ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA

NGUYỄN THỊ HỊA CHÂU

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH
THÀNH PHẦN HĨA HỌC CAO CHLOROFORM
TỪ TỔNG CAO ETHANOL CỦA
THÂN CÂY MẬT GẤU Ở CAO BẰNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CỬ NHÂN SƢ PHẠM

Đà Nẵng - 2017


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO CHLOROFORM
TỪ TỔNG CAO ETHANOL CỦA
THÂN CÂY MẬT GẤU Ở CAO BẰNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CỬ NHÂN SƢ PHẠM

SINH VIÊN THỰC HIỆN

: NGUYỄN THỊ HÒA CHÂU

LỚP

: 13SHH

GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN : TS. TRẦN MẠNH LỤC

Đà Nẵng - 2017


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

KHOA HÓA

===0o0===

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên

: Nguyễn Thị Hòa Châu

Lớp


: 13SHH

1. Tên đề tài:
“Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học cao chloroform từ tổng cao
ethanol của thân cây mật gấu ở Cao Bằng”.

2. Nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị


Nguyên liệu: Thân cây mật gấu thái lát khơ.

Hóa chất: Nƣớc cất, axitsunfuric, silica gel, vanilin, dung dịch CH3COOH,
methanol, hexane, ethyl acetate, chloroform.


Dụng cụ và thiết bị:

-

Cốc thủy tinh 100mL, 250mL, 500mL, 1000mL;

-

Phễu lọc, bếp điện, bếp cách thủy, tủ sấy, cân phân tích.

-

Đũa thủy tinh, nhiệt kế, burret, pipet, bình tam giác, ống đong.

-


Máy đo GC-MS.

3. Nội dung nghiên cứu
- Khối lƣợng của các cao chiết bằng các dung môi hexane, dung mơi
chloroform.
- Định danh các chất có trong dịch chiết bằng phổ GC-MS.
4. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Trần Mạnh Lục
5. Ngày giao đề tài: 15/07/2016
6. Ngày hoàn thành: 25/04/2017


Chủ nhiệm khoa

PGS. TS. Lê Tự Hải

Giáo viên hướng dẫn

TS. Trần Mạnh Lục

Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho Khoa ngày… tháng… năm 2017
Kết quả đánh giá
Ngày …. Tháng…. Năm 2017
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(Ký và ghi rõ họ tên)


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai

công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hòa Châu


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
GC/MS : Gas Chromatography/Mass Spectrometry
STT

: Số thứ tự

TCCS

: Tiêu chuẩn Cơ Sở

HP

: Helicobarter Pylori

USA

: The United States of America


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài .....................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................2

3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ...........................................................................2
4. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................2
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................2
6. Bố cục luận văn .......................................................................................................2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI MAHONIA ......................................................................3
1.2. GIỚI THIỆU VỀ CÂY MẬT GẤU .....................................................................3
1.2.1. Tên gọi ...........................................................................................................3
1.2.2. Phân bố ..........................................................................................................4
1.2.3. Đặc điểm thực vật ..........................................................................................4
1.2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc về cây mật gấu ..........................5
1.2.5. Giá trị sử dụng của cây mật gấu ở Việt Nam ................................................7
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................9
2.1. NGU

N IỆU D NG C

H

CHẤT ........................................................9

2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................................9
2.1.2. Thiết bị dụng cụ h a chất...........................................................................10
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGÂM DẦM TẠO TỔNG CAO ETHANOL TỪ BỘT
THÂN CÂY MẬT GẤU ...........................................................................................10
2.2.1. Nguyên tắc ...................................................................................................10
2.2.2. Cách tiến hành...............................................................................................10
2.3. PHƢƠNG PHÁP CHIẾT PHÂN BỐ LỎNG – LỎNG TỪ TỔNG CAO
ETHANOL ................................................................................................................11
2.3.1. Nguyên tắc ...................................................................................................11

2.3.2. Cách tiến hành .............................................................................................11


2.4. PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN BẰNG SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG
...................................................................................................................................12
2.4.1. Sắc k cột .....................................................................................................12
2.4.2. Sắc k bản mỏng ..........................................................................................14
2.5. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC BẰNG PHƢƠNG PHÁP GC/MS ...18
2.5.1. Nguyên tắc ...................................................................................................18
2.5.2. Cấu tạo thiết bị .............................................................................................19
2.5.3. Chƣơng tr nh chạy GC/MS ..........................................................................20
CHƢƠNG 3:

ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................22

3.1. KẾT QUẢ CHIẾT TÁCH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TỪ
TỔNG CAO ETHANOL CỦA THÂN CÂY MẬT GẤU CAO BẰNG ..................22
3.1.1. Kết quả điều chế tổng cao ethanol bằng phƣơng pháp ngâm chiết .............22
3.1.2. Kết quả xác định thành phần hóa học trong cao chiết hexane từ tổng cao
ethanol ....................................................................................................................23
3.1.3. Kết quả xác định thành phần hóa học trong cao chiết chloroform từ tổng
cao ethanol .............................................................................................................27
3.1.4. Tổng kết thành phần hóa học trong các dịch chiết lỏng - lỏng từ tổng cao
ethanol ....................................................................................................................32
3.2. KẾT QUẢ PHÂN ẬP PHÂN ĐOẠN CAO CHLOROFORM TỪ TỔNG CAO
ETHANOL CỦA THÂN CÂY MẬT GẤU CAO BẰNG ........................................34
3.2.1. Kết quả chạy sắc ký cột cao chloroform (2,33 g) tách từ tổng cao ethanol 34
3.2.2. Định danh thành phần hóa học trong phân đoạn DA7.13 ...........................37
3.2.3. Định danh thành phần hóa học trong phân đoạn D 26.31 ........................38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................41

Kết luận ..................................................................................................................41
Kiến nghị................................................................................................................41
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................43


DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu
2.1.
3.1.

3.2.

3.3.

3.4.

3.5.

3.6.

Tên bảng
H a chất đƣợc sử dụng trong quá tr nh làm thí nghiệm
Khối lƣợng cao thu đƣợc sau khi cô quay chân không các
dịch chiết
Bảng Sự thay đổi lƣợng chất chiết theo số lần chiết trong
cao chiết hexane từ tổng cao ethanol
Thành phần h a học trong cao hexane từ tổng cao ethanol
của thân cây mật gấu
Sự thay đổi lƣợng chất chiết theo số lần chiết trong cao chiết
chloroform từ tổng cao ethanol

Thành phần h a học trong cao chloroform từ tổng cao
ethanol của thân cây mật gấu
Thành phần h a học trong các dịch chiết lỏng - lỏng từ tổng
cao ethanol của thân cây mật gấu

Trang
10
23

23

25

27

28

32

3.7.

Thành phần h a học trong phân đoạn D 7.13

38

3.8.

Thành phần h a học trong phân đoạn D 26.31

39



DANH MỤC CÁC HÌNH
Số hiệu

Tên hình

Trang

1.1.

Hoa (a) quả (b) lá (c) cây mật gấu

5

1.2.

Cây mật gấu (Mahonia Nepalensis DC.)

5

1.3.

Berberin

6

1.4.

Magnoflorin


6

1.5.

Berbamin

6

1.6.

Oxyacanthin

6

1.7.

Columbamin

7

2.1.

Thân cây mật gấu thái lát

9

2.2.

Thân cây mật gấu đã nghiền nhỏ


9

2.3.

Hộp bản mỏng c kích thƣớc 5 x 10 cm

16

2.4.

Các b nh triển khai cho sắc k lớp mỏng

16

2.5.

Mẫu trên bản mỏng soi UV dƣới ánh sáng tử ngoại bƣớc
s ng 366 nm

18

2.6.

Sơ đồ thiết bị sắc k khí ghép khối phổ

19

2.7.


Chƣơng tr nh nhiệt độ lò cột

21

3.1.

Bột thân cây mật gấu ngâm trong ethanol 96o

22

3.2.

3.3.

3.4.

3.5.

3.6.

Dịch chiết ethanol của ba lần chiết (a) và cao tổng ethanol
(b)
Sự thay đổi lƣợng chất theo số lần chiết trong cao chiết
hexane từ tổng cao ethanol
Sắc k đồ GC của dịch chiết lỏng - lỏng với dung môi
hexane từ tổng cao ethanol trong thân cây mật gấu
Sự thay đổi lƣợng chất theo số lần chiết trong cao chiết
chloroform từ tổng cao ethanol
Sắc k đồ GC của dịch chiết lỏng - lỏng với dung môi
chloroform từ tổng cao ethanol trong thân cây mật gấu


22

24

24

27

28


Kết quả chạy sắc k
3.7.

bản mỏng với hệ dung môi

hexane:ethyl acetate theo các t lệ 5:5 6:4 7:3 8:2 9:1 (từ

34

trái qua phải) tại bƣớc s ng 366 nm
3.8.
3.9.
3.10.

Cột sắc k (d = 1cm h = 75cm) và các lọ dung dịch hứng
(15ml)
Các vết chất trên các bản mỏng của lọ D 1 đến lọ D 36
Các vết chất trên bản mỏng (a) và chất thu đƣợc của các

phân đoạn

35
36
36

3.11.

Sơ đồ phân lập phân đoạn cao chloroform

37

3.12.

Sắc k đồ GC phân đoạn D 7.13

37

3.13.

Sắc k đồ GC phân đoạn D 26.31

39


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nƣớc Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gi mùa đƣợc thiên

nhiên ban tặng một thảm thực vật đa dạng và phong phú bao gồm nhiều cây
thuốc quý với đầy đủ chủng loại, số lƣợng và nhiều công dụng. Cùng với kinh
nghiệm dân gian con ngƣời đã sử dụng những bộ phận khác nhau từ các loại
cây, cỏ trong thiên nhiên để chữa bệnh vô cùng hiệu quả. Những dƣợc phẩm từ
thảo dƣợc khơng những an tồn mà cịn phát huy tác dụng cộng hƣởng của nhiều
hợp chất trong thành phần của cây thuốc c

nghĩa rất quan trọng trong việc

chăm s c và điều trị nhiều loại bệnh. Chính vì vậy dƣợc phẩm với hoạt chất từ
nguồn dƣợc liệu thiên nhiên đã trở thành đề tài nghiên cứu hàng đầu của các nhà
khoa học trong lĩnh vực y - dƣợc ngày nay.
Cây mật gấu là tên gọi của nhiều loài thuộc chi Mahonia, họ hoàng liên gai
(Berberidaceae). Các loài thuộc chi Mahonia đƣợc phát hiện ở nhiều vùng núi nƣớc
ta nhƣ Cao Bằng Hà Giang

ai Châu

ào Cai

âm Đồng. Theo kinh nghiệm dân

gian, cây mật gấu đƣợc dùng để chữa các bệnh tiêu h a nhƣ kiết lỵ, viêm ruột, tiêu
chảy, viêm gan, vàng da hoặc dùng ngoài chữa viêm da, dị ứng, ngứa lở. Nhân dân
một số địa phƣơng thuộc t nh Cao Bằng dùng làm thuốc bổ dƣới dạng hãm chè
“Mát gan”. Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cho thấy
loài M. aquifolium đặc biệt có hiệu quả trong chữa trị các bệnh về da nhƣ vảy nến,
eczema, da khơ, nấm ngồi da.
Là loại dƣợc liệu có tác dụng qu nhƣ vậy nhƣng cho đến nay, các cơng trình
nghiên cứu về quy trình chiết tách hay xác định thành phần hóa học, cấu trúc các

hợp chất chính trong cây mật gấu vẫn cịn ít và chƣa hệ thống. Để tiếp tục nghiên
cứu sâu về cây mật gấu ở t nh Cao Bằng làm cơ sở cho việc tạo ra chế phẩm
thuốc, tôi chọn đề tài “Nghiên cứ

hi

á h và á

nh h nh phần h

h

cao chloroform từ tổng cao ethanol ủ thân cây mật gấu ở Cao Bằng” làm luận
văn tốt nghiệp nhằm đ ng g p thơng tin khoa học về thành phần hóa học của loài
cây này.


2

2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định thành phần hóa học từ các dịch chiết của thân cây mật gấu (Mahonia
nepalensis DC.). Phân lập và xác định thành phần hóa học từ một số phân đoạn
phân lập.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Dịch chiết phần thân của cây mật gấu (Mahonia nepalensis DC.) thu mua tại
Cao Bằng vào tháng 5 năm 2015.
4. Nội dung nghiên cứu
4.1. Nghiên cứu lý thuy t
+ Thu thập, tổng hợp, phân tích các tài liệu tƣ liệu về nguồn nguyên liệu,
thành phần h a học và ứng dụng của cây mật gấu.

+ Tổng hợp tài liệu về phƣơng pháp chiết tách phân lập và xác định thành
phần h a học các chất từ dịch chiết mẫu thực vật.
4.2. Nghiên cứu thực nghiệm
+ Chiết tách các chất bằng các dung môi khác nhau theo phƣơng pháp chiết
lỏng - lỏng.
Dùng phƣơng pháp GC/MS để định danh các chất trong các dịch chiết.
+ Phân lập bằng phƣơng pháp sắc ký.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
5.1. Ý nghĩ kho h c
Cung cấp thông tin khoa học về quy trình chiết tách, thành phần hóa học trong
một số dịch chiết của thân cây mật gấu Cao Bằng.
5.2. Ý nghĩ

hực tiễn

Góp phần khai thác, mở rộng sản xuất, sử dụng và bảo vệ loài cây này một
cách hiệu quả và bền vững.
6. Bố cục uận v n
uận văn gồm trang, 9 bảng, 27 hình, 13 tài liệu tham khảo. Ngoài phần mở
đầu (02 trang) và kết luận, kiến nghị (02 trang), nội dung chính gồm các phần sau:
Chƣơng 1. Tổng quan (6 trang)
Chƣơng 2. Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (13 trang)
Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận (19 trang)


3

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI MAHONIA
Cây bụi hoặc gỗ nhỏ, vỏ có lớp bần dày, màu trắng xám; gỗ thân và rễ có màu
vàng; cây có thể phân nhánh. Lá kép lông chim lẻ; lá chét mỗi bên từ 3 - 7 cái, gần
nhƣ khơng cuống, hình bầu dục hoặc hơi thuôn cỡ 3,5 – 7 x 2,5 – 4 cm, gốc hơi h nh
tim hoặc cụt đ nh nhọn hoắt thành gai; phiến lá dày, cứng, mép khía 3 - 5 răng cƣa to
nhọn sắc; 3 gân chính, gân phụ nổi rõ cả 2 mặt. Cụm hoa 1 - 5, hình bơng, phân nhánh,
mọc thẳng ở ngọn. Hoa nhiều, màu vàng; lá bắc hình bầu dục tù. Đài 9 xếp thành 3
vịng. Cánh hoa 6 hình mác tù, có 2 tuyến ở gốc. Nhị 6, mọc đối với cánh hoa, bao
phấn dài bằng nửa ch nhị. Bầu hình trụ, phình ở giữa. Quả hạch màu xanh lơ gần
hình cầu đƣờng kính 6 – 7 mm đầu quả có núm nhỏ do đầu nhuỵ tồn tại. Hạt 1, màu
nâu đen dài khoảng 3 mm.
Mùa hoa tháng 2 - 4, quả tháng 4 - 6. Cây ra hoa kết quả nhiều. Nhân giống tự
nhiên bằng hạt, có khả năng tái sinh sau khi bị chặt phát. Cây ƣa ẩm, chịu bóng lúc
nhỏ sau ƣa sáng; thích nghi với vùng có khí hậu ơn hồ. Thƣờng mọc rải rác ở ven
rừng hay dƣới tán rừng kín thƣờng xanh ẩm, ở độ cao 1700 – 1900 m.
Ở Việt Nam có các loài thuộc chi Mahonia nhƣ M. japonica (Thunb) DC.;
M. bealei (Fort) Carr.; M. nepalensis DC.; [3]
Viện Dƣợc liệu (Bộ Y tế) đã lấy và lƣu mẫu 3 loài thuộc chi Mahonia [3]:
- M. bealei (Fort) Carr.: Ngày 12/11/1969 ở Hà Giang đ nh núi cao 1400 m.
- M. japonica (Thunb) DC.: Ngày 26/10/1973 ở Sìn Hồ - Lai Châu.
- M. nepalensis DC.: Ngày 13/05/1980 ở Langbiang - Lạc Dƣơng - âm Đồng.
1.2. GIỚI THIỆU VỀ CÂY MẬT GẤU
1.2.1. Tên gọi
Tên khoa học: Mahonia nepalensis DC., họ Hoàng liên gai (Berberidaceae).
Tên Tiếng Việt: Mã hồ; Hồng liên ơ rơ; Hồng bá gai; Thích hồng bá; Thập
đại cơng lao.


4


0Tên khác: Berberis nepalensis Spreng.; Mahonia japonica DC.;
Mahonia annamica Gagnep.
Theo phân loại khoa học, cây mật gấu thuộc:
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Ranunculales
Họ: Berberidaceae
Chi: Mahonia
Loài: Mahonia nepalensis DC.
1.2.2. Phân bố
Lần đầu tiên ở vùng núi cao huyện Bát Xát (Lào Cai), cây mật gấu đã đƣợc
đoàn điều tra dƣợc liệu của t nh ào Cai do Trƣờng đại học Dƣợc khảo sát và tìm
thấy vào năm 1967.
Hiện nay, cây mật gấu thƣờng mọc hoang ở vùng núi cao, lạnh trên núi đá
vôi, ở độ cao 1000 m trở lên [4]. Theo Sách đỏ Việt Nam 2007, cây thƣờng phân bố
tại 6 t nh bao gồm Lâm Đồng, Lào Cai, Lai Châu, Sơn La, Hà Giang và Cao Bằng.
Ngồi ra, cịn có ở nhiều nƣớc châu Á nhƣ Trung Quốc, Nepal, Ấn Độ,…
1.2.3. Đặc điểm thực vật
Cây mật gấu có thể cao 4 – 6 m. Lá kép hình lơng chim lẻ, mọc so le, dài 20 – 40
cm, mang 11 - 25 lá chét cứng khơng cuống, hình trái xoan hẹp, dài 6 – 10 cm, rộng 2 –
4,5 cm, gốc trịn, đầu lá nhọn nhƣ gai, mép có răng nhọn; gân chính 3. Lá kèm nhọn
nhƣ hai gai nhỏ. Các cụm hoa ở ngọn thân, mang nhiều hoa màu vàng nhạt; lá đài 9,
xếp thành 3 vòng; cánh hoa 6, có tuyến ở gốc; nhị 6; bầu hình trụ. Quả thịt, hình trái
xoan, đƣờng kính khoảng 1 cm, đầu quả có núm nhọn, khi chín màu xanh nâu, chứa 3
- 5 hạt. Mùa hoa: tháng 2 - 4, quả: tháng 5 - 6. Cây thân gỗ, màu vàng nhạt, vị đắng
nhƣ mật gấu, tính mát.


5


(a)

(b)

(c)

Hình 1.1. Hoa (a), quả (b), lá (c) cây mật gấu [12]

Hình 1.2. Cây mật gấu (Mahonia Nepalensis DC.) [13]
1.2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc về cây mật gấu
Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đi sâu nghiên cứu về lồi M.aquifolium,
cho thấy nó có hiệu quả nổi bật trong điều trị bệnh vảy nến [8], [9]. Dịch chiết từ vỏ
thân lồi M.aquifolium có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của những tế bào hóa
sừng [11]. Tại Đức, trong số 443 bệnh nhân bị vảy nến đƣợc điều trị bằng
M.aquifolium 375 ngƣời đã khỏi hẳn sau 12 tuần điều trị hoặc sớm hơn [9].
Theo Muller k và Ziereis K, tác dụng ức chế sự phát triển các tế bào hóa sừng
của alcaloid chính trong cây là Berberin, Magnoflorin ch tƣơng đƣơng với tác dụng
của dịch chiết từ vỏ thân trong khi đ những alcaloid có khung bisbenzyl isoquinolin
nhƣ berbamin oxyacanthin lại cho hiệu quả tốt hơn [11].


6

Hình 1.3. Berberin

Hình 1.4. Magnoflorin

Hình 1.5. Berbamin


Hình 1.6. Oxyacanthin
Bezakova L cùng một số tác giả khác đã công bố: 6 alcaloid có khung
bisbenzyl isoquinoline (Oxyacanthin, berbamin, armoline, aquifolin, baluchisin,
obamegin), 2 alcaloid khung protoberberin (Oxyberberin, columbamin) và 1
alcaloid khung aporphin (Corytuberin) có hoạt tính chống oxy h a ngăn cản sự
peroxy hóa lipid. Các tác giả cho rằng sản phẩm oxy hóa trong chuyển hóa lipid là
tác nhân gây ra bệnh vảy nến. Cơ chế ngăn chặn q trình oxy hóa lipid của các
alcaloid này có thể giải thích do sự ức chế trực tiếp các phản ứng peroxy hóa hoặc
sự thu dọn gốc tự do. Nhờ tác dụng này của các hợp chất alcaloid, dịch chiết
M.aquifolium có thể dùng trong chữa trị các bệnh mà tác nhân gây ra là những sản
phẩm của quá tr nh oxy h a lipid trong đ c bệnh vảy nến [7], [10].


7

Hình 1.7. Columbamin
Các nghiên cứu bƣớc đầu về thành phần hóa học và tác dụng của cây mật gấu ở
Việt Nam cho thấy rằng: Nƣớc sắc của thân cây mật gấu có tác dụng chống viêm cấp,
kháng khuẩn, kháng nấm. Dịch chiết cồn từ thân cây mật gấu có tác dụng lợi mật, tác
dụng bảo vệ tế bào gan chuột thí nghiệm [2], [5].
1.2.5. Giá trị sử dụng của cây mật gấu ở Việt Nam
Ngƣời ta dùng lá, thân, rễ và quả để làm thuốc. Thân và lá thu hái quanh năm
rửa sạch, phơi khô. Gỗ của thân và rễ có màu vàng nhạt. Cây mật gấu có tác dụng
rất tốt trong việc điều trị các triệu chứng về bệnh rối loạn tiêu hố, đƣờng ruột, mát
gan, phịng và chữa sỏi mật, giảm đau lƣng và thấp khớp, tăng cƣờng sức khoẻ,… Ở
Bắc Kạn, Cao Bằng, cây mật gấu đƣợc thu hái dƣới dạng những đoạn thân cây, rửa
sạch, chặt nhỏ, phơi khô rồi ngâm rƣợu một thời gian, khi rƣợu ngả vàng thì tùy độ
đậm đặc mà pha thêm rƣợu để trị bệnh. Hoặc đơn giản là cắt lát nhỏ, cho vào nồi
đun sôi 15 phút rồi uống. Cũng có thể phối hợp cây mật gấu với các vị thuốc khác
để chữa kiết lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm gan vàng da, mắt đau sƣng đỏ và đặc biệt

là tiêu mỡ, viêm đại tràng, chữa béo phì, gút,…
Dƣới đây là một số bài thuốc trong dân gian có sử dụng cây mật gấu để sắc
uống [1]:
+ Chữa viêm gan cấp tính: Dùng thân hoặc rễ mật gấu 25 g, rễ hoàng liên gai
15 g, nhân trần 15 g.
+ Chữa ho lao, sốt cơn khạc ra máu lƣng gối yếu mỏi, chóng mặt ù tai, mất
ngủ: Dùng lá khơ hay quả 8 – 12 g, sắc uống hay phối hợp với các vị thuốc khác.
+ Chữa viêm ruột, a chảy, viêm da dị ứng, viêm gan vàng da, mắt đau sƣng
đỏ: Dùng rễ hay cây khô 10 – 20 g, dùng riêng hay phối hợp với các vị thuốc khác.


8

+ Chữa say nắng (nếu kèm theo nôn mửa, tiêu chảy, tim hồi hộp khát nƣớc):
Dùng hƣơng nhu tía 10 g cát căn 10 g, diếp cá 10 g, cây ban 10 g, mật gấu 10 g,
thạch xƣơng bồ 6 g, mộc hƣơng 3 g.
+ Chữa lao phổi, ho ra máu hoặc khạc ra đờm lẫn máu: Dùng mỏ quạ 40 g,
dây rung rúc 30 g, bách bộ 20 g, mật gấu 20 g.
+ Chữa kiết lỵ, tiêu chảy, viêm ruột ăn khơng tiêu: Dùng rễ, thân hoặc tồn
cây mật gấu 15 g, rễ cốt khí củ 15 g.
+ Chữa đau mắt đỏ, viêm gan vàng da: Dùng rễ hoặc thân mật gấu 20 g, hạ
khô thảo 10 g.
+ Chữa viêm da dị ứng, mẩn ngứa, mụn nhọt: Dùng rễ hoặc lá mật gấu 15 g, lá
khổ sâm 20 g, nấu nƣớc đặc để rửa.


9

CHƢƠNG 2


NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU DỤNG CỤ H A CHẤT
2.1.1. Ngu ên iệu
Nguyên liệu nghiên cứu là thân cây mật gấu đƣợc thu mua tại Cao Bằng vào
tháng 5 năm 2015 ở dạng thái lát, khô tự nhiên và đựng sẵn trong bao
polyethylene sau đ đƣợc nghiền nhỏ để tiến hành nghiên cứu.

Hình 2.1. Thân cây mật gấu thái lát

Hình 2.2. Thân cây mật gấu đã nghiền nhỏ


10

2.1.2. Thiết bị dụng cụ h a chất
a. hi

ng

- Máy đo sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS 7890A/5975C của hãng Agilent tại
Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lƣờng chất lƣợng 2 - Đà Nẵng.
- Cân phân tích, bếp cách thủy, cốc thủy tinh đũa thủy tinh, bình tam giác,
ống đong bếp điện, phễu lọc, phễu chiết, các loại pipet b nh định mức, nhiệt kế,
bình hút ẩm, bản mỏng, cột chạy sắc ký,...
.

hấ
Bảng 2.1. Hóa chất được sử dụng trong q trình làm thí nghiệm
Tiêu


STT

Tên hóa chất

Độ tinh khiết

1

Hexane

Tinh khiết

TCCS

Trung Quốc

2

Chloroform

Tinh khiết

TCCS

Trung Quốc

3

Ethyl Acetate


Tinh khiết

TCCS

Trung Quốc

4

Methanol

Tinh khiết

TCCS

Trung Quốc

5

Ethanol tuyệt đối

Tinh khiết

TCCS

Việt Nam

8

Dung dịch CH3COOH


Đậm đặc (98%)

TCCS

Trung Quốc

9

Silicagen

Tinh khiết

TCCS

Đức

10

Vanilin

Thƣơng mại

TCCS

Trung Quốc

11

Axitsunfuric


Đậm đặc (98%)

TCCS

Việt Nam

chuẩn

Nguồn gốc

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGÂM DẦM TẠO TỔNG CAO ETHANOL TỪ BỘT
THÂN CÂY MẬT GẤU
2.2.1. Nguyên tắc
Ngâm chất rắn (đã đƣợc nghiền nhỏ) vào dung môi thích hợp trong thời gian
xác định sau đ gạn hoặc lọc lấy dung dịch rồi cô quay dung môi.
2.2.2. Cách tiến hành
Lấy 500 g bột thân cây mật gấu ngâm chiết bằng ethanol 96o ở nhiệt độ phòng,


11

thời gian ngâm chiết 24 giờ, sử dụng máy khuấy (hoặc lắc đều sau mỗi 15 phút) để
đảm bảo cho sự khuyếch tán tốt. Lọc gạn lấy phần dịch chiết rồi tiếp tục lọc qua
giấy lọc trên phễu Buschle. Lặp lại 3 lần, lần đầu dùng 2 lít ethanol, những lần sau
mỗi lần dùng 1 lít ethanol. Gộp các dịch chiết và cất loại ethanol dƣới áp suất giảm
ta đƣợc cao ethanol của thân cây mật gấu.
Cân xác định khối lƣợng cao thu đƣợc và tính % khối lƣợng cao chiết so với
khối lƣợng mẫu ban đầu.
2.3. PHƢƠNG PHÁP CHIẾT PHÂN BỐ LỎNG – LỎNG TỪ TỔNG CAO
ETHANOL

2.3.1. Nguyên tắc
Là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này khơng
hịa tan vào nhau. Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của
chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng đƣợc biểu diễn bằng hằng số
phân bố K:
K = Ca/Cb
Ca: nồng độ chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng.
Cb: nồng độ chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng.
Lựa chọn dung môi chiết [6]:
Dung môi chiết phải đảm bảo các u cầu sau:
- Dung mơi chiết phải hịa tan tốt chất đƣợc chiết.
- Khơng hịa lẫn với dung mơi cũ nghĩa là c t khối khác nhiều với dung môi cũ.
- Dung môi này không đƣợc tƣơng tác với chất cần chiết và có nhiệt độ sơi
tƣơng đối thấp.
Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết:
- Ảnh hƣởng của pH.
- Vai trò của sự tạo phức.
- Ảnh hƣởng của sự tạo thành hợp chất ít tan.
2.3.2. Cách tiến hành
Lấy 10 g cao ethanol đem hòa tan lại bằng một lƣợng ethanol tối thiểu, tiếp
theo cho nƣớc cất vào để đƣợc tổng thể tích 100 ml, lắc kỹ để cao phân tán đều


12

trong nƣớc rồi chia thành 2 phần bằng nhau, cho vào 2 bình tam giác, mỗi bình
là 250 ml. Sau đ

tiến hành chiết lỏng - lỏng với các dung môi hexane


chloroform. Chiết 3 lần, mỗi lần 100 ml dung môi. Thời gian lắc chiết mỗi lần là
1 giờ sau đ chuyển ngay lên phễu chiết loại 250 ml chờ tách lớp và chiết riêng
phần dung môi, làm khan bằng Na2SO4 rồi đem định mức đến 100 ml. Gộp dịch
chiết của cả 3 cô đuổi dung môi dƣới áp suất giảm ta đƣợc các cao hexane,
chloroform từ tổng cao ethanol. Cân xác định khối lƣợng các cao thu đƣợc và
tính % lƣợng chất chiết theo số lần chiết trong cao chiết hexane và chloroform từ
tổng cao etanol.
Sau đ tiến hành định danh thành phần hóa học bằng phƣơng pháp GC/MS.
2.4. PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN BẰNG SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ BẢN
MỎNG
2.4.1. Sắc k cột
Nạp chất hấp thu vào cột
Chuẩn bị: Sử dụng cột sắc kí c kích thƣớc phù hợp với lƣợng cao khảo sát.
Lấy cốc 500 ml chứa sẵn dung môi hexane, cho từ từ silica gel (đã sấy ở 130oC
trong vòng 6 giờ) vào và khuấy đều đặn để đuổi hết bọt khí. Chú ý, khơng r t trực
tiếp dung môi vào chất hấp thu (silica gel) bởi v chất hấp thu gặp dung môi s phát
nhiệt c thể làm chất hấp thu v n cục không đồng nhất. ƣợng dung môi sử dụng
phải vừa đủ để hỗn hợp không đƣợc quá sệt.
Ngâm hỗn hợp khoảng 12 giờ hoặc qua đêm để silica gel trƣơng nở hết trong
hexane. Trƣớc khi nhồi cột phải quan sát hỗn hợp hexane:silica gel, nếu hỗn hợp
khơng có dạng sệt th thêm hexane vào để hỗn hợp trở nên sệt nhƣ vậy khi nhồi cột
hỗn hợp mới c thể r t chảy xuống cột dễ dàng. Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng
đứng trên giá. Nới lỏng kẹp để có thể xoay cột theo vịng trịn, khơng nới kẹp rộng
q để tránh trƣờng hợp cột khơng đƣợc giữ cố định có khả năng rơi vỡ. Cho mẫu
bông nhỏ vào đáy cột (để tránh silica gel lọt xuống bình hứng).
Cách tiến hành
Dùng một phễu lọc c đuôi dài đặt trên đầu cột cho vào cột 1 lƣợng hexane
(có thể dùng hexane từ hỗn hợp hexane:silica gel đã ngâm), dung môi hexane s



13

thấm qua bơng gịn, giúp cố định bơng gịn ở bên dƣới cột không bị lệch khỏi đáy
cột trong lúc cho hỗn hợp hexane:silica gel vào. Mở nhẹ kh a ở bên dƣới cột và
dùng lọ thủy tinh hứng hexane chảy ra bên dƣới cột. Khi bơng gịn đã đƣợc cố định,
ta vặn khóa lại và chú ý trong cột bây giờ vẫn còn dung dịch hexane cao khoảng 40
cm so với chiều cao làm việc của cột. Đổ nhẹ từ từ hỗn hợp ở dạng sệt vào cột. Sau
khi đổ 1 ít hỗn hợp vào cột, ta xoay nhẹ cột theo vòng tròn và dùng một thanh cao
su g nhẹ quanh thành cột từ dƣới lên trên để chất hấp thu nén đều trong cột và
không bị lỏng. Tiến hành mở nhẹ kh a ở bên dƣới cột để dung môi hexane tiếp tục
chảy ra từ từ và hứng vào một lọ thủy tinh trống để ở bên dƣới cột hexane sau khi
hứng lại đƣợc r t vào đầu cột sắc ký. Tiếp tục đổ 1 ít hỗn hợp vào cột, tiến hành
liên tục nhƣ vậy cho đến khi hết hỗn hợp để việc nạp cột đƣợc chặt ch

cho thấy

chất hấp thu trong cột c dạng đồng nhất.
Ta phải làm cho mặt thoáng chất hấp thu (silica gel) ở đầu cột nằm ngang.
Nếu mặt thống khơng nằm ngang phải cho dung môi thêm lên trên phần đầu
cột dùng đũa thủy tinh khuấy đảo nhẹ phần dung môi gần sát mặt thoáng làm
xáo trộn một phần chất hấp thu ở trên đầu cột. Sau đ để yên chất hấp thu lắng
xuống từ từ tạo nên mặt thoáng bằng phẳng. Để ổn định cột qua đêm nhằm tránh
tình trạng nứt cột.
Nạp mẫu vào cột
Cao nghiên cứu đƣợc trộn với một lƣợng silica gel vừa đủ rồi cô quay chân
không đến khô hoàn toàn. Sau đ lấy ra, nghiền mịn bằng cối chày sứ thu đƣợc mẫu
cao đã thấm đều trên bề mặt silica gel. Cho mẫu cao này vào cột (đã nạp silica gel)
qua một phễu nhỏ một cách từ từ để tránh tạo bọt khí và vón cục. Cột sắc ký sau khi
nạp silica gel đƣợc điều ch nh lƣợng dung mơi hexane thích hợp (đủ thấm ƣớt mẫu
khơ cho vào). Phủ lên trên mẫu 1 lớp silica gel mỏng nữa và cho 1 ít dung mơi

hexane ở trên đầu cột để cột ổn định qua 3 giờ.
Chạy sắc ký cột silica gel
Rửa giải bằng hệ dung mơi thích hợp dựa theo kết quả từ sắc ký bản mỏng. Tốc
độ giải ly thay đổi tùy từng trƣờng hợp cụ thể thông thƣờng từ 0,5 – 1,5 ml/phút.
- Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ: ch sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn


14

hợp dung môi nhƣng trong hỗn hợp t lệ giữa các thành phần không thay đổi để giải
ly cho đến khi việc tách chất hồn tất.
- Giải ly có nồng độ tăng dần: Đôi khi việc sử dụng một dung môi s ch giải
ly ra khỏi cột một số cấu tử nhất định nào đ và một số cấu tử khác có tính phân cực
hơn vẫn cịn nằm ở đầu cột. Nếu muốn đuổi chúng ra khỏi cột, phải dùng một dung
mơi có lực mạnh hơn. Trong q trình sắc ký, cần thay đổi nhiều loại dung mơi
khác nhau, có lực mạnh tăng dần để có thể đuổi hết các cấu tử khác nhau ra khỏi
cột. Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng
chậm; nếu tăng tính phân cực nhanh đột ngột s làm gãy cột. Cột gãy làm mất đi sự
liên tục của chất hấp thu và vì thế khơng tách chất tốt đƣợc.
- Theo d i quá tr nh giải ly: Hứng dung dịch giải ly trong những lọ c đánh số
thứ tự. Hứng mỗi lần thể tích nhƣ nhau là 15 ml. Dung dịch trong những lọ hứng
đƣợc làm bay hơi còn lại khoảng 5 ml và chấm bản mỏng. Những lọ cho kết quả sắc
kí bản mỏng giống nhau đƣợc gộp chung thành 1 phân đoạn.
Chọn phân đoạn c lƣợng cao nhiều và c hợp chất cần phân lập (khi định
danh bằng GC/MS) để tiếp tục khảo sát. Các phân đoạn c lƣợng cao ít kết quả
định danh bằng GC/MS cho nhiều tạp chất rất kh khảo sát tiếp v nếu c cô lập
đƣợc chất tinh khiết s không đủ lƣợng mẫu để khảo sát cấu trúc h a học bằng
phƣơng pháp h a l hiện đại.
2.4.2. Sắc k bản


ỏng

Phƣơng pháp này đƣợc Izmailop và Schreiber đề nghị từ năm 1938 đƣợc Stan
phát triển hoàn thiện năm 1955 và c ứng dụng rộng rãi.
Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng đƣợc dùng để định tính, thử độ tinh khiết và
đôi khi để bán định lƣợng hoặc định lƣợng hoạt chất thuốc. Sắc ký lớp mỏng là
một kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha
tĩnh trên đ đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ đƣợc chọn
phù hợp theo từng yêu cầu phân tích đƣợc trải thành lớp mỏng đồng nhất và
đƣợc cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung
môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng