.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐINH THỊ THANH LOAN

XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CLORAMPHENICOL,
FLORFENICOL, THIAMPHENICOL, OFLOXACIN,
CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN CĨ TRONG NƢỚC THẢI
NI TRỒNG THỦY SẢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐINH THỊ THANH LOAN

XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CLORAMPHENICOL,
FLORFENICOL, THIAMPHENICOL, OFLOXACIN,
CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN CĨ TRONG NƢỚC THẢI
NI TRỒNG THỦY SẢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS

Ngành:

Kiểm nghiệm thuốc và độc chất

Mã số :

8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

Hƣớng dẫn khoa học:

TS. ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ
PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018

.


.

Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học – Khóa: 2016 – 2018
Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất – Mã số: 8720210

XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CLORAMPHENICOL, FLORFENICOL,
THIAMPHENICOL, OFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN
CÓ TRONG NƢỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS
Đinh Thị Thanh Loan
Thầy hƣớng dẫn: TS. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn
Từ khóa: cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin,
enrofloxacin, LC –MS/MS, nƣớc thải, phenicol, quinolon.
Mở đầu: Kháng sinh đóng vai trị quan trọng trong chăm sóc sức khỏe nhân dân, phịng và
trị bệnh trong chăn ni và ni trồng thủy sản. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không
hợp lý đã gây nên hiện tƣợng kháng thuốc, tồn dƣ thuốc trong nƣớc thải, vật ni. Bên
cạnh đó, sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng trở nên đáng báo động.
Do có phổ kháng khuẩn rộng và khả năng phân bố tốt nên nhóm phenicol và nhóm
quinolon đƣợc dùng rất phổ biến. Trong đó, đƣợc sử dụng nhiều là cloramphenicol,
florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin. Hiện nay, đã có một số
nghiên cứu phân tích riêng lẻ các kháng sinh trên bằng phƣơng pháp LC-MS/MS nhƣng
chƣa có cơng bố về định lƣợng đồng thời 6 kháng sinh trên, đặc biệt là trên các mẫu nƣớc
thải nuôi trồng thủy sản.
Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin,
ciprofloxacin, enrofloxacin có trong mẫu nƣớc thải nuôi trồng thủy sản.
Phương pháp nghiên cứu: Xây dựng qui trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol,
florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải nuôi
trồng thủy sản bằng kỹ thuật UPLC-MS/MS với bộ phận ion hóa phun điện tử. Các kháng
sinh và nội chuẩn đƣợc tách trên cột sắc ký pha đảo, sử dụng hệ pha động gồm acetonitril,
methanol, nƣớc chứa acid formic. Qui trình định lƣợng đƣợc thẩm định theo hƣớng dẫn
của EC-657/2002.
Kết quả: Cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin,
enrofloxacin, nội chuẩn cloramphenicol-d5 và norfloxacin đƣợc ion hóa kiểu ESI với kỹ
thuật ghi phổ MRM để thu đƣợc các mảnh mẹ và mảnh con dùng cho định lƣợng lần lƣợt

nhƣ sau: m/z 321,14  152,01, m/z 356,14  335,94, m/z 354,14  184,98, m/z 362,22
 261,03, m/z 332,29  231,08, m/z 360,35  245,17, m/z 326,14  156,95, m/z
320,16  233,01. Điều kiện sắc ký bao gồm cột Agilent ZORBAX Eclipse Plus (150 x 4,6
mm; 3,5 µm), pha động gồm acetonitril, methanol, nƣớc chứa acid formic theo chƣơng
trình gradient, tốc độ dòng 1 ml/phút. Miền giá trị của các kháng sinh nằm trong khoảng 1200 ppb (r > 0,99). Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của 6 kháng sinh lần lƣợt
nằm trong khoảng 0,1-1 ppb và 0,4-4 ppb. Các chỉ tiêu về tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính
xác đều cho kết quả nằm trong giới hạn cho phép.
Kết luận: Đề tài đã xây dựng và thẩm định thành cơng qui trình định lƣợng đồng thời
cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacinn, ciprofloxacin, enrofloxacin trong
nƣớc thải nuôi trồng thủy sản bằng phƣơng pháp UPLC–MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu
và độ chính xác cao. Do đó, qui trình có thể đƣợc ứng dụng để xác định dƣ lƣợng 6 kháng
ản.
.


.

Master’s Thesis – Academic course: 2016 - 2018
Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210
SIMULTANEOUS DETERMINATION OF CHLORAMPHENICOL,
FLORFENICOL, THIAMPHENICOL, OFLOXACIN, CIPROFLOXACIN,
ENROFLOXACIN IN AQUACULTURE WASTEWATER BY LC-MS/MS
Dinh Thi Thanh Loan
Supervisor: Dr. Do Chau Minh Vinh Tho, Assoc. Prof. Dr. Nguyen Duc Tuan
Keywords: LC-MS/MS, wastewater, chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol,
ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, quinolone, phenicol.
Introduction: Antibiotics play an important role in people's health care, prevention and
treatment in livestock and aquaculture. However, unreasonably antibiotics use cause drug
resistance, drug residues in wastewater, and livestock. In addition, the spread of resistant
strains of bacteria is becoming increasingly alarming. Due to its broad spectrum of

antibacterial activity and its ability to distribute well, phenol and quinolone are commonly
used. The most commonly used ones are chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol,
ofloxacin, ciprofloxacin, and enrofloxacin. At present, there are some studies on analyzing
separately these antibiotics by LC-MS/MS methods, but there is no published quantitative
information on these 6 antibiotics, especially in aquaculture wastewater samples.
Materials and methods
Object of study: Chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, and
enrofloxacin in aquaculture wastewater samples.
Methods: A method for quantification of chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol,
ofloxacin, ciprofloxacin, and enrofloxacin in aquaculture wastewater was developed by
UPLC-MS/MS equipped with an electrospray ionization source. Six antibiotics and 2
internal standards (IS) were seperated on a C18 reversed phase column, and finally eluted
with acetonitrile, methanol, and water with formic acid. The assay was validated in
compliance with EC-657/2002 guideline.
Results: Electrospray ionization source operated in positive and negative mode, and multi
reaction monitoring (MRM) mode were applied for analysis of chloramphenicol,
florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, chloramphenicol-d5 IS,
and norfloxacin, using the transition of m/z 332.29  231.08, m/z 362.22  261.03, m/z
360.35  245.17, m/z 320.16  233.01, m/z 321.14  152.01, m/z 326.14  156.95,
m/z 354.14  184.98, m/z 356.14  335.94, respectively for quantification. LC
conditions contain Agilent ZORBAX Eclipse Plus (150 x 4.6 mm; 3.5 µm) column, mobile
phase of acetonitrile – methanol - water with formic acid in gradient mode, and flow rate
of 1 mL/min. This method was validated and met the requirements of widely linearity
range (1-200 ppb) with high correlation coefficient (r > 0.99), very good accuracy
(recovery of 81.2-109.2%) and intra-day precision (RSD < 6.63%), and typical LOD and
LOQ values in the range of 0.1-1 ppb and 0.4-4 ppb for six antibiotics, respectively.
Conclusion: A highly sensitive, specific, reproducible and rapid UPLC-MS/MS method
for simultaneous determination of chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin,
ciprofloxacin, enrofloxacin in aquaculture wastewater was successfully developed and
validated. This method can be useful for monitoring level of these antibiotics in

aquaculture wastewater samples.
.


.

LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này đƣợc đảm bảo tính trung thực và chƣa
từng đƣợc ai cơng bố trong bất kì cơng trình nghiên cứu khác.
Ngƣời cam đoan

Đinh Thị Thanh Loan

.


.

i

MỤC LỤC
Trang
TRANG PHỤ BÌA
TĨM TẮT
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC ................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................ vi
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................viii

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ........................................................... ix
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 2
1.1. Tổng quan về cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin,
ciprofloxacin, enrofloxacin ........................................................................................ 2
1.1.1. Tổng quan về cloramphenicol .......................................................................... 2
1.1.1.1. Cấu trúc, tên hóa học ..................................................................................... 2
1.1.1.2. Tính chất ........................................................................................................ 2
1.1.1.3. Định tính ........................................................................................................ 2
1.1.1.4. Định lƣợng .................................................................................................... 3
1.1.1.5. Dƣợc lý và cơ chế tác dụng .......................................................................... 3
1.1.1.6. Tác dụng phụ và độc tính ............................................................................. 3
1.1.2. Tổng quan về florfenicol .................................................................................. 4
1.1.2.1. Cấu trúc, tên hóa học ..................................................................................... 4
1.1.2.2. Tính chất ....................................................................................................... 4
1.1.2.3. Định tính ........................................................................................................ 5
1.1.2.4. Định lƣợng .................................................................................................... 5
1.1.2.5. Dƣợc lý và cơ chế tác dụng ........................................................................... 6
1.1.2.6. Tác dụng phụ và độc tính ............................................................................. 6

.


.

ii

1.1.3. Tổng quan về thiamphenicol ............................................................................ 7
1.1.3.1. Cấu trúc, tên hóa học ..................................................................................... 7
1.1.3.2. Tính chất ....................................................................................................... 7

1.1.3.3. Định tính ........................................................................................................ 7
1.1.3.4. Định lƣợng .................................................................................................... 7
1.1.3.5. Dƣợc lý và cơ chế tác dụng ........................................................................... 8
1.1.3.6. Tác dụng phụ và độc tính ............................................................................. 8
1.1.4. Tổng quan về ofloxacin .................................................................................... 9
1.1.4.1. Cấu trúc, tên hóa học ..................................................................................... 9
1.1.4.2. Tính chất ....................................................................................................... 9
1.1.4.3. Định tính ........................................................................................................ 9
1.1.4.4. Định lƣợng .................................................................................................. 10
1.1.4.5. Dƣợc lý và cơ chế tác dụng ......................................................................... 10
1.1.4.6. Tác dụng phụ và độc tính ........................................................................... 10
1.1.5. Tổng quan về ciprofloxacin hydroclorid ........................................................ 11
1.1.5.1. Cấu trúc, tên hóa học ................................................................................... 11
1.1.5.2. Tính chất ..................................................................................................... 11
1.1.5.3. Định tính ...................................................................................................... 11
1.1.5.4. Định lƣợng .................................................................................................. 12
1.1.5.5. Dƣợc lý và cơ chế tác dụng ......................................................................... 13
1.1.5.6. Tác dụng phụ và độc tính ............................................................................ 13
1.1.6. Tổng quan về enrofloxacin............................................................................. 14
1.1.6.1. Cấu trúc, tên hóa học ................................................................................... 14
1.1.6.2. Tính chất ..................................................................................................... 14
1.1.6.3. Định tính ...................................................................................................... 14
1.1.6.4. Định lƣợng .................................................................................................. 14
1.1.6.5. Dƣợc lý và cơ chế tác dụng ......................................................................... 15
1.1.6.6. Tác dụng phụ và độc tính ........................................................................... 15
1.2. Ảnh hƣởng của dƣ lƣợng kháng sinh trong nƣớc thải ..................................... 16

.



.

iii

1.3. Một số nghiên cứu liên quan đến phƣơng pháp định lƣợng cloramphenicol,
florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải
bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ................................................................................ 17
1.4. Tổng quan về phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu nƣớc thải .................... 20
1.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu nƣớc thải..................................................................... 20
1.4.1.1. Địa điểm lấy mẫu ........................................................................................ 20
1.4.1.2. Thời gian lấy mẫu và phân tích mẫu ........................................................... 20
1.4.1.3. Số lƣợng lấy mẫu ....................................................................................... 20
1.4.1.4. Yêu cầu chất lƣợng bình chứa mẫu ............................................................. 21
1.4.1.5. Phƣơng pháp lấy mẫu .................................................................................. 21
1.4.1.6. Thiết bị lấy mẫu .......................................................................................... 22
1.4.1.7. Thể tích lấy mẫu .......................................................................................... 22
1.4.2. Phƣơng pháp bảo quản mẫu nƣớc thải ........................................................... 22
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 23
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................................ 23
2.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ......................................................................... 23
2.3. Phƣơng tiện nghiên cứu .................................................................................... 23
2.3.1. Hóa chất, thuốc thử ........................................................................................ 23
2.3.2. Chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn ................................................................ 23
2.3.3. Trang thiết bị .................................................................................................. 24
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................... 25
2.4.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol,
thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải nuôi trồng
thủy sản bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ................................................................. 25
2.4.1.1. Khảo sát sự lựa chọn nội chuẩn .................................................................. 25
2.4.1.2. Khảo sát điều kiện khối phổ ....................................................................... 25

2.4.1.3. Khảo sát điều kiện sắc ký ........................................................................... 26
2.4.1.4. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ...................................................................... 27
2.4.1.5. Khảo sát sự ổn định mẫu ............................................................................ 29

.


.

iv

2.4.1.6. Khảo sát sự ảnh hƣởng nhiễu nền lên chất phân tích .................................. 29
2.4.2. Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol,
thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải ni trồng
thủy sản bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ................................................................. 29
2.4.2.1. Tính tƣơng thích hệ thống ........................................................................... 29
2.4.2.2. Tính đặc hiệu ............................................................................................... 29
2.4.2.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn ............................................................ 30
2.4.2.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng ..................................................... 31
2.4.2.5. Độ đúng và độ chính xác ............................................................................. 31
2.4.3. Ứng dụng quy trình để xác định đồng thời dƣ lƣợng cloramphenicol,
florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin có trong một số
mẫu nƣớc thải ni trồng thủy sản bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ........................ 32
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 33
3.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol,
thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải nuôi trồng
thủy sản bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ................................................................. 33
3.1.1. Khảo sát sự lựa chọn nội chuẩn .................................................................... 33
3.1.2. Khảo sát điều kiện khối phổ .......................................................................... 34
3.1.3. Khảo sát điều kiện sắc ký ............................................................................... 39

3.1.4. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ........................................................................ 46
3.1.5. Khảo sát sự ổn định mẫu ................................................................................ 47
3.1.6. Khảo sát sự ảnh hƣởng nhiễu nền lên chất phân tích ..................................... 48
3.2. Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol,
thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải nuôi trồng
thủy sản bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ................................................................. 49
3.2.1. Tính phù hợp hệ thống ................................................................................... 49
3.2.2. Tính đặc hiệu .................................................................................................. 50
3.2.3. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính ............................................................... 53
3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng .................................................... 54

.


.

v

3.2.5. Độ đúng và độ chính xác ................................................................................ 56
3.3. Ứng dụng quy trình để xác định đồng thời dƣ lƣợng cloramphenicol,
florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong một số mẫu
nƣớc thải nuôi trồng thủy sản bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ............................... 57
Chƣơng 4. BÀN LUẬN .......................................................................................... 60
4.1. Xây dựng quy trình định lƣợng ......................................................................... 60
4.1.1. Khảo sát nội chuẩn ......................................................................................... 60
4.1.2. Khảo sát điều kiện khối phổ tối ƣu ................................................................ 60
4.1.3. Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp............................................................... 64
4.1.4. Khảo sát quy trình xử lý mẫu thích hợp ......................................................... 67
4.1.5. Khảo sát sự ổn định mẫu phân tích ................................................................ 68
4.1.6. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiễu nền lên chất phân tích ................................... 68

4.2. Thẩm định quy trình định lƣợng ....................................................................... 68
4.2.1. Tính tƣơng thích hệ thống .............................................................................. 68
4.2.2. Tính đặc hiệu ................................................................................................. 69
4.2.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn ............................................................... 70
4.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng .................................................... 70
4.2.5. Độ đúng và độ chính xác ................................................................................ 71
4.3. Ứng dụng quy trình định lƣợng đã thẩm định................................................... 71
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 72
5.1. Kết luận ............................................................................................................. 72
5.2. Kiến nghị ........................................................................................................... 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

.


.

vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Từ nguyên

AF

Acid formic


AS

Analyte Standard

Chất chuẩn phân tích

AOAC

Association of Official Analytical

Hiệp hội các nhà hóa học

Chemists

phân tích

Atmospheric Pressure Chemical

Ion hóa hóa học ở áp suất

Ionization

khí quyển

CID

Collision-Induced Dissociation

Va chạm gây ra sự phân ly


CIP

Ciprofloxacin

CLOR

Cloramphenicol

CV

Coefficient of Variation

CLOR-d5

Cloramphenicol-d5

EMA

European Medicines Agency

ERF

Enrofloxacin

ESI

Electronspray Ionization

APCI


Ý nghĩa

Hệ số phân tán
Cơ quan quản lý dƣợc
phầm Châu Âu

Ion hóa bằng cách phun
điện tử

The United States Food and Drug

Cục Quản lý thuốc và Thực

Administration

phẩm Hoa Kỳ

FLD

Flourescence Detector

Đầu dò huỳnh quang

FLOR

Florfenicol

FDA

HPLC


High Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IS

Internal Standard

Nội chuẩn

ISBN

International Standard

Mã số tiêu chuẩn quốc tế

.


.

Chữ viết tắt

vii

Từ nguyên

Ý nghĩa


Book Number

cho sách

Liquid Chromatography – Mass

Sắc ký lỏng ghép hai lần

Spectrometry/ Mass Spectrometry

khối phổ

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantification

Giới hạn định lƣợng

MeOH

Methanol

MRM


Multiple Reaction Monitoring

NOR

Norfloxacin

OFL

Ofloxacin

Ppm

Parts per million

Phần triệu

Ppb

Parts per billion

Phần tỷ

Rs

Resolution factor

Hệ số phân giải

RSD


Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

S

Area

Diện tích

S/N

Signal / Noise

Tín hiệu / Nhiễu

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SPME

Solid Phase Microextraction

Vi chiết pha rắn

SPE


Solid Phase Extraction

Chiết pha rắn

SRM

Single Reaction Monitoring

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

THI

Thiamphenicol

UPLC

Ultra Performance Liquid

LC-MS/MS

Tiêu chuẩn Việt Nam
Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

Chromatography
USA

The United States of America


Hoa Kỳ

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế thế giới

.


.

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Một số cơng trình nghiên cứu định lƣợng cloramphenicol, florfenicol,
thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải bằng phƣơng
pháp LC-MS/MS ..................................................................................................... 17
Bảng 1.2. Giá trị K tƣơng ứng với mỗi mức tin cậy ................................................ 21
Bảng 2.1. Hóa chất, thuốc thử đƣợc dùng trong nghiên cứu ................................... 23
Bảng 2.2. Chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn đƣợc dùng trong nghiên cứu ........... 24
Bảng 2.3. Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ................................................. 24
Bảng 2.4. Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỉ lệ ion ........................................ 30
Bảng 3.1. Thông tin khảo sát nội chuẩn ................................................................... 33
Bảng 3.2. Điều kiện khối phổ tối ƣu các kháng sinh phân tích ............................... 34
Bảng 3.3. Chƣơng trình gradient pha động thích hợp phân tích đồng thời CLOR,
FLOR, THI, CIP, OFL, ERF. ................................................................................... 45

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu ..................................................... 47
Bảng 3.5. Khảo sát độ ổn định mẫu ........................................................................ 48
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của nền mẫu lên chất phân tích ................. 48
Bảng 3.7. Kết quả tính tƣơng thích hệ thống ........................................................... 49
Bảng 3.8. Tỉ lệ ion định tính và định lƣợng các kháng sinh phân tích ................... 52
Bảng 3.9. Độ lệch chuẩn thời gian lƣu cho các chất phân tích. ............................... 52
Bảng 3.10. Khoảng tuyến tính, phƣơng trình hồi quy và hệ số tƣơng quan ........... 53
Bảng 3.11. LOD, LOQ của các chất cần phân tích. ................................................. 55
Bảng 3.12. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và liên ngày của các chất. .............. 56
Bảng 3.13. Kết quả phân tích trên 60 mẫu nƣớc thải vùng nuôi trồng thủy sản
tại 4 tỉnh. ................................................................................................................... 57
Bảng 4.1. So sánh kết quả khảo sát pha tĩnh tìm điều kiện sắc ký tối ƣu ................ 65

.


.

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của cloramphenicol ..................................................... 2
Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của florfenicol ............................................................. 4
Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của thiamphenicol ....................................................... 7
Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của ofloxacin ............................................................... 9
Hình 1.5. Phổ IR của ofloxacin chuẩn .................................................................... 10
Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo của ciprofloxacin hydroclorid .................................. 11
Hình 1.7. Phổ IR của ciprofloxacin ......................................................................... 12
Hình 1.8. Cơng thức cấu tạo của enrofloxacin ........................................................ 14

Hình 2.1. Hệ thống LC-MS/MS Xevo-TQD của Waters ......................................... 25
Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu 1 .............................................................................. 27
Hình 2.3. Quy trình xử lý mẫu 2 .............................................................................. 28
Hình 2.4. Quy trình xử lý mẫu 3 .............................................................................. 28
Hình 3.1. Kết quả năng lƣợng phân mảnh tối ƣu tín hiệu cho nội chuẩn CLOR-d5
(a) và NOR (b) ........................................................................................................ 33
Hình 3.2. Kết quả Auto-tune và Manual-tune của chất chuẩn ofloxacin. ................ 35
Hình 3.3. Kết quả Auto-tune và Manual-tune của chất chuẩn cloramphenicol ...... 36
Hình 3.4. Cơ chế phân mảnh và các mảnh con của các chất phân tích ................... 39
Hình 3.5. Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký thích hợp................................................... 42
Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát pH pha động. ............................................................. 44
Hình 3.7. SKĐ phân tích đồng thời CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF ở điều kiện
khối phổ tối ƣu và sắc ký thích hợp. ........................................................................ 46
Hình 3.8. Hiệu suất thu hồi các chất phân tích qua các quy trình xử lý mẫu. ......... 47
Hình 3.9. Sắc ký đồ overlay 6 lần tiêm liên tiếp của cloramphenicol. .................... 50
Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu trắng
thêm chuẩn lần 2 của chất cloramphenicol. ............................................................. 50
Hình 3.11. Phổ đồ MS fullscan ES+ của mẫu trắng thêm chuẩn.............................. 51

.


.

x

Hình 3.12. Phổ đồ Daughter Scan của ciprofloxacin. .............................................. 51
Hình 3.13. Đƣờng tuyến tính của CIP (a) và CLOR (b) đƣợc truy xuất từ phần mềm
Masslynx 4.1 ............................................................................................................ 54
Hình 3.14. S/N xác định LOD, LOQ của các kháng sinh phân tích. ...................... 55

Hình 4.1. Phân mảnh con trong đặc trƣng cho phân tích định lƣợng CLOR, THIAM,
FLOR, CIP, OFL, ERF và nội chuẩn NOR bằng kỹ thuật LC-MS/MS so với Thƣ
viện Phổ chuẩn châu Âu (European Massbank) ..................................................... 64
Hình 4.2. Sắc ký đồ minh họa hệ acetonitril - nƣớc acid formic pH 2,99 ............... 66

.


.

1

MỞ ĐẦU
Kháng sinh đã và đang đóng vai trị quan trọng trong chăm sóc sức khỏe nhân dân,
phịng và trị bệnh trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, việc sử dụng
kháng sinh không hợp lý đã gây nên hiện tƣợng kháng thuốc, tồn dƣ thuốc trong
nƣớc thải, vật nuôi, ảnh hƣởng xấu đến hiệu quả điều trị bệnh, sức khỏe cộng đồng
và môi trƣờng [9],[36]. Sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng
trở nên đáng báo động. Trên thế giới đã phát hiện rất nhiều chủng vi khuẩn kháng
thuốc, siêu kháng thuốc [23],[25],[27],[44],[53]. Chính vì vậy, để tăng cƣờng kiểm
sốt dƣ lƣợng kháng sinh, các nƣớc phát triển đã có những qui định rất chặt chẽ và
kiểm sốt nghiêm ngặt [32],[52]. Do có phổ kháng khuẩn rộng và khả năng phân bố
tốt nên kháng sinh nhóm phenicol và nhóm quinolon đƣợc dùng phổ biến. Trong hai
nhóm này, các kháng sinh đƣợc sử dụng nhiều nhất là cloramphenicol, florfenicol,
thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin [9]. Các kháng sinh nhóm
phenicol rất độc, có thể gây hội chứng xám, suy tủy và dẫn đến tử vong. Các kháng
sinh nhóm quinolon có thể gây hủy hoại mơ sụn, lú lẫn, co giật, ảo giác [2].
Hiện nay, đã có một số cơng bố quy trình phân tích riêng lẻ cloramphenicol,
florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải
bằng phƣơng pháp LC-MS/MS [6],[10],[18],[20],[30],[37],[41],[42],[46] nhƣng

chƣa có cơng bố về định lƣợng đồng thời tất cả các kháng sinh trên trong nƣớc thải.
Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Xác định dư lượng cloramphenicol,
florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin có trong nước
thải ni trồng thủy sản bằng phương pháp LC-MS/MS” đƣợc thực hiện với các
mục tiêu sau:
- Xây dựng và thẩm định quy trình định lƣợng cloramphenicol, florfenicol,
thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong mẫu thử giả lập bằng
phƣơng pháp LC-MS/MS.
- Ứng dụng quy trình đã đƣợc thẩm định để xác định đồng thời dƣ lƣợng
cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin
trong nƣớc thải nuôi trồng thủy sản bằng phƣơng pháp LC-MS/MS.

.


.

2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin,
ciprofloxacin, enrofloxacin
1.1.1. Tổng quan về cloramphenicol
1.1.1.1. Cấu trúc, tên hóa học
Tên

khoa

học:


2,2-dicloro-N-[(1R,2R)-2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)-2-(4-

nitrophenyl) ethyl] acetamid [1].
Cơng thức phân tử: C11H12Cl2N2O5 [1],[25].
Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của cloramphenicol [1].
Phân tử lƣợng: 323,132 g/mol [1],[25].
1.1.1.2. Tính chất
Bột kết tinh màu trắng, trắng xám hoặc trắng vàng hay tinh thể hình kim hoặc phiến
dài, khó tan trong nƣớc, dễ tan trong ethanol 96% và trong propylen glycol [1].
Dung dịch trong ethanol thì hữu tuyền, trong ethyl acetat thì tả tuyền [1].
1.1.1.3. Định tính
Có thể chọn một trong hai nhóm phép thử định tính sau:
Nhóm 1: A, B
Nhóm 2: B, C, D, E
A. Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của
cloramphenicol chuẩn [1].
B. Điểm chảy từ 149 oC đến 153 oC [1].
C. Trong phần thử tạp chất liên quan, vết chính trên sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng của
1 µl dung dịch thử phải tƣơng đƣơng với vết chính của dung dịch đối chiếu (1) về vị
trí và kích thƣớc [1].
D. Hịa tan khoảng 10 mg chế phẩm trong 1 ml ethanol 50%, thêm 3 ml dung dịch

.


.

3


calci clorid 1% và 50 mg bột kẽm, đun cách thủy 10 phút. Lọc dung dịch nóng và
để nguội. Thêm 0,1 ml benzoyl clorid và lắc 1 phút. Thêm 0,5 ml dung dịch sắt (III)
clorid 10,5% và 2 ml cloroform, lắc. Lớp nƣớc có màu đỏ tím nhạt đến đỏ tía [1].
E. Lấy 50 mg chế phẩm vào chén sứ, thêm 0,5 g natri carbonat khan, đốt trên ngọn
lửa trong 10 phút, để nguội. Hòa tan cắn bằng 5 ml dung dịch acid nitric 2 M và lọc.
Lấy 1 ml dịch lọc, thêm 1 ml nƣớc, thêm 0,4 ml dung dịch bạc nitrat 2%, lắc và để
yên, sẽ tạo tủa trắng lổn nhổn. Lọc lấy tủa, rửa tủa 3 lần, mỗi lần với 1 ml nƣớc,
phân tán tủa trong 2 ml nƣớc và thêm 1,5 ml dung dịch amoniac 10 M, tủa tan dễ
dàng [1].
1.1.1.4. Định lượng
Hịa lỗng một thể tích chế phẩm có chứa 20 mg cloramphenicol với nƣớc thành
200 ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml, thêm nƣớc vừa đủ
đến vạch. Lắc kỹ và đo độ hấp thu của dung dịch thu đƣợc ở bƣớc sóng cực đại 278
nm, cốc đo dày 1 cm, dùng nƣớc làm mẫu trắng. Tính hàm lƣợng của
cloramphenicol, C11H12Cl2N2O5, theo A (1%, 1 cm). Lấy 297 là giá trị A (1%, 1 cm)
ở cực đại 278 nm [1].
1.1.1.5. Dược lý và cơ chế tác dụng
Cloramphenicol thƣờng có tác dụng kìm khuẩn, nhƣng có thể diệt khuẩn ở nồng độ
cao hoặc đối với những vi khuẩn nhạy cảm cao. Cloramphenicol ức chế tổng hợp
protein ở những vi khuẩn nhạy cảm bằng cách gắn vào tiểu đơn vị 50S của ribosom.
Cloramphenicol có thể gây ức chế tủy xƣơng và có thể khơng hồi phục đƣợc [2].
Tỷ lệ kháng thuốc đối với cloramphenicol ở Việt Nam trong năm 1998: Shigella
flexneri (85%), Escherichia coli (83%), Enterobacter spp. (80%), Staphylococcus
aureus (64%), Salmonella typhi (81%), Streptococcus pneumoniae (42%),
Streptococcus pyogenes (36%), Haemophilus influenzae (28%). Thử nghiệm in
vitro cho thấy sự kháng thuốc đối với cloramphenicol tăng dần từng bƣớc. Sự kháng
thuốc này là do sử dụng quá mức và đƣợc lan truyền qua plasmid [2].
1.1.1.6. Tác dụng phụ và độc tính
Những tác dụng khơng mong muốn của cloramphenicol có thể rất nghiêm trọng, do


.


.

4

đó phải tránh việc điều trị kéo dài hoặc nhắc lại. Tác dụng không mong muốn
nghiêm trọng nhất là thiếu máu không tái tạo, không phục hồi do suy tủy xƣơng,
thƣờng gây tử vong và có tần xuất khoảng 1 trong 10000 ca điều trị [2].
Thƣờng gặp (ADR > 1/100): Ngoại ban, buồn nơn, nơn, tiêu chảy [2].
Ít gặp (1/1000 < ADR < 1/100): Giảm bạch cầu hạt, giảm tiểu cầu và thiếu máu với
giảm hồng cầu lƣới, tất cả có thể phục hồi, mày đay, phản ứng quá mẫn [2].
Hiếm gặp (ADR < 1/1000): Nhức đầu, mất bạch cầu hạt, giảm tồn thể huyết cầu,
thiếu máu khơng tái tạo, viêm dây thần kinh thị giác, viêm đa thần kinh ngoại biên,
liệt cơ mắt, và lú lẫn, hội chứng xám [2].
Những tác dụng không mong muốn về máu với sự ức chế tủy xƣơng không phục
hồi dẫn đến thiếu máu khơng tái tạo, có tỷ lệ tử vong cao, có thể xảy ra chậm tới
nhiều tháng sau điều trị. Giảm bạch cầu hạt, giảm tiểu cầu và thiếu máu có giảm
hồng cầu lƣới có thể phục hồi xảy ra ở ngƣời lớn với liều trên 25 g [2].
1.1.2. Tổng quan về florfenicol
1.1.2.1. Cấu trúc, tên hóa học
Tên khoa học:
2,2-dicloro-N-[(1R,2S)-3-floro-1-hydroxy-1-(4-methanesulfonylphenyl)propan-2yl] acetamid [47],[48].
Cơng thức phân tử: C12H14Cl2FNO4S [47],[48].
Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của florfenicol [47].
Phân tử lƣợng: 358,21 g/mol [47].

1.1.2.2. Tính chất
Chất rắn, dạng bột, màu trắng, khơng mùi, vị đắng, khó tan trong nƣớc, tan nhiều
trong lipid và dung môi hữu cơ [48].

.


.

5

1.1.2.3. Định tính
Florfenicol đƣợc định tính bằng phƣơng pháp HPLC theo TCVN 8374 : 2010 [15].
1.1.2.4. Định lượng
Florfenicol đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC theo TCVN 8374 : 2010 [15]
Điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký: C8 (150 x 4,6 mm; 5 m).
- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.
- Tốc độ dịng: 1 ml/phút
- Bƣớc sóng phát hiện: 220 nm.
- Thời gian: 10 phút
- Pha động: acetonitril - đệm amoni acetat pH 4,8 (25:75, tt/tt)
Dung dịch chuẩn gốc, nồng độ 1 mg/ml: Cân chính xác 50 mg ± 0,1 mg florfenicol
chuẩn, cho vào bình định mức 50 ml, hịa tan bằng acetonitril, lắc đều đến khi tan
hoàn toàn và định mức đến vạch.
Dung dịch chuẩn trung gian, nồng độ 100 µg/ml: Hút 1 ml dung dịch chuẩn gốc,
cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng acetonitril.
Dung dịch chuẩn, nồng độ 0; 0,1; 0,5; 1; 2,5 và 5 µg/ml: Hút lần lƣợt 0 µl, 10 µl, 50
µl, 100 µl, 250 µl, 500 µl dung dịch chuẩn trung gian vào các bình định mức 10 ml,
định mức đến vạch bằng hỗn hợp pha động.

Dung dịch thử: Cân 3,0 g ± 0,1 g mẫu vào ống ly tâm dung tích 15 ml. Cho 2 ml
nƣớc cất vào, đậy nắp, lắc đều. Thêm tiếp 6 ml ethyl acetat, lắc khoảng 5 phút bằng
máy lắc, sau đó ly tâm 7 phút ở tốc độ 4000 vòng/phút. Hút 4 ml lớp trên cho vào
ống ly tâm dung tích 15 ml và làm khơ dung dịch bằng hệ thống thổi khí nitơ ở
nhiệt độ 50 oC. Hoà tan phần cắn bằng 1 ml n-hexan, sau đó cho tiếp 1 ml hỗn hợp
pha động, lắc khoảng 2 phút trên máy lắc, ly tâm 5 phút ở tốc độ 4000 vòng/phút.
Hút bỏ lớp n-hexan ở trên, lấy lớp dƣới lọc qua màng lọc 0,22 µm.
Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
Hàm lƣợng florfenicol trong mẫu thử (C) đƣợc tính bằng miligam trên kilogam sản
phẩm (mg/kg) theo công thức:

.


.

6

C = Cx.(V3.V1)/(m.V2)
C = Cx.f
Trong đó:
Cx là hàm lƣợng của florfenicol tính từ đƣờng chuẩn, tính bằng microgam trên
mililit (µg/ml);
V1 là thể tích ethyl acetat ban đầu để chiết florfenicol, tính bằng mililit (ml);
V2 là thể tích dịch chiết đem làm khơ, tính bằng mililit (ml);
V3 là thể tích pha động để hịa tan cắn, tính bằng mililit (ml);
m là khối lƣợng mẫu, tính bằng gam (g);
f là hệ số pha lỗng mẫu, đƣợc xác định theo cơng thức F = (V3.V1)/(m.V2).
Trong trƣờng hợp này f = 0,5 (ml/g).
1.1.2.5. Dược lý và cơ chế tác dụng

Florfenicol là kháng sinh chủ yếu đƣợc sử dụng trong ngành thủy sản, chăn nuôi.
Tác dụng tƣơng tự thiamphenicol. Florfenicol là kháng sinh thế hệ mới nhất của
nhóm phenicol, là kháng sinh tổng hợp phổ rộng, tác dụng tốt trên nhiều loại vi
khuẩn gram âm và gram dƣơng. Dùng để điều trị các bệnh nhiễm trùng đƣờng hô
hấp trên gia súc, bệnh nhiễm trùng da, nhiễm trùng niệu đạo; kiểm soát nhiễm trùng
ruột ở cá da trơn. Florfenicol đƣợc Cơ quan Quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa
Kỳ (FDA) cho phép sử dụng để trị bệnh do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây
bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tơm hiện nay [47].
Florfenicol có hoạt tính chống lại sự phát triển của vi khuẩn bằng cách kết dính với
tiểu đơn vị 50S của ribosom, ngăn chặn cầu nối peptid giữa các acid amin.
Florfenicol ít bị đề kháng hơn so với cloramphenicol và thiamphenicol vì florfenicol
chứa ngun tử flour ở vị trí C3 có khả năng kháng lại sự truyền plasmid gây đề
kháng kháng sinh trên vi khuẩn gây bệnh [47].
1.1.2.6. Tác dụng phụ và độc tính
Tƣơng tự cloramphenicol [47].
Florfenicol thiếu nhóm nitro nằm trên vịng thơm nên không liên quan đến thiếu
máu bất sản. Về mặt lý thuyết, florfenicol có thể gây ra một số ức chế tủy xƣơng

.


.

7

phụ thuộc vào liều nhƣng chƣa đƣợc báo cáo lâm sàng [47].
1.1.3. Tổng quan về thiamphenicol
1.1.3.1. Cấu trúc, tên hóa học
Tên


khoa

học:

2,2-dicloro-N-{(1R,2R)-2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)-2-[4-

(methylsulfonyl) phenyl] ethyl} acetamid [47].
Tên khác: Thiophenicol, dextrosulphenidol.
Công thức phân tử: C12H15Cl2NO5S [47].
Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của thiamphenicol [47].
Phân tử lƣợng: 356,223 g/mol [47].
1.1.3.2. Tính chất
Bột kết tinh rắn, màu trắng, ít tan trong nƣớc, tan trong methanol, tan tốt trong
acetonitril và dimethyl formamid, tan rất tốt trong dimethyl acetamid [47].
1.1.3.3. Định tính
Định tính thiamphenicol trong thuốc tiêm bằng phƣơng pháp HPLC [17].
1.1.3.4. Định lượng
Định lƣợng thiamphenicol trong thuốc tiêm thiamphenicol 10% bằng phƣơng pháp
HPLC [17].
Điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 m).
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
- Pha động: acetonitril – nƣớc – acid acetic băng (25:74,25:0,75).
- Đầu dị UV-Vis
- Bƣớc sóng phát hiện: 254 nm.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 l.

.



.

8

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 100 mg thiamphenicol chuẩn cho vào bình
định mức 100 ml, bổ sung pha động vừa đủ. Hút 2 ml dung dịch này cho vào bình
định mức 20 ml, bổ sung pha động vừa đủ. Lọc qua màng lọc 0,45 m.
Dung dịch thử: Hút 1 ml thuốc tiêm cho vào bình mức 100 ml, bổ sung pha động
vừa đủ. Hút 2 ml dung dịch này cho vào bình định mức 20 ml, bổ sung pha động
vừa đủ. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn và dung dịch thử, ghi nhận kết quả.
% hàm lƣợng thiamphenicol so với hàm lƣợng ghi trên nhãn đƣợc tính theo cơng
thức:
X

ST .mC .C
SC .0,1.100

Trong đó:
X là % hàm lƣợng của thiamphenicol so với hàm lƣợng ghi trên nhãn (%);
SC là diện tích pic của dung dịch mẫu thử;
ST là diện tích pic của dung dịch chuẩn;
C là độ tinh khiết của chất chuẩn (%);
mC là khối lƣợng chất chuẩn, tính bằng miligam (mg);
1.1.3.5. Dược lý và cơ chế tác dụng
Thiamphenicol có phổ kháng khuẩn và cơ chế tác dụng tƣơng tự cloramphenicol,
đặc biệt hiệu quả hơn trên Haemophilus và Neisseria spp. Có sự đề kháng chéo xảy
ra giữa thiamphenicol và cloramphenicol. Tuy nhiên, một số chủng vi khuẩn kháng

cloramphenicol có thể nhạy cảm với thiamphenicol [47].
Thiamphenicol dùng trị nhiễm khuẩn do Haemophilus influenzae, bệnh thƣơng hàn
do S. Typhi, áp xe não, viêm xƣơng chũm, bệnh chét chuột, bệnh dịch hạch, điều trị
viêm màng não mủ [2].
Hiện nay nhiều nƣớc đã dùng thiamphenicol thay thế cloramphenicol. Tác dụng
kháng khuẩn của thiamphenicol gấp 2 – 2,5 lần cloramphenicol [2].
1.1.3.6. Tác dụng phụ và độc tính
Tác dụng phụ và độc tính của thiamphenicol tƣơng tự nhƣ cloramphenicol.

.


.

9

Thiamphenicol thƣờng không liên quan đến thiếu máu bất sản. Thiamphenicol ít
gây ra hội chứng xám ở trẻ sơ sinh hơn so với cloramphenicol. Liều của
thiamphenicol nên đƣợc giảm ở bệnh nhân suy thận. Không cần thiết giảm liều ở
bệnh nhân suy gan [47].
1.1.4. Tổng quan về ofloxacin
1.1.4.1. Cấu trúc, tên hóa học
Tên khoa học: acid (RS)-9-fluoro-3-methyl-10-(4-methylpiperazin-1-yl)-7-oxo-2,3dihydro-7H-pyrido[1,2,3-de]-1,4-benzoxazin-6-carboxylic [1],[25],[47].
Cơng thức phân tử: C18H20FN3O4 [1],[25],[47].
Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của ofloxacin [1].
Phân tử lƣợng: 361,368 g/mol [1].
1.1.4.2. Tính chất
Bột kết tinh màu vàng nhạt hoặc vàng sáng, ít tan trong nƣớc và methanol, tan trong

acid acetic băng, ít tan đến tan trong dicloromethan [1].
1.1.4.3. Định tính
Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của ofloxacin
chuẩn. Phổ hồng ngoại của ofloxacin có các đỉnh đặc trƣng: C=O (1700-1600 cm-1),
C=C (1500-1450 cm-1), C-O (1300-1250 cm-1), C-O-C (1150-1050 cm-1), Ar-H
(800 cm-1) [1].

.


.

10

Hình 1.5. Phổ IR của ofloxacin chuẩn [1].
1.1.4.4. Định lượng
Phƣơng pháp chuẩn độ thể tích [1].
Hịa tan 0,300 g chế phẩm trong 100 ml acid acetic băng. Chuẩn độ bằng dung dịch
acid percloric 0,1 N, xác định điểm tƣơng đƣơng bằng phƣơng pháp chuẩn độ đo
điện thế.
1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N tƣơng đƣơng với 36,14 mg C18H20FN3O4.
1.1.4.5. Dược lý và cơ chế tác dụng
Ofloxacin là thuốc kháng khuẩn nhóm fluoroquinolon giống nhƣ ciprofloxacin,
nhƣng ofloxacin khi uống có khả dụng sinh học cao hơn (trên 95%). Ofloxacin có
phổ kháng khuẩn rộng bao gồm Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa,
Haemophilus

influenzae,

Neisseria


spp.,

Staphylococcus,

Streptococcus

pneumoniae và một vài vi khuẩn gram dƣơng khác [2].
Ofloxacin có tác dụng mạnh hơn ciprofloxacin đối với Chlamydia trachomatis,
Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma pneumoniae. Nó cũng có tác dụng đối với
Mycobacterium

leprae

và

cả

với

Mycobacterium

tuberculosis

và

vài

Mycobacterium spp. khác [2].
Ofloxacin có tác dụng diệt khuẩn, ofloxacin ức chế ADN-gyrase là enzym cần thiết

trong q trình nhân đơi, phiên mã và sửa chữa ADN của vi khuẩn [2].
1.1.4.6. Tác dụng phụ và độc tính

.