.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

BỘ Y TẾ

NGUYỄN VĂN TRUNG
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI
AMLODIPIN, LOSARTAN VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA ACID
CARBOXYLIC LOSARTAN TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI
BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS
Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất
Mã số: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. CHƢƠNG NGỌC NÃI
PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN
Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019

.


.

LỜI CAM ĐOAN

Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố

trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Nguyễn Văn Trung

.


.

Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2017 – 2019
Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất – Mã số: 8720210
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPIN, LOSARTAN VÀ
CHẤT CHUYỂN HÓA ACID CARBOXYLIC LOSARTAN TRONG HUYẾT TƢƠNG
NGƢỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS
Nguyễn Văn Trung
Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Chƣơng Ngọc Nãi, PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn
Từ khóa: amlodipin, losartan, huyết tƣơng ngƣời, LC – MS/MS.
Mở đầu: Dạng thuốc phối hợp amlodipin (thuốc chẹn kênh calci) và losartan (thuốc ức chế thụ thể
angiotensin II) đƣợc sử dụng rộng rãi vì giúp kiểm sốt huyết áp hữu hiệu và nhanh chóng hơn so
với đơn trị bằng từng thành phần riêng rẽ. Hiện nay, thị trƣờng Việt Nam đang lƣu hành thuốc kết
hợp amlodipin và losartan với giá thành rẻ hơn so với các thuốc ngoại nhập. Tuy nhiên, chế phẩm
này chƣa đƣợc đánh giá tƣơng đƣơng sinh học so với thuốc gốc, hai dƣợc chất này hiện diện trong
huyết tƣơng ở nồng độ rất thấp và 14% liều losartan uống chuyển thành chất chuyển hóa có hoạt
tính là acid carboxylic losartan. Cho đến nay, chỉ có một cơng trình định lƣợng đồng thời
amlodipin, losartan và chất chuyển hóa trong huyết tƣơng bằng kỹ thuật LC-MS/MS. Vì vậy, đề tài
này đƣợc thực hiện với mục tiêu xây dựng qui trình định lƣợng đồng thời amlodipin, losartan và
chất chuyển hóa acid carboxylic losartan trong huyết tƣơng ngƣời bằng kỹ thuật LC-MS/MS, góp
phần vào việc đánh giá tƣơng đƣơng sinh học của chế phẩm phối hợp chứa amlodipin và losartan.
Đối tƣợng & Phƣơng pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Các mẫu huyết tƣơng ngƣời chứa amlodipin (AM), losartan (LOS) và acid

caboxylic losartan (ACL). Phương pháp nghiên cứu: Mẫu huyết tƣơng giả lập chứa các chất phân
tích cùng nội chuẩn (IS) irbesartan đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp chiêt lỏng-lỏng. Qui trình định
lƣợng AM, LOS và ACL trong huyết tƣơng ngƣời đƣợc xây dựng bằng kỹ thuật LC-MS/MS và
đƣợc thẩm định theo hƣớng dẫn của US-FDA và EMA.
Kết quả: AM, LOS, ACL và nội chuẩn đƣợc ion hóa ở chế độ ESI(+) và đƣợc ghi phổ với kỹ thuật
MRM cho ra các ion phân tử và ion phân mảnh dùng cho định lƣợng lần lƣợt là m/z 409,15 →
238,05, m/z 423,25 → 207,10, m/z 437,20 → 235,10 và m/z 429,35 → 207,10. Với dung môi chiết
ethyl acetat (3 ml x 2 lần) có bổ sung 100 µl acid phosphoric 5%, hầu hết các chất đƣợc chiết với
hiệu suất chiết ổn định trên 85%. Điều kiện sắc ký thích hợp bao gồm cột Gemini C18 (250 x 2
mm; 5 µm) nhiệt độ cột 40º C, pha động acetonitril – acid formic 0,1% (65:35,tt/tt), tốc độ dòng
0,55 ml/phút. Miền giá trị của AM, LOS và ACL lần lƣợt là 0,045 – 15 ng/ml; 0,5 – 1000 ng/ml và
0,5 – 1000 ng/ml. Giới hạn định lƣợng dƣới của AM, LOS và ACL lần lƣợt là 0,045 ng/ml; 0,5
ng/ml và 0,5 ng/ml. Các chỉ tiêu thẩm định nhƣ tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, ảnh hƣởng
của nền mẫu, lƣợng mẫu tồn dƣ, độ pha loãng và độ ổn định đều cho kết quả nằm trong giới hạn
cho phép.
Kết luận: Đã xây dựng đƣợc qui trình định lƣợng đồng thời AM, LOS và chất chuyển hóa ACL
trong huyết tƣơng ngƣời bằng kỹ thuật LC–MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác cao.
Qui trình có thể đƣợc ứng dụng để theo dõi nồng độ hai thuốc này trong huyết tƣơng ngƣời trong
các nghiên cứu sinh khả dụng và tƣơng đƣơng sinh học.

.


.

Master’s Thesis – Academic course: 2017- 2019
Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210
DEVELOPMENT OF LC–MS/MS METHOD FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION
OF AMLODIPINE, LOSARTAN AND LOSARTAN CARBOXYLIC ACID METABOLITE
IN HUMAN PLASMA

Nguyen Van Trung
Supervisor: Dr. Chuong Ngoc Nai, Assoc. Prof. Dr. Nguyen Duc Tuan
Keywords: Amlodipine, losartan, losartan carboxylic acid, LC-MS/MS, human plasma.
Introduction: The combination of amlodipine (calcium channel blockers) and losartan
(angiotensin II receptor inhibitors) is widely used since it helps control blood pressure more
effectively and quickly than monotherapy with individual components. Vietnamese market is
currently circulating a combination of amlodipine and losartan with a selling price which is cheaper
than the one of imported products. However, this formulation has not been assessed for in vivo
bioequivalence to reference product, these substances are present in plasma at very low
concentrations, and 14% of the oral dose of losartan is converted to an active metabolite, losartan
carboxylic acid. There has been only one publication on simultaneous quantitative determination of
amlodipine, losartan and its metabolite in human plasma by LC-MS/MS, so far. Therefore, this
study has been performed with the aim of development and validation of the simultaneous
quantitative procedure for amlodipine, losartan and its losartan carboxylic acid metabolite in
human plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technique in
accordance with the guidelines of US-FDA and EMA, contributing to the in vivo bioequivalence
study of pharmaceuticals containing amlodipine and losartan.
Materials and methods
Object of study: Human plasma samples containing amlodipine (AM), losartan (LOS) and losartan
carboxylic acid (ACL). Methods of study: Human plasma samples containing AM, LOS, ACL, and
irbesartan as internal standard (IS) were treated by liquid-liquid extraction (LLE). A method for
quantification of AM, LOS and ACL in human plasma was developed using LC-MS/MS. The
assay was validated in compliance with US-FDA and EMA guidelines on bioanalytical method
validation.
Results: AM, LOS, ACL and IS were ionized using positive ion electrospray ionization (ESI+) and
detected by multi-reaction monitoring (MRM) mode to obtain molecular and fragment ions for
quantification. The transition of m/z is 409.15 → 238.05, 423.25 → 207.10, 437.20 → 235.10, and
429.35 → 207.10 for AM, LOS, ACL and IS, respectively. The human plasma samples were
treated by LLE using ethyl acetate (3 ml x 2 times) and following by acidification with 100 µl of
5% phosphoric acid, which gave the recovery above 85% for most analytes. The chromatography

was performed on a Gemini C18 column (250 x 2.0 mm; 5.0 µm) at 40ºC, the mobile phase
comprising of acetonitrile and 0.1% formic acid (80:20, v/v), and flow rate of 0.55 mL/min.
Linearity range is 0.045-15 ng/mL, 0.5-1000 ng/mL, and 0.5-1000 ng/mL for AM, LOS and ACL,
respectively. The lower limit of quantitation of amlodipine, losartan and losartan carboxylic acid is
0.045 ng/mL, 0.5 ng/mL, and 0.5 ng/mL, respectively. The validation results showed that the
selectively, intra- and inter-day precision and accuracy, matrix effect, carry over, dilution and
stability of all the analytes were in the acceptable range.
Conclusion: A highly sensitive, specific and precision LC-MS/MS method for simultaneous
quantitative determination of AM, LOS and ACL in human plasma was successfully developed and
validated. This method can be applied for quantification of these compounds in human plasma for
in vivo bioavailability (BA) and bioequivalence (BE) studies.

.


.

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................III
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ vii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3

1.1. Tổng quan về amlodipin.......................................................................................3
1.2. Tổng quan về losartan kali ...................................................................................4
1.3. Tổng quan về chất chuyển hóa acid carboxylic losartan .....................................6
1.4. Tổng quan về chuẩn nội .......................................................................................7
1.5. Tổng quan về sắc ký lỏng - khối phổ ...................................................................8

1.6. Lựa chọn chuẩn nội cho phƣơng pháp LC-MS ..................................................12
1.7. Ảnh hƣởng của nền mẫu huyết tƣơng ................................................................13
1.8. Xử lý mẫu huyết tƣơng ......................................................................................13
1.9. Thẩm định quy trình định lƣợng thuốc trong dịch sinh học ..............................15
1.10. Một số cơng trình nghiên cứu ..........................................................................21
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................28
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.........................................................................................28
2.2. Địa điểm nghiên cứu ..........................................................................................28
2.3. Nguyên vật liệu ..................................................................................................28
2.4. Trang thiết bị ......................................................................................................29
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................30
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN .................................38
3.1. Khảo sát điều kiện khối phổ ...............................................................................38
3.2. Khảo sát chuẩn nội .............................................................................................38
3.3. Khảo sát điều kiện sắc ký ...................................................................................38
3.4. Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu ......................................................................48
3.5. Xác định khoảng nồng độ định lƣợng các thuốc................................................54

.


.

i

3.6. Thẩm định phƣơng pháp phân tích ....................................................................55
3.7. Dự thảo quy trình định lƣợng đồng thời amlodipin, losartan và acid carboxylic
losartan trong huyết tƣơng ngƣời bằng kỹ thuật LC-MS/MS ...................................64
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN .......................................................................................66
4.1. Lựa chọn kỹ thuật phân tích ...............................................................................66

4.2. Điều kiện sắc ký .................................................................................................66
4.3. Lựa chọn chất chuẩn nội ....................................................................................67

4.4. Điều kiện xử lý mẫu và hiệu suất chiết ..............................................................68
4.5. Độ nhạy của phƣơng pháp .................................................................................68
4.6. Tính đặc hiệu ......................................................................................................69
4.7. Xây dựng đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính ...................................................69
4.8. Độ ổn định của các chất phân tích .....................................................................69
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................72
Kết luận……….. .......................................................................................................72
Kiến nghị…. ..............................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

.


.

i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu, chữ

Từ nguyên

viết tắt
AUC

Area under cover (Diện tích bên dƣới đƣờng cong)


AM

Amlodipin

ACL

Acid carboxylic losartan

APCI

Atmospheric pressure chemical ionization (Ion hóa hóa học ở áp suất
khí quyển

CE

Collision cell (Buồng va chạm)

CF-FAB

Continuous flow fast atom bombardment (Bắn phá nhanh nguyên tử
dòng liên tục)

CI

Chemical ionization (Ion hóa hóa học)

Cmax

Nồng độ đỉnh


CV

Coefficient of variation (Hệ số phân tán)

EI

Electronic ionization (Ion hóa điện tử)

ESI

Electrospray ionization (Ion hóa phun điện)

FDA

Food and Drug Administration (Cơ quan Quản lý thuốc và Thực
phẩm)

EMA

European Medicines Agency (Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu)

FI

Field ionization (Ion hóa trƣờng)

FTICR-MS

Fourier transform ion cyclotron resonance - Mass spectrometry
(Khối phổ cộng hƣởng ion cyclotron - sử dụng phép biến đổi

Fourier)

HQC

High quality control (Mẫu kiểm chứng nồng độ cao)

IT

Ion trap (bẫy ion)

IS

Internal standard (Chuẩn nội)

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry (Hiệp hội Quốc

.


.

v

Ký hiệu, chữ

Từ nguyên

viết tắt


tế về Hóa học thuần túy và ứng dụng)
LC

Liquid chromatography (Sắc ký lỏng)

LC-MS/MS

Liquid chromatography – Tandem Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng Khối phổ/Khối phổ)

LOS

Losartan

LLOQ

Lower limit of quantification (Giới hạn định lƣợng dƣới)

LQC

Low quality control (Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp)

MQC

Medium quality control (Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình)

MS

Mass spectrometry (Khối phổ)


MRM

Multiple reacting monitoring (Kỹ thuật ghi phổ MRM)

RSD

Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tƣơng đối)

Tmax

Thời gian đạt nồng độ đỉnh

TOF

Time of flight (Thời gian bay)

ULOQ

Upper limit of quantification (Giới hạn định lƣợng trên)

USP

United States Pharmacopoeia (Dƣợc điển Mỹ)

.


.

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1. So sánh hƣớng dẫn của US-FDA và EMA ............................................20
Bảng 1.2. Một số cơng trình nghiên cứu định lƣợng amlodipin, losartan và chất
chuyển hóa acid carboxylic losartan trong huyết tƣơng ngƣời bằng kỹ thuật sắc ký
lỏng - khối phổ ..........................................................................................................22
Bảng 2.1. Chất chuẩn và chuẩn nội dự kiến sử dụng trong nghiên cứu ................28
Bảng 2.2. Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu..................................28
Bảng 2.3. Lô huyết tƣơng trắng của ngƣời sử dụng trong nghiên cứu ..................29
Bảng 2.4. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ........................................................29
Bảng 3.1. Các hệ pha động khảo sát ......................................................................41
Bảng 3.2. Thơng số sắc ký của chất phân tích và chuẩn nội tƣơng ứng với tốc độ
dịng khảo sát.............................................................................................................46
Bảng 3.3. Thơng số sắc ký của chất phân tích và chuẩn nội tƣơng ứng với nhiệt độ
cột khảo sát ...............................................................................................................47
Bảng 3.4. Thông số sắc ký của chất phân tích và chuẩn nội tƣơng ứng với thể tích
tiêm khảo sát .............................................................................................................49
Bảng 3.5. Hiệu suất chiết hoạt chất và chuẩn nội từ huyết tƣơng với 2 dung môi
tủa protein (n=6) ........................................................................................................49
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=6) .................................................50
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát nồng độ acid hóa huyết tƣơng (n=6) .........................52
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát thể tích acid hóa huyết tƣơng (n=6) ...........................53
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát thể tích dung môi chiết ethyl acetat (n=6) .................53
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát số lần chiết (n=6) .......................................................54
Bảng 3.11. Nồng độ lý thuyết của các thuốc trong huyết tƣơng .............................55
Bảng 3.12. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống (n=6) (phụ lục 2)..........................55
Bảng 3.13. Kết quả xác định độ đặc hiệu ................................................................56
Bảng 3.14. Kết quả xác định giới hạn đinh lƣợng dƣới ...........................................57

.



.

i

Bảng 3.15. Mối tƣơng quan giữa nồng độ AM, LOS và ACL và tỷ số diện tích pic
chất phân tích với chuẩn nội trong huyết tƣơng........................................................58
Bảng 3.16. Kết quả đánh giá tính tƣơng thích của phƣơng trình hồi quy và ý nghĩa
của các hệ số của phƣơng trình hồi quy ....................................................................58
Bảng 3.17. Kết quả xác định độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày .......59
Bảng 3.18. Hiệu suất chiết của AM, LOS và ACL (n = 6) ......................................60
Bảng 3.19. Độ ổn định của AM, LOS, ACL và IS trong dung dịch chuẩn gốc (n =
6)

...............................................................................................................60

Bảng 3.20. Độ ổn định của AM, LOS và ACL trong huyết tƣơng (n = 6) ..............61
Bảng 3.21. Kết quả đánh giá sự ảnh hƣởng của nền mẫu ........................................62
Bảng 3.22. Kết quả đánh giá sự ảnh hƣởng của mẫu tồn dƣ ...................................63
Bảng 3.23. Kết quả đánh giá sự ảnh hƣởng của việc pha loãng ..............................63

.


.

ii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang

Hình 1.1.

Cơng thức cấu tạo amlodipin ...................................................................3

Hình 1.2.

Cơng thức cấu tạo losartan kali ...............................................................4

Hình 1.3.

Cơng thức cấu tạo acid carboxylic losartan .............................................6

Hình 1.4.

Cơng thức cấu tạo irbesartan ...................................................................7

Hình 1.5.

Cơng thức cấu tạo felodipin ....................................................................7

Hình 1.6.

Kỹ thuật ion hóa phun điện .....................................................................9

Hình 1.7.

Cấu tạo của bộ phận ESI và APCI. .......................................................10

Hình 1.8.


Bộ tách khối phổ một tứ cực .................................................................11

Hình 1.9.

Bộ tách khối phổ hai tứ cực. ..................................................................11

Hình 1.10. Cơ chế phân mảnh của amlodipin, losartan, acid carboxylic losartan,
irbesartan và felodipin. .............................................................................................26
Hình 3.1.

Phổ khối (ion phân tử và ion phân mảnh) của amlodipin (A và A’),

losartan (B và B’), acid carboxylic losartan (C và C’), irbesartan (D và D’),
felodipin (E và E’) ở cùng nồng độ 1 µg/mL ............................................................40
Hình 3.2.

Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tƣơng ứng với điều kiện khảo sát 1 đến 7. ...42

Hình 3.3.

Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tƣơng ứng với điều kiện khảo sát 8 và 9 ......42

Hình 3.4.

Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tƣơng ứng với điều kiện khảo sát 10 và 11 ..43

Hình 3.5.

Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tƣơng ứng với điều kiện khảo sát 12 và 13 ..43


Hình 3.6.

Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tƣơng ứng với điều kiện khảo sát 14 và 15 ..44

Hình 3.7.

Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tƣơng ứng với điều kiện khảo sát 16 và 17 ..44

Hình 3.8.

Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tƣơng ứng với điều kiện khảo sát 18 và 19 ..44

Hình 3.9.

Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tƣơng ứng với các tốc độ dịng khảo sát ......46

Hình 3.10. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tƣơng ứng với các nhiệt độ cột khảo sát ......47
Hình 3.11. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tƣơng ứng với các thể tích tiêm khảo sát .....49
Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu giả lập với các dung môi tủa protein khác nhau (A).
methanol và (B). acetonitril.......................................................................................50

.


.

ii

Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu giả lập với các dung môi chiết khác nhau (A). tert-butyl
methyl ether, (B). ethyl acetat, (C). hỗn hợp tert-butyl methyl ether – ethyl acetat

(5:5), (D). hỗn hợp tert-butyl methyl ether – dicloromethan (7:3). ..........................51
Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu giả lập với các nồng độ acid hóa huyết tƣơng khác nhau.
(A). H3PO4 1%, (B). H3PO4 2%, (C). H3PO4 5%, (D). H3PO4 10%. ........................52
Hình 3.15. Sắc ký đồ huyết tƣơng trắng (A1 và A2) và mẫu giả lập chứa chất phân
tích ở nồng độ LLOQ (B1 và B2). ............................................................................57

.


.

1

MỞ ĐẦU
Tăng huyết áp là một vấn đề rất thƣờng gặp trong cộng đồng, là nguyên nhân gây tử
vong hàng đầu và dẫn đến cái chết của hàng triệu ngƣời mỗi năm, đồng thời là
nguyên nhân gây suy tim và đột quỵ não; là nguyên nhân hàng thứ hai gây nhồi máu
cơ tim cấp. Tỷ lệ ngƣời bị tăng huyết áp ngày càng tăng và tuổi bị bệnh cũng ngày
một trẻ hơn [24], [40].
Dựa trên dữ liệu năm 2007 – 2010 của Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ cho thấy có
33,0% ngƣời Mỹ trên 20 tuổi bị tăng huyết áp [36]. Theo ƣớc tính của Tổ chức Y tế
thế giới (WHO), năm 2000, tồn thế giới có 972 triệu ngƣời bị tăng huyết áp và con
số này đƣợc ƣớc tính vào khoảng 1,56 tỷ ngƣời vào năm 2025. Theo WHO, mỗi
năm có 17,5 triệu ngƣời chết về các bệnh tim mạch trên thế giới, nhiều hơn gấp 4
lần tổng số ngƣời tử vong của 3 bệnh lý HIV/AIDS, sốt rét và lao phổi. Trong đó,
bệnh nhân tử vong vì tăng huyết áp và biến chứng của tăng huyết áp hơn 7 triệu
ngƣời [40].
Tại Việt Nam, năm 2000 có khoảng 16,3% ngƣời lớn bị tăng huyết áp, đến năm
2009 tỷ lệ tăng huyết áp ở ngƣời lớn là 25,4% và năm 2016 tỷ lệ ngƣời lớn bị tăng
huyết áp lên đến 48%, một mức báo động đỏ trong thời điểm hiện tại [40].

Hiện nay, nếu không đƣợc điều trị đúng và đầy đủ căn bệnh này, sẽ có rất nhiều
biến chứng nặng nề, thậm chí có thể gây tử vong hoặc để lại các di chứng ảnh
hƣởng đến sức khỏe, sức lao động của ngƣời bệnh.
Trong điều trị bệnh nhân tăng huyết áp, đơn trị chỉ kiểm soát đƣợc huyết áp khơng
q 60% các trƣờng hợp [41]. Vì vậy, để đạt mục tiêu điều trị là kiểm soát huyết áp
trở về chỉ số bình thƣờng, các nhà nghiên cứu thƣờng phải phối hợp nhiều thuốc
[41]. Theo Tạp chí Dƣợc học Châu Á năm 2014, có 4 phác đồ phối hợp thuốc là ức
chế men chuyển/chẹn thụ thể angiotensin II và lợi tiểu thiazid, ức chế men
chuyển/chẹn thụ thể angiotensin II và chẹn kênh calci, ức chế men chuyển/chẹn thụ
thể angiotensin II và chẹn beta, chẹn beta và chẹn kênh calci [36]. Trong đó, phối
hợp chẹn thụ thể angiotensin II và chẹn calci đang đƣợc sử dụng rộng rãi vì phối

.


.

2
hợp này giúp kiểm soát huyết áp hữu hiệu và nhanh chóng hơn so với đơn trị bằng
từng thành phần riêng rẽ [36]. Ngoài ra, thuốc ức chế thụ thể angiotensin II có thể
giảm thiểu phù ngoại biên gây ra bởi thuốc chẹn kênh calci, giảm tác dụng phụ của
thuốc do liều thấp khi phối hợp, cụ thể là amlodipin (thuốc chẹn kênh calci) và
losartan (thuốc ức chế thụ thể angiotensin II) [36].
Hiện nay, thị trƣờng Việt Nam đang lƣu hành thuốc kết hợp amlodipin và losartan
với giá thành rẻ hơn so với các thuốc ngoại nhập. Tuy nhiên, chế phẩm này chƣa
đƣợc đánh giá tƣơng đƣơng sinh học so với thuốc gốc và các chất này hiện diện
trong huyết tƣơng ở nồng độ rất thấp, 14% liều losartan uống chuyển thành chất
chuyển hóa có hoạt tính là acid carboxylic losartan [2].
Trên thế giới đã có một cơng trình định lƣợng đồng thời amlodipin, losartan và chất
chuyển hóa trong huyết tƣơng ngƣời bằng kỹ thuật LC-MS/MS, xử lý mẫu bằng

phƣơng pháp chiết pha rắn [35]. Tuy nhiên cho đến nay, chƣa có phƣơng pháp định
lƣợng đồng thời amlodipin, losartan và chất chuyển hóa trong huyết tƣơng ngƣời
đƣợc cơng bố ở Việt Nam. Một trong những khó khăn khi định lƣợng amlodipin,
losartan và acid carboxylic losartan trong huyết tƣơng ngƣời là nồng độ các chất
này rất thấp, đòi hỏi phƣơng pháp định lƣợng có độ nhạy cao, đặc hiệu và chính
xác. Với những lý do trên, đề tài “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời
amlodipin, losartan và chất chuyển hóa acid carboxylic losartan trong huyết
tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS” đƣợc thực hiện để góp phần vào việc đánh
giá tƣơng đƣơng sinh học của chế phẩm phối hợp chứa amlodipin và losartan. Mục
tiêu của đề tài là:
- Xác định chuẩn nội, điều kiện sắc ký và điều kiện khối phổ thích hợp.
- Xây dựng quy trình chiết amlodipin, losartan và chất chuyển hóa acid carboxylic
losartan trong huyết tƣơng ngƣời.
-

Xây dựng và thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời amlodipin, losartan và
chất chuyển hóa acid carboxylic losartan trong huyết tƣơng ngƣời bằng kỹ thuật
LC-MS/MS. Việc thẩm định đƣợc thực hiện theo tài liệu hƣớng dẫn của US-FDA
và EMA về thẩm định phƣơng pháp phân tích mẫu sinh học.

.


.

3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ AMLODIPIN


Hình 1.1. Công thức cấu tạo amlodipin
-

Công thức phân tử: C20H25ClN2O5.

-

Danh pháp: 3,5-Pyridin dicarboxylic acid, 2-[(2-amino ethoxy) methyl]-4-(2chloro phenyl)-1,4-dihydro-6-methyl-, 3-ethyl 5-methyl ester, (±).

-

Khối lƣợng phân tử: 408,88 g/ mol.

-

Dẫn xuất benzensulfonat của amlodipin
+ Tên thƣờng: Amlodipin besylat.
+ Công thức phân tử: C20H25ClN2O5. C6H5SO3H.
+ Khối lƣợng phân tử: 567,06 g/ mol.

Tính chất hóa lý
Amlodipin dạng besylat là chất bột màu trắng, dễ tan trong methanol, hơi tan trong
ethanol, khó tan trong nƣớc và 2-propanol [1].
Hệ số phân bố log P = 3,0; pKa = 8,6 [6].
Dược lý và cơ chế tác dụng.
Amlodipin là dẫn chất của dihydropyridin có tác dụng chẹn dịng calci qua màng tế
bào. Amlodipin có tác dụng chống tăng huyết áp bằng cách trực tiếp làm giảm cơ
trơn mạch ngoại biên và ít tác dụng trên kênh calci cơ tim, có tác dụng làm giảm
sức cản mạch máu thận nên làm tăng lƣu lƣợng máu ở thận và cải thiện chức năng
thận.

Có thể dùng amlodipin để điều trị tăng huyết áp ở ngƣời bệnh đái tháo đƣờng.
Amlodipin có tác dụng tốt cả khi đứng, nằm cũng nhƣ ngồi và trong làm việc.

.


.

4
Amlodipin tác dụng chậm nên ít có nguy cơ hạ huyết áp cấp hoặc nhịp nhanh phản
xạ.
Amlodipin có tác dụng chống đau thắt ngực, thời gian chống đau kéo dài 24 giờ.
Ngƣời bệnh có thể dùng phối hợp với thuốc chẹn beta và nitrat trong điều trị đau
thắt ngực [2].
Dược động học
Sinh khả dụng của amlodipin khi uống khoảng 60-80% và không bị ảnh hƣởng bởi
thức ăn. Nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng đạt đƣợc sau 6 đến 12 giờ. Nửa đời trong
huyết tƣơng từ 30-40 giờ. Nồng độ ổn định trong huyết tƣơng đạt đƣợc 7 đến 8
ngày sau khi uống thuốc mỗi ngày một lần. Thể tích phân bố xấp xỉ 21 lít/kg thể
trọng và thuốc liên kết với protein - huyết tƣơng cao (trên 98%). Ðộ thanh thải trong
huyết tƣơng tới mức bình thƣờng vào khoảng 7 mL/phút/kg thể trọng do bài tiết chủ
yếu thông qua chuyển hóa trong gan. Các chất chuyển hóa mất hoạt tính và bài tiết
qua nƣớc tiểu. Ở ngƣời suy gan, nửa đời của amlodipin tăng, vì vậy có thể cần phải
giảm liều hoặc kéo dài thời gian giữa các liều dùng [2].
1.2. TỔNG QUAN VỀ LOSARTAN KALI
3
4

2
1


5

4'

K+

5'

3'

3
4

6'

-

2
1

2'
2

1'
1
6

5


5

3
4

Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo losartan kali
-

Công thức phân tử: C22H22ClKN6O.

-

Danh

pháp:

Kali

5-[4’-[[2-butyl-4-cloro-5-(hydroxymethyl)-1H-imidazol-1-

yl]methyl]biphenyl-2-yl]tetrazol-1-id.

.


.

5
-


Khối lƣợng phân tử: 461,0 g/ mol.

Tính chất hóa lý
Losartan kali là chất bột kết tinh màu trắng đến trắng ngà, tan nhiều trong nƣớc, tan
trong alcohol và ít tan trong dung môi hữu cơ nhƣ acetonitril và methyl ethyl keton.
Hệ số phân bố log P = 4,0 và pKa = 5 - 6 [6]. Sự oxy hóa nhóm 5-hydroxymethyl ở
vịng imidazol tạo nên chất chuyển hóa acid carboxylic losartan [9].
Dược lý và cơ chế tác dụng
Losartan là chất đầu tiên của nhóm thuốc chống tăng huyết áp mới, đó là một chất
đối kháng thụ thể (typ AT1) angiotensin II, là một chất co mạch mạnh; và là một
thành phần quan trọng trong sinh lý bệnh học của tăng huyết áp. Đó là hormon kích
hoạt mạch chủ yếu của hệ thống renin-angiotensin và là một thành phần quan trọng
trong sinh lý bệnh học và tăng huyết áp. Angiotensin II cũng kích thích vỏ tuyến
thƣợng thận tiết aldosteron [2].
Losartan và chất chuyển hóa chính acid carboxylic losartan có hoạt tính chẹn tác
dụng co mạch và tiết aldosteron của angiotensin II bằng cách ngăn cản có chọn lọc
angiotensin II, khơng cho gắn vào thụ thể AT1 có trong nhiều mơ (thí dụ cơ trơn
mạch máu, tuyến thƣợng thận). Losartan là một chất ức chế cạnh tranh thuận nghịch
của thụ thể AT1. Chất chuyển hóa có hoạt tính của thuốc mạnh hơn từ 10 đến 40 lần
so với losartan, tính theo trọng lƣợng và là một chất ức chế không cạnh tranh thuận
nghịch của thụ thể AT1 [2].
Dược động học
Sau khi uống, losartan hấp thu tốt và chuyển hóa bƣớc đầu nhiều qua gan nhờ các
enzym cytochrom P450. Khả dụng sinh học của losartan xấp xỉ 33%. Khoảng 14%
liều losartan uống chuyển thành chất chuyển hóa có hoạt tính, chất này đảm nhiệm
phần lớn tính đối kháng thụ thể angiotensin II. Nửa đời thải trừ của losartan khoảng
2 giờ và của chất chuyển hóa khoảng 6 - 9 giờ. Nồng độ đỉnh trung bình của
losartan đạt trong vịng 1 giờ và của chất chuyển hóa có hoạt tính trong vịng 3 - 4
giờ. Losartan thải trừ 35% qua nƣớc tiểu và khoảng 60 % qua phân. Cả losartan và


.


.

6
chất chuyển hóa có hoạt tính đều liên kết nhiều với protein huyết tƣơng (> 98%),
chủ yếu là albumin và không qua hàng rào máu não.
Ở ngƣời bệnh xơ gan từ nhẹ đến vừa, diện tích dƣới đƣờng cong (AUC) của
losartan và của chất chuyển hóa có hoạt tính cao hơn, tƣơng ứng gấp 5 lần và 2 lần
so với ở ngƣời bệnh có gan bình thƣờng [2].
1.3. TỔNG QUAN VỀ CHẤT CHUYỂN HĨA ACID CARBOXYLIC
LOSARTAN

Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo acid carboxylic losartan
-

Công thức phân tử: C22H21ClN6O2.

-

Danh pháp: 2-butyl-5-cloro-3-[[4-[2-(2H-tetrazol-5yl)phenyl]phenyl]methyl]
imidazol-4-carboxylic acid.

-

Khối lƣợng phân tử: 436,89 g/ mol.

Tính chất hóa lý
Acid carboxylic losartan là chất bột kết tinh màu trắng, tan trong dimethyl

formamid, dimethyl sulfoxyd và methanol [8].

.


.

7
1.4. TỔNG QUAN VỀ CHUẨN NỘI
1.4.1. Irbesartan
8
7

9
5

4

6

3

1
2

Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo irbesartan
-

Công thức phân tử: C25H28N6O.


-

Danh

pháp:

2-butyl-3-[[2'-(lH-tetrazol-5-yl)biphenyl-4-yl]methyl]-l,3-

diazaspiro[4.4]non-l-en-4-on.
-

Khối lƣợng phân tử: 428,50 g/mol.

Tính chất hóa lý
Irbesartan là chất bột kết tinh màu trắng hoặc gần nhƣ trắng, đa hình. Irbesartan hơi
tan trong methanol, khó tan trong methylen clorid, thực tế khơng tan trong nƣớc [1].
Hệ số phân bố log P = 10,1; pKa = 4,5 [6].
1.4.2. Felodipin

4

3
2

5
6

1
1


Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo felodipin

.


.

8
-

Công thức phân tử: C18H19Cl2NO4.

-

Danh pháp: 3,5-Pyridin dicarboxylic acid 4-(2,3-dichloro phenyl)-1,4-dihydro2,6-dimethyl-, ethyl methyl ester, (±)-.

-

Khối lƣợng phân tử: 384,25 g/mol.

Tính chất hóa lý
Felodipin là chất bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng nhƣ trắng. Felodipin dễ tan
trong methanol, ethanol khan, aceton và methylen clorid, không tan trong nƣớc [1].
Hệ số phân bố log P = 3,86 [6].
1.5. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ
1.5.1. Sơ lƣợc về sắc ký lỏng - khối phổ
Khối phổ là kỹ thuật phân tích nhạy và có tính chọn lọc tốt bằng cách đo lƣờng trực
tiếp tỷ lệ khối lƣợng theo điện tích của ion đó (m/z). Tuy nhiên, kỹ thuật này khơng
thể tách một chất phân tích từ những mẫu có hàng ngàn phân tử có khối lƣợng phân
tử giống nhau, nên cần một kỹ thuật tách trƣớc khi vào máy khối phổ nhƣ sắc ký

lỏng, sắc ký khí, điện di mao quản [32].
Sắc ký lỏng - khối phổ là sự kết hợp giữa kỹ thuật sắc ký lỏng (LC) và kỹ thuật khối
phổ (MS). Sự kết hợp này gặp khó khăn do sự khơng tƣơng thích của hai hệ thống.
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao hoạt động ở áp suất cao, nhiệt độ thƣờng, chất phân
tích ở dạng lỏng, tốc độ dòng chảy lớn vài ml/phút. Máy khối phổ hoạt động trong
điều kiện chân không sâu, nhiệt độ cao, chất phân tích phải ở thể khí, tốc độ dịng
chảy vài µL/ phút [3].
Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải sử dụng giao diện (interface) là các bộ
phận ion hóa. Có nhiều loại dao diện khác nhau nhƣ: ion hóa bằng bắn phá điện tử
(EI), ion hóa hóa học (CI), bắn phá nhanh nguyên tử dòng liên tục (CF-FAB), ion
hóa bằng cách phun điện (ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI), ion
hóa trƣờng (FI), … Tùy thuộc vào khối lƣợng phân tử và đặc tính (phân cực hay
khơng phân cực) của hợp chất khảo sát mà có thể sử dụng hệ thống LC-MS với các
giao diện khác nhau. Giao diện thông dụng cho hệ thống LC - MS/MS là ESI và
APCI [3].

.


.

9
1.5.2. Kỹ thuật ion hóa
Giao diện thơng dụng cho hệ thống LC-MS/MS là ESI.
Kỹ thuật ESI (Electrospray ionization)
Trong kỹ thuật ESI, dòng chất lỏng đi ra từ máy sắc ký lỏng sẽ đƣợc phun qua một
ống mao quản dƣới dạng hạt rất nhỏ (phun sƣơng) bởi dịng khí nitơ, q trình phun
sƣơng đƣợc áp thế rất cao và tạo thành các mảnh ion. Khi dung môi bay hơi ở áp
suất thƣờng bởi dịng khí khơ nitơ, ion phân tích sẽ tách khỏi các hạt bởi lực tĩnh
điện và đƣợc đƣa đến bộ phận tách ion [3],[15] (hình 1.6).

-

Ƣu điểm khi áp dụng kỹ thuật ESI [3],[15]
+ Thích hợp các chất phân tích có khối lƣợng phân tử lớn, có tính phân cực.
+ Chất phân tích khơng cần bay hơi.
+ Chất phân tích khơng cần bền nhiệt.

Hình 1.6. Kỹ thuật ion hóa phun điện
“Nguồn: Primer, Basics of LC/MS, Agilent Technologies” [4]

Kỹ thuật APCI (Atmospheric pressure chemical ionization)
Trong kỹ thuật APCI, dòng chất lỏng đi ra từ máy sắc ký lỏng sẽ đƣợc phun qua
một ống mao quản dƣới dạng hạt rất nhỏ (phun sƣơng) bởi dịng khí nitơ, qua ống
thạch đốt nóng và chuyển đến vùng có áp suất khí quyển, nơi đây xảy ra q trình
ion hóa hóa học nhờ vào que phóng điện tạo thành các mảnh ion. Các ion phân tích
sẽ tách khỏi các hạt bởi lực tĩnh điện và đƣợc đƣa đến bộ phận tách ion [15] (hình
1.7).

.


.

10
Ƣu điểm khi áp dụng kỹ thuật APCI: Thích hợp các chất phân tích có khối lƣợng
tƣơng đối nhỏ, có tính phân cực vừa [3], [15].

Hình 1.7. Cấu tạo của bộ phận ESI và APCI
“Nguồn: [37].


1.5.3. Bộ phận tách ion
Các ion tạo thành ở bộ phận ion hóa có m/z khác nhau sẽ đƣợc tách theo số khối
nhờ bộ phận từ trƣờng, điện trƣờng.
Một số loại tiêu biểu nhƣ sau [3]:
-

Khối phổ bẫy ion (Ion trap, IT)

-

Khối phổ thời gian bay (Time of flight, TOF)

-

Khối phổ tứ cực (Quadrupole)

-

Khối phổ cộng hƣởng ion cyclotron - sử dụng phép biến đổi Fourier (FTICRMS)

Bộ phận tách khối một tứ cực (Single quadrupole)
Gồm 2 cặp thanh hình trụ đƣợc đặt song song, từng cặp 2 thanh chéo nhau đƣợc nối
điện với nhau. Một hiệu điện thế gồm vừa điện một chiều và vừa điện xoay chiều
đƣợc tạo thành, những ion có động năng thích hợp mới đi qua thanh trụ đến bộ phận
nhận tín hiệu, những ion có động năng khác sẽ va chạm vào thanh trụ [3],[4] (hình
1.8).

.



.

11

Hình 1.8. Bộ tách khối phổ một tứ cực
“Nguồn: Primer, Basics of LC/MS, Agilent Technologies” [4]

Bộ phận tách khối ba tứ cực (Triple quadrupole)
Gồm ba bộ tứ cực nối với nhau (Q1Q2Q3) trong đó Q1 và Q3 có cấu trúc giống
nhau nhƣ một tứ cực, có tác dụng chọn lọc ion. Tại Q2 (là buồng va chạm có vai trị
tạo ra sự phân ly ion do va chạm), các ion ban đầu sẽ bị va chạm tạo thành các ion
phân mảnh [20] (hình 1.9).

Hình 1.9. Bộ tách khối phổ hai tứ cực.
“Nguồn: Primer, Basics of LC/MS, Agilent Technologies” [4]

1.5.1 Một số kỹ thuật ghi phổ
Chủ yếu có ba kỹ thuật ghi phổ.
Kỹ thuật full scan
Đây là phƣơng pháp quét dãy khối trong khoảng thời gian nhất định, đầu dò sẽ nhận
đƣợc tất cả các mảnh ion để cung cấp phổ khối tất cả ion của các chất trong suốt
quá trình phân tích. Việc tìm hợp chất quan tâm có thể khó khăn vì nhiều hợp chất
có cùng số khối. Phƣơng pháp này chủ yếu đƣợc sử dụng để phân tích định tính
[39].
Kỹ thuật SIM (Selected ion monitoring)

.


.


12
Trong kỹ thuật SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trƣng
cho chất cần xác định. Kỹ thuật SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã đƣợc lựa chọn
trƣớc đó, nên kỹ thuật SIM đƣợc sử dụng để phân tích định lƣợng [39].
Kỹ thuật SRM (Selected reaction monitoring) và MRM (Multiple reaction
monitoring)
Kỹ thuật SRM: chọn ion mẹ mong muốn (Q1), sau đó phân mảnh ion đƣợc chọn đó
trong buồng va chạm, trong các mảnh ion sinh ra, chỉ chọn 1 mảnh ion con cần quan
tâm (Q3) và đƣa vào đầu dò để phát hiện [39].
Kỹ thuật MRM: có hiệu quả trong việc phân tích vi lƣợng trong nền mẫu phức tạp,
các ion con cần quan tâm thƣờng từ 2 trở lên. Đầu tiên, chọn ion mẹ trong tứ cực
thứ nhất (Q1), sau đó phân mảnh ion đƣợc chọn đó trong buồng va chạm. Trong các
mảnh ion sinh ra, chọn hai hoặc nhiều mảnh ion con cần quan tâm (Q3) và đƣa vào
đầu dò để phát hiện. Kỹ thuật MRM có độ đặc hiệu và độ nhạy cao nên đƣợc sử
dụng để phân tích định lƣợng [18].
1.6. LỰA CHỌN CHUẨN NỘI CHO PHƢƠNG PHÁP LC-MS
Chuẩn nội (IS) là một chất đƣợc sử dụng để cải thiện độ chính xác trong việc định
lƣợng các chất trong nền mẫu phức tạp, cải thiện sự khác biệt trong chiết xuất, tiêm
mẫu, sắc ký, ion hóa và phát hiện giữa các mẫu [34], [38].
Yêu cầu của chuẩn nội
- Phản ứng ion hóa và mẫu phân mảnh của IS tƣơng tự nhƣ chất phân
Chất phân tích.
- Sự khác biệt khối lƣợng phân tử: quá trình ghi phổ MRM của IS khơng
tích
nên cản trở nhiều đến q trình ghi phổ MRM của chất phân tích.
- Các chất gắn đồng vị giống hệt hoặc gần giống chất phân tích.
Sắc ký
- Độ phân giải sắc ký giữa chất phân tích với các chất gắn đồng vị.
- Độ tinh khiết cao, các tạp chất khơng gây nhiễu cho chất phân tích với

Độ tinh
các chất phân tích khác trong mẫu.
khiết
Các phƣơng pháp với dải động học rộng và độ nhạy cao yêu cầu các
Dải động
chuẩn nội có độ tinh khiết cao, tƣơng đồng với chất phân tích và thể hiện
học rộng
và độ nhạy tối thiểu hoặc khơng có về độ xáo trộn và nhiễm chéo.

.


.

13
1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA NỀN MẪU HUYẾT TƢƠNG
Ảnh hƣởng của nền mẫu trong phân tích sinh học định lƣợng cho thấy sự ức chế ion
hoặc tăng cƣờng ion thƣờng đi kèm với sự suy giảm đáng kể độ đúng và độ chính
xác của phƣơng pháp. Ngay cả khi ảnh hƣởng của nền mẫu có thể đƣợc bù đắp bằng
IS thích hợp. Các phƣơng pháp nên đƣợc thực hiện để loại bỏ các hợp chất gây
nhiễu trong nền mẫu vì sự hiện diện của chúng sẽ giảm độ nhạy. Khi phân tích các
mẫu có nồng độ thấp, điều này có thể dẫn đến kết quả âm tính. Trong huyết tƣơng
và đặc biệt là nƣớc tiểu có nền mẫu rất phức tạp và thành phần của nó có thể khác
nhau đáng kể giữa các cá thể và loài. Hầu hết, các phƣơng pháp đều đƣợc thực hiện
bằng cách sử dụng các nội chuẩn và các chất phân tích đƣợc chuẩn bị từ cùng một
mẫu trắng. Nên sử dụng các mẫu đồng nhất để tránh sự biến đổi nền mẫu [26].
Sự ảnh hƣởng của nền mẫu thể hiện rõ trong thiết bị phổ khối, các ion trong nền
mẫu sẽ làm thay đổi đến độ đúng và độ chính xác của phƣơng pháp vì vậy các
phƣơng pháp kết tủa protein (PPT), chiết lỏng - lỏng (LLE), chiết pha rắn (SPE) và
sử dụng nguồn ion của thiết bị đƣợc nghiên cứu để giảm tối thiểu ảnh hƣởng của

các ion trong nền mẫu đến các quả phân tích [26].
1.8. XỬ LÝ MẪU HUYẾT TƢƠNG
Xử lý mẫu là kỹ thuật làm sạch mẫu trƣớc khi phân tích nhằm loại trừ các chất gây
nhiễu hay loại trừ ảnh hƣởng của nền mẫu. Các phƣơng pháp xử lý huyết tƣơng bao
gồm phƣơng pháp kết tủa protein (PPT), chiết lỏng - lỏng (LLE) và chiết pha rắn
(SPE). Thực tế lựa chọn phƣơng pháp xử lý mẫu cần biết tính chất của chất phân
tích, cân bằng chi phí so với tốc độ phân tích, mỗi kỹ thuật xử lý mẫu cung cấp
những lợi thế riêng [22].
1.8.1. Phƣơng pháp kết tủa protein (PPT)
Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi trong phân tích sinh học của các mẫu
huyết tƣơng. Phƣơng pháp này đã đƣợc mở rộng để định lƣợng thuốc và chất
chuyển hóa từ máu tồn phần. Nhìn chung, PPT là phƣơng pháp chuẩn bị mẫu phổ
biến và nhanh chóng, có thể dễ dàng tự động hóa [22].

.