦU


1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1. Tổng quan về metronidazol (MET)

3

1.2. Tổng quan về spiramycin I (SPY I)

5

1.3. Tổng quan về các chất dùng làm chất chuẩn nội

7

1.4. Tổng quan về sắc ký lỏng ghép khối phổ

8

1.5. Xử lý mẫu huyết tương

14

1.6. Thẩm định quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học theo US-

17


FDA và EMA
1.7. Một số cơng trình nghiên cứu định lượng metronidazol và spiramycin

24

trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

27

2.1. Đối tượng nghiên cứu

27

2.2. Địa điểm nghiên cứu

27

2.3. Nguyên vật liệu

27

2.4. Phương pháp nghiên cứu

28

2.4.1. Chuẩn bị mẫu

28


2.4.2. Xây dựng quy trình định lượng đồng thời MET và SPY I trong huyết

29

tương người bằng phương pháp LC-MS/MS

.


2.4.3. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời MET VÀ SPY I, IS trong

31

huyết tương người bằng phương pháp LC-MS/MS theo hướng dẫn của USFDA và EMA
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

35

3.1. Khảo sát điều kiện khối phổ

35

3.2. Khảo sát chuẩn nội

37

3.3. Khảo sát điều kiện sắc ký

38


3.4. Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương

45

3.5. Xác định khoảng nồng độ định lượng MET và SPY I trong huyết tương

47

người
3.6. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời MET và SPY I trong huyết

47

tương người bằng phương pháp LC-MS/MS
3.7. Dự thảo quy trình định lượng đồng thời MET và SPY I trong huyết

57

tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS
Chương 4. BÀN LUẬN

60

4.1. Lựa chọn kỹ thuật phân tích để định lượng đồng thời MET và SPY I

60

4.2. Điều kiện sắc ký, thời gian phân tích và lượng mẫu thử

60


4.3. Khảo sát thành phần pha động

62

4.4. Lựa chọn chất chuẩn nội

63

4.5. Quy trình xử lý mẫu, hiệu suất chiết và ảnh hưởng của nền mẫu

64

4.6. Độ nhạy và tính đặc hiệu của phương pháp

65

4.7. Độ ổn định của các chất phân tích

65

4.8. Ảnh hưởng của lượng mẫu tồn dư

66

Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

67

5.1. Kết luận


67

5.2. Kiến nghị

68

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

.


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu,

Từ nguyên

chữ viết tắt
ACN

Acetonitrile

AUC

Area under cover (Diện tích dưới đường cong)

APCI

Atmospheric pressure chemical ionization (Ion hóa hóa học

ở áp suất khí quyển)

AS

Analytical Substance (Chất phân tích)

CE

Collision cell (Buồng va chạm)

FAB

Fast atom bombardment (Bắn phá nhanh nguyên tử)

CI

Chemical Ionization (Ion hóa hóa học)

Cmax

Nồng độ đỉnh

CV

Coefficient of variation (Hệ số phân tán)

ECD

Electron capture detection (Đầu dị cộng kết điện tử)


ESI

Electrospray Ionization (Ion hóa bằng cách phun điện)

FDA

Food and Drug Administration (Cơ quan Quản lý thuốc và Thực phẩm)

FI

Field Ionization (ion hóa trường)

EMA

European Medicines Agency (Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu)

HQC

High Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ cao)

HT

Huyết tương

IS

Internal standard (Chuẩn nội)

IUPAC


International Union of Pure and Applied Chemistry (Hiệp
hội Quốc tế về Hóa học thuần túy và ứng dụng)

LC

Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng)

LC-MS/MS

Liquid Chromatography- Mass Spectrometry/Mass
Spectrometry (Sắc ký lỏng – Khối phổ/Khối phổ)

LLE

Liquid-liquid extraction (Chiết lỏng-lỏng)

LLOQ

Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới)

LQC

Low Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ thấp)

.


MIC

Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)


MQC

Medium Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình)

MS

Mass Spectrometry (Khối phổ)

MRM

Multiple reacting monitoring (Kỹ thuật ghi phổ MRM)

MeOH

Methanol

MF

Matrix effect (Ảnh hưởng nền mẫu)

MET

Metronidazole

ROX

Roxithromycin

PPT


Protein precipitation (Tủa protein)

CV

Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

SIM

Selected Ion Monitoring (Kỹ thuật ghi phổ SIM)

SD

Standard deviation (Độ lệch chuẩn)

SPE

Solid phase extraction (Chiết pha rắn)

SRM

Selected Reaction Monitoring (Kỹ thuật ghi phổ SRM)

SPY I

Spiramycin I

TB

Trung bình


TIN

Tinidazole

Tmax

Thời gian đạt nồng độ đỉnh

t1/2

Thời gian bán thải

ULOQ

Upper Limit of Quantification (Giới hạn định lượng trên)

.


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các thông số dược động học của thuốc đối chứng và thuốc thử

4

Bảng 1.2. Các thơng số dược động học của spiramycin

6


Bảng 1.3. Tóm tắt quy triǹ h xử lý mẫu huyế t tương

16

Bảng 1.4. So sánh hướng dẫn US-FDA 2018 và EMA 2015

23

Bảng 2.1. Chất chuẩn đối chiếu và chuẩn nội được sử dụng trong nghiên cứu

27

Bảng 2.2. Dung mơi và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu

27

Bảng 2.3. Nồng độ lý thuyết các dung dịch chuẩn và dung dịch kiểm tra (QC)

29

Bảng 3.1. Tóm tắt thơng tin khảo sát nội chuẩn

37

Bảng 3.2. So sánh tỷ lệ thu hồi với 2 dung môi tủa protein ở mức nồng độ MQC

47

Bảng 3.3. Nồng độ lý thuyết của các thuốc trong huyết tương


47

Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống (n = 6)

48

Bảng 3.5. Kết quả xác định tính đặc hiệu của phương pháp

49

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

50

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát tính tương thích của phương trình hồi quy

50

và ý nghĩa của các hệ số của phương trình hồi quy
Bảng 3.8. Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác của phương pháp

51

(với MET)
Bảng 3.9. Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác của phương pháp

52

(với SPY I)
Bảng 3.10. Hiệu suất chiết của MET, SPY I và ROX (n = 6)


52

Bảng 3.11. Độ ổn định của MET và SPY I trong dung dịch chuẩn gốc (n = 6)

53

Bảng 3.12. Độ ổn định của MET và SPY I trong huyết tương (n = 6)

54

Bảng 3.13. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu khi phân tích MET và

55

SPY I
Bảng 3.14. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của mẫu tồn dư MET, SPY I và

56

ROX
Bảng 3.15. Kết quả đánh giá độ pha loãng của MET, SPY I trong huyết tương

.

58


DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ
Trang

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của metronidazol

3

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của spiramycin

5

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của roxithromycin

7

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của tinidazol

7

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của carbamazepin

8

Hình 1.6. Sơ đồ cấu tạo của hệ thống HPLC

9

Hình 1.7. Sơ đờ ta ̣o thành ion dương trong kỹ thuật ESI

10

Hình 1.8. Sơ đồ khối của đầu dị khối phổ hai lần tứ cực


11

Hình 1.9. Các chế độ làm việc của MS/MS

12

Hình 1.10. Bộ phận phân tích khối phổ của thiết bị LC-MS/MS 8040

14

Shimadzu
Hình 3.1. Phổ khối của SPY I (A), MET (B), ROX (C) và TIN (D)

36

Hình 3.2. Sắc ký đồ dung dịch MQC với hệ pha động acid formic 0,1% -

37

MeOH (43:57), cột Gemini NX-C18 (100 x 3 mm; 5 µm), nhiệt độ cột
40 oC, thể tích tiêm mẫu 3 µl
Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động 1 (A đến C) và pha động

38

2 (D).
Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động 3 (A), 4 (B), 5 (C) và

39


(D), 6 (E) và 7 (F)
Hình 3.5. Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động có pH 2,5 (A),

40

pH 5 (B), pH 7,5 (C) và pH 8,0 (D)
Hình 3.6. Sắc ký đồ dung dịch MQC với các cột sắc ký khác nhau (nhiệt
độ cột 40 oC). (A) Cột Nucleosil C18 (150 x 4,6 mm; 3 µm). (B) Cột
Nucleosil C8 (150 x 4,6 mm; 5 µm). (C) Cột Gemini NX-C18 (100 x 3,0
mm; 5 µm). (D) Cột Gemini C18 (100 x 4,6 mm; 3 µm). (E) Cột Zorbax
C18 (250 x 4,6 mm; 3 µm). Hệ pha động ACN - amoni format 5 mM pH
7,4 (80:20). Thể tích tiêm mẫu 3 µl

.

42


Hình 3.7. Sắc ký đồ dung dịch MQC với nhiệt độ cột khác nhau.

43

(A) 30 oC, (B) 35 oC, (C) 40 oC. Hệ pha động amoni format 5 mM pH 7,4 ACN (20:80). Thể tích tiêm mẫu 3 µl
Hình 3.8. Sắc ký đồ dung dịch MQC với tốc độ dòng khác nhau.

44

(A) 0,3 ml/phút, (B) 0,4 ml/phút, (C) 0,5 ml/phút
Hình 3.9. Sắc ký đồ dung dịch MET, SPY I và ROX ở mức nồng độ


45

MQC
Hình 3.10. Sắc ký đồ dung dịch MQC với các dung môi tủa protein

45

khác nhau. (A) tủa bằng ACN, (B) tủa bằng MeOH
Hình 3.11. Sắc ký đồ dung dịch MQC với các dung môi tủa protein khác

46

nhau. (A) tủa bằng ACN trong dung dịch NaOH 0,01 N; (B) và (C) tủa bằng
ACN trong dung dịch NaOH 0,1 N; (D) tủa bằng ACN trong dung dịch
NaOH 1 N; (E) tủa bằng ACN trong dung dịch acid formic 1%; (F) tủa bằng
MeOH trong dung dịch acid formic 1%. Hệ pha động amoni format 5 mM
pH 7,4 -ACN (20:80). Nhiệt độ cột 40 oC. Thể tích tiêm mẫu 3 µl
Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (A) và mẫu huyết tương tự tạo

49

có chứa chuẩn ở nồng độ LLOQ (B)
Hình 4.1. Cơng thức cấu tạo của spiramycin I gồm có 3 phân tử đường

.

61


MỞ ĐẦU

Hiện nay dạng thuốc phối hợp metronidazol và spiramycin với liều cố định được sử
dụng phổ biến trong nha khoa để điều trị nhiễm khuẩn răng miệng cấp tính, mạn tính và dự
phịng nhiễm khuẩn tại chỗ sau phẫu thuật nha khoa tại Việt Nam. Ngoài việc sử dụng các
thuốc kháng viêm giảm đau trong điều trị nhiễm trùng răng miệng, kháng sinh cũng có vai
trị quan trọng trong việc diệt vi khuẩn gây bệnh vùng răng miệng như nướu răng, lợi…Các
vi khuẩn gây bệnh vùng răng miệng khá đa dạng, thường bao gồm cả hai loại kỵ khí và
hiếu khí nên sự phối hợp kháng sinh để điều trị là cần thiết. Việc phối hợp metronidazol và
spiramycin nhằm tăng tác dụng điều trị, mở rộng phổ kháng khuẩn, tạo nên tác dụng hiệp
đồng ức chế một số chủng vi khuẩn nhạy cảm, giảm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 30 lần
đối với metronidazol và giảm MIC 10 lần đối với spiramycin [31], cũng như giảm những
tác dụng khơng mong muốn. Spiramycin là một kháng sinh thuộc nhóm macrolid được
phân lập từ Streptomyces ambofaciensand, là một hỗn hợp tự nhiên gồm ba thành phần
spiramycin I, II và III, trong đó hàm lượng spiramycin I trên 85%, spiramycin II và
spiramycin III lần lượt không quá 5% và 10% [27],[32]. Spiramycin I có hoạt tính sinh học
cao nhất trong số ba đồng phân trên [25]. Vì vậy, spiramycin I thường được chọn là chất
đại diện để định lượng spiramycin [5],[9],[32].
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng để định lượng
metronidazol trong dịch sinh học [11],[17],[21],[24],[29],[32],[34],[35],[36] và spiramycin
I [5],[9],[23],[32]. Tuy nhiên, việc nghiên cứu định lượng đồng thời metronidazol và
spiramycin I trong mẫu huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS chỉ có một cơng trình
cơng bố cho đến thời điểm hiện tại [32]. Trong nước, vẫn chưa có cơng trình cơng bố về
phương pháp định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin I trong huyết tương người.
Thị trường Việt Nam hiện nay đang lưu hành dạng bào chế phối hợp metronidazol và
spiramycin với nhiều tên biệt dược khác nhau, được sản xuất trong nước với giá thành rẻ
hơn so với các thuốc ngoại nhập cùng hàm lượng. Tuy nhiên, chế phẩm này chưa được
đánh giá tương đương sinh học so với thuốc gốc. Để đảm bảo chất lượng thuốc sản xuất
trong nước, các thuốc generic cần được chứng minh tính hiệu quả và an tồn trong điều trị
qua thử nghiệm tương đương sinh học với thuốc gốc.

.



2
Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN I TRONG HUYẾT TƯƠNG
NGƯỜI NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC –
MS/MS)” được thực hiện với các mục tiêu sau:
- Xây dựng quy trình định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin I trong huyết tương
người bằng kỹ thuật LC – MS/MS.
- Thẩm định quy trình định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin I trong huyết
tương người bằng kỹ thuật LC – MS/MS theo hướng dẫn của US-FDA và EMA.

.


3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan về metronidazol (MET)

1.1.1 Danh pháp, cấu trúc
- Cấu trúc hóa học:

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của metronidazol
- Danh pháp IUPAC: (Metronidazol là 2-(2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl)-ethanol
[1].
- Công thức phân tử: C6H9N3O3 [1].
- Khối lượng phân tử: 171,2 g/mol [1].
1.1.1. Tính chất lý hóa

- Metronidazol là bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng hoặc gần như trắng, dễ hút ẩm [1].
- Tính chất: khó tan trong nước, aceton, ethanol 96% và methylen clorid [1].
- pKa = 2,5 [12].
- Điểm chảy: 159 - 162 oC [12].
1.1.2. Cơ chế tác dụng và dược động học
1.1.2.1. Cơ chế tác dụng
Metronidazol là một dẫn chất 5-nitro imidazol, có phổ hoạt tính rộng trên động vật nguyên
sinh như amip, Giardia, Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis và trên vi khuẩn
kỵ khí. Trong ký sinh trùng, nhóm 5-nitro của thuốc bị khử thành các chất trung gian độc
với tế bào. Các chất này liên kết với cấu trúc xoắn của phân tử DNA làm vỡ các sợi này và
cuối cùng làm tế bào chết. Nồng độ trung bình có hiệu quả của metronidazol là 8 µg/ml
hoặc thấp hơn đối với hầu hết các động vật nguyên sinh và các vi khuẩn nhạy cảm. Nồng
độ ức chế tối thiểu các chủng nhạy cảm khoảng 0,5 µg/ml [2].
Metronidazol có tác dụng diệt khuẩn trên Bacteroides, Fusobacterium và các vi khuẩn kỵ
khí bắt buộc khác, nhưng khơng có tác dụng trên vi khuẩn hiếu khí. Khi bị nhiễm cả vi
khuẩn hiếu khí và kỵ khí, phải phối hợp metronidazol với các thuốc kháng khuẩn khác [2].

.


4
1.1.2.2. Dược động học
Metronidazol thường hấp thu nhanh và hoàn toàn sau khi uống. Khoảng 80% liều được hấp
thu từ đường tiêu hóa, đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương (Cmax) khoảng 11,5 – 13,0 µg/ml
trong vịng 1-3 giờ sau khi uống liều đơn 500 mg. Khoảng 10 - 20% thuốc liên kết với
protein huyết tương. Metronidazol thâm nhập tốt vào các mô và dịch cơ thể, vào nước bọt
và sữa mẹ. Nồng độ điều trị cũng đạt được trong dịch não tủy. Metronidazol chuyển hóa ở
gan thành các chất chuyển hóa dạng hydroxy và acid, và thải trừ qua nước tiểu một phần
dưới dạng glucuronid [2].
Thời gian bán thải trung bình trong huyết tương khoảng 7 giờ, đối với chất chuyển hóa

hydroxy là 9,5 - 19,2 giờ. Sự bài tiết chủ yếu qua thận, chủ yếu là các chất chuyển hóa
hydroxy và khoảng 14% liều dùng thải trừ qua phân [2].
Các thông số dược động học của metronidazol, thuốc đối chứng Flagyl® 250 mg và thuốc
thử Amin 250 mg [11] được trình bày trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Các thơng số dược động học của thuốc đối chứng và thuốc thử
Thử (TB ± SD)

Đối chứng (TB ± SD)

Cmax (µg/ml)

9,99 ± 1,34

10,61 ± 1,43

Tmax (giờ)

2,17 ± 0,91

2,17 ± 0,86

t1/2(giờ)

9,15 ± 1,84

9,10 ± 0,64

Nồng độ đỉnh của metronidazol và spiramycin sau 2 giờ uống thuốc phối hợp metronidazol
và spiramycin (viên nén Rodogyl® và viên nghiên cứu chứa spiramycin 769.000 UI và
metronidazol 128 mg trên người tình nguyện) lần lượt là 13,5 µg/ml và 1,06 µg/ml [31].

Trên bệnh nhân viêm nha chu, sau 2 giờ uống viên nén Rodogyl® chứa spiramycin 739.000
UI và metronidazol 127,4 mg; nồng độ đỉnh của metronidazol và spiramycin lần lượt là
11,8 µg/ml và 1,8 µg/ml [31].

.


5
1.2. Tổng quan về spiramycin I (SPY I)
1.2.1. Danh pháp, cấu trúc
Cấu trúc hóa học:

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Spiramycin
Thành phần
Spiramycin I
Spiramycin II
Spiramycin III

R
H
COCH3
CO-CH2-CH3

Công thức phân tử
C43H74N2O14
C45H76N2O15
C46H78N2O15

Phân tử lượng
843,1

885,1
899,1

Danh pháp IUPAC: Spiramycin là một kháng sinh nhóm macrolid được tạo ra khi nuôi cấy
các chủng vi khuẩn Streptomyces ambofaciens hoặc thu được bằng các phương pháp khác.
Thành phần chính là (4R,5S,6S,7R,9R,10R, 11E,13E,16R)-6-[[3,6-dideoxy-4-O-(2,6dideoxy-3-C-methyl--L-ribo-hexopyranosyl)-3-(dimethylamino)--Dglucopyranosyl]oxy]-4-hydroxy-5-methoxy-9,16-dimethyl-7-(2-oxoethyl)-10-[[2,3,4,6tetradeoxy-4-(dimethylamino)-D-erythro-hexopyranosyl]oxy]-oxacy-clohexadeca-11,13dien-2-on (spiramycin I). Ngồi ra cịn có spiramycin II (4-O-acetyl spiramycin I) và
spiramycin III (4-O-propanoyl spiramycin I) [1].
1.2.2. Tính chất lý hóa
Spiramycin có dạng bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng, hút ẩm nhẹ, khó tan trong nước, dễ
tan trong aceton, trong ethanol 96% và trong MeOH [1].
pKa = 7,9 [16].
1.2.3. Cơ chế tác dụng và dược dộng học
1.2.3.1. Cơ chế tác dụng
Spiramycin là kháng sinh nhóm macrolid. Thuốc có tác dụng kìm khuẩn trên vi khuẩn đang
phân chia tế bào. Cơ chế tác dụng của thuốc là tác dụng trên các tiểu đơn vị 50S của ribosom

.


6
vi khuẩn và ngăn cản vi khuẩn tổng hợp protein. Ở những nơi có mức kháng thuốc rất thấp,
spiramycin có tác dụng kháng các chủng vi khuẩn Gram dương, các chủng Coccus như
Staphylococcus, Pneumococcus, Meningococcus, phần lớn chủng Gonococcus, 75% chủng
Streptococcus và Enterococcus. Các chủng Bordetella pertussis, Corynebacteria,
Chlamydia, Actinomyces, một số chủng Mycoplasma và Toxoplasma cũng nhạy cảm với
spiramycin. Spiramycin khơng có tác dụng với các vi khuẩn đường ruột Gram âm [2].
1.2.3.2. Dược động học
Spiramycin được hấp thu không hồn tồn ở đường tiêu hóa. Thuốc uống được hấp thu
khoảng 20 - 50% liều sử dụng. Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được trong vòng 2 - 4
giờ sau khi uống và có thể duy trì được 4 đến 6 giờ. Nồng độ đỉnh trong huyết tương sau

khi uống liều 6 triệu đơn vị spiramycin đạt được tương ứng là 3,3 µg/ml sau 1,5 – 3 giờ.
Thức ăn làm giảm khoảng 70% nồng độ tối đa của thuốc trong huyết thanh và làm cho thời
gian đạt đỉnh chậm 2 giờ. Spiramycin phân bố rộng khắp cơ thể. Nửa đời thải trừ trung
bình là 5 - 8 giờ. Thuốc thải trừ chủ yếu ở mật [2].
Các thông số dược động học của spiramycin được thống kê trên 10 người tình nguyện sau
khi uống thuốc thử spiramycin 1,5 g (6 viên Rovanmycin 750000 IU của Rhone-Poulenc
Rorer) [37] được trình bày trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Các thông số dược động học của spiramycin
Thơng số

Thử (TB ± SD)

Cmax (µg/ml)

2,403 ± 1,004

Tmax (giờ)

2,726± 1,234

t1/2(giờ)

6,238 ± 2,811

.


7
1.3. Tổng quan về các chất dùng làm chuẩn nội
1.3.1. Roxithromycin (ROX)

Cấu trúc hóa học:

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của roxithromycin
Danh pháp IUPAC: (3R,4S,5S,6R,7R,9R,11S,12R,13S, 14R)-4-[(2,6-dideoxy-3-Cmethyl-3-O-methyl--L-ribo-hexopyranosyl)oxy]-14-ethyl-7,12,13-trihydroxy-10-[(E)-[(2methoxyethoxy)methoxy]imino]-3,5,7,9,11,13-hexomethyl-6-[[3,4,6-trideoxy-3(dimethylamino)--D-xylo-hexapyranosyl]oxy] oxacyclotetradecan-2-on [1].
Công thức phân tử: C41H76N2O15 [1].
Khối lượng phân tử: 837,0 g/mol [1].
Roxithromycin có dạng bột kết tinh trắng, đa hình, rất khó tan trong nước, dễ tan trong
aceton, ethanol 96% và methylen clorid, khó tan trong dung dịch acid hydrocloric lỗng
[1].
pKa = 9,08 (trong kiềm mạnh); pKa = 12,46 (trong acid mạnh) [38].
1.3.2. Tinidazol (TIN)
- Cấu trúc hóa học:

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của tinidazol

.


8
Danh pháp IUPAC: 1-[2-(ethylsulphonyl)ethyl]-2-methyl-5-nitro-1H-imidazol [1].
Công thức phân tử: C8H13N3O4S [1].
Khối lượng phân tử: 274,3 g/mol [1].
Tindazol có dạng bột kết tinh gần như trắng hoặc vàng nhạt, thực tế không tan trong nước,
tan trong aceton và trong methylen clorid, hơi tan trong MeOH [1].
pKa = 4,7 [39]. Điểm chảy: 127 - 128 °C [39].
1.3.3. Carbamazepin
Cấu trúc hóa học:

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của carbamazepin
Danh pháp IUPAC: 5H-dibenzo[b,f]azepin-5-carboxamid [1].

Cơng thức phân tử: C15H12N2O [1].
Khối lượng phân tử: 236,3 g/mol [1].
Carbamazepin có dạng kết tinh trắng hoặc gần như trắng, đa hình, rất khó tan trong nước,
dễ tan trong dicloromethan, hơi tan trong aceton và ethanol 96% [1].
pKa = 13,9 [40].
1.4. Tổng quan về sắc ký lỏng ghép khối phổ
Sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS là kỹ thuật phân tích kết hợp khả năng tách của sắc
ký lỏng với khả năng phân tích khối lượng của máy khối phổ. LC-MS/ MS đã được ứng
dụng thành cơng trong phân tích các dược chất, nội tiết tố, độc chất và chất chuyển hóa…
LC-MS/MS mang đến những đột phá lớn trong lĩnh vực phân tích định lượng trong dịch
sinh học do tính đặc hiệu, độ nhạy cao và thời gian phân tích nhanh. Ngoài ra, LC-MS/MS
cũng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác như mỹ phẩm, môi trường, thực
phẩm…

.


9
1.4.1. Hệ thống sắc ký lỏng

Cột HPLC

Xử lýdữ liệu
liệu

Bình
chứa pha
động

Bơm

mp

Bộ phận
tiêm mẫu
Đầu dị

Hình 1.6. Sơ đồ cấu tạo của hệ thống HPLC
(Nguồn: />
Sắc ký lỏng là kỹ thuật phân tích phổ biến sử dụng để tách, định tính và định lượng từng
thành phần trong hỗn hợp. Trong kỹ thuật LC, dung môi được đẩy qua cột nhờ bơm với áp
suất 50 đến 350 bar. Cột LC thường có đường kính từ 2,1 mm đến 4,6 mm, chiều dài từ 30
mm đến 250 mm và hạt có kích thước từ 1,5 μm đến 5 μm. Sự phân tách xảy ra dựa trên
sự tương tác của mẫu với pha động và pha tĩnh. Sắc ký lỏng tách các thành phần của mẫu
dựa trên sự khác biệt về tính phân cực của chất đó đối với pha tĩnh hoặc pha động [28].
1.4.2. Đầu dò khối phổ hai lần tứ cực
1.4.2.1. Bộ phận ion hóa phun điện (Electrospray ionization - ESI)
ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất kém bền nhiệt, phân cực,
có khối lượng phân tử lớn. Kỹ thuật ESI có khả năng tạo thành những ion nhiều điện tích
(dương hoă ̣c âm, tùy vào cực điê ̣n thế ) [3].
Trong kỹ thuật ESI, dung dịch phân tích được phun ra khỏi đầu mao quản vào vùng có điện
trường mạnh 3-6 kV ở áp suất khí quyển. Dưới ảnh hưởng của điê ̣n thế cao, ta ̣i đầ u ố ng
dẫn mao quản bằng thép không rỉ (có đường kính 0,1 – 0,5 mm), mẫu được phun thành
những hạt sương nhỏ mang điện tích (dương hay âm) bị bay dung mơi dần nhờ dịng khí
xung quanh. Các giọt sương càng xa đầu phun càng có kích thước nhỏ và bị hút vào bộ
phân tích khối lượng [3],[18].

.


10

Những phân tử nhỏ (khoảng dưới 500 Da) có một nhóm chức có khả năng mang điện tích,
sẽ nhận một proton để tạo thành ion phân tử [M+H]+ khi nguồn ion hoạt động ở chế độ ion
dương hoặc cho một proton để tạo thành ion phân tử [M-H]- khi ở chế độ ion âm. Khi có
sự hiện diện của muối (như muối natri, kali, format, acetat, …), sẽ tạo các ion phân tử như
[M+Na]+, [M+K]+, [M+format]-, [M+acetat]-…Với những phân tử lớn hơn, có thể có nhiều
tâm nhận ion, ESI sẽ tạo ra những ion phân tử mang điện tích như [M+2H]2+, [M+3H]3+
[18].

Bộ phận
phân tích
khối phổ

Dung dịch chất phân tích

Hình 1.7. Sơ đồ ta ̣o thành ion dương trong kỹ thuật ESI
(Nguồn: http:// pubs.acs.org/ac)

1.4.2.2. Bộ phận phân tích khối 2 lần tứ cực
Máy khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS) gồm hai tứ cực được ghép như hình 1.8.

.


11

Hình 1.8. Sơ đồ khối của đầu dị khối phổ hai lần tứ cực
(Nguồn: />
1. Nguồn ion hóa. 2a. Bộ phận phân tích khối thứ nhất (Q1), 2b. Buồng va chạm (Q2) 2c.
Bộ phân phân tích khối thứ hai (Q3). 3. Bộ phận phát hiện (detector)
Máy khối phổ tứ cực hoạt động như một bộ lọc khối. Mỗi tứ cực có một chức năng riêng.

Đầu tiên tứ cực thứ nhất (Q1) chọn khảo sát một ion cụ thể (ion mẹ) cho vào Q2 là buồng
va chạm (collison cell) với dòng khí trơ (argon) để phân mảnh. Các ion trong buồng va
chạm được tăng tốc nhờ áp điện thế, tạo ra năng lượng va chạm. Nhờ va chạm, các ion
được gia tốc cùng với các phân tử khí trơ để tạo phân mảnh nhỏ. Quá trình này được gọi là
phân mảnh do va chạm. Các mảnh ion được tạo ra ở buồng va chạm được phân tích trong
tứ cực thứ hai (Q3) và đến đầu dò [15],[19].
1.4.2.3. Một số kỹ thuật ghi phổ
a. Kỹ thuật full scan
Đây là phương pháp quét dãy khối trong khoảng thời gian nhất định, đầu dò sẽ nhận được
tất cả các mảnh ion để cung cấp phổ khối tất cả ion của các chất trong suốt q trình phân
tích. Việc tìm hợp chất quan tâm có thể khó khăn vì nhiều hợp chất có cùng số khối. Phương
pháp này chủ yếu được sử dụng để phân tích định tính [18].

.


12
b. Kỹ thuật SIM (Selected ion monitoring)
Trong kỹ thuật SIM, đầu dị MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất
cần xác định. Kỹ thuật SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, nên kỹ
thuật SIM được sử dụng để phân tích định lượng [18].
c. Kỹ thuật SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring)
Kỹ thuật SRM: chọn ion mẹ mong muốn (Q1), sau đó phân mảnh ion được chọn đó trong
buồng va chạm, trong các mảnh ion sinh ra, chỉ chọn 1 mảnh ion con cầ n quan tâm (Q3)
và đưa vào đầu dò để phát hiện [41].
Kỹ thuật MRM: có hiệu quả trong việc phân tích vi lượng trong nền mẫu phức tạp, các ion
con cầ n quan tâm thường từ 2 trở lên. Đầ u tiên, chọn ion mẹ trong tứ cực thứ nhất (Q1),
sau đó phân mảnh ion được chọn đó trong buồng va chạm. Trong các mảnh ion sinh ra,
chọn hai hoặc nhiều mảnh ion con cầ n quan tâm (Q3) và đưa vào đầu dị để phát hiện. Kỹ
thuật MRM có độ đặc hiệu và độ nhạy cao nên được sử dụng để phân tích định lượng [15].


Nguồn ion

Q1

Q2

Q3

KHƠNG

Chế độ 1:
MS2-SCAN

m/z
Tất cả các ion
mẹ

Phân mảnh

SCAN
m/z

KHÔNG

Chế độ

Chọn ion
mẹ


Phân mảnh

SIM
Phân mảnh

Chế độ
PRODUCTION

m/z
Chọn tất cả
ion con

SIM
Phân mảnh

Chế độ

m/z
Chọn ion mẹ và
các ion con

SIM
Hình 1.9. Các
chế độ làm việc của MS/MS

(Nguồn: />
.


13

1.4.3. Hệ thống sắc ký lỏng ghép nối với đầu dò khối phổ 2 lần tứ cực (LC-MS/MS)
Viê ̣c ghép hệ thống LC với MS không thể thực hiê ̣n trực tiế p đươ ̣c vì muố n đo khố i phổ
cầ n phải ta ̣o ra các ion ở thể khi,́ trong khi đó sắ c ký lỏng thường đươ ̣c áp du ̣ng cho những
hơ ̣p chấ t it́ bay hơi. Vấ n đề còn phức ta ̣p hơn khi hơ ̣p chấ t ra khỏi cô ̣t sắ c ký đang trong
pha đô ̣ng lỏng, cầ n phải loa ̣i bỏ dung môi trước khi đưa vào máy khố i phổ .
Sự không tương thích cơ bản giữa hai hệ thống là:
- Hệ thống khố i phổ hoa ̣t đô ̣ng trong điề u kiê ̣n chân không sâu, nhiê ̣t đô ̣ cao, chấ t khảo sát
phải ở thể khi,́ vâ ̣n tố c dòng chảy nhỏ (vài µl/phút).
- Hệ thống sắ c ký lỏng hoa ̣t đô ̣ng trong điề u kiê ̣n áp suấ t cao, nhiê ̣t đô ̣ tương đố i thấ p, các
chấ t khảo sát ở thể lỏng, vâ ̣n tố c dòng chảy tương đối lớn (vài trăm microlit/phút) so với
vận tốc dòng chảy của hệ MS.
Để khắ c phu ̣c những khó khăn trên, cầ n phải sử dụng giao diê ̣n (interface) là các bộ phận
ion hóa. Có nhiề u loa ̣i giao diê ̣n khác nhau như: ion hóa bằng bắn phá điện tử (EI), ion hóa
hóa học (CI), ion hóa bắ n phá nhanh nguyên tử dòng liên tu ̣c (CF – FAB), ion hóa phun
điện (ESI), ion hóa hóa ho ̣c ở áp suấ t khí quyể n (APCI), ion hóa trường (FI), … Tùy thuô ̣c
vào khố i lươ ̣ng phân tử và đă ̣c tin
́ h (phân cực hay không phân cực) của các chất phân tích
mà có thể sử du ̣ng hệ thống LC– MS/MS với các giao diê ̣n khác nhau. Giao diện thông
dụng cho hệ thống LC-MS/MS là ESI và APCI [3].
1.4.4. Vài nét về máy Shimadzu LCMS-8040
Thiết bị LC-MS/MS 8040 của hãng Shimadzu bao gồm hai hệ thống sau [42]:
Hệ thống sắc ký lỏng: Dung môi được đưa vào hệ thống bằng bộ phận bơm áp suất cao,
sau đó bộ phận tiêm mẫu tự động có nhiệm vụ hút mẫu cần phân tích cho vào hệ thống,
mẫu được phân tách khi đi qua cột.
Hệ thống MS/MS
- Mẫu được phun và ion hóa dưới áp suất khí quyển bằng nguồn ion hóa. Có hai nguồn ion
hóa: ion hóa phun điện (ESI) và ion hóa hóa học (APCI).
- Mẫu sau khi được ion hóa được đưa qua thanh chọn lọc sơ cấp, sau đó được định hướng
vng góc để phun vào buồng chân không thứ nhất, nơi mẫu tập trung vào phần nón
skimmer bởi bộ phận Qarray nhằm sắp xếp các lớp ion tần số cao.


.


14
- Các hệ bát cực (octapole) sẽ cho các ion được chọn lọc đi qua rồi được sắp xếp trong
Bộ phận
buồng
phunchân
sươngkhông thứ hai và thứ ba.
- Các ion được tách ra theo tỷ lệ số khối/điện tích (m/z) bởi bộ lọc tứ cực với các thanh tứ
cực Q1 và buồng va chạm bằng khí Ar (Q2). Ion con được lọc một lần nữa ở bộ tứ cực Q3.
Sau cùng được phát hiện bởi đầu dị.
- Các tín hiệu ion được khuếch đại bởi bộ khuếch đại, sau đó được ghi nhận tín hiệu và xử
lý bằng phần mềm xử lý dữ liệu Labsolution.

Bộ phận
phun sương
Buồng chân
không

Q1
Chọn ion
mẹ
(parent ion)

Q3
Chọn ion con
(product ion)


Đầu

3
10

Ống mao quản

Ống mao quản

Buồng va chạm
(Collision Cell)

Bộ phận
phát hiện

Hình 1.10. Bộ phận phân tích khối phổ của thiết bị LC-MS/MS 8040 Shimadzu
(Nguồn />
1.5. Xử lý mẫu huyết tương
1.5.1. Một số phương pháp xử lý mẫu huyết tương
Xử lý mẫu là kỹ thuật làm sạch mẫu trước khi phân tích nhằm loại trừ các chất gây nhiễu
hay loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu. Các phương pháp xử lý huyết tương bao gồm phương
pháp tủa protein (PP), chiết lỏng - lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE). Muốn lựa chọn
phương pháp thích hợp để xử lý mẫu huyết tương cần biết tính chất lý hóa và tính phân cực
của chất phân tích. Ngồi ra, tỷ lệ thu hồi của phương pháp phải phù hợp và có độ lặp lại
[33].
1.5.1.1. Phương pháp kết tủa protein (PPT)

Ion
Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu chung, đơn giản để làm sạch mẫu và cắt đứt liên kết của
thuốc với protein. Tủa protein với các tác nhân khác nhau (dung môi hữu cơ, acid mạnh,

muối). Tính tan của protein phụ thuộc vào tương tác với dung dịch nước, tương tác ion với

.

3

3

10


15
muối, lực đẩy tĩnh điện giữa các phân tử mang điện. Tại điểm đẳng điện, protein khơng
mang điện, protein ít tan trong nước; trên điểm đẳng điện, protein tích điện âm; dưới điểm
đẳng điện, protein tích điện dương. PPT là phương pháp nhanh, đơn giản hơn so với phương
pháp chiết lỏng - lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE) [30],[33].
Tủa protein bằng các dung môi hữu cơ như ACN, MeOH, ethanol,... ACN là dung môi
được lựa chọn đầu tiên để tủa protein do có khả năng tủa hồn tồn protein với tỷ lệ dung
môi thấp. MeOH được chọn làm dung môi tủa sau ACN. Tủa bằng các muố i vô cơ như
kem
̃ sulfat 10%, amoni sulfat bão hòa,…các dung dịch acid như acid tricloroacetic 10%
(kl/tt), acid phosphoric 5%... Sau khi ly tâm, dịch ly tâm được lọc, tiêm trực tiếp vào hệ
thống sắc ký hay bốc hơi và hòa tan lại trong pha động trước khi tiêm [30],[33].
1.5.1.2. Phương pháp chiết lỏng - lỏng (LLE)
Chiết lỏng – lỏng là phương pháp dựa trên sự phân bố của chất hòa tan trong hai dung mơi
khơng hỗn hịa vào nhau. Sự phân bố của các chất phụ thuộc vào độ tan của chúng trong
các dung môi khác nhau. Phương pháp chiết lỏng – lỏng sử dụng trong phân tích dịch sinh
học giúp tách các chất phân tích ra khỏi những chất gây nhiễu có trong nền mẫu sinh học.
Chất phân tích được tách ra khỏi mẫu bằng các dung môi hữu cơ sẽ được bay hơi dung
mơi, cắn được hịa tan trong thể tích dung mơi thích hợp (có thể là pha động). Phương pháp

cho khả năng thu hồi tốt nhờ chiết liên tục nhiều lần [33].
1.5.1.3. Phương pháp chiết pha rắn (SPE)
Chiết pha rắn là phương pháp xử lý mẫu được sử dụng rộng rãi nhất trong việc phân tích
các thuốc và các chất chuyển hóa trong dịch sinh học. SPE thường dùng những ống nhựa
nhỏ sử dụng một lần, có chứa chất rắn được nhồi. Có nhiều dạng chất rắn như: chất liên
kết pha đảo, pha thuận, trao đổi ion và chất hấp phụ. Sự hấp phụ dựa trên tương tác giữa
chất phân tích và chất hấp phụ. Chất phân tích sẽ được rửa giải khỏi cột trong khi các tạp
chất được giữ lại trên cột, hoặc chất phân tích được giữ lại trên cột còn tạp chất bị rửa ra
khỏi cột. Cách thứ nhất được lựa chọn khi có một chất phân tích mong muốn có nồng độ
cao trong mẫu, hoặc nhiều chất cần phân tích quan tâm có nồng độ thấp hoặc có nhiều chất
với độ phân cực khác nhau cần được tách ra khỏi hỗn hợp. Cách thứ hai dùng để làm giàu
mẫu trong phân tích vết, nồng độ mẫu thấp. Đối với những nền mẫu phức tạp có thể sử
dụng cả hai phương pháp để tách nhiều chất khác nhau. Ưu điểm của phương pháp chiết

.


16
pha rắn là lượng dung môi hữu cơ sử dụng ít hơn so với chiết lỏng - lỏng. Phương pháp có
độ thu hồi và độ lặp tốt, có thể tự động hóa, tuy nhiên khá đắ t tiề n và tốn kém [33].
1.6. Thẩm định quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học theo US-FDA và
EMA
1.6.1. Các chỉ tiêu thẩm định và mức yêu cầu
1.6.1.1. Tính phù hợp hệ thống
Kiểm tra tính phù hợp hệ thống để đảm bảo các thiết bị có khả năng cho kết quả chính xác
và đáng tin cậy tại thời điểm sử dụng.Tiêu chí chấp nhận: hệ số đối xứng, độ phân giải,
thời gian lưu, tỷ số diện tích pic chất phân tích/chuẩn nội. Sự phù hợp của hệ thống được
đánh giá trước khi phân tích mẫu. Mẫu dùng kiểm tra tính phù hợp với hệ thống phải khác
với mẫu nghiên cứu, mẫu chuẩn đối chiếu và mẫu kiểm tra. Dùng chất chuẩn để kiểm tra
tính phù hợp của hệ thống trước khi tiến hành phân tích [6],[10],[13],[43].

1.6.1.2. Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng có thể phân biệt và xác định chính
xác và đặc hiệu chất phân tích trong nền mẫu gồm nhiều thành phần khác nhau. Để xác
định tính đặc hiệu, tiến hành phân tích các mẫu trắng (huyết tương, nước tiểu hoặc các nền
mẫu sinh học khác) từ ít nhất 6 lơ khác nhau. Mỗi mẫu trắng phải được kiểm tra về sự nhiễu
và tính chọn lọc ở giới hạn định lượng dưới (LLOQ) [13].
Các chất gây nhiễu trong dịch sinh học gồm các chất nội sinh, các chất chuyển hóa, các sản
phẩm phân hủy hay các thuốc dùng đồng thời với thuốc đang nghiên cứu.
Nếu phương pháp định lượng đồng thời nhiều chất phân tích, mỗi chất phân tích phải được
kiểm tra để đảm bảo khơng có sự nhiễm chéo [13].
1.6.1.3. Hiệu suất chiết (tỷ lệ thu hồi)
Hiệu suất chiết của chất phân tích trong quy trình định lượng là đáp ứng của đầu dị ghi
nhận được từ một lượng chất phân tích thêm vào và chiết ra trong nền mẫu dịch sinh học,
được so với đáp ứng của đầu dò ghi nhận nồng độ thực của chất phân tích trong dung mơi
pha mẫu. Lượng thu hồi là hiệu suất chiết của phương pháp phân tích. Tỷ lệ thu hồi của
chất phân tích khơng địi hỏi 100% nhưng khoảng thu hồi của chất phân tích và chuẩn nội
phải ổn định, chính xác và có tính tái lặp [13].

.