.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

LÊ THỊ ĐÀO

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI IRBESARTAN VÀ HYDROCLOROTHIAZID
TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Tp. Hồ Chí Minh – 2019

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

LÊ THỊ ĐÀO

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI IRBESARTAN VÀ HYDROCLOROTHIAZID
TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS

Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất
Mã số: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. CHƯƠNG NGỌC NÃI
PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN

Tp. Hồ Chí Minh – 2019

.


.

LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này được đảm bảo tính trung thực và chưa
từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nghiên cứu khác.

Lê Thị Đào

.



.

Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2017 – 2019
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất – Mã số: 8720210
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI IRBESARTAN VÀ HYDROCLOROTHIAZID
TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS
Lê Thị Đào
Hướng dẫn khoa học: TS. Chương Ngọc Nãi, PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn.
Từ khóa: LC-MS/MS, irbesartan, hydroclorothiazid.
Mở đầu: Phối hợp của irbesartan (IRB) và hydroclorothiazid (HCTZ) được chỉ định trong
điều trị phù nề và tăng huyết áp. Các nghiên cứu lâm sàng về IRB và HCTZ cho rằng sự
kết hợp này có hiệu quả lâm sàng. Cho đến nay, chỉ có một chế phẩm phối hợp IRB và
HCTZ được sản xuất trong nước với giá thành rẻ hơn so với các sản phẩm ngoại nhập. Để
chứng minh hiệu quả điều trị tương đương giữa thuốc generic và thuốc phát minh, cần phải
đánh giá tương đương sinh học in vivo. Kỹ thuật LC-MS/MS có nhiều ưu điểm như độ
nhạy và tính đặc hiệu cao, thời gian phân tích ngắn và giới hạn định lượng các chất thấp
trên các nền mẫu dịch sinh học. Vì vậy, kỹ thuật này đang được áp dụng phổ biến để định
lượng thuốc trong dịch sinh học. Trên thế giới đã có một số cơng trình định lượng đồng
thời IRB và HCTZ trong huyết tương người. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có tác giả nào
trong nước cơng bố cơng trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương
người. Do đó, đề tài này được thực hiện với mục tiêu xây dựng và thẩm định quy trình định
lượng đồng thời irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng kỹ thuật
LC-MS/MS theo hướng dẫn của US-FDA và EMA, góp phần vào việc đánh giá tương
đương sinh học của các chế phẩm chứa IRB và HCTZ.
Đối tượng & Phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: IRB và HCTZ trong các mẫu huyết tương người giả lập.
Phương pháp nghiên cứu: Mẫu huyết tương giả lập chứa các chất phân tích và chuẩn nội

telmisartan được xử lý bằng các phương pháp như kết tủa protein với methanol, acetonitril;
chiết lỏng-lỏng với tert-butyl methyl ether, ethyl acetat và hỗn hợp tert-butyl methyl ether ethyl acetat. Mẫu sau khi xử lý sẽ được định lượng bằng kỹ thuật LC-MS/MS, sử dụng cột
sắc ký pha đảo, pha động methanol và đệm amoni format 5 mM pH 5. Sau cùng, quy trình
định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của US-FDA và EMA.
Kết quả: IRB, HCTZ và chuẩn nội được ion hóa bằng kỹ thuật ESI và được ghi phổ bằng
k4y thuật MRM để thu được các ion phân tử và ion phân mảnh dùng cho định lượng. Quy
trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương người bằng kỹ thuật LCMS/MS đã được xây dựng, sử dụng cột sắc ký Gemini C18 (250 x 2 mm; 5 µm), pha động
methanol và đệm amoni format 5 mM, pH 5 (80:20, tt/tt), tốc độ dòng 0,4 ml/phút. Mẫu
huyết tương giả lập được xử lý bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng với hỗn hợp tert-butyl
methyl ether - ethyl acetat (50:50, tt/tt) cho hiệu suất chiết trên 95%. Quy trình định lượng
đã được thẩm định đạt yêu cầu chung của một quy trình phân tích thuốc trong dịch sinh
học.
Kết luận: Đề tài đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong
huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác
cao. Quy trình có thể được ứng dụng để đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học
của các chế phẩm chứa IRB và HCTZ.

.


.i

Master’s Thesis – Academic course: 2017 – 2019
Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210
DEVELOPMENT OF LC-MS/MS METHOD FOR
SIMULTANEOUS DETERMINATION OF IRBESARTAN AND
HYDROCHLOROTHIAZIDE IN HUMAN PLASMA
Le Thi Dao
Supervisor: Dr. Chuong Ngoc Nai, Assoc. Prof. Dr. Nguyen Duc Tuan
Keywords: LC-MS/MS, irbesartan, hydrochlorothiazide.

Introduction: Combination of irbesartan (IBR) and hydrochlorothiazide (HCTZ) is
indicated in the treatment of edema and hypertension. Clinical studies on IRB and HCTZ
suggest that this combination is effective. So far, there has been only one formulation of
IRB and HCTZ combination is locally produced with a competitive price than one of
imported products. In order to prove clinically equivalent efficacy between generic and
patent drugs, the in vivo bioequivalence study is mandatory. The LC-MS/MS technique has
several advantages such as high sensitivity and specificity, short analysis time and low
limit of quantitation. This technique is being applied commonly to quantify active
ingredients in biological fluids. There have been several simultaneous quantitative studies
of IRB and HCTZ in human plasma until now. However, no local authors have published
the simultaneous quantitative studies of IRB and HCTZ in human plasma, so far.
Therefore, this study has been performed with the aim of development and validation of
the simultaneous quantitative procedure of irbesartan and hydrochlorothiazide in human
plasma by LC-MS/MS in accordance with the guidelines of US-FDA and EMA,
contributing to the in vivo bioequivalence study of pharmaceuticals containing IRB and
HCTZ.
Materials and methods
Object of study: IRB and HCTZ spiked into blank human plasma samples.
Methods of study: Blank human plasma samples containing the analytes and telmisartan as
internal standard, were treated by protein precipitation with methanol, acetonitrile; liquidliquid extraction with tert-butyl methyl ether, ethyl acetate and mixture of tert-butyl methyl
ether and ethyl acetate. The treated samples were quantified by LC-MS/MS, using reverse
phase column, mobile phase containing methanol and ammonium formate buffer 5 mM
with pH 5. Finally, the quantitative procedure was validated on the basis of FDA and EMA
guidelines on bioanalytical method validation.
Results: IRB, HCTZ and internal standard were ionized using ESI source and detected by
multiple reaction monitoring (MRM) mode to obtain molecular ions and fragment ions for
quantification. The procedure for simultaneous assay IRB and HCTZ in human plasma by
LC-MS/MS was developed, using Gemini C18 column (250 x 2 mm; 5 µm), mobile phase
containing methanol and ammonium formate buffer 5 mM with pH 5 (80:20, v/v), and
flow rate of 0.4 ml/min. The human plasma samples were treated by liquid-liquid

extraction with a mixture of tert-butyl methyl ether and ethyl acetate (50:50, v/v), which
gave the recovery above 95%. The procedure was successfully validated with general
requirements for a bioanalytical procedure.
Conclusion: The procedure for simultaneous assay of IRB and HCTZ in human plasma by
LC-MS/MS was developed which is high sensitivity, specificity and accuracy. The
procedure can be applied for in vivo bioequivalence study of combination medical products
containing IBR and HCTZ.

.


.

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................ vi
DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ ........................................................x
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1.

Tổng quan về irbesartan ...................................................................................3

1.2.

Tổng quan về hydroclorothiazid ......................................................................4

1.3.


Tổng quan về chuẩn nội ...................................................................................6

1.4.

Tổng quan về phương pháp xử lý mẫu huyết tương ........................................8

1.5.

Thẩm định quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học theo US-FDA và
EMA ...............................................................................................................11

1.6.

Một số cơng trình nghiên cứu định lượng irbesartan và hydroclorothiazid
trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng – khối phổ ....................18

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................24
2.1.

Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................24

2.2.

Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................24

2.3.

Nguyên vật liệu ..............................................................................................24

2.4.


Phương pháp nghiên cứu ................................................................................26

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................................36
3.1.

Khảo sát điều kiện khối phổ ...........................................................................36

3.2.

Khảo sát chuẩn nội .........................................................................................38

3.3.

Khảo sát điều kiện sắc ký ...............................................................................38

3.4.

Khảo sát quy trình xử lý mẫu .........................................................................46

3.5.

Xác định khoảng nồng độ định lượng các thuốc ............................................52

.


.

3.6.


Thẩm định quy trình định lượng đồng thời irbesartan và hydroclorothiazid
trong huyết tương người bằng LC-MS/MS theo hướng dẫn của US-FDA và
EMA ...............................................................................................................53

3.7.

Dự thảo quy trình định lượng đồng thời irbesartan và hydroclorothiazid trong
huyết tương người bằng LC-MS/MS .............................................................62

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .......................................................................................66
4.1.

Lựa chọn kỹ thuật phân tích ...........................................................................66

4.2.

Điều kiện khối phổ .........................................................................................66

4.3.

Điều kiện sắc ký .............................................................................................67

4.4.

Lựa chọn chuẩn nội ........................................................................................67

4.5.

Quy trình xử lý mẫu .......................................................................................68


4.6.

Kết quả thẩm định ..........................................................................................69

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................71
5.1.

Kết luận ..........................................................................................................71

5.2.

Kiến nghị ........................................................................................................72

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

.


i.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt, Từ nguyên
Ký hiệu
AF

Acid formic

AS


Analytical standard (Chất chuẩn phân tích)

ACN

Acetonitrile

Cmax

Nồng độ đỉnh

CC

Calibration curve (Đường chuẩn)

CV

Coefficient of variation (Hệ số phân tán)

EMA

European Medicines Agency (Cơ quan Quản lý Dược phẩm Châu
Âu)

ESI

Electrospray ionization (Ion hóa phun điện)

US-FDA


The United States Food and Drug Administration (Cơ quan Quản lý
Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ)

HCTZ

Hydroclorothiazid

HPLC

High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng
cao)

HQC

High quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ cao)

HT

Huyết tương

IRB

Irbesartan

IS

Internal standard (Chuẩn nội)

LC-MS


LC-MS/MS

Liquid chromatography – Mass spectrometry (Sắc ký lỏng - Khối
phổ)
Liquid chromatography – Tandem Mass spectrometry (Sắc ký lỏng
- Khối phổ/Khối phổ)

LLOQ

Lower limit of quantification (Giới hạn định lượng dưới)

LOD

Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

.


.i

LOQ

Limit of quantification (Giới hạn định lượng)

LQC

Low quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ thấp)

MF


Matrix factor (Yếu tố nền mẫu)

MRM

Multiple reaction monitoring

MQC

Medium quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình)

QC

Quality control (Mẫu kiểm tra)

RSD

Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

S

Area (Diện tích pic)

S/N

Signal / Noise (Tín hiệu / Nhiễu)

TB

Trung bình


TLTK

Tài liệu tham khảo

tR

Retention time (Thời gian lưu)

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

UHPLC-

Ultra high performance liquid chromatography – Tandem Mass

MS/MS

spectrometry (Sắc ký lỏng siêu hiệu năng – Khối phổ/Khối phổ)

ULOQ

Upper limit of quantitation (Giới hạn định lượng trên)

UPLC-

Ultra performance liquid chromatography – Tandem Mass

MS/MS


spectrometry (Sắc ký lỏng siêu hiệu năng – Khối phổ/Khối phổ).

.


.
ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Một số quy trình xử lý mẫu huyết tương người .......................................10
Bảng 1.2. Một số công trình nghiên cứu định lượng irbesartan và hydroclorothiazid
trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng - khối phổ ................................18
Bảng 1.3. Nồng độ đỉnh (Cmax) và khoảng nồng độ tuyến tính của irbesartan và
hydroclorothiazid trong huyết tương người ..............................................................19
Bảng 2.1. Chất chuẩn và chuẩn nội được sử dụng trong nghiên cứu .......................24
Bảng 2.2. Dung mơi và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu ...........................24
Bảng 2.3. Các mẫu huyết tương trắng sử dụng trong nghiên cứu ............................25
Bảng 2.4. Một số thiết bị phân tích sử dụng trong nghiên cứu ................................25
Bảng 2.5. Khoảng nồng độ tuyến tính dự kiến và các mức nồng độ của mẫu kiểm
tra của IRB và HCTZ trong huyết tương người ........................................................31
Bảng 2.6. Nồng độ lý thuyết của các thuốc trong huyết tương người ......................32
Bảng 3.1. Kết quả tối ưu hóa thế phân mảnh của IRB, HCTZ, telmisartan, losartan,
valsartan ....................................................................................................................36
Bảng 3.2. Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của telmisartan, losartan, valsartan
ở cùng nồng độ 1 µg/mL ...........................................................................................38
Bảng 3.3. Các thơng số sắc ký của các chất phân tích theo nhiệt độ cột..................43
Bảng 3.4. Các thơng số sắc ký của các chất phân tích theo tốc độ dịng..................44
Bảng 3.5. Các thơng số sắc ký của các chất phân tích theo thể tích tiêm mẫu.........45
Bảng 3.6. Hiệu suất chiết dược chất và chuẩn nội từ huyết tương với 2 dung môi tủa

protein (n=6)..............................................................................................................47
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=6) ....................................................48
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát nồng độ natri hydroxyd kiềm hóa huyết tương (n=6) ..49
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát nồng độ acid phosphoric acid hóa huyết tương (n=6) ..50
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát thể tích acid phosphoric acid hóa huyết tương (n=6) .51
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát số lần chiết (n=6) ........................................................52
Bảng 3.12. Nồng độ lý thuyết của các thuốc trong huyết tương ..............................53

.


.

Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống (n=6) .......................................53
Bảng 3.14. Kết quả thẩm định tính đặc hiệu của phương pháp ................................54
Bảng 3.15. Hiệu suất chiết các chất từ huyết tương người (n = 6) ...........................55
Bảng 3.16. Mối tương quan giữa nồng độ IRB và HCTZ trong huyết tương và tỷ số
diện tích pic (S/SIS) ...................................................................................................56
Bảng 3.17. Kết quả đánh giá tính tương thích của phương trình hồi quy và ý nghĩa
của các hệ số của phương trình hồi quy ....................................................................56
Bảng 3.18. Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác trong ngày và giữa các ngày
...................................................................................................................................57
Bảng 3.19. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới ...........................................58
Bảng 3.20. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lượng mẫu tồn dư (n=6) ......................58
Bảng 3.21. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu (n=6) .....................................59
Bảng 3.22. Kết quả đánh giá ảnh hưởng độ pha loãng của IRB và HCTZ trong huyết
tương (n=6) ................................................................................................................60
Bảng 3.23. Kết quả đánh giá độ ổn định của dung dịch gốc IRB, HCTZ và IS (n=6)
...................................................................................................................................60
Bảng 3.24. Kết quả đánh giá độ ổn định của IRB và HCTZ trong huyết tương (n=6)

...................................................................................................................................61

.


.

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ
Trang
Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết mẫu bằng phương pháp kết tủa protein ..........................29
Sơ đồ 2.2. Quy trình chiết mẫu bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng.........................30
Hình 1.1.Cấu trúc hóa học của irbesartan ..................................................................3
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của hydroclorothiazid .....................................................4
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của losartan kali..............................................................6
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của telmisartan ...............................................................7
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của valsartan ...................................................................8
Hình 1.6. Cơ chế phân mảnh của telmisartan, hydroclorothiazid (HCTZ),
irbesartan, losartan, valsartan. ...................................................................................22
Hình 3.1. Phổ khối (ion phân tử và ion phân mảnh) của telmisartan (A và A’),
irbesartan (B và B’), hydroclorothiazid (C và C’), losartan (D và D’), valsartan (E
và E’) ở cùng nồng độ 1 µg/mL ................................................................................37
Hình 3.2. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với 2 hệ pha động khảo sát: (A).
acetonitril – amoni format 10 mM pH 5 (80:20) và (B). methanol – amoni format 10
mM pH 5 (80:20) ......................................................................................................39
Hình 3.3. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với hệ pha động methanol - amoni
format pH 5 (80:20) có nồng độ 1 mM (A), 3 mM (B), 5 mM (C) và 10 mM (D) ..39
Hình 3.4. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với pha động methanol - amoni
format 5 mM pH 5 với các tỷ lệ 60:40 (A), 70:30 (B), 80:20 (C), 90:10 (D)...........40
Hình 3.5. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với pha động methanol - amoni
format 5 mM (80:20) có pH 3 (A), pH 4 (B), pH 5 (C), pH 6 (D) ...........................41

Hình 3.6. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với nhiệt độ cột 30 oC(A), 35 oC(B),
40 oC(C) và 45 oC(D) ................................................................................................42
Hình 3.7. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với tốc độ dòng 0,35 mL/phút (A),
0,4 mL/phút (B) và 0,45 mL/phút (C). ......................................................................44
Hình 3.8. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với thể tích tiêm mẫu 2 µL (A),
3 µL (B), 5 µL (C) và 10 µL (D) ..............................................................................45

.


i.

Hình 3.9. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn irbesartan, hydroclorothiazid và chuẩn nội
telmisartan nồng độ 100 ng/mL ở điều kiện sắc ký thích hợp ..................................46
Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu giả lập tương ứng với dung môi tủa protein methanol (A)
và acetonitril (B) .......................................................................................................47
Hình 3.11. Sắc ký đồ mẫu giả lập với các dung môi chiết khác nhau. (A). tert-butyl
methyl ether, (B). ethyl acetat, (C). hỗn hợp tert-butyl methyl ether – ethyl acetat
(5:5). ..........................................................................................................................48
Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu giả lập với các nồng độ acid hóa huyết tương khác nhau.
(A). H3PO4 0%, (B). H3PO4 5%, (C). H3PO4 10%, (D). H3PO4 15% và (E). H3PO4
20%. ………………………………………………………………………………..51
Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (A), (B), (C) và mẫu huyết tương giả
lập có chứa irbesartan (A’), hydroclorothiazid (B’) và telmisartan (C’) ở mức nồng
độ LLOQ ...................................................................................................................54

.


.


MỞ ĐẦU
Bệnh tim mạch là bệnh do sự hoạt động quá sức của tim dẫn đến khả năng hoạt
động của tim suy yếu. Theo số liệu thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, trung bình
mỗi năm có khoảng 17,5 triệu người tử vong do căn bệnh này. Đây là con số báo
động về sự nguy hiểm mà căn bệnh này gây ra. Tăng huyết áp động mạch là một
trong những yếu tố nguy cơ phổ biến và quan trọng nhất đối với bệnh tim
mạch. Tuy nhiên, việc kiểm sốt huyết áp khơng đạt u cầu cũng chiếm một tỷ lệ
lớn trong điều trị. Vì vậy, trong điều trị huyết áp việc phối hợp thuốc đang được
khuyến khích nhằm tăng tác dụng điều trị, tạo nên tác dụng hiệp đồng và giảm số
lần uống thuốc cũng như những tác dụng khơng mong muốn. Mặc khác, muốn kiểm
sốt huyết áp tốt trong điều trị thì cần phải theo dõi nồng độ thuốc trong huyết
tương có đạt yêu cầu điều trị hay khơng để có thể điều chỉnh liều cho phù hợp. Vì
thế, các phương pháp xác định nồng độ thuốc làm hạ huyết áp trong huyết tương
hoặc trong các dịch sinh học được áp dụng trong nhiều năm qua để theo dõi việc
kiểm soát huyết áp trong điều trị bệnh [22].
Irbesartan (IRB) là một thuốc đối kháng thụ thể typ I angiotensin II. IRB được
chỉ định điều trị tăng huyết áp động mạch vô căn, bệnh thận do đái tháo đường typ 2
có tăng huyết áp [2],[29]. Hydroclorothiazid (HCTZ) là thuốc lợi tiểu thuộc nhóm
thiazid. HCTZ được chỉ định điều trị tăng huyết áp, dùng đơn độc hoặc phối hợp
với các thuốc chẹn thụ thể angiotensin II. Phối hợp của IRB và HCTZ được chỉ định
trong điều trị phù nề và tăng huyết áp. Các nghiên cứu lâm sàng về IRB / HCTZ cho
rằng sự kết hợp này có hiệu quả lâm sàng [2],[3],[20],[23],[29].
Hiện nay, có rất nhiều chế phẩm phối hợp IRB và HCTZ trên thị trường Việt
Nam như Co-dovel, Coaprovel, Avalide, Irbesartan/HTC Sanzod, Karvezide,
Irbenida Plus, Irovel H, Ibarzid. Tuy nhiên, chỉ có Co-dovel được sản xuất trong
nước bởi Công ty Cổ phần xuất nhập khẩu Y tế Domesco với giá thuốc rẻ hơn các
thuốc ngoại nhập hoặc thuốc phát minh. Để các thuốc generic có khả năng thay thế

.



.

được thuốc phát minh, cần phải tiến hành thử nghiệm chứng minh tương đương sinh
học giữa thuốc generic và thuốc phát minh vì sẽ giúp cho người bệnh giảm chi phí
điều trị mà hiệu quả điều trị vẫn tốt. Do đó, việc đánh giá tương đương sinh học
giữa thuốc generic và thuốc phát minh rất cần thiết trong việc nghiên cứu sản xuất
thuốc generic ở nước ta.
Trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu định lượng IRB và HCTZ trong
huyết tương người một cách riêng lẻ, đồng thời hoặc kết hợp với các thuốc khác
bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS hay LC-MS/MS)
[5],[11],[14],[15],[16],[18],[20],[21],[27],[29]. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có tác
giả nào trong nước cơng bố cơng trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong
huyết tương người.
Kỹ thuật LC-MS/MS là một trong những kỹ thuật đang được áp dụng phổ biến
để định lượng thuốc trong dịch sinh học. Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm như độ
nhạy và tính đặc hiệu cao, thời gian phân tích ngắn, giới hạn định lượng các chất
thấp trên các nền mẫu phức tạp như dịch sinh học.
Vì những lý do trên, đề tài “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG
THỜI IRBESARTAN VÀ HYDROCLOROTHIAZID TRONG HUYẾT TƯƠNG
NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS” được thực hiện để góp phần vào việc
đánh giá tương đương sinh học của các chế phẩm chứa irbesartan và
hydroclorothiazid. Mục tiêu của đề tài là:
- Xác định chuẩn nội, điều kiện sắc ký và điều kiện khối phổ thích hợp.
- Xây dựng quy trình chiết irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương
người.
- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời irbesartan và
hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS. Việc thẩm
định được thực hiện theo tài liệu hướng dẫn của US-FDA và EMA về thẩm định

phương pháp phân tích mẫu sinh học.

.


.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về irbesartan
1.1.1. Tính chất lý hóa
- Cấu trúc hóa học:
8
7

9
5

4
3

6

1
2

4
3

5
3


4

2

6
2
5

6'

1
1'
2'

1
3'

5'
4'

Hình 1.1.Cấu trúc hóa học của irbesartan
- Danh pháp IUPAC: 2-butyl-3-[[2'-(lH-tetrazol-5-yl)biphenyl-4-yl]methyl]-l,3diazaspiro[4.4]non-l-en-4-on.
- Cơng thức phân tử: C25H28N6O.
- Khối lượng phân tử: 428,5 g/mol.
- Irbesartan là chất bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, đa hình [1].
- Irbesartan hơi tan trong methanol, khó tan trong methylen clorid, thực tế không
tan trong nước [1].
- pKa1 = 4,12; pKa2 = 7,4 [4].
- Điểm chảy: 180-181 °C [31].

1.1.2. Cơ chế tác dụng và dược động học
1.1.2.1. Cơ chế tác dụng
Irbesartan là một thuốc đối kháng thụ thể typ I angiotensin II. Irbesartan phong bế
hoạt động sinh lý của angiotensin II, là chất được tạo từ angiotensin I trong phản

.


.

ứng xúc tác bởi men chuyển angiotensin. Angiotensin II là chất co mạch chính của
hệ renin-angiotensin và kích thích vỏ thượng thận tổng hợp và tiết aldosteron.
Irbesartan phong bế tác dụng co mạch và bài tiết aldosteron của angiotensin II nhờ
gắn chọn lọc vào thụ thể AT1 của angiotensin II [2].
Irbesartan có tác dụng làm giảm huyết áp. Tác dụng chống tăng huyết áp của
irbesartan và thuốc lợi tiểu thiazid có tính cộng hợp [2].
1.1.2.2. Dược động học
Irbesartan hấp thu nhanh qua ống tiêu hóa với sinh khả dụng 60-80 %. Thức ăn
không làm thay đổi nhiều đến sinh khả dụng của thuốc. Thuốc liên kết khoảng 96%
với protein huyết tương. Thể tích phân bố của thuốc khoảng 53-93 lít. Nồng độ đỉnh
trong huyết tương đạt khoảng 1-2 giờ sau một liều uống. Nồng độ thuốc trong máu
đạt trạng thái cân bằng ổn định sau 3 ngày uống thuốc. Thuốc chuyển hóa ở gan nhờ
q trình liên hợp glucuronic và oxy hóa. Irbesartan được oxy hóa chủ yếu qua xúc
tác của isoenzym CYP2C9 của cytochrom P450. Thuốc và các sản phẩm chuyển hóa
được đào thải qua mật và nước tiểu, phần còn lại (khoảng 80%) qua phân. Một
lượng nhỏ dưới 2% của liều đào thải qua nước tiểu dưới dạng không biến đổi. Nửa
đời thải trừ của thuốc là 11-15 giờ [2],[12].
1.2. Tổng quan về hydroclorothiazid
1.2.1. Tính chất lý hóa
- Cấu trúc hóa học:

5
6
4
7

3

1 2
8

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của hydroclorothiazid
- Danh

pháp:

6-Cloro-3,4-dihydro-2H-1,2,4-benzothiadiazin-7-sulfonamid-1,1-

dioxid.

.


.

- Công thức phân tử: C7H8ClN3O4S2.
- Khối lượng phân tử: 297,7 g/mol.
- Hydroclorothiazid là chất bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, đa hình [1].
- Hydroclorothiazid rất ít tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96 %, tan trong
aceton, tan trong dung dịch kiềm loãng [1].
- pKa = 7,9 và 9,2 [13].

- Điểm chảy: 273 °C [32].
1.2.2. Cơ chế tác dụng và dược động học
1.2.2.1. Cơ chế tác dụng
Hydroclorothiazid và các thuốc lợi tiểu thiazid làm tăng bài tiết natri clorid và nước
kèm theo do cơ chế ức chế tái hấp thu các ion natri và clorid ở ống lượn xa. Sự bài
tiết các chất điện giải khác cũng tăng, đặc biệt là kali và magnesi, cịn calci thì
giảm. Các thiazid có tác dụng lợi tiểu mức độ vừa phải vì khoảng 90% ion natri đã
được tái hấp thu trước khi đến ống lượn xa là vị trí chủ yếu thuốc có tác dụng [2].
Hydroclorothiazid có tác dụng hạ huyết áp do làm giảm thể tích huyết tương và dịch
ngoại bào liên quan đến sự bài tiết natri. Hydroclorothiazid có tác dụng hạ huyết áp
sau 1-2 tuần, cịn tác dụng lợi tiểu xảy ra nhanh có thể thấy ngay sau vài giờ.
Hydroclorothiazid làm tăng tác dụng của các thuốc hạ huyết áp khác [2].
1.2.2.2. Dược động học
Sau khi uống, hydroclorothiazid hấp thu tương đối nhanh, khoảng 65-75% liều sử
dụng, tuy nhiên tỷ lệ này có thể giảm ở người suy tim. Thức ăn có thể làm giảm hấp
thu của thuốc. Hydroclorothiazid tích lũy trong hồng cầu, 40-68% thuốc liên kết với
protein huyết tương. Thuốc thải trừ chủ yếu qua thận, phần lớn dưới dạng khơng
chuyển hóa. Nửa đời của hydroclorothiazid khoảng 9,5-13 giờ, nhưng có thể kéo dài
trong trường hợp suy thận nên cần điều chỉnh liều. Hydroclorothiazid đi qua hàng
rào nhau thai, phân bố và đạt nồng độ cao trong thai nhi [2].
Tác dụng lợi tiểu xuất hiện sau khi uống 2 giờ, đạt tối đa sau 4 giờ và kéo dài
khoảng 12 giờ [2].

.


.

Tác dụng chống tăng huyết áp xảy ra chậm hơn tác dụng lợi tiểu nhiều và chỉ có thể
đạt được tác dụng đầy đủ sau 2 tuần, ngay cả với liều tối ưu giữa 12,5-25 mg/ngày.

Ðiều quan trọng cần biết là tác dụng chống tăng huyết áp của hydroclorothiazid
thường đạt được tối ưu ở liều 12,5 mg (nửa viên 25 mg). Các hướng dẫn điều trị và
thử nghiệm lâm sàng hiện đại đều nhấn mạnh cần sử dụng liều thấp nhất và tối ưu,
điều đó làm giảm được nguy cơ tác dụng có hại. Vấn đề quan trọng là phải chờ đủ
thời gian để đánh giá sự đáp ứng của cơ thể đối với tác dụng hạ huyết áp của
hydroclorothiazid vì tác dụng trên sức cản ngoại vi cần phải có thời gian mới thể
hiện rõ [2].
1.3. Tổng quan về chuẩn nội
1.3.1. Losartan kali
- Cấu trúc hóa học:
3
4

2
1

5

4'

K+

5'

3'

3
4

6'


-

2
1

2'
2

1'
1
6

5

5

3
4

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của losartan kali
- Danh

pháp:

Kali

5-[4’-[[2-butyl-4-cloro-5-(hydroxymethyl)-1H-imidazol-1-

yl]methyl]biphenyl-2-yl]tetrazol-1-id.

- Cơng thức phân tử: C22H22ClKN6O.
- Khối lượng phân tử: 461,0 g/mol.
- Losartan kali là chất bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, dễ hút ẩm [6].
- Losartan kali dễ tan trong nước và methanol (MeOH), hơi tan trong acetonitril
(ACN) [6].

.


.

- pKa = 4,9 [28].
1.3.2. Telmisartan
- Cấu trúc hóa học:

3
4
5

2

3'

1

2'

4'
3


2

6

7
5'

4

6'

1

5

6

5

1' 1

4

2
3

7
6

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của telmisartan

- Danh pháp: Acid 4'-[[4-methyl-6-(1-methyl-lH-benzimidazol-2-yl)-2-propyl-lHbenzimidazol-1-yl]methyl]biphenyl-2-carboxylic.
- Công thức phân tử: C33H30N4O2.
- Khối lượng phân tử: 514,6 g/mol.
- Telmisartan là chất bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng nhạt, đa hình [1].
- Telmisartan khơng tan trong nước, khó tan trong methanol, hơi tan trong
methylen clorid và tan trong dung dịch natri hydroxyd 1 M [1].
- pKa = 4,45 ± 0,09 [7].
1.3.3. Valsartan
- Danh pháp IUPAC: (2S)-3-Methyl-2-[pentanoyl[[2’-(1H-tetrazol-5-yl)biphenyl4-yl]methyl]amino]butanoic acid.
- Công thức phân tử: C24H29N5O3.
- Khối lượng phân tử: 435,5 g/mol.
- Valsartan là chất bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, dễ hút ẩm [6].
- Valsartan dễ tan trong ethanol khan nước, ít tan trong methylen clorid, thực tế
không tan trong nước [6].

.


.

- pKa = 4,9 [7].
- Cấu trúc hóa học:
4
3
2 1

2

3


3
4
1

5
2'

2

1'

3'

4

1
5
6

6'

4'
5'

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của valsartan
1.4. Tổng quan về phương pháp xử lý mẫu huyết tương
Phương pháp phân tích sinh học đề cập đến một quy trình được sử dụng để định
lượng thuốc và / hoặc chất chuyển hóa của nó trong dịch sinh học cụ thể có nguồn
gốc từ người hoặc động vật như huyết tương, huyết thanh, nước tiểu, nước bọt,
nước mắt. Chuẩn bị mẫu là một kỹ thuật được sử dụng để làm sạch mẫu trước khi

phân tích và / hoặc tập trung mẫu để cải thiện việc phát hiện mẫu. Giai đoạn làm
sạch mẫu là quá trình nhằm loại trừ các chất gây nhiễu hay chính xác hơn là loại trừ
ảnh hưởng của nền mẫu. Các phương pháp thường được sử dụng là kết tủa protein,
chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn [26].
1.4.1. Phương pháp kết tủa protein
Phương pháp kết tủa protein là phương pháp rất hữu ích trong lĩnh vực độc chất lâm
sàng, khám phá thuốc và theo dõi thuốc điều trị. Điều này có thể được thực hiện
bằng cách cho dung môi hữu cơ thích hợp, acid mạnh hoặc một số muối của kim
loại nặng vào mẫu. Thường dùng acetonitril, methanol.... để tạo kết tủa protein. Sau
đó thực hiện ly tâm để tủa protein. Dịch ly tâm được sử dụng để phân tích và có thể
được bơm trực tiếp vào hệ thống sắc ký hoặc có thể được bay hơi và được hịa tan
lại bằng pha động [26].

.


.

1.4.2. Phương pháp chiết lỏng-lỏng
Phương pháp chiết lỏng-lỏng dựa trên sự phân bố các chất hòa tan giữa pha nước và
pha hữu cơ không thân nước. Sự phân bố các chất tan khác nhau phụ thuộc vào mức
độ hòa tan của chúng trong các dung môi khác nhau. Phương pháp chiết lỏng-lỏng
sử dụng trong phân tích dịch sinh học rất hữu ích, dùng để tách các chất phân tích ra
khỏi các chất gây nhiễu có mặt trong nền mẫu sinh học. Chất phân tích được chiết
xuất vào pha hữu cơ, dịch chiết có thể được bay hơi đến khơ và được hịa tan trong
một thể tích nhỏ hơn của dung mơi thích hợp (tốt nhất là pha động). Trong khi đó,
các chất phân tích được chiết vào pha nước thường có thể được bơm trực tiếp vào
hệ thống sắc ký. Kỹ thuật này rất đơn giản, nhanh chóng và thu được kết quả tốt
thông qua nhiều lần chiết liên tục [26].
1.4.3. Phương pháp chiết pha rắn

Chiết pha rắn là phương pháp thường sử dụng những ống nhựa có chứa pha rắn
(sorbent) thích hợp. Có 4 loại pha rắn: pha đảo, pha thuận, trao đổi ion và chất hấp
phụ. Việc lựa chọn pha rắn phụ thuộc vào tương tác giữa chất phân tích và pha rắn.
Chất phân tích sẽ được rửa giải khỏi cột trong khi các tạp chất được giữ lại trên cột;
hoặc chất phân tích được giữ lại trên cột còn tạp chất bị rửa ra khỏi cột. Cách thứ
nhất được lựa chọn khi chất phân tích hiện diện ở nồng độ cao trong mẫu. Cách thứ
hai được áp dụng khi chất phân tích có nồng độ thấp hoặc có nhiều chất với độ phân
cực khác nhau cần được tách ra khỏi hỗn hợp. Đối với những nền mẫu phức tạp, có
thể phải áp dụng cả hai cách để chiết nhiều chất khác nhau [26].
1.4.4. Một số quy trình xử lý mẫu huyết tương người khi định lượng
irbesartan và hydroclorothiazid bằng kỹ thuật sắc ký lỏng - khối phổ

.


0.

Bảng 1.1. Một số quy trình xử lý mẫu huyết tương người
Chất phân tích
IRB + HCTZ

IRB + HCTZ

HCTZ

Irbesartan

Candesartan +
HCTZ


Lisinopril +
HCTZ

Phương pháp
Kết tủa protein
bằng acetonitril

Tóm tắt quy trình
- 250 µL HT + 0,5 mL hỗn hợp (acetonitril và IS 120
ng/mL).
- Lắc xốy 30 giây, sau đó ly tâm 4000 vịng/phút trong
5 phút.
- Lấy 250 L dịch ly tâm, bay hơi đến cắn khơ bằng
dịng khí N2 ở 40 °C.
- Hịa tan cắn trong 1 mL nước, lắc xoáy 30 giây và sau
đó tiến hành sắc ký.
Kết tủa protein
- 100 µL HT + 200 L hỗn hợp (acetonitril và IS 100
bằng acetonitril ng/mL).
- Lắc xốy 01 phút, sau đó ly tâm 14900 vòng/phút
trong 10 phút.
- Lấy 10 L dịch ly tâm và tiến hành sắc ký.
Kết tủa protein
- 100 µL HT + 10 L IS (40 ng/mL trong methanol),
bằng methanol
lắc xoáy 30 giây + 300 L methanol, lắc xoáy 2 phút.
- Ly tâm 13400 vòng/phút trong 10 phút.
- Lấy 20 L dịch ly tâm và tiến hành sắc ký.
Kết tủa protein
- 200 L HT + 10 L IS (0,6 g/mL), lắc xoáy 30 giây

bằng acetonitril + 300 L acetonitril, lắc xoáy 30 giây + 300 L
và methanol
methanol, lắc xoáy 30 giây.
- Ly tâm 15000 vòng/phút trong 10 phút, dịch ly tâm
được tách và bay hơi đến cắn khơ dưới dịng khí N2 ở
40 °C.
- Hòa tan cắn với 200 L methanol – nước (60:40, tt/tt)
và tiến hành sắc ký.
Chiết lỏng – lỏng - 100 μL HT + 50 μL hỗn hợp (IS1 =
với dung môi
400 ng / mL và IS2 = 500 ng / mL), lắc xoáy 5 phút +
chiết là hỗn hợp 200 μL hỗn hợp acid formic - nước (99,5:0,5; tt /tt), lắc
acid formic xoáy 5 phút.
nước (99,50:0,50, - Thêm 2 mL hỗn hợp tert-butyl-methyl-ether và
tt/tt), tert-butyl- dicloromethan (70:30, tt/tt), lắc xoáy 5 phút, để yên 1-2
methyl-ether và phút.
dicloromethan
- Bay hơi dịch ly tâm đến cắn khơ bằng dịng khí N2 ở
(70:30, tt/tt)
40 °C.
- Hòa tan cắn với 200 μL pha động và tiến hành sắc ký.
Chiết pha rắn:
- 100 µL HT + 50 L IS, lắc xoáy 30 giây + 100 μL
cột Oasis HLB
amoni format 5,0 mM (pH 3,0), sau đó lắc xốy 30
(30 mg, 1 ml)
giây.
- Ly tâm mẫu ở 14000 vòng/phút ở 10 °C trong 5 phút .
- Ổn định cột SPE với 1,0 mL methanol và 1,0 mL
amoni format 5,0 mM (pH 3,0).

- Nạp mẫu lên cột Oasis HLB (30 mg, 1 mL).
- Rửa cột bằng 1 mL amoni format 5,0 mM (pH 3,0),
sau đó với 1 mL nước.
- Cột được làm khơ bằng khí nitrogen (1,72 × 105 Pa)
trong 1 phút với tốc độ 2,4 L/phút.
- Rửa giải cột với 0,5 mL pha động và tiến hành sắc ký.

.

TLTK

[20]

[29]

[11]

[27]

[5]

[15]


1.

Chất phân tích
Amilorid +
HCTZ


Phương pháp
Chiết pha rắn:
cột Phenomenex
Strata™-X
(30 mg, 1 ml)

Tóm tắt quy trình
- 250 L HT + 25 μL hỗn hợp IS, lắc xoáy trong 30
giây + 100 μL amoni format 10 mM, lắc xốy 30 giây.
Sau đó ly tâm ở 14000 vòng/phút trong 5 phút ở 10 °C.
- Hoạt hóa cột với 1,0 mL methanol và 1,0 mL dung
dịch amoni format 10 mM.
- Nạp mẫu lên cột Phenomenex StrataTM-X 30 mg/mL
đã được hoạt hóa.
- Rửa giải cột với 1,0 mL amoni format 10 mM, tiếp
theo với 1,0 mL methanol 10 % trong nước (tt/tt).
- Sấy khô dịch rửa giải trong 1,0 phút.
- Hòa tan cắn với 500 μL hỗn hợp acetonitril và amoni
format 4,0 mM pH 4,0 (80:20, tt /tt), lắc xoáy và tiến
hành sắc ký.

TLTK

Nhận xét
- Trong xử lý mẫu IRB và HCTZ trong huyết tương người, có nhiều phương pháp
được sử dụng như kết tủa protein, chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn.
- Phương pháp kết tủa protein với tác nhân như acetonitril, methanol là những tác
nhân phổ biến dễ tìm và kinh tế, cho được hiệu suất chiết trên 80%
[11],[20],[27],[29]. Đây là phương pháp đơn giản, ít tốn dung môi.
- Phương pháp chiết lỏng-lỏng với hỗn hợp dung môi acid formic và nước

(99,50:0,50; tt/tt), tert-butyl-methyl-ether và dicloromethan (70:30, tt/tt) cho hiệu
suất chiết trên 90% [5]. Phương pháp này đơn giản nhưng tốn nhiều thời gian và
dung môi.
- Phương pháp chiết pha rắn với cột Oasis HLB (30 mg, 1 mL), Phenomenex
Strata™-X (30 mg, 1 mL) cho hiệu suất chiết trên 90% [15],[16]. Tuy nhiên,
phương pháp này tốn nhiều thời gian và khá đắt tiền nên ít được sử dụng.
1.5. Thẩm định quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học theo US-FDA
và EMA
1.5.1. Những điểm lưu ý trong hướng dẫn US-FDA 2018
Bản hướng dẫn về thẩm định phương pháp trong dịch sinh học của US-FDA được
cập nhật mới nhất vào năm 2018 [10]. Khi tiến hành so sánh với quy định của EMA
2015 [9], có một số điểm khác biệt sau:

.

[16]


2.

-

Tỷ lệ thu hồi hay hiệu suất chiết không nhất thiết phải đạt 100% nhưng phải
đúng và có tính lặp lại. Thực hiện ở 3 nồng độ: LQC, MQC và HQC.

-

Hướng dẫn quy định giới hạn định lượng dưới (LLOQ) của phương pháp để
đánh giá độ nhạy của phương pháp sao cho thỏa mãn điều kiện tín hiệu phải gấp
ít nhất 5 lần đáp ứng của tín hiệu của mẫu nền.


-

Trong u cầu độ đúng và độ chính xác địi hỏi thực hiện ở 3 mức nồng độ,
trong đó mức thấp có nồng độ trong khoảng 3 lần giới hạn LLOQ. Tuy nhiên,
một trong những yêu cầu để xác nhận giá trị LLOQ là phải đạt độ đúng trong
khoảng 80-120% và độ chính xác khơng q 20%. Do đó, nếu thực hiện cả phần
độ đúng và độ chính xác ở nồng độ LLOQ thì phải thẩm định ở 4 mức nồng độ.

-

Độ ổn định của chất phân tích (thuốc và / hoặc chất chuyển hóa) nên được đánh
giá trong suốt quá trình thu thập và bảo quản mẫu, tốt nhất là tại thời điểm phân
tích mẫu.

-

Ảnh hưởng của sự pha loãng nên được đánh giá bằng cách thêm vào nền mẫu
dịch sinh học trắng chất phân tích có nồng độ cao hơn ULOQ và pha loãng mẫu
với mẫu dịch sinh học trắng (thực hiện khơng ít hơn năm mẫu đối với mỗi hệ số
pha loãng.

-

Yêu cầu ảnh hưởng của nền mẫu: đường chuẩn trong dịch sinh học nên được so
sánh dựa với đường chuẩn trong dung môi để phát hiện ra ảnh hưởng của nền
mẫu. Song song với việc pha loãng mẫu thử nên pha loãng mẫu chuẩn để phát
hiện ảnh hưởng của nền mẫu.

-


FDA không đề cập đến ảnh hưởng của lượng mẫu tồn dư mà chỉ đề cập đến ảnh
hưởng của nền mẫu.

1.5.2. Những điểm lưu ý trong hướng dẫn EMA 2015
Quy định hiện hành của Cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMA) được cập nhật mới
nhất vào năm 2015 [9]. Khi tiến hành so sánh với quy định của FDA 2018 [10], có
một số điểm khác biệt sau:

.