BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

NGUYỄN THỊ HỒNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP - NHÂN GIỐNG
VÀ NUÔI TRỒNG NẤM ĐÔNG TRÙNG
HẠ THẢO (Cordyceps militaris) Ở VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN THỊ HỒNG GẤM

Hà Nội, 2019


i
LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan, đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ
cơng trình nghiên cứu nào khác.
Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ cơng trình nghiên cứu
nào đã cơng bố, tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá
luận văn của Hội đồng khoa học.
Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2020

Ngƣời cam đoan

Nguyễn Thị Hồng


ii
LỜI CẢM ƠN
Luận văn được hồn thành trong chương trình đào tạo nghiên cứu sinh khóa
26A của trường Đại học Lâm nghiệp.
Đ hoàn thành được Luận văn này, trước hết tôi xin chân thành cảm ơn tập
th Ban lãnh đạo Viện, các th y cô giáo của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp
và Ban Giám đốc Công ty Cổ ph n Dược thảo Thiên Phúc đã tạo đi u kiện tốt nhất
cho tơi trong q trình thực hiện Luận văn này.
Đặc biệt, tôi xin g i lời biết ơn sâu s c đến TS. Nguyễn Thị Hồng Gấm đã
tận tình hướng d n tơi ngay nh ng ngày đ u b t tay vào nghiên cứu đ tơi hồn
thành tốt Đ tài nghiên cứu.
Luận văn được tiến hành dưới sự hỗ trợ kinh phí của Dự án thuộc Quỹ đổi
mới Công nghệ Quốc gia - Bộ Khoa học & Cơng nghệ tài trợ: “Hồn thiện, nâng
cấp quy trình sản xuất và phát tri n sản phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa Cordyceps
militaris”, do PGS.TS. Lê Minh S t, Công ty Cổ ph n Dược thảo Thiên Phúc làm
chủ nhiệm.
Cuối c ng, tôi xin g i lời cảm ơn tới gia đình, bạn b và người thân đã ln
ln kh ch lệ, động viên và tạo mọi đi u kiện thuận lợi cho tơi học tập và hồn
thành Luận văn này.
Tuy đã cố g ng đ hoàn thiện Luận văn, song kinh nghiệm của tơi c n hạn
chế, vì vậy Luận văn khơng tránh khỏi nh ng thiếu sót, k nh mong các qu th y cơ
đóng góp

kiến đ Luận văn của tơi được hồn thiện hơn.


Tơi xin chân thành cảm ơn!
à Nội, ngày29 tháng 5 năm 2020
Học viên

Nguyễn Thị Hồng


iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................... ix
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1
Phần I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................ 2
1.1. Tổng quan chung v Cordyceps militaris ............................................. 2
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu ......................................................................... 2
1.1.2. Phân loại ........................................................................................ 2
1.1.3. Đặc điểm và phân bố của Cordyceps militairs ............................... 3
1.1.4. Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris ............................... 4
1.1.5. Các hoạt chất chính trong nấm đơng trùng hạ thảo Cordyceps
militaris ................................................................................................... 5
1.2. Tình hình nghiên cứu ni cấy đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris
ở Việt Nam và trên thế giới ......................................................................... 7
1.2.1. Tình hình nghiên cứu ni cấy đơng trùng hạ thảo Cordyceps
militaris trên thế giới ............................................................................... 7

1.2.2. Tình hình nghiên cứu ni cấy đơng trùng hạ thảo Cordyceps
militaris ở Việt Nam. ................................................................................ 9
1.3. Các phương pháp định danh nấm ....................................................... 10
1.3.1. Phương pháp định danh thơng qua hình thái................................ 10
1.3.2. Phương pháp định danh bằng phân tử ......................................... 11
1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát tri n của nấm Đông
trùng hạ thảo Cordyceps militaris.............................................................. 15


iv

1.4.1. Yếu tố giống ................................................................................. 15
1.4.2. Yếu tố dinh dưỡng ........................................................................ 15
1.4.3. Các yếu tố môi trường .................................................................. 17
Phần 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................... 18
2.1.1. Mục tiêu tổng quát ....................................................................... 18
2.1.2. Mục tiêu cụ thể ............................................................................. 18
2.2. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu ....................................... 18
2.2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu .................................................... 18
2.2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................... 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 19
2.3.1. Phương pháp thu thập và định danh loài nấmCordyceps militaris. ...19
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật phân lập giống gốc nấm
Cordyceps militaris ................................................................................ 22
2.3.3. Phương phápnghiên cứu kỹ thuật nhân giống cấp 1 và cấp 2 nấm
Cordyceps militaris. ............................................................................... 23
2.3.4. Phương phápnghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng bằng cơ chất tổng hợp
phù hợp với Cordyceps militaris bản địa................................................ 24
2.4. Nguyên liệu,hóa chất, thiết bị ............................................................. 27

2.5. Phương pháp thu thập và x lý số liệu ................................................ 27
Phần 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 28
3.1. Kết quả thu thập và định danh loài nấm Cordyceps militaris .............. 28
3.1.1. Kết quả điều tra thu thập mẫu tại VQG Hoàng Liên - Lào Cai ..... 28
3.1.2. Kết quả định danh loài nấm Cordyceps militaris bằng phân tử .... 37
3.2. Kỹ thuật phân lập giống gốc nấm Cordyceps militaris ....................... 51
3.3. Kỹ thuật nhân giống cấp 1 và cấp 2 nấm Cordyceps militaris ............ 54
3.3.1. Nhân giống cấp 1 trên môi trường thạch ...................................... 54
3.3.2. Nhân giống cấp 2 trên môi trường lỏng........................................ 63


v
3.4. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng bằng cơ chất tổng hợp ph hợp
với Cordyceps militaris bản địa. ................................................................ 73
KẾT LUẬN ............................................................................................... 101
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................ 102


vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
APS
C
CMWE

Viết đầy đủ
Acidic polysaccharide
Cacbon
Dịch chiết từ quả th nấm Cordyceps militaris


C.militaris

Cordyceps militaris

CNSH

Công nghệ sinh học

Cu

Đồng

ddNTP

Dideoxynucleotide

ĐTHT

Đông tr ng hạ thảo

FAME

Fatty Acid Methyl Ester

IL-6

Interleukin-6

ITS


Internal Transcribed Spacer

LPS

Lipopolysaccharide

PCR

Polemerase Chain Reaction

PDA

Potato Dextro Agar

PGA

Potato Glucose Agar

rRNA

ARN riboxom

Se
SSU

Selen
Small Subunit

TNHH


Trách nhiệm h u hạn

TNF - α

yếu tố hoại t khối u α

VQG
Zn

Vườn quốc gia
Kẽm


vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thành ph n phản ứng PCR .................................................................. 221
Bảng 2.2. Công thức phối trộn 3 loại môi trường nuôi cấy sợi nấm C.militaris .... 255
Bảng 2.3. Công thức phối trộn 3 loại môi trường nuôi cấy sợi nấm C.militaris .... 255
Bảng 3.1. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM1 với các trình tự
tương đồng ở GeneBank ........................................................................................ 37
Bảng 3.2. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM2 với các trình tự
tương đồng ở GeneBank ........................................................................................ 39
Bảng 3.3. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM13 với các trình
tự tương đồng ở GeneBank .................................................................................... 41
Bảng 3.4. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM18 với các trình
tự tương đồng ở GeneBank .................................................................................... 43
Bảng 3.5. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM28 với các trình
tự tương đồng ở GeneBank .................................................................................... 44
Bảng 3.6. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM29 với các trình
tự tương đồng ở GeneBank .................................................................................... 46

Bảng 3.7. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM32 với các trình
tự tương đồng ở GeneBank .................................................................................... 47
Bảng 3.8. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM34 với các trình
tự tương đồng ở GeneBank .................................................................................... 49
Bảng 3.9. Kết quả phân lập m u nấm Codyceps militaris thu ngoài tự nhiên ......... 50
Bảng 3.10. Đường k nh sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trên môi
trường cơ bản PGA................................................................................................ 55
Bảng 3.11. Đường k nh sinh trưởng của các hệ sợ nấm Cordyceps militaris ở các
đi u kiện nhiệt độ khác nhau ................................................................................. 57
Bảng 3.12. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thành ph n môi trường đến khả năng
tạo sinh khối nấm trong môi trường dịch th .......................................................... 62
Bảng 3.13. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ l c đến khả năng tạo sinh khối
nấm trong môi trường dịch lỏng ............................................................................ 69


viii
Bảng 3.14. Kết quả ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến khả năng hình thành và phát
tri n quả th ........................................................................................................... 71
Bảng 3.15. Kết quả nghiên cứu đặc đi m sinh trưởng của hệ sợi khi nuôi cấy trên
môi trường C2 ....................................................................................................... 76
Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của nguồn Nito đến khả năng hình thành và phát
tri n quả th ........................................................................................................... 79
Bảng 3.17. Kết quả nghiên cứu đặc đi m sinh trưởng của hệ sợi khi nuôi cấy trên
môi trường N2 ....................................................................................................... 83
Bảng 3.18. Kết quả ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng và phát
tri n quả th Cordyceps militaris ........................................................................... 81
Bảng 3.19. kết quả nghiên cứu đặc đi m quả th khi chiếu sáng ở cường độ 700 lux .. 87
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng hình thành và phát
tri n quả th Cordyceps militaris ........................................................................... 89
Bảng 3.21. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày .. 90

Bảng 3.22. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng hình thành và phát tri n quả th
Cordyceps militaris................................................................................................ 92
Bảng 3.23. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm 80% và 90% đến sinh trưởng
của quả th ............................................................................................................ 93
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành và phát tri n quả th
Cordyceps militaris................................................................................................ 96
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của quả th ........................... 97


ix
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1. Hình ảnh m u nấm CM1 thu ngồi tự nhiên ......................................... 299
Hình 3.2. Hình ảnh m u nấm CM2 thu ngồi tự nhiên ......................................... 309
Hình 3.3. Hình ảnh m u nấm CM5 thu ngồi tự nhiên ........................................... 30
Hình 3.4. Hình ảnh m u nấm CM7 thu ngồi tự nhiên ........................................... 31
Hình 3.5. Hình ảnh m u nấm CM13 thu ngồi tự nhiên ......................................... 31
Hình 3.6. Hình ảnh m u nấm CM14 thu ngồi tự nhiên ......................................... 32
Hình 3.7. Hình ảnh m u nấm CM18 ngồi tự nhiên ............................................... 33
Hình 3.8. Hình ảnh m u nấm CM24 thu ngồi tự nhiên ......................................... 33
Hình 3.9. Hình ảnh m u nấm CM28 ngồi tự nhiên ............................................... 35
Hình 3.10. Hình ảnh m u nấm CM29 thu ngồi tự nhiên ....................................... 36
Hình 3.11. Hình ảnh m u nấm CM32 ngồi tự nhiên ............................................. 36
Hình 3.12. Hình ảnh m u nấm CM34 ngồi tự nhiên ............................................. 37
Hình 3.13. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM1 trên BLAST NCBI ............... 38
Hình 3.14. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM1 ............................................... 39
Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM2 trên BLAST NCBI ............... 40
Hình 3.16. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM2 ............................................... 40
Hình 3.17. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM7 ............................................... 40
Hình.3.18. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM13 trên BLAST NCBI ............. 41
Hình 3.19. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM13 ............................................. 42

Hình 3.20. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM18 trên BLAST NCBI ............. 42
Hình 3.21. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM18 ............................................. 44
Hình 3.22. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM28 trên BLAST NCBI ............. 45
Hình 3.23. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM28 ............................................. 46
Hình 3.24. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM29 trên BLAST NCBI ............. 47
Hình 3.25. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM29 ............................................. 48
Hình 3.26. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM32 trên BLAST NCBI ............. 49
Hình 3.27. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM32 ............................................. 49
Hình 3.28. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM34 trên BLAST NCBI ............. 50


x
Hình 3.29. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM34 ............................................. 51
Hình 3.30. M u CM2 và CM13 sau 10 ngày phân lập ........................................... 51
Hình 3.31. Hình ảnh các m u nấm ngoài tự nhiên sau 10 ngày phân lập ................ 52
Hình 3.32. Hình ảnh các m u nấm sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường Hansen . 55
Hình 3.33. Hình ảnh các m u nấm sau 15 ngày ni cấy trên mơi trườngCzapek-Dox .... 56
Hình 3.34. Hình ảnh m u CM1 sau 7 ngày ni cấy và m u CM7 sau 15 ngày nuôi cấy . 58
Hình 3.35. Hình ảnh các m u nấm sau 7 ngày nhân giống trên mơi trường PGA ... 58
Hình 3.36. Hình ảnh các m u nấm sau 15 ngày nhân giống trên mơi trường PGA . 59
Hình 3.37. Hình ảnh m u nấm CM1 ...................................................................... 61
Hình 3.38. Hình ảnh m u nấm CM2 ...................................................................... 60
Hình 3.39. Hình ảnh m u nấm CM7 ...................................................................... 60
Hình 3.40. Hình ảnh các m u nấm sau 15 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 25oC .............. 61
Hình 3.41. Hình ảnh m u CM1 trên mơi trường M1(A) và mơi trường M2(B) ...... 65
Hình 3.42. Hình ảnh các m u được nuôi cấy trên môi trường M1 sau 7 ngày l c dịch ...... 66
Hình 3.43. Hình ảnh các m u được ni cấy trên mơi trường M2 sau 7 ngày l c dịch ...... 67
Hình 3.44. Hình ảnh các m u được ni cấy trên môi trường M3 sau 7 ngày l c dịch ...... 68
Hình 3.45. Hình ảnh các m u khi l c ở tốc độ 100 vịng/phút ................................ 70
Hình 3.46. Hình ảnh các m u khi l c ở tốc độ 150 vịng/phút ................................ 71

Hình 3.47. Hình ảnh các m u khi l c ở tốc độ 200 vịng/phút ................................ 70
Hình 3.48. Hình ảnh các m u sau khi ươm sợi trên mơi trường C2 ........................ 75
Hình 3.49. Hình ảnh m u nấm CM29 và CM32 sau 63 ngày và 56 ngày ni trồng
trên mơi trường C1 ................................................................................................ 76
Hình 3.50. Hình ảnh m u nấm CM29 và CM32 sau 63 ngày và 56 ngày ni trồng
trên mơi trường C3 ................................................................................................ 76
Hình 3.51. Hình ảnh m u CM1 sau 25 ngày ni cấy (A)và 57 ngày nuôi cấy (B)
trên môi trường C2 ................................................................................................ 78
Hình 3.52. Hình ảnh các m u sau khi ni trồng trên mơi trường C2 ..................... 79
Hình 3.53. Hình ảnh các m u sau khi ươm sợi trên môi trường N2 ............................ 81
Hình 3.54. Hình ảnh m u nấm CM18 và CM29 sau 59 ngày và 63 ngày nuôi trồng
trên môi trường N1 ................................................................................................................ 82


xi
Hình 3.55. Hình ảnh m u nấm CM13 và CM32 sau 63 ngày và 64 ngày nuôi trồng
trên môi trường N3 ................................................................................................................ 82
Hình 3.56. Hình ảnh các m u sau khi ni trồng trên mơi trường N2 ...................... 840
Hình 3.57. Hình ảnh m u CM29 sau 55 ngày ni cấy ở mơi trường N2 .................. 81
Hình 3.58. Hình ảnh m u CM29 sau 56 ngày nuôi cấy ở cường độ ánh sáng 500 lux.... 86
Hình 3.59. Hình ảnh các m u nấm sau khi nuôi trồng ở cường độ 700 lux ............... 88
Hình 3.60. Hình ảnh các m u sau khi nuôi trồng trên cơ chất tổng hợp ở thời gian
chiếu sáng 12 giờ/ngày ......................................................................................................... 91
Hình 3.61. Hình ảnh các m u sau khi nuôi trồng trong độ ẩm 80% ............................ 90
Hình 3.62. Hình ảnh các m u sau khi ni trồng trong độ ẩm 90% ............................ 95
Hình 3.63. Hình ảnh m u CM18 sau khi hệ sợi ăn lan k n b mặt cơ chất (A) và sau
khi nuôi sáng 3 ngày (B) ở nhiệt độ 22oC ......................................................................... 96
Hình 3.64. Hình ảnh m u CM32 ở nhiệt độ 22oC - 24oC sau 50 và 52 ngày nuôi trồng . 98
Hình 3.65. Hình ảnh m u CM1, CM29, CM34 ở nhiệt độ 22oC và 24oC sau khi
nuôi trồng trên giá th tổng hợp .......................................................................................... 99

Hình 3.66. Hình ảnhm u CM13 sau khi nuôi trồng 58 ngày ở nhiệt độ 22oC và 24oC......... 99
Hình 3.67. Hình ảnh m u CM7 sau khi nuôi trồng trên cơ chất tổng hợp ở nhiệt độ
22oC và 24oC......................................................................................................................... 100


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đơng tr ng hạ thảo là một lồi nấm dược liệu qu hiếm từ lâu đã được cả thế
giới biết đến. Nhi u nghiên cứu khoa học đã chứng minh Cordycep militaris có các
thành ph n hóa học ch nh có giá trị dinh dưỡng và dược t nh như: cordycepin,
adenosine, cordycepic acid, polysaccharides, superoxide dismutase (SOD), acid
béo, các sterol và các hoạt chất có tác dụng sinh học khác như acid amin, protein,
vitamin (A, B1, B3, B6, B12, ...) và nguyên tố vi lượng (Zn, Se, Cu, ...). Các bằng
chứng khoa học cũng đã xác nhận hiệu quả của Cordycep militaris như: cải thiện hệ
miễn dịch, chống lão hóa, chống mệt mỏi, tiêu diệt tế bào ung thư, vi rút và vi
khuẩn, hỗ trợ hệ tim mạch, cải thiện sự đ kháng insulin trên bệnh nhân ti u đường,
giảm cân và có th s dụng trong mỹ phẩm, .... Ch nh vì vậy, nhu c u các sản phẩm
từ Cordycep militaris trong nước hiện nay ước t nh đạt 300 tỷ đồng và đang ngày
càng gia tăng, trong đó trên 70% là các sản phẩm nhập khẩu. Trong khi đó, thị
trường tiêu thụ các sản phẩm từ Cordycep militaris trên thế giới hiện nay đạt mức
10.000 tấn/năm, tương đương khoảng 100 tỷ đô la Mỹ/năm. Việc Đông tr ng hạ
thảo tự nhiên d n trở nên khan hiếm đã thúc đẩy nhi u nghiên cứu hướng đến việc
nuôi trồng Đông tr ng hạ thảo nhân tạo. Cordyceps militaris hiện được s dụng như
nguồn Đông tr ng hạ thảo có th ni cấy nhân tạo đ tạo ra quả th , đáp ứng nhu
c u s dụng ngày càng gia tăng trong nước và trên thế giới với ch ph hợp l .
Ở Việt Nam có nhi u chủng nấm Đông tr ng hạ thảo (Cordyceps militaris)
mọc tự nhiên ở các v ng sinh thái khác nhau, tuy vậy việc phân lập, nhân giống và
định danh loài cũng như nuôi trồng chủng cho năng suất quả th cao, chất lượng
hoạt t nh tốt c n hạn chế. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đ tài “Phân lập - nhân
giống và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) ở Việt Nam”

với mục đ ch định danh được nh ng chủng giống nấm Đông tr ng hạ thảo thu nhận
ngồi tự nhiên Việt Nam đ ni trồng cho năng suất quả th cao và hàm lượng các
hoạt chất Cordycepin, Adenosine tốt, sẽ góp ph n thúc đẩy sản xuất nh ng lồi nấm
này tại Cơng ty Cổ Ph n Dược Thảo Thiên Phúc cũng như ở Việt Nam.


2

Phần I.
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan chung về Cordyceps militaris
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu
Nấm đông tr ng hạ thảo được xem là rất quý hiếm. Nh ng câu truyện mang
tính th n thoại và truy n thuyết liên quan đến loài nấm này được lưu truy n trong
nhi u thiên niên kỷ. Hiện nay, các ghi nhận v thời gian phát hiện đ u tiên loài nấm
này chưa được thống nhất. Theo Das (2009) thì nấm đơng tr ng hạ thảo Cordyceps
được biết đến từ nh ng năm 2000 trước công nguyên. Nhưng theo Holliday và cộng
sự (cs.) (2004) tổng hợp từ nhi u nguồn tài liệu ghi nhận đ u tiên v nấm đông
trùng hạ thảo được thực hiện tại Trung Quốc vào năm 620 sau công nguyên, vào
tri u đại nhà Đường. Sự ghi nhận này đã làm rõ bản chất sinh học từ nh ng câu
truyện huy n thoại và truy n thuyết v đông tr ng hạ thảo.
Đông tr ng hạ thảo là một sinh vật tồn tại hàng năm được chuy n một cách
th n bí từ động vật sang thực vật vào m a h và sau đó lại từ thực vật chuy n sang
động vật vào m a đông. Tiếp sau đó có nhi u cơng trình được xuất bản với nội
dung v lồi nấm đơng tr ng hạ thảo này của các học giả xứ Tây Tạng từ thế kỷ 15
đến thế kỷ 18, trong đó có cơng trình đ u tiên được cho là có cơ sở khoa học tin cậy
nhất mô tả v nấm đông tr ng hạ thảo của Wu-Yiluo năm 1757, trong cuốn sách
Dược đi n, dưới tri u đại Thanh. Theo sau các học giả xứ Tây Tạng, việc phát hiện
ra giá trị của đông trùng hạ thảo thuộc v nh ng người chăn b trên núi Hymalaya ở
Tây Tạng cũ và Nepal, họ thấy rằng nh ng chú bò gặm cỏ ăn phải cây nấm đông

trùng hạ thảo vào m a xuân đã trở nên cuồng nhiệt, b đực ln tìm và theo sát bò
cái (Holliday J. và cs, 2004)
1.1.2. Phân loại
Chi nấm Cordyceps đã được thu m u và định loại trên 400 loài khác nhau.
Theo hệ thống phân loại truy n thống, chi Cordyceps thuộc giới Nấm, ngành
Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae (Sung J.H.
và cs, 2007).


3
Phân loại nấm đông tr ng hạ thảo Cordyceps militaris:
Giới : Fungi
Ngành: Ascomycota
Phân ngành: Ascomycotina
Lớp: Sordariomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Clavicipataceae
Chi: Cordyceps
Loài: Cordyceps militaris.
1.1.3. Đặc điểm và phân bố của Cordyceps militairs
Nấm Đông tr ng hạ thảo là các loài nấm ký sinh trên sâu non hoặc nhộng
hoặc sâu trưởng thành của một số lồi cơn trùng, lớp nhện. Vào m a Đơng nấm
xâm nhiễm, k sinh vào cơ th côn trùng và làm cho côn trùng chết và nấm tồn tại
trong cơ th côn trùng dạng hệ sợi và là giai đoạn vô t nh. Đến mùa Hè, nhiệt độ và
ẩm độ khơng khí cao, hợi sợi nấm vơ tính tiến hành giao phối và chuy n giai đoạn
h u tính, hình thành cây nấm (chất đệm) là cơ quan chứa bào t vơ tính và nhú lên
khỏi mặt đất nhưng gốc v n dính li n vào thân sâu. Chính vì vậy mà nấm có tên gọi
Đơng tr ng hạ thảo (Phạm Quang Thu và cs, 2013).
Nấm đông tr ng hạ thảo thường phát hiện vào mùa hè ở một số cao
nguyên có độ cao từ 3500 m đến 5000 m so với mặt bi n; đó là các v ng Tây Tạng,

Tứ Xuyên, Cam Túc, Vân Nam... Đây ch nh là nguồn đông tr ng hạ thảo tự nhiên
(Nguyễn Mậu Tuấn và cs, 2013). Ngồi ra cịn phát hiện tại các vùng núi cao thuộc
Ấn Độ, Nepal, Bhutan. Hiện nay, khoảng hơn 400 lồi đã được tìm thấy, trong đó
có khoảng 90 loài được phát hiện ở Trung Quốc (Zhou X. và cs, 2009).
Tại Việt Nam, đông tr ng hạ thảo cũng đã được phát hiện tại nhi u địa đi m
khác nhau. Năm 2009, Phạm Quang Thu và cs đã phát hiện 3 chủng là
Cordyceps nutans Pat. tại khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên T - Sơn Động - B c
Giang, Cordyceps gunni Berk. tại vườn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc,
Cordyceps militaris Link. tại vườn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai. Năm 2009,
Đái Duy Ban và cộng sự cũng công bố phát hiện mới của mình v lồi đơng trùng


4
hạ thảo l n đ u tiên được tìm thấy ở Việt Nam đó là lồi đơng tr ng hạ thảo có tên
là Isaria cerambycidae. Năm 2010, Phạm Thị Thùy Viện phát hiện được 2 giống là
Cordyceps nutans ở Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) và Cordyceps
militaris ở Vũ Quang (Hà Tĩnh).
1.1.4. Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris
Các hợp chất dược liệu của loại nấm Cordyceps militaris ứng dụng trong
đi u trị bệnh và nâng cao sức khỏe con người, do đó lồi nấm này có giá trị kinh tế
cao. Nấm Cordyceps militaris rất khan hiếm trong tự nhiên. Do đó, việc sản xuất ở
quy mơ lớn các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và đi u trị bệnh
từ Cordyceps militaris hiện đang là một vấn đ cấp thiết.
Các hợp chất chống ung thư: Hợp chất cordycepin (3′-deoxyadenosine) từ
nấm cho thấy có hoạt t nh kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, đi u h a
miễn dịch (Shonkor et al, 2010).
oạt tính kháng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy hợp chất CM-hs-CPS2
chứa trong dịch chiết nấm C.militaris có t nh kháng DPPH, hoạt t nh kh và tạo
phức ở nồng độ (8 mg/ml) là 89%, 1,188 và 85% (Fengyao et al., 2011).
Tăng số lượng tinh trùng: Nghiên cứu trên lợn cho thấy khi d ng chế phẩm

từ Cordyceps militaris, số lượng tinh tr ng tăng, số ph n trăm tinh tr ng di động và
hình dạng bình thường tăng . Hiệu quả này được duy trì thậm ch sau 2 tu n ngưng
s dụng chế phẩm. Lượng cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian s dụng chế
phẩm nên có khả năng chất này làm tăng lượng tinh dịch và chất lượng tinh tr ng ở
lợn (Lin et al, 2007).
ạn

chế

vius

cúm: Acidic

polysaccharide

(APS)

tách

chiết

từ

nấm Cordyceps militaris trồng trên đậu nành nảy m m có khả năng ứng dụng trong
đi u trị cúm A. Chất này góp ph n đi u h a hoạt động miễn dịch của các đại thực
bào (Yuko et al, 2007).
Kháng khuẩn kháng nấm và kháng ung thư: C. militaris: protein (CMP) tách
chiết từ nấm có k ch thước 12kDa, pI 5,1 và có hoạt t nh trong khoảng pH 7-9.
Protein này ức chế nấm Fusariumoxysporum và gây độc đối với tế bào ung thư
bàng quan (Byung-Tae et al, 2009). Hợp chất cordycepin c n cho thấy khả năng



5
kháng vi khuẩn Clostridium. Các hợp chất d n xuất từ nấm được mong đợi ứng
dụng trong việc đi u trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột (Young-Joonet al.,
2000). Cordycepin ngăn sự bi u hiện của gen T2D chịu trách nhiệm đi u h a bệnh
ti u đường thông qua việc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, do
đó được hy vọng sẽ ứng dụng được như một chất đi u h a miễn dịch d ng trong
đi u trị các bệnh v miễn dịch (Seulmee et al., 2009).
Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps
militaris có hoạt t nh g n fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin. Enzyme này
có khả năng s

dụng trong đi u trị tan huyết khối tương tự như các enzym

fibrinolytic mạnh khác như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất. Khi enzyme
này có th sản xuất ở quy mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế h u hiệu cho các
enzym fibrinolytic giá thành cao hiện đang được s dụng cho bệnh tim lão hóa ở
người (Jae-Sung et al., 2006).
Tính kháng viêm: Đ xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch chiết từ
quả th nấm Cordyceps militaris (CMWE) được th nghiệm v tác dụng ki m soát
lipopolysaccharide (LPS) (chịu trách nhiệm k ch th ch việc sản xuất nitric oxide),
việc phóng th ch yếu tố hoại t khối u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) của tế bào
RAW 264,7. Các đại thực bào được x l với nồng độ khác nhau của CMWE làm
giảm đáng k LPS, TNF-α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết.
Nh ng kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản
xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào (Wol et al., 2010).
Các ứng dụng trên lâm sàng của nấm Cordyceps militaris: Mặc d
nấm Cordyceps sinensis được s dụng rộng rãi hơn Cordyceps militaris, tuy nhiên
các ứng dụng lâm sàng của chúng cũng khá tương tự nhau. Các chiết xuất từ

nấm Cordyceps militaris có th được s dụng trong các trường hợp suy giảm chức
năng phổi, ho có đờm, chóng mặt (Mizuno, 1999; Das et al., 2010).
1.1.5. Các hoạt chất chính trong nấm đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris
Theo số liệu nghiên cứu v

thành ph n hóa học của th

quả

nấm C.militaris cho thấy lồi nấm này chứa các thành ph n như protein chiếm
40,69%; các loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam),


6

vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9
mg/gam); các nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm);
hợp chất hóa học và nhóm hợp chất quan trọng: cordycepin (1,52%), cordycepic
acid (11,8%), polychaccaride (30%) (Shih et al, 2007)
Acid amin: Kết quả nghiên cứu của Hyun (2008) cho thấy trong quả th
nấm Cordyceps militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối
nấm (69,32 mg/g trong quả th và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm). Khối lượng
acid amin mỗi loại trong quả th và sinh khối nấm cũng có sự chênh lệch, dao động
từ 1,15-15,06 mg/g và 0,36-2,99 mg/g. Thành ph n acid amin của mỗi loại trong
quả th bao gồm: lysine (15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68
mg/g), threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18 mg/g) in the
fruiting body. Số liệu phân t ch của Chang và cộng sự (2001) cho thấy ph n lớn
trong sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine
(1,57 mg/g) (Chang, 2001).
Acid béo: Quả th nấm Cordyceps militaris chứa nhi u acid béo không no,

chiếm 70% tổng số acid béo, trong đó lượng acid linoleic chiếm đến
61,3% trongquả th và 21,5% trong sinh khối. Lượng acid béo no chủ yếu là acid
palmitic, chiếm 24,5% trong quả th và 33,0% trong sinh khối (Hur, 2008)
Adenosine và cordycepin: Adenosine và cordycepin là hai hợp chất có dược
t nh cao của nấm Cordyceps militaris. Adenosine chiếm 0,18% trong quả th và
0,06% trong sinh khối nấm. Đối với hợp chất cordycepin, trong quả th có hàm
lượng cao gấp 3 l n so với sinh khối (0,97% so với 0,36%) (Hyun et al, 2008).
Polysaccharide: Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 được tách chiết từ
nấm Cordyceps militaris cho thấy chúng có thành ph n từ các đơn phân là các
đường monosaccharide, mannose và galactose. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai
loại polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và
tác dụng này tăng lên khi tăng li u d ng chiết xuất. Yan và cộng sự cho rằng tác
dụng này có th do chức năng kháng oxy hóa của các polysaccharide từ nấm
(Yan et al, 2008)


7
1.2. Tình hình nghiên cứu ni cấy đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris ở
Việt Nam và trên thế giới
1.2.1. Tình hình nghiên cứu ni cấy đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris
trên thế giới
Các cơng trình nghiên cứu trên thế giới v loại nấm này chứng minh được
công dụng vượt trội của nấm đông tr ng hạ thảo là một nguồn dược liệu quý.
Nh ng năm g n đây, rất nhi u tính chất dược lý của lồi nấm này được nghiên cứu
một cánh khoa học và đã được công bố trên các tạp ch chuyên ngành như:
Năm 2004, Yoo H.S và cs công bố: Dịch chiết từ th quả Cordyceps militaris
có tác dụng chống ung thư, hiệu quả đối với hai loại tế bào màng trong tĩnh mạch
rốn là HT1080 và B16-F10 do có khả năng chống lại sự tạo thành các mạch máu
mới bằng cách giảm sự bi u hiện của bFGF, một trong nh ng nhân tố kích thích
q trình này. Do có vai trị kìm hãm q trình tạo thành các mạch máu mà có th

ngăn chặn được quá trình di căn và sự phát tri n của tế bào ung thư. Ngồi ra, dịch
chiết nấm Đơng tr ng hạ thảo cịn có tác dụng kìm hãm sự phát tri n của tế bào ung
thư vú, ung thư phổi (Ahn Y.J. và cs, 2001). Mặt khác, dịch chiết bằng nước ấm
nấm Cordyceps militaris có tác dụng kìm hãm sự phát tri n của dòng tế bào ung thư
máu ở người bằng cách gây ra hiện tượng tự chết của các tế bào thơng qua sự hoạt
hố enzym caspase-3 (Lee H. Và cs, 2006).
Năm 2005, cơng trình nghiên cứu của Won S.Y và Park E.H. cho thấy
Cordyceps militaris có tác dụng chống lão hố, chống các chứng viêm tấy. Ahn Y.J.
và cs (2000) cho rằng nấm Đông tr ng hạ thảo có tác dụng chống viêm nhiễm kìm
hãm sự phát tri n của một số virut, vi khuẩn và nấm. Ngồi ra nấm Đơng tr ng hạ
thảo Cordyceps militaris cịn có tác dụng kìm hãm sự oxy hố của lipit, lipoprotein
và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E và Kamendulis L.M., 2004).
Vì vậy, việc ni trồng lồi nấm q hiếm này đã được các nhà khoa học
trên thế giới nghiên cứu từ quy mơ phịng thí nghiệm thu sinh khối sợi nấm, tới quy
mô lớn hơn là thu quả th nấm.
Nuôi trồng quả th nấm đông tr ng hạ thảo Cordyceps militaris được tiến
hành ở nhi u nước trên thế giới: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Mỹ... Tại


8
Trung Quốc có các trang trại lớn chun ni trồng loài nấm này ở các tỉnh:
Thượng Hải, Quảng Châu, Chiết Giang, An Huy, Giang Tơ... Chỉ tính một trang trại
ni trồng loài nấm này tại Kaiping, Quảng Châu, sản lượng một năm thu được
100000 kg sản phẩm. Sản phẩm nấm đông tr ng hạ thảo từ nuôi trồng nhân tạo đã
có mặt ở nhi u nước trên thế giới k cả các nước phương Tây và mang lại lợi nhuận
cao cho các doanh nghiệp và người nuôi trồng nấm (Phạm Quang Thu, 2013).
Patcharaporn Wongsa (2005) tại Thái Lan đã nghiên cứu phân lập và sự sinh
trưởng của hệ sợi, hình thành bào t chồi của nấm Cordyceps unilateralis ký sinh
kiến. Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), PYEG (Peptone Yeast Extract
Glucose), CSA (Carrot extract Sucrose Agar) và môi trường MEA (Malt Extract

Agar) được d ng đ phân lập và nuôi cấy hệ sợi.
Tại Hàn Quốc, Jae Sung Kim và cs (2006), đã s dụng nhộng tằm đ nuôi
trồng th quả nấm Cordyceps militaris. Nhộng tằm được đựng trong các lọ nuôi cấy,
kh trùng ở 12oC trong thời gian 90 phút, đ nguội, cấy giống nấm, 20 ngày sợi
nấm ăn k n toàn bộ giá th trong đi u kiện nhiệt độ 20-250C, cường độ ánh sáng
500-700 lux đã hình thành m m th quả. Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi cũng được
các tác giả tiến hành trên môi trường dinh dưỡng lỏng với thành ph n như sau: 40
g/l t đường glucose, 10 g/lít cao nấm men, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít
K2HPO4:3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O. Duck-Hyun Cho và cs (2003), đã tiến
hành nghiên cứu sự sinh trưởng của hệ sợi của 3 chủng ký hiệu là CHO-7208;
CHO-7845; CHO-7846 của lồi Cordyceps militaris trên mơi trường dinh dưỡng
và q trình hình thành th quả nấm Cordyceps militaris với giá th là sâu non loài
Allomyrina dichotoma Linnaeus. Kết quả cho thấy sự sinh trưởng của hệ sợi của
các chủng khác nhau là khác nhau trong nuôi cấy thu n khiết. Chỉ có 2 chủng CHO7208 và CHO-7846 hình thành th quả khi s dụng sâu non Allomyrina dichotoma
Linnaeus làm giá th . Chi u dài của th quả đạt 51-56 mm sau 27 ngày nuôi cấy.
Tại thành phố Hayward, bang California, Mỹ, Công ty công nghệ sinh học
BIOKEN đã nuôi trồng quy mơ cơng nghiệp lồi nấm Cordyceps militaris. Sản
phẩm được tiêu thụ trong nước và thị trường quốc tế.


9
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ni cấy đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris ở
Việt Nam.
Các cơng trình nghiên cứu v nuôi cấy đông tr ng hạ thảo Cordyceps
militaris ở Việt Nam chưa nhi u và chưa có hệ thống. Một số ít các nghiên cứu
được tiến hành nhưng cũng chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu v sự sinh trưởng của
hệ sợi hoặc nghiên cứu tạo quả th ở mức độ th nghiệm.
Đ tài: “Nghiên cứu đặc đi m sinh học hệ sợi trong nuôi cấy thu n khiết các
chủng nấm đông tr ng hạ thảo Cordyceps militaris (L.Fr) Link.” của Phạm Quang
Thu và cs (2011) chỉ ra rằng: Đặc đi m sinh học của nấm Cordyceps militaris bao

gồm đặc đi m sinh trưởng, loại môi trường dinh dưỡng, pH của mơi trường, nhiệt
độ và ẩm độ khơng khí tối ưu cho sự phát tri n của nấm đã được nghiên cứu. Kết
quả chỉ ra rằng 8 chủng nấm Cordyceps militaris gồm 4 chủng thu thập ở Việt
Nam, 3 chủng sưu t m từ Nhật và 1 chủng ở Trung Quốc, tất cả đ u sinh trưởng
bình thường trên mơi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong đó 4 chủng sinh trưởng
nhanh bao gồm chủng HL2, chủng CM, chủng F1010 và chủng F1080 với tốc độ
l n lượt là 104,66; 122,02; 107,64; 105,08 μm/giờ, 4/8 chủng nấm
sinhtrưởng chậm là chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35 và chủng F1012 với
tốc độ sinh trưởng đạt 69,95; 71,92; 79,37 và 80,36 μm/giờ. Các đặc đi m nuôi cấy
cho sự phát tri n tối ưu của hệ sợi được xác định là môi trường dinh dưỡng là PDA
có bổ sung thêm 10% nhộng tằm, nhiệt độ khơng khí thích hợp nhất là từ 20 - 25oC,
một số chủng như HL2 và chủng F1012 cho sinh trưởng nhanh ở cả nhiệt độ thấp
15oC.Độ ẩm trong khơng khí trong khoảng 80 - 85%, và mơi trường pH là axit từ
4,5 - 6,5.
“Nghiên cứu thành ph n lồi nấm Đơng tr ng hạ thảo tại Vườn Quốc gia
Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai” của Tr n Văn Tú (2011) cho thấy: Tại
Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Huyện Sa Pa Tỉnh Lào Cai, tác giả đã phát hiện, thu
hái, giám định và phân lập được 8 lồi nấm Đơng tr ng hạ thảo, k sinh trên 3 bộ
côn tr ng khác nhau: Cordyceps militaris, Cordyceps nutans, Cordyceps crinalis,
Cordyceps

formosana,

Cordyceps

pseudomilitaris

Beauveriabassiana,

Isariafarinosa, Isaria tenuipes, Trong đó có 2 lồi nấm Cordyceps formosana và



10
Cordyceps pseudomilitaris l n đ u tiên được mô tả ở Việt Nam. Thành ph n loài
nấm ĐTHT thu được trên địa bàn khu vực nghiên cứu khá đa dạng, với 8 loài khác
nhau. Nấm phân bố trên nhi u loại hình rừng, độ cao, độ tàn che khác nhau, tập
trung chủ yếu ở: rừng tự nhiên, có độ cao từ 1500- trên 2000m và độ tàn che > 0,5.
Các loài nấm ĐTHT thu được tại khu vực nghiên cứu khá đa dạng v giá trị thương
mại, dược liệu, công nghiệp. Đặc biệt là giá trị dược liệu, đáng k nhất là 5 loài nấm
ĐTHT thuộc chi nấm Cordyceps và nấm Isaria tenuipes, Isaria farinosa là 2 loài
nấm ở giai đoạn vô t nh của chi nấm Cordyceps.
Năm 2011, Tô Quang Huyên và Lê Thị Xuân tiến hành đi u tra thành ph n
nấm k sinh côn tr ng tại khu rừng di t ch lịch s cảnh quan môi trường Mường
Phăng huyện Điện Biên tỉnh Điện Biên. Kết quả đi u tra từ tháng 4 đến tháng 8 thu
được 7 loài nấm khác nhau bao gồm 6 loài thuộc chi Cordyceps và 1 lồi thuộc chi
Beauveria. Lồi có t n suất b t gặp nhi u nhất tại khu vực đi u tra là C. nutans với
t n suất xuất hiện 96,40%, loài Beauveria bassiana với t n suất 1,35% các loài c n
lại mỗi loài chỉ chiếm 0,45%.
Ngoài ra, có một số đ tài đã đánh giá ảnh hưởng của đi u hiện ni trồng
đến khả năng hình thành quả th như:
Cơng trình nghiên cứu của Đỗ Tuấn Bách và cs (2017) chỉ ra rằng khi s
dụng giá th gạo lứt với dung dịch dinh dưỡng tối ưu thu được gồm glucose 40 g/L,
peptone 5 g/L, MgSO4.7H2O 1,5g/L, K2HPO4 1,5 g/L, NAA 1 mg/L, bột nhộng tằm
3%. Đi u kiện nhiệt độ duy trì ở mức 12h chiếu sáng ở 250C-12h tối ở 200C. Quả
th nuôi trồng trên mơi trường tối ưu có hàm lượng cordycepin đạt 4,33±0,08 mg/g
khơ, cho thấy ti m năng ứng dụng quy trình trên quy mô công nghiệp.
1.3. Các phƣơng pháp định danh nấm
1.3.1. Phương pháp định danh thơng qua hình thái
S dụng phương pháp truy n thống đ định danh thường dựa vào các chỉ tiệu
phân loại như: đặc đi m hình thái, sinh l , đặc đi m biến dưỡng năng lượng. Trong

đó các th nghiệm đ xác định các đặc đi m sinh l , sinh hóa là các chỉ tiêu quan
trọng nhất.
 Sử dụng khóa phân loại
Thơng thường đ định danh theo phương thức truy n thống, người ta thường


11
dựa vào các khóa phân loại. Riêng đối với nấm men việc định danh theo phương
thức truy n thống rất phức tạp. Từ trước đến nay có rất nhi u khóa phân loại nấm
men của nhi u tác giả khác nhau. Hansen là người đưa ra khóa phân loại nấm men
đ u tiên. Trong khóa phân loại này, Hansen chia nấm men thành 8 giống. Sau
Hansen, Klocker (1907), Guilliermond (1920) cũng đã tiến hành chỉnh s a khóa
phân loại của Hansen, nhưng chưa được hoàn thiện.
Đến năm 1952, J. Lodder và Kreger-van rij đã tổng kết lại một cách khá
hoàn thiện vấn đ phân loại nấm men và xuất bản một tài liệu rất có giá trị (J.
Lodder and N.J.W.Kreger-Van Rij, 1952, the yeast, a taxonomic study, North
Holland, Pub Co. Amsterdam), được xuất bản l n thứ hai năm 1957. Năm 1970, J.
Lodder bổ sung s a ch a lại và in tái bản l n thứ nhất năm 1970, l n thứ hai 1971.
Đây là tài liệu phân loại nấm men rất có giá trị và và là khóa phân loại thông dụng
nhất hiện nay trên thế giới. Hệ thống phân loại này dựa trên ki u phân chia tế bào,
hình thái bào t nang và đã xác định 349 loài nấm men thuộc 39 chi khác nhau.
 Sử dụng phương pháp số học
Ngoài ra, dựa vào nh ng thông tin v đặc đi m của nấm, người ta c n có th
tính hệ số tương đồng đ đánh giá mức độ tương đồng gi a các chủng nấm với
nhau. Trong đó hệ số Jaccard được s dụng đ so sánh mức độ tương đồng gi a hai
chủng khi muốn bỏ qua các đặc đi m mà cả hai chủng đ u thiếu.
1.3.2. Phương pháp định danh bằng phân tử
Ngày nay, sự phát tri n của các kỹ thuật sinh học hiện đại đã đưa việc phân
loại, định danh nấm lên một bước phát tri n mới. Phương pháp hiện đại trong định
danh nấm dựa trên vật liệu di truy n có th cho kết quả ch nh xác trong một thời

gian ng n. Tuy nhiên, phương pháp phân loại hiện đại này đ i hỏi phải có trang
thiết bị hiện đại và hóa chất đ t ti n.
Năm 1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng các phân t sinh học có th
là “tài liệu của lịch s tiến hóa”, là “thước đo tiến hóa”.
Phân t rRNA 16S ở prokaryote và 18S ở eukaryote (riêng nấm men thì trình
tự đoạn D1/D2 26S rRNA và v ng ITS 5.8S rRNA được s dụng phổ biến đ xây
dựng cây phát sinh chủng lồi) là một cơng cụ h u ch trong phân loại và định danh.


12
Ngoài đặc đi m là hiện diện trong tất cả các sinh vật, có chức năng khơng đổi, phân
t rRNA 16S c n có ưu đi m là có nhi u bản sao trong tế bào, có t nh bảo tồn cao
nhưng v n có nh ng v ng trình tự khác biệt gi a các lồi và trình tự đặc trưng cho
từng nhóm; đặc biệt là th ch hợp với mục tiêu phân loại nhờ 16 có k ch thước vừa
phải (khoảng 1500 ribonucleotide), thuận tiện cho việc giải trình tự.
Phương pháp hiện đại d ng đ định danh vi sinh vật bên cạnh việc dựa vào
trình tự rRNA, các trình tự rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA) cũng thường được s
dụng, vì DNA là vật liệu dễ thu nhận và có t nh b n cao hơn RNA.
Một số phương pháp phân loại dựa vào vật liệu di truy n đang được s dụng
hiện nay:
 Sử dụng mẫu d kết hợp với phương pháp lai in-situ phát huỳnh quang
(Fluorescence in-situ Hybridazation - FISH)
M u dò là một trình tự acid nucleic, thường là một đoạn mạch đơn của acid
nucleic (DNA) được g n với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh
quang, d ng đ nhận biết trình tự nucleotide đặc trưng (trình tự nhận diện) của một
chủng đã biết trước.
Phân tích d liệu các trình tự SSU rRNA (Small Subunit rRNA) đã biết sẽ
cho phép xác định các trình tự nhận diện chuyên biệt cho từng giới. Một số trình tự
nhận diện cho một nhóm chuyên biệt chuyên biệt trong giới, thậm ch một giống,
một loài cũng đã được xác định. Trong tương lai, nhi u trình tự tương tự được xác

định và sẽ rất h u dụng trong việc nhận diện và định danh.
Các trình tự nhận diện chuyên biệt cho sinh vật có th được tổng hợp, đánh
dấu bằng chất phát huỳnh quang và d ng đ phát hiện chuyên biệt các giới này. Các
m u d này được gọi là “m u d phát sinh chủng loại” (phylogenic prode).
Bằng việc x lý m u bằng một tác nhân th ch hợp làm tăng t nh thấm của
màng, cho phép m u dò vào bên trong tế bào, thực hiện phương pháp lai phân t
(lai in-situ, tức là lai trực tiếp trên tế bào m u), và quan sát dưới k nh hi n vi huỳnh
quang, người ta có th xác định trực tiếp chủng thu n thuộc giới nào hay qu n xã
sinh vật hiện diện trong một m u tự nhiên gồm nh ng giới nào. Kỹ thuật lai và phát


13
hiện này được gọi là phương pháp lai in-situ huỳnh quang (FISH).
 Phương pháp lai nucleic acid
Thành ph n base của DNA chỉ có tác dụng chứng minh các chủng là khơng
có liên hệ với nhau. Tỷ lệ các base trong DNA có th thay đổi trong phạm vi rất
rộng. Nếu hai chủng có thành ph n base khác nhau thì chúng khơng có liên hệ với
nhau. Tuy nhiên, hai chủng có c ng thành ph n base chưa hẳn là có quan hệ với
nhau do trình tự base có th khác nhau. Việc lai gi a các DNA của hai chủng cho
phép định danh một loài mới hoặc xác định mối quan hệ đến mức giống và loài gi a
hai vi khuẩn.
Đ xác định mối quan hệ gi a các chủng, thông thường người ta so sánh
ph n trăm lai (DNA-DNA) gi a chủng c n khảo sát với một chủng đã biết (chủng
chuẩn). DNA từ chủng chuẩn được ly tr ch, tinh chế, đánh dấu bằng đồng vị phóng
xạ, phân đoạn thành nh ng đoạn ng n có chi u dài ng u nhiên, đun nóng đ tách
mạch. DNA từ các chủng được khảo sát cũng được chuẩn bị tương tự nhưng không
được đánh dấu. Tiến hành lai m u DNA chủng chuẩn với nhau (đối chứng). Sau đó
tu n tự lai DNA chủng chuẩn với DNA chủng c n khảo sát. Thu lấy DNA mạch kép
(có lai), loại bỏ DNA mạch đơn. Đo năng lượng phóng xạ của trường hợp đối
chứng. Lượng này được xem là tương đương 100% lai. Tương tự t nh năng lượng

phóng xạ thu được từ các trường hợp lai gi a chủng chuẩn với chủng được khảo sát.
Tính ph n trăm lai.
Từ số liệu v mức độ lai có th xác định mối tương quan gi a các chủng
như sau:
Trên 70% lai: 2 chủng c ng loài (khác chủng)
Trên 20% lai: 2 chủng cùng giống (khác loài)
Dưới 10% lai: 2 chủng khác giống
Lai nucleic acid dựa vào nguyên t c bổ sung gi a các base A-T và G-C. Các
đoạn polynuclotide đơn có nguồn gốc khác nhau nhưng có cấu trúc bổ sung với
nhau thì chúng có th b t cặp với nhau tạo ra phân t lai.
Một số phương pháp lai nucleic acid thường được s dụng:
- Phương pháp lai Southern Blot