.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

PHẠM HỒNG ANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

PHẠM HỒNG ANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN
PGS.TS. PHAN THANH DŨNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018

.


.

LỜI CAM ĐOAN

Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và
chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Phạm Hồng Anh

.



.

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC – KHÓA 2016-2018
Ngành Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất – Mã số: 8720210
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS
Phạm Hoàng Anh
Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN
PGS.TS. PHAN THANH DŨNG

Từ khóa
Collagen, 4-hydroxyprolin, LC-MS/MS, sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC),
thực phẩm chức năng.
Mở đầu
Collagen là một loại protein cấu trúc phong phú nhất và có vai trị quan trọng trong
cơ thể động vật có vú. Collagen được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như:
y học, dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm nên việc kiểm soát chất lượng collagen trong
các sản phẩm là điều cần thiết. Tại Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu định
lượng collagen trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp LC-MS/MS. Do vậy,
cần nghiên cứu tìm quy trình định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS phù hợp để
xác định hàm lượng collagen có trong thực phẩm chức năng với yêu cầu dễ thực hiện,
độ nhạy cao và có khả năng ứng dụng tốt trên thực tế.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: các mẫu thực phẩm chức năng dạng rắn có chứa collagen.
Phương pháp nghiên cứu: định lượng collagen gián tiếp thông qua 4-hydroxyprolin,
không qua giai đoạn tạo dẫn chất. Quy trình định lượng sử dụng kỹ thuật HILICUPLC-MS/MS, nguồn ion hóa phun điện tử (ESI) và kỹ thuật ghi phổ MRM. Khảo

sát tìm điều kiện khối phổ và điều kiện sắc ký (pha tĩnh, pha động, chương trình
gradient pha động, nồng độ đệm, nồng độ acid formic, tốc độ dòng, thời gian tái cân
bằng cột) thích hợp để định lượng collagen. Khảo sát tìm điều kiện thủy phân tối ưu
cho mẫu thử (nhiệt độ, thời gian, thể tích acid hydrocloric 6 N), sau đó được đem
phân tích. Thẩm định quy trình định lượng dựa trên quy định của AOAC và ICH.
Kết quả
Xác định được điều kiện khối phổ và điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng
collagen trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HILIC-UPLC-MS/MS. Quy
trình thủy phân trong 6 giờ, nhiệt độ thủy phân 110 °C, thể tích acid hydroclorid 6 N
là 1 ml ứng với lượng cân 2 mg mẫu thử. Quy trình thủy phân đạt được hiệu suất cao
91,5% và được chứng minh có tính lặp lại, tính tuyến tính. Quy trình đã được thẩm
định đạt tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng,
miền giá trị. Đã ứng dụng quy trình để định lượng collagen trong các mẫu thực phẩm
chức năng trên thị trường.
Kết luận
Đã xây dựng được quy trình định lượng collagen trong thực phẩm chức năng bằng
phương pháp HILIC-UPLC-MS/MS với độ nhạy cao, có tính đặc hiệu và đơn giản.
Quy trình đã được thẩm định và có khả năng ứng dụng trên thực tế để định lượng
collagen trong các mẫu thực phẩm chức năng trên thị trường.

.


.

Master’s Thesis of Pharmaceutical – Academic course 2016-2018
Speciality: Drug Quality Control and Toxicology – Code: 8720210
A QUANTITATIVE METHOD FOR COLLAGEN
IN HEALTH SUPPLEMENTS BY LC-MS/MS
Pham Hoang Anh

Supervisor: Assoc. Prof. Dr. NGUYEN THI NGOC VAN
Assoc. Prof. Dr. PHAN THANH DUNG
Key words
Collagen, 4-hydroxyproline, LC-MS/MS, hydrophilic interaction chromatography
(HILIC), health supplements.
Introduction
Collagen is the most abundant structural protein and plays an important role in
mammals. Collagen is used in many fields such as medicine, pharmaceutical,
cosmetic and food, so a quality control for collagen in products is necessary. In
Vietnam, we’ve not seen any research for collagen quantification in health
supplements using LC-MS/MS method. Therefore, it needs to study a quantitative
method by LC-MS/MS for collagen quantification in health supplements. The
method must be easy to implement, high sensitivity and practical application.
Objects and method of study
Objects: solid health supplements containing collagen.
Method: quantitative analyze collagen through underivatised 4-hydroxyproline. The
quantitative method uses HILIC-UPLC-MS/MS with electrospray ionization (ESI)
and multiple reaction monitoring (MRM) transition to determine target substance.
Optimize the mass spectrometry and liquid chromatography conditions (static phase,
mobile phase, gradient program, buffer concentration, acid formic concentration,
flow rate, re-equilibration for column). Investigate the optimum hydrolysis
conditions for the sample (temperature, time, volume of acid hydrochloric 6 N).
Validate of the quantitative method based on AOAC and ICH guidelines.
Results
The method was optimized the mass spectrometry and liquid chromatography
conditions to determine collagen in health supplements by HILIC-UPLC-MS/MS.
Hydrolyze 2 mg of sample in 6 hours, 110 ° C with 1 mL of acid hydrochloric 6 N.
The hydrolysis process achieved a high efficiency of 91.5% and has been
demontrated repeatable, linear. The method was validated for system suitability,
specificity, linearity, repeatability, accuracy, analytical range. It was applied the

method to quantify collagen in health supplements in market.
Conclusions
This study has developed a HILIC-UPLC-MS/MS method for the determination of
4-hydroxyproline to quantification collagen in health supplements. The method
showed a high sensitivity, specificity and simple. Also, the method was validated and
was applied to quantify collagen in health supplements in market.

.


i
.

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................. iii
DANH MỤC CÁC BẢNG ...............................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................. vii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ......................................................................... ix
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN .................................................................... 3
1.2. SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC (HILIC) .............................. 7
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG GHÉP ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ HAI LẦN
TỨ CỰC (LC-MS/MS)........................................................................................ 10
1.4. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID AMIN .............................................. 12
1.5. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN ......................................... 13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 17
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................................... 17
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 18

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................ 32
3.1. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS ............................................................................. 32
3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CỦA QUY TRÌNH THỦY PHÂN
COLLAGEN ........................................................................................................ 43
3.3. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG PHƯƠNG
PHÁP LC-MS/MS ............................................................................................... 49
3.4. PHÂN TÍCH MẪU THỰC ........................................................................... 54
3.5. DỰ THẢO QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG PHƯƠNG
PHÁP LC-MS/MS ............................................................................................... 54

.


ii
.

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ....................................................................................... 59
4.1. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS ............................................................................. 59
4.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CỦA QUY TRÌNH THỦY PHÂN
COLLAGEN ........................................................................................................ 62
4.3. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLLAGEN BẰNG PHƯƠNG
PHÁP LC-MS/MS ............................................................................................... 63
4.4. PHÂN TÍCH MẪU THỰC ........................................................................... 64
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................ 66
PHỤ LỤC

.



iii
.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ nguyên gốc

Từ tiếng Việt

AOAC

Association of Official

Hiệp hội các nhà hố phân

Analytical Chemists

tích chính thống

Atmospheric pressure chemical

Ion hóa hóa học ở áp suất khí

ionization

quyển


Atmospheric pressure

Ion hóa bằng photon tại áp

photoionization

suất khí quyển

APCI

APPI

AQC

6-aminoquinolyl-N-succinimidyl Thuốc thử 6-aminoquinolylcarbamat

N-succinimidyl carbamat

BP

British Pharmacopoeia

Dược điển Anh

CI

Chemical ionization

Ion hóa hóa học


DABS-Cl

Dimethylamino-

Thuốc thử dimethylamino-

azobenzensulfonyl clorid

azobenzensulfonyl clorid

Dược điển Việt Nam phiên

Dược điển Việt Nam phiên

bản V

bản V

ESI

Electrospray ionization

Ion hóa phun điện tử

FMOC-Cl

9-fluorenylmethyl cloroformat

Thuốc thử 9-fluorenylmethyl


DĐVN V

cloroformat
FT-IR

Fourier transform Infrared

Quang phổ hồng ngoại biến
đổi Fourier

HILIC

HPLC

Hydrophilic interaction

Sắc ký lỏng tương tác thân

chromatography

nước

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography
HPLC-MS

High performance liquid


Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography - Mass

ghép đầu dò khối phổ

spectrometry

.


iv
.

HPLC-MS/MS High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography - Tandem mass

ghép đầu dò khối phổ hai lần

spectrometry

tứ cực

IEC

Ion exchange chromatography


Sắc ký trao đổi ion

IP RPLC

Ion pairing Reversed - phase

Sắc ký pha đảo dùng cặp ion

liquid chromatography
Liquid chromatography - Mass

Sắc ký lỏng ghép đầu dò khối

spectrometry

phổ

Liquid chromatography -

Sắc ký lỏng ghép đầu dò khối

Tandem mass spectrometry

phổ hai lần tứ cực

MRM

Multiple Reaction Monitoring


Kỹ thuật ghi phổ MRM

MS

Mass spectrometry

Phổ khối

MS/MS

Tandem mass spectrometry

Hệ thống khối phổ hai lần tứ

LC-MS

LC-MS/MS

cực
NPLC

Normal - phase liquid

Sắc ký lỏng pha thuận

chromatography
OPA

ortho-phthalaldehyd


Thuốc thử orthophthalaldehyd

PITC

Phenylisothiocyanat

Thuốc thử
phenylisothiocyanat

RPLC

Reversed - phase liquid

Sắc ký lỏng pha đảo

chromatography
SEC

Size exclusion chromatography

Sắc ký rây phân tử

UPLC

Ultra performance liquid

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

chromatography
UPLC-MS/MS Ultra performance liquid


USP

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

chromatography- tandem mass

ghép đầu dò khối phổ hai lần

spectrometry

tứ cực

United States Pharmacopeia

Dược điển Mỹ

.


v
.

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các pha tĩnh thông dụng trong HILIC ...................................................... 9
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu định lượng collagen .................................................. 14
Bảng 2.3. Thông tin về mẫu thử ............................................................................... 17
Bảng 2.4. Danh mục các thiết bị sử dụng ................................................................. 19
Bảng 2.5. Danh mục các hóa chất sử dụng ............................................................... 20

Bảng 2.6. Các thông số khảo sát nguồn ion hóa điện tử........................................... 20
Bảng 2.7. Thơng số cột BEH HILIC và cột BEH Amide ........................................ 21
Bảng 2.8. Chương trình gradient khảo sát pha động ................................................ 22
Bảng 2.9. Chương trình gradient khảo sát thời gian tái cân bằng cột ...................... 24
Bảng 2.10. Giá trị của các yếu tố khảo sát điều kiện thủy phân ............................... 25
Bảng 2.11. Bảng mơ tả thí nghiệm khảo sát điều kiện thủy phân ............................ 25
Bảng 2.12. Thiết kế thí nghiệm đánh giá tính lặp lại của quy trình thủy phân ........ 26
Bảng 2.13. Thiết kế thí nghiệm đánh giá tính tuyến tính của quy trình thủy phân .. 27
Bảng 2.14. Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỷ lệ ion ...................................... 29
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát điều kiện khối phổ ...................................................... 33
Bảng 3.16. Thông số MRM phát hiện trans-4-Hydroxy-L-prolin ........................... 33
Bảng 3.17. Kết quả tiêm lặp lại 6 lần trên hai loại pha tĩnh ..................................... 34
Bảng 3.18. Kết quả tiêm lặp lại của hệ pha động 3 và 4 .......................................... 39
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát gradient hệ 4 ............................................................... 39
Bảng 3.20. Kết quả so sánh chương trình gradient pha động và chế độ đẳng dòng ....
...................................................................................................................................40
Bảng 3.21. Kết quả khảo sát nồng độ đệm ............................................................... 41
Bảng 3.22. Kết quả tiêm lặp lại 6 lần trên hệ 4.2 và hệ 4.3 ...................................... 41
Bảng 3.23. Kết quả tiêm lặp lại 10 lần trên hệ 4.2 và hệ 4.3 ................................... 41
Bảng 3.24. Kết quả khảo sát tốc độ dòng ................................................................. 42
Bảng 3.25. Kết quả khảo sát thời gian tái cân bằng cột ........................................... 42
Bảng 3.26. Kết quả khảo sát điều kiện thủy phân collagen ..................................... 43

.


vi
.

Bảng 3.27. Thiết kế thí nghiệm đánh giá tính lặp lại của quy trình thủy phân collagen

................................................................................................................................... 45
Bảng 3.28. Kết quả thủy phân 3 mẫu chuẩn collagen cùng nồng độ ....................... 46
Bảng 3.29. Kết quả thủy phân 6 mẫu chuẩn collagen riêng biệt .............................. 46
Bảng 3.30. Thiết kế thí nghiệm đánh giá tính tuyến tính của quy trình thủy phân
collagen ..................................................................................................................... 47
Bảng 3.31. Kết quả tính tuyến tính của quy trình thủy phân collagen ..................... 47
Bảng 3.32. Kết quả hiệu suất quy trình thủy phân collagen ..................................... 48
Bảng 3.33. Kết quả tính tương thích hệ thống .......................................................... 49
Bảng 3.34. Kết quả độ lặp lại ................................................................................... 52
Bảng 3.35. Kết quả độ đúng ..................................................................................... 53
Bảng 3.36. Kết quả phân tích mẫu thực ................................................................... 54
Bảng 4.37. u cầu của quy trình phân tích định lượng sử dụng đầu dò MS .......... 63

.


vii
.

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc của collagen ................................................................................. 4
Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo: (A) trans-4-Hydroxy-L-prolin; (B) dạng ion lưỡng tính
của trans-4-Hydroxy-L-prolin; (C) dạng cation của trans-4-Hydroxy-L-prolin; (D)
dạng anion của trans-4-Hydroxy-L-prolin .................................................................. 5
Hình 1.3. HILIC kết hợp nguyên lý của 3 kỹ thuật sắc ký lỏng................................. 7
Hình 1.4. Cơ chế lưu giữ trong HILIC ....................................................................... 8
Hình 1.5. Sơ đồ khối hệ thống LC-MS/MS: (1) Hệ thống sắc ký lỏng, (2) Nguồn ion
hóa, (3) Tứ cực thứ nhất, (4) Buồng va chạm, (5) Tứ cực thứ hai, (6) Bộ phận phát
hiện và ghi nhận kết quả............................................................................................ 10

Hình 1.6. Ảnh thực tế hệ sắc ký lỏng Acquity UPLC® H class (Waters) kết hợp đầu
dị TQ Detector .......................................................................................................... 12
Hình 2.7. (A) Lọ chất chuẩn trans-4-Hydroxy-L-prolin; (B) Lọ chất chuẩn collagen
................................................................................................................................... 17
Hình 3.8. Phổ khối: (A) ion mẹ của trans-4-Hydroxy-L-prolin (m/z = 131,9); (B) 2
mảnh ion con của trans-4-Hydroxy-L-prolin (m/z = 85,9 và m/z = 67,7) ................ 32
Hình 3.9. Sắc ký đồ khảo sát pha tĩnh: (A) cột BEH HILIC; (B) cột BEH Amide ....
................................................................................................................................... 34
Hình 3.10. Sắc ký đồ khảo sát hệ 1: (A) gradient 1; (B) gradient 3; (C) gradient 5 ....
................................................................................................................................... 35
Hình 3.11. Sắc ký đồ khảo sát hệ 2: (A) gradient 1; (B) gradient 3; (C) gradient 5 ....
................................................................................................................................... 36
Hình 3.12. Sắc ký đồ khảo sát hệ 3: (A) gradient 1; (B) gradient 2; (C) gradient 3;
(D) gradient 4; (E) gradient 5 .................................................................................... 37
Hình 3.13. Sắc ký đồ khảo sát hệ 4: (A) gradient 1; (B) gradient 2; (C) gradient 3;
(D) gradient 4; (E) gradient 5 .................................................................................... 39
Hình 3.14. Đường chuẩn đánh giá tính tuyến tính của quy trình thủy phân collagen
do phần mềm MassLynx®4.1 xây dựng .................................................................... 47

.


viii
.

Hình 3.15. Đường chuẩn đánh giá hiệu suất của quy trình thủy phân collagen do phần
mềm MassLynx®4.1 xây dựng .................................................................................. 48
Hình 3.16. Sắc ký đồ tính đặc hiệu: (A) Mẫu trắng; (B) Mẫu chuẩn collagen; (C) Mẫu
chuẫn trans-4-Hydroxy-L-prolin; (D) Mẫu giả lập; (E) Mẫu giả lập + chuẩn trans-4Hydroxy-L-prolin ......................................................................................................51
Hình 3.17. Đường chuẩn thẩm định tính tuyến tính trans-4-Hydroxy-L-prolin do

phần mềm MassLynx®4.1 xây dựng ......................................................................... 52
Hình 3.18. Miền giá trị của quy trình định lượng collagen ...................................... 53

.


ix
.

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân ..................................................... 44
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân ..................................................... 44
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của thể tích acid hydroclorid 6 N ...................................... 45

.


1
.

MỞ ĐẦU
Protein cấu trúc là loại protein đóng vai trị rất quan trọng trong thành phần cấu tạo
của cơ thể, giúp hình thành cấu trúc của tế bào, mơ và các cơ quan. Một trong những
protein cấu trúc quan trọng nhất, phong phú nhất trong cơ thể động vật có vú là
collagen. Đối với da, collagen có vai trị liên kết và tạo sự đàn hồi. Với cơ xương
khớp, nó là thành phần cấu tạo và đảm bảo chức năng vận động của cơ thể. Ngồi ra,
collagen cịn có vai trò quan trọng trong nhiều cơ quan khác như mạch máu, răng,
tóc. Trong cơ thể, collagen chiếm khoảng một phần ba lượng protein, ba phần tư trọng
lượng khô của da và được tìm thấy có trong mơ liên kết, mơ cơ, xương, dây chằng,

sụn, da, mạch máu, răng. Cho đến nay, có 28 loại collagen khác nhau đã được xác
định [12], [14].
Collagen được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: y học, dược phẩm, mỹ
phẩm, thực phẩm. Nhiều thực phẩm chức năng có chứa collagen với các dạng bào
chế như viên uống, dung dịch uống nhằm giúp tăng độ đàn hồi của da. Collagen cũng
là một thành phần có trong nhiều mỹ phẩm dùng cho da với nhiều cách sử dụng như
tiêm vào lớp hạ bì, bơi hoặc đắp lên da, tắm, ngâm. Bên cạnh đó, collagen cịn được
sử dụng trong cơng nghệ thực phẩm như là chất đông, chất gây lắng trong sản xuất
bánh kẹo, sản xuất sữa, sản xuất đồ uống, chế biến thịt.
Chính vì được sử dụng rộng rãi nên việc kiểm soát chất lượng collagen trong các sản
phẩm là điều cần thiết. Tuy nhiên, DĐVN V và một số Dược điển tham chiếu như
BP năm 2017, USP 40 năm 2017 khơng có chun luận collagen [1], [42], [43]. Một
số phương pháp được sử dụng để phân tích xác định collagen như: kiểm tra nhiệt độ
biến tính, định lượng bằng phương pháp đo quang, phương pháp quang phổ hồng
ngoại và phổ biến nhất là sắc ký lỏng. Tại Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu
định lượng collagen trên nền mẫu thực phẩm chức năng áp dụng phương pháp LCMS/MS. Do vậy, cần nghiên cứu tìm quy trình định lượng bằng phương pháp LCMS/MS phù hợp để xác định hàm lượng collagen có trong thực phẩm chức năng với
u cầu có tính đặc hiệu, độ nhạy, độ chính xác cao, đơn giản và có khả năng ứng
dụng tốt trên thực tế.

.


2
.

Xuất phát từ nhu cầu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình
định lượng collagen trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp LCMS/MS”. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là:
1. Tìm điều kiện sắc ký định lượng collagen trong thực phẩm chức năng bằng phương
pháp LC-MS/MS.
2. Tìm điều kiện tối ưu để thủy phân collagen trong thực phẩm chức năng.

3. Thẩm định quy trình định lượng collagen trong thực phẩm chức năng bằng phương
pháp LC-MS/MS.
4. Ứng dụng quy trình đã thẩm định để xác định hàm lượng collagen có trong một số
chế phẩm thực phẩm chức năng đang lưu hành trên thị trường.

.


3
.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN
Collagen là một loại protein cấu trúc có trong cơ thể động vật. Nghiên cứu của M.D.
Shoulders và cộng sự cho thấy collagen là protein phong phú nhất, chiếm ba phần tư
trọng lượng khô của da và chiếm khoảng một phần ba lượng protein trong cơ thể động
vật có vú [36]. Collagen được tìm thấy có trong da, mơ cơ, xương, dây chằng, sụn,
mạch máu, răng và đóng vai trị thực hiện một loạt các chức năng sinh học quan trọng
ở những nơi mà nó có mặt mặc dù tỷ lệ phân bố của collagen ở các mô và cơ quan là
không giống nhau. Cho đến nay đã xác định được 42 gen mã hóa cho 28 loại collagen
khác nhau trong đó collagen type I được tìm thấy nhiều nhất ở động vật [14], [16].
1.1.1. Thành phần, cấu trúc và chức năng của collagen
Thành phần
Collagen được tạo thành từ các acid amin, trong đó đặc biệt là hàm lượng của prolin
và 4-hydroxyprolin cao hơn so với các loại protein khác. Theo nghiên cứu của M.E.
Nimni và cộng sự [26], acid amin có trong collagen người nhiều nhất là glycin chiếm
khoản 33%, tiếp theo là prolin và 4-hydroxyprolin mỗi acid amin chiếm khoản 10%.
Một số acid amin khác cũng được tìm thấy trong collagen là alanin, acid glutamic,
acid aspartic, 3-hydroxyprolin, arginin, serin, threonin, lysin, leucin, isoleucin,
tyrosin, phenylalanin, methionin, histidin [26].

Cấu trúc
Phân tử collagen là một protein dạng sợi gồm ba chuỗi polypeptid α. Các chuỗi này
phân biệt với nhau về thành phần và tỷ lệ acid amin. Cấu trúc của chuỗi polypeptid α
đặc trưng bởi sự lặp lại của các bộ ba acid amin là (Gly-X-Y)n. Thông thường X là
prolin và Y là 4-hydroxyprolin. Bộ ba acid amin (Gly-Pro-Hyp) là loại phổ biến nhất
trong collagen, chiếm khoản 10% [26]. Trong không gian, mỗi chuỗi polypeptid α
được sắp xếp theo đường xoắn ốc về bên trái. Sau đó, ba chuỗi xoắn polypeptid α sẽ
liên kết với nhau nhờ các liên kết hydro và xoắn về bên phải. Sự xoắn theo hai chiều
này tạo nên cấu trúc bền vững của collagen. Nhiều phân tử collagen kết hợp với nhau
thành sợi nhỏ collagen (microfibril), nhiều sợi nhỏ kết hợp với nhau tạo thành sợi

.


4
.

collagen (fibril) và nhiều sợi collagen kết hợp với nhau tạo thành bó sợi collagen
tham gia vào chức năng liên kết của collagen (fiber).
Sợi nhỏ collagen
Bó sợi collagen

Phân tử
collagen

Sợi collagen

Chuỗi polypeptid α
Chuỗi xoắn ba
Hình 1.1. Cấu trúc của collagen

Ngồi ra, các phân tử collagen cịn có thể liên kết ở dạng khơng tạo thành bó sợi (nonfibrillar collagen). Dạng cấu trúc này có thể là dạng mạng (collagen type IV), mạng
6 cạnh (collagen type VIII, X), dạng sợi với hai đầu có hình dạng mỏ neo (collagen
type VII), dạng sợi với hai đầu tròn xếp chồng lên nhau (collagen type VI) [12], [14].
Chức năng
Chức năng quan trọng nhất của collagen là chức năng cơ học, đó là khả năng duy trì
một hình dạng trong giới hạn hoạt động bình thường của cơ quan hoặc mơ dưới tác
động bên ngồi. Ví dụ như sự thay đổi lớn về kích thước của tử cung trong thai kỳ,
khả năng chịu áp lực cực lớn của động mạch, tác dụng của sụn giúp giảm chấn động
và cọ xát giữa hai đầu xương khi cử động khớp… đều có được nhờ vào chức năng cơ
học của khung collagen.
Ngồi ra, collagen cịn có chức năng lưu trữ năng lượng ở lớp da, các dây chằng và
gân. Chức năng này giúp tạo cho da khả năng hấp thụ và phân tán năng lượng khi có
lực tác động vào, giảm tác động của lực hấp dẫn khi cơ thể vận động. Một chức năng
khác của collagen là khả năng thay đổi kích thước và tính chất cơ học của các tế bào,
như trong trường hợp các tế bào da và tử cung phải thay đổi kích thước, hình dạng và
tính chất cơ học để thích nghi với sự lớn lên từng ngày của bào thai.

.


5
.

1.1.2. Hydroxyprolin
Hydroxyprolin là một dẫn xuất acid amin không thiết yếu được hình thành trong quá
trình biến đổi protein sau dịch mã. Nó đóng vai trị ổn định cấu trúc xoắn của collagen
bằng cách tạo liên kết hydro với các acid amin khác. Trong collagen, hydroxyprolin
được tìm thấy có 2 đồng phân là 4-hydroxyprolin và 3-hydroxyprolin, tuy nhiên hàm
lượng của 3-hydroxyprolin là rất thấp, khoản 0,2% [26]. Ngoài collagen, 4hydroxyprolin cũng được tìm thấy trong elastin nhưng với tỷ lệ thấp hơn nhiều. Trong
hỗn hợp đồng lượng của collagen và elastin, 4-hydroxyprolin từ collagen chiếm

93,2% và 4-hydroxyprolin từ elastin đóng góp 6,8% [39].

(A)

(B)

(C)

(D)

Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo: (A) trans-4-Hydroxy-L-prolin; (B) dạng ion lưỡng
tính của trans-4-Hydroxy-L-prolin; (C) dạng cation của trans-4-Hydroxy-L-prolin;
(D) dạng anion của trans-4-Hydroxy-L-prolin.

4-hydroxyprolin
Danh pháp IUPAC: (2S,4R)-4-hydroxypyrrolidin-2-carboxylic acid
Công thức phân tử: C5H9NO3
CAS No.:

51-35-4

Khối lượng phân tử: 131,131 g/mol
Tính tan:

rất tan trong nước, hơi tan trong rượu, không tan trong ether [18]

pKa:

pKa1 = 1,82


.

pKa2 = 9,65


6
.

Điểm đẳng điện:

pHi = 5,73

Điểm nóng chảy:

270 °C

4-hydroxyprolin có dạng tinh thể khơng màu, phân tử có tính quang hoạt. Trong tự
nhiên, 4-hydroxyprolin tồn tại ở dạng l-hydroxyprolin, hay trans-4-Hydroxy-Lprolin. Đây cũng là dạng sử dụng có sẵn trên thị trường [18]. Ở điểm đẳng điện (pH
= pHi), 4-hydroxypolin tồn tại ở cả 3 dạng cation, anion và ion lưỡng tính và khả năng
hịa tan là thấp nhất. Ở pH ≤ pKa1, 4-hydroxyprolin chuyển hoàn toàn thành dạng
cation. Ở pH ≥ pKa2, 4-hydroxyprolin chuyển hoàn toàn thành dạng anion.
4-hydroxyprolin là một acid amin đặc trưng của collagen với hàm lượng từ 12-14%
[26], [39]. Do hàm lượng cao và tính đại diện đặc trưng nên 4-hydroxyprolin đã được
sử dụng để xác định lượng collagen có trong mơ hoặc các mẫu sinh học [11], [30].
1.1.3. Ứng dụng của collagen
Trong y học:
Collagen là một chất có mùi vị trung hịa, khơng gây dị ứng, được hấp thụ hoàn toàn
trong cơ thể con người nên có nhiều ứng dụng trong y học.
- Chế tạo các loại vật liệu cầm máu do có tính tương thích sinh học cũng như khả
năng tạo lớp màng tự nhiên và bền về cơ học.

- Có thể sử dụng làm chất thay thế máu tạm thời “Plasma expander” phục hồi lại thể
tích máu đã mất và duy trì mức áp suất thích hợp trong mạch máu. Thành phần của
“Plasma expander” có chứa khoảng 3,5 – 5,5% collagen.
- Đặc biệt trong kỹ thuật nội soi, collagen hydrolysat được ứng dụng để bôi trơn các
ống nội soi, giúp dễ dàng đưa các ống này vào cơ thể bệnh nhân mà không gây đau.
- Collagen được dùng trong phẫu thuật thẩm mỹ tạo hình như bơm mơi, căng da mặt.
Trong dược phẩm:
Collagen được sử dụng khá nhiều nhờ các đặc tính kết dính, dẻo dai, được hấp thụ dễ
dàng vào trong cơ thể và không gây dị ứng.
- Sản phẩm thủy phân của collagen là gelatin được sử dụng để sản xuất vỏ viên nang.
- Là một chất keo bảo vệ các thành phần nhạy cảm khỏi tác động của sự oxy hóa ánh
sáng, sự hấp thụ ẩm; tạo mùi vị trung hòa; là chất ổn định của hệ nhũ tương, hỗn dịch.
- Là chất tạo bọt trong sản xuất chất bọt cầm máu.

.


7
.

Trong mỹ phẩm:
Collagen có tác dụng chống lão hóa da, ngăn ngừa và cải thiện nếp nhăn trên da.
Collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như sức căng,
độ đàn hồi; đồng thời duy trì độ ẩm, làm cho da được mịn màng, tươi tắn và trẻ trung.
Ngồi ra, collagen cịn được bổ sung vào một số sản phẩm dưỡng tóc để phục hồi tóc.
Do có nhiều tác dụng đối với da nên collagen là một thành phần có trong mỹ phẩm
dưỡng da, làm đẹp da với nhiều dạng bào chế như: collagen tiêm (vào lớp hạ bì),
collagen dùng ngồi (bơi, đắp, tắm, ngâm).
Trong thực phẩm:
Collagen được dùng làm nguyên liệu sản xuất nhiều loại thực phẩm chức năng được

giới thiệu giúp tăng độ đàn hồi cho da, căng mịn da, giảm vết nhăn, ngăn ngừa q
trình hình thành lão hóa da, giúp hỗ trợ cho tóc chắc khỏe và hạn chế rụng tóc. Thực
phẩm chức năng collagen được bào chế ở nhiều dạng như viên uống, nước uống, bột
pha uống với thành phần đơn chất hay kết hợp với các chất khác.
Collagen còn được dùng để làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo, chất phụ gia trong
sản xuất sữa, làm sạch rượu vang, bia và nước trái cây.
1.2. SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC (HILIC)
Sắc ký lỏng tương tác thân nước (Hydrophilic
interaction chromatography - HILIC) là kỹ thuật

RPLC

sắc ký lỏng cho khả năng lưu giữ và phân tách
hiệu quả các hợp chất phân cực và có tính thân

HILIC

nước từ trung bình đến cao. HILIC sử dụng các
pha tĩnh thân nước giống như sắc ký lỏng pha

NPLC

IEC

thuận (NPLC) kết hợp với pha động là hỗn hợp
nước và dung môi hữu cơ phân cực thường được
sử dụng trong sắc ký lỏng pha đảo (RPLC). Hơn

Hình 1.3. HILIC kết hợp nguyên
lý của 3 kỹ thuật sắc ký lỏng


nữa, HILIC cịn có thể lưu giữ và tách các hợp
chất ion hóa mà thông thường phải sử dụng sắc ký trao đổi ion (IEC) hoặc sắc ký pha
đảo dùng cặp ion (IP-RPLC) [33]. Hiện nay, HILIC cho thấy nhiều ứng dụng trong
phân tích amino acid, peptid, carbohydrat, kháng sinh… [13], [23].

.


8
.

Cơ chế lưu giữ:
Khả năng tách trong HILIC dựa trên việc sử dụng pha tĩnh thân nước kết hợp với pha
động là hỗn hợp dung môi hữu cơ – nước với hàm lượng dung mơi hữu cơ cao. Các
nhóm chức thân nước trên bề mặt của pha tĩnh lưu giữ mạnh các phân tử nước từ pha
động, tạo thành một lớp nước hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh. Do đó, một chất phân
tích phân cực hịa tan trong pha động sẽ được phân bố và lưu giữ giữa hai pha lỏng:
lớp nước hấp phụ cố định trên bề mặt của pha tĩnh và lớp pha động giàu dung môi
hữu cơ. Ngồi ra sự lưu giữ cịn có thể do liên kết hydro giữa các nhóm chức phân
cực của chất phân tích và pha tĩnh, tương tác tĩnh điện trên các nhóm chức ion hóa
của chất phân tích và pha tĩnh, lực van der Waals giữa các phần kỵ nước của pha tĩnh
(hoặc nhóm siloxan, ở nồng độ dung mơi hữu cơ rất thấp) và phần không phân cực
của chất phân tích cũng được ghi nhận [9], [33].
Tương tác
thân nước
Lớp nước hấp
phụ trên bề
mặt pha tĩnh


Pha động
với lượng
dung môi
hữu cơ cao

Liên kết hydro

Tương tác
tĩnh điện

Hình 1.4. Cơ chế lưu giữ trong HILIC
Pha tĩnh:
Các vật liệu được sử dụng làm pha tĩnh trong HILIC có hai đặc tính. Một là có tính
thân nước để tạo lớp nước hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh, hai là có thể tương tác cụ thể
với chất phân tích góp phần vào việc lưu giữ. Các pha tĩnh silica đã được sử dụng

.


9
.

rộng rãi trong phân tách HILIC. Các nhóm silanol bề mặt đóng vai trị chính cho khả
năng hấp phụ nước của bề mặt silica. Tuy nhiên, tính acid của các nhóm silanol
thường dẫn đến kết quả pic bị kéo đi khi chất phân tích có tính base. Vì vậy các
pha tĩnh silica dẫn xuất được tạo ra bằng cách gắn thêm các nhóm chức hóa học trên
bề mặt để khắc phục tình trạng này, như pha tĩnh silica dẫn xuất trung tính, cation
hoặc anion và ion lưỡng tính (zwiterionic) [28]. Hiện nay có rất nhiều loại pha tĩnh
HILIC có sẵn trên thị trường như silica không dẫn xuất, silica dẫn xuất với các nhóm
chức có độ phân cực khác nhau như nhóm amin, diol, amide, cyano, sulfobetaine...

Bảng 1.1. Các pha tĩnh thơng dụng trong HILIC [9]
Loại pha tĩnh

Nhóm chức

Silica khơng dẫn

Cấu trúc

Hạt silica trần

xuất
Dẫn xuất silica

Diol

trung tính

Amide

Cyano

Dẫn xuất silica

Sulfobetaine

lưỡng tính
Dẫn xuất silica

Amin


cation
Pha động:

Pha động được sử dụng trong HILIC thường bao gồm hỗn hợp nước (hoặc dung dịch
đệm) trộn với dung mơi hữu cơ, trong đó dung mơi hữu cơ là dung môi rửa giải yếu

.


10
.

và nước là dung môi rửa giải mạnh nhất. Thứ tự rửa giải tăng dần [9]:
tetrahydrofuran < acetone < acetonitrile < isopropanol < ethanol < methanol < nước
Hàm lượng nước của pha động trong HILIC thường dao động từ 5 – 40%. Hàm lượng
nước cao hơn có thể làm giảm đáng kể hoặc thậm chí ngăn cản sự lưu giữ các chất
tan phân cực. Tuy nhiên, một lượng nhỏ nước (tối thiểu là 2%) bắt buộc phải có trong
pha động để tạo thành một lớp giàu nước trên bề mặt của pha tĩnh phân cực, đảm bảo
khả năng lưu giữ các chất phân tích phân cực [33]. Bên cạnh tính chất hóa học của
pha tĩnh, một số yếu tố liên quan đến pha động như bản chất của dung môi hữu cơ,
pH, độ mạnh và nồng độ dung dịch đệm, tính chất và nồng độ chất thêm vào, đều có
ảnh hưởng đáng kể đến khả năng lưu giữ và rửa giải chất phân tích trong HILIC.
Trong các hướng dẫn chung về HILIC, thành phần muối đệm được thêm vào pha
động để giảm hiện tượng kéo đuôi và/hoặc kém lưu giữ các chất phân tích. Nhiều
nghiên cứu cho thấy nếu khơng có muối đệm dẫn đến thời gian lưu dài hơn và các
đỉnh rất rộng trên cột amide, cyclodextrin, cyano, amino [9], [28]. Do khả năng hịa
tan tốt trong dung mơi hữu cơ, nên các dung dịch đệm dùng trong HILIC là muối
amoni của acid acetic, acid formic. Chất thêm vào pha động có thể là acid formic,
acid acetic, ammoni hydroxid, triethylamin. Những muối đệm và các chất thêm vào

này có ưu điểm là dễ bay hơi kết hợp với pha động có thành phần dung mơi hữu cơ
cao nên HILIC có thể dễ dàng kết hợp với đầu dị khối phổ trong LC-MS hoặc LCMS/MS [23], [35].
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG GHÉP ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ HAI LẦN
TỨ CỰC (LC-MS/MS)

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

Hình 1.5. Sơ đồ khối hệ thống LC-MS/MS: (1) Hệ thống sắc ký lỏng, (2) Nguồn
ion hóa, (3) Tứ cực thứ nhất, (4) Buồng va chạm, (5) Tứ cực thứ hai, (6) Bộ phận
phát hiện và ghi nhận kết quả.

.


11
.

Sắc ký lỏng là phương pháp sắc ký tách các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của
chúng giữa hai pha khơng trộn lẫn vào nhau, trong đó pha động là một chất lỏng chảy
qua pha tĩnh được giữ cố định [2].

1.3.1. Sắc ký lỏng siêu hiệu năng
Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) là kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng
được hãng Waters phát triển và giới thiệu vào năm 2004. Kỹ thuật này đang được
ứng dụng ngày càng rộng rãi. Ưu điểm của UPLC là tăng độ phân giải, tăng độ nhạy,
tăng độ chọn lọc, độ nhạy, độ lặp lại cũng như độ tái lập, giảm thời gian phân tích
mẫu và giảm lượng dung môi sử dụng. Sự tăng hiệu năng là do thay đổi về sự phân
tán nhờ sử dụng cỡ hạt pha tĩnh < 2 µm, tốc độ dịng thấp giúp giảm sự mở rộng dãi
(giảm chiều rộng pic ở đáy). Đường kính trong của cột nhỏ, chiều dài ống mao quản
giảm, bộ phận kết nối thiết bị, thể tích tế bào dòng của đầu dò nhỏ là những yếu tố
làm giảm sự phân tán hệ thống. Việc sử dụng UPLC sẽ giúp giảm chi phí cho một lần
phân tích nhờ thời gian phân tích ngắn, giảm lượng dung mơi sử dụng, đồng thời kết
quả phân tích đáng tin cậy hơn.
1.3.2. Khối phổ
Đầu dị khối phổ là đầu dị có độ nhạy cao và độ chọn lọc cao. Ngồi thơng tin sắc ký
đồ, khối phổ (MS) cịn có thế cung cấp các thông tin về phổ khối lượng của từng chất
nên rất phù hợp để ứng dụng trong phân tích các chất trong nền mẫu phức tạp như
thực phẩm (protein) [1]. Khối phổ gồm có ba bộ phận chính là nguồn ion hóa, bộ
phân tích khối và bộ phận phát hiện. Mẫu sau khi được chiết tách từ hệ thống sắc ký
lỏng được đưa vào khối phổ, sau đó sẽ được ion hóa trong nguồn ion hóa rồi được
chuyển đến bộ phận phân tích khối để tách các ion khác nhau theo tỉ số m/z. Các ion
được bộ phận phát hiện thu nhận, chuyển tín hiệu vào máy tính để xử lý.
Một số cách tạo ion thường được áp dụng là: ion hóa phun điện tử (ESI); ion hóa hóa
học ở áp suất khí quyển (APCI); ion hóa hóa học (CI) và ion hóa bằng photon tại áp
suất khí quyển (APPI). Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI thường được sử dụng
nhiều nhất trong LC-MS, LC-MS/MS.
ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất dễ phân ly, tan trong
dung dịch có khối lượng phân tử lớn [1]. ESI có khả năng tạo thành ion dương hoặc

.