BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Đình Q

ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA HỖN HỢP CIPROFLOXACIN,
METRONIDAZOL VÀ MINOCYCLIN
TRÊN TẾ BÀO GỐC TUỶ RĂNG NGƯỜI

Luận văn Thạc sĩ Răng Hàm Mặt

Thành phố Hồ Chí Minh ­ 2018

.


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Đình Q

ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA HỖN HỢP CIPROFLOXACIN,
METRONIDAZOL VÀ MINOCYCLIN
TRÊN TẾ BÀO GỐC TUỶ RĂNG NGƯỜI

Ngành:
Mã số:

RĂNG HÀM MẶT
8720501

Luận văn Thạc sĩ Răng Hàm Mặt
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Hoàng Đạo Bảo Trâm

Thành phố Hồ Chí Minh ­ 2018

.


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình
nào khác.

Nguyễn Đình Q

.


MỤC LỤC

Trang
Danh mục chữ viết tắt

iii


Danh mục thuật ngữ Việt - Anh

iv

Danh mục bảng

v

Danh mục hình

vi

Mở đầu

1

1

Tổng quan tài liệu

3

1.1

Phương pháp nội nha tái tạo . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3

1.2


Thuốc kháng sinh dùng trong nội nha . . . . . . . . . . . . . .

5

1.3

Các yếu tố cần thiết để tái tạo mô . . . . . . . . . . . . . . . .

8

1.4

Mô học tuỷ răng được tái tạo . . . . . . . . . . . . . . . . . .

11

1.5

Một số thử nghiệm in vitro đánh giá khả năng gây độc tế bào .

13

1.6

Các nghiên cứu về độc tính của hỗn hợp kháng sinh lên tế bào .

16

2


3

4

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

19

2.1

Đối tượng nghiên cứu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

19

2.2

Phương pháp nghiên cứu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

20

2.3

Thực hiện nghiên cứu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

24

2.4

Các biến số nghiên cứu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .


30

Kết quả

32

3.1

Độc tính đối với tế bào 3T3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

32

3.2

Độc tính của các vật liệu thử nghiệm đối với tế bào gốc tủy răng

37

Bàn luận

43

i

.


ii
4.1


Về dòng tế bào trong nghiên cứu . . . . . . . . . . . . . . . .

43

4.2

Về vật liệu dùng trong nghiên cứu . . . . . . . . . . . . . . .

44

4.3

Phương pháp đánh giá mức độ độc tính tế bào . . . . . . . . .

45

4.4

Mức độ độc tính tế bào của các loại vật liệu dùng trong thử nghiệm 46

Kết luận

53

Kiến nghị

54

Tài liệu tham khảo


55

Tiếng Việt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

55

Tiếng Anh . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

55

.


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AFM

Autologous Fibrin Matrix

BMSC

Bone marrow stem cell

CH

Calcium hydroxide

CS

Calf Serum


DAP

Double antibiotic paste

DMEM

Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMEM-F12

Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12

DPSC

Dental pulp stem cell

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

FBS

Fetal Bovine Serum

HERS

Hertwig epithelial root sheath

HPDL


Human Periodontal Ligament

IL6

Interleukin 6

LSTR

Lesion Sterilization and Tissue Repair

MTA

Mineral trioxide aggregate

MTS

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)2-

MTT

(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

PDLSC

bromide
Periodontal ligament stem cell

PMS


Phenazine methyl sulfate

SCAP

Stem cells from the apical papilla

TAP

Triple antibiotic paste

iii

.


DANH MỤC THUẬT NGỮ VIỆT - ANH
Tiếng Anh

Tiếng Việt

American Asociation of Endodontists Hội Nội Nha Mỹ
Cytotoxic

Độc tính tế bào

Double antibiotic paste

Hỗn hợp hai kháng sinh


Molecular Signals

Tín hiệu phân tử

Platelet-Rich Fibrin

Fibrin giàu tiểu cầu

Platelet-Rich Plasma

Huyết tương giàu tiểu cầu

Pulp revascularization

Tái sinh mạch máu tuỷ răng

Regenerative endodontic

Nội nha tái tạo

Scarfold

Giá thể

Stem cell

Tế bào gốc

Tissue engineering


Kỹ nghệ mô

Triple antibiotic paste

Hỗn hợp ba kháng sinh

iv

.


DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1:

Đặc điểm của ba phương pháp điều trị răng chưa đóng chóp

Bảng 1.2:

Tác dụng của các thành phần trong hỗn hợp ba loại kháng

4

sinh . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7

Bảng 1.3:


Một số nghiên cứu về độc tính của kháng sinh trên tế bào

18

Bảng 2.1:

Thơng tin các vật liệu dùng trong nghiên cứu . . . . . .

20

Bảng 2.2:

Các dụng cụ dùng trong nghiên cứu . . . . . . . . . .

21

Bảng 2.3:

Các thiết bị dùng trong nghiên cứu . . . . . . . . . . .

22

Bảng 2.4:

Các hoá chất dùng trong nghiên cứu . . . . . . . . . .

23

Bảng 3.1:


Tỉ lệ phần trăm tế bào 3T3 sống sau thử nghiệm với TAP,
DAP và CH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Bảng 3.2:

Tỉ lệ phần trăm tế bào DPSC sống sau thử nghiệm với
TAP, DAP và CH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

v

.

35

40


DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1:

Phương pháp tiếp cận bằng tế bào cho răng chưa đóng
chóp tủy răng hoại tử [61] . . . . . . . . . . . . . . .

Hình 1.2:

Phương pháp tiếp cận khơng tế bào cho răng chưa đóng

chóp tủy răng hoại tử [61] . . . . . . . . . . . . . . .

Hình 1.3:

5

6

Nguồn tế bào và các yếu tố tăng trưởng trong nội nha
tái tạo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

10

Hình 1.4:

Phản ứng chuyển hóa MTT thành formazan . . . . . .

14

Hình 1.5:

Phản ứng chuyển hóa MTS thành formazan . . . . . .

15

Hình 2.1:

Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu . . . . . . . . .

23


Hình 2.2:

Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu . . . . . . . . . .

24

Hình 2.3:

Kết quả đo pH của các vật liệu thử nghiệm . . . . . .

25

Hình 2.4:

Tế bào 3T3 (Vật kính 10X) . . . . . . . . . . . . . .

27

Hình 2.5:

Tế bào DPSC (Vật kính 10X) . . . . . . . . . . . . .

27

Hình 3.1:

Hình thái tế bào 3T3 ở các mẫu thử với TAP (vật kính
10X) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .


Hình 3.2:

33

Hình thái tế bào 3T3 ở các mẫu thử với DAP (vật kính
10X) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

33

Hình 3.3:

Hình thái tế bào 3T3 ở các mẫu thử với CH (vật kính 10X) 34

Hình 3.4:

So sánh mức độ độc tính tế bào 3T3 của các vật liệu
TAP, DAP và CH . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Hình 3.5:

So sánh mức độ độc tính tế bào 3T3 của các vật liệu
TAP, DAP và CH ở các nồng độ khác nhau . . . . . .

vi

.

36

37



vii
Hình 3.6:

Hình thái tế bào DPSC ở các mẫu thử với TAP (vật kính
10X) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Hình 3.7:

Hình thái tế bào DPSC ở các mẫu thử với DAP (vật kính
10X) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Hình 3.8:

Hình 4.1:

.

39

So sánh tỉ lệ phần trăm tế bào DPSC sống sót của các
vật liệu TAP, DAP và CH . . . . . . . . . . . . . . .

Hình 3.10:

38

Hình thái tế bào DPSC ở các mẫu thử với CH (vật kính
10X) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .


Hình 3.9:

38

41

So sánh mức độ độc tính tế bào DPSC của các vật liệu
TAP, DAP và CH ở các nồng độ khác nhau . . . . . .

42

DAP nồng độ 8mg/ml xuất hiện các tinh thể không tan

45


MỞ ĐẦU
Tuỷ răng là một mô liên kết đặc biệt giàu mạch máu, nằm trong hốc tuỷ của
răng. Mô tuỷ có phản ứng với các kích thích và đảm nhận chức năng sống của
ngà và toàn bộ răng. Trong tuỷ răng có nhiều loại tế bào (nguyên bào ngà, nguyên
bào sợi, tế bào gốc, tế bào miễn dịch, và các tế bào nội mơ). Những tế bào này
đóng vai trị trong phát triển răng và kiểm soát nhiễm trùng ống tuỷ thúc đẩy quá
trình tự sửa chữa [16]. Bệnh lý tủy răng và vùng quanh chóp là bệnh nhiễm trùng
thường gặp trong miệng. Sự xâm nhập của vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn vào
tuỷ răng khi răng bị sâu, khi chấn thương răng nứt gãy răng có thể gây viêm tuỷ
và làm chết tuỷ, dẫn tới các bệnh lý vùng quanh chóp.
Điều trị răng chưa phát triển chân răng đầy đủ gặp nhiều khó khăn và thách
thức, mục tiêu chính của điều trị nội nha các răng bị nhiễm khuẩn trong ống tủy
là sát trùng hệ thống ống tủy bằng cơ học hoặc hóa học để loại bỏ vi khuẩn. Tuy

nhiên, ở răng chưa đóng chóp, việc loại bỏ vi khuẩn bằng biện pháp cơ học có hạn
chế là làm thành ngà chân răng mỏng và trở nên dễ gãy. Giai đoạn sát trùng ống
tủy trong trường hợp này thường phụ thuộc vào việc bơm rửa và băng thuốc nội
nha. Sau khi điều trị nội nha hoàn tất, theo cách thơng thường ống tủy sẽ được
trám bít bằng côn gutta percha, trong trường hợp này sẽ làm làm các răng chưa
trưởng thành có tỉ lệ thân - chân răng không thuận lợi dẫn tới răng dễ bị gãy hơn.
Phương pháp nội nha tái tạo trở thành mơ hình điều trị mới để xử trí răng hoại
tử tủy có chân răng chưa đóng chóp với ý tưởng ”sát trùng vết thương và sữa chữa
mô (LSTR)” [9] nhằm loại bỏ nhiễm trùng, tạo ra mơi trường vơ khuẩn kích thích
mơ tái tạo và tái sinh và cho phép chân răng tiếp tục phát triển. Hỗn hợp kháng
sinh ciprofloxacin, metronidazol và minocyclin thường được dùng để sát trùng hệ
thống ống tủy [9]. Nhiều nghiên cứu khác nhau dùng hỗn hợp ba kháng sinh để
điều trị nội nha các răng chưa trưởng thành hoại tử tuỷ báo cáo kết quả đầy hứa

1

.


2
hẹn [17].
Nồng độ kháng sinh dùng trong giai đoạn sát trùng ống tủy trong phương pháp
nội nha tái tạo trong các nghiên cứu lâm sàng rất cao (1000 mg/ml) [39], tuy nhiên
rất khó loại bỏ TAP (triple antibiotic paste) bằng các biện pháp bơm rửa ống tủy,
88% TAP còn tồn tại trong hệ thống ống tủy bất kể dùng phương pháp bơm rửa
nào [12].
Nguyên bào sợi là tế bào nhiều nhất trong mơ liên kết, có chức năng tạo cấu
trúc. Nguyên bào sợi chuột 3T3 là loại tế bào tăng sinh nhanh, dễ nuôi cấy, được
sử dụng nhiều để đánh giá độc tính của vật liệu. Nguồn tế bào tham gia vào q
trình sửa chữa chân răng có thể từ các tế bào tuỷ răng cịn sót lại, các tế bào gốc

từ bao răng, bao biểu mô Hertwig, tế bào gốc nhú chóp, tế bào gốc dây chằng
nha chu…. Các tế bào này có thể bị tổn thương sau khi dùng hỗn hợp kháng sinh
trong ống tuỷ làm ảnh hưởng tới sự thành công của điều trị.
Hiện nay ở Việt Nam, nghiên cứu sử dụng kháng sinh trong nội nha điều trị
răng vĩnh viễn chưa đóng chóp bị hoại tử tuỷ cịn hạn chế. Vì vậy, để bổ sung
kiến thức cơ bản cho điều trị nội nha và mở ra hướng nghiên cứu điều trị răng
vĩnh viễn chưa đóng chóp hoại tử tuỷ ở Việt Nam, nghiên cứu này được thực hiện
để khảo sát độc tính trên nguyên bào sợi 3T3 và tế bào gốc tuỷ răng người.
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Xác định mức độ độc tính tế bào của hỗn hợp ba kháng sinh dùng trong thủ
thuật nội nha tái tạo.
2. So sánh độc tính của ba loại thuốc băng nội nha hỗn hợp ba kháng
sinh (ciprofloxacin, metronidazol, minocyclin) , hỗn hợp hai kháng sinh
(ciprofloxacin, metronidazol) và calci hydroxide lên nguyên bào sợi chuột
3T3 và tế bào gốc tủy răng người.

.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phương pháp nội nha tái tạo
Điều trị nội nha răng chưa trưởng thành hoại tử tuỷ là một trong những thách
thức điều trị lớn nhất do chân răng mỏng manh dễ gãy và lỗ chóp lớn. Cách
thơng thường để điều trị răng hoại tử chưa đóng chóp là dùng calcium hydroxide
[Ca(OH)2 ] hoặc tạo rào chặn nhân tạo phía chóp bằng mineral trioxide aggregate
(MTA) [59]. Các phương pháp điều trị nội nha này chủ yếu tập trung vào vấn đề
diệt khuẩn, sau đó là tạo hàng rào ngăn chặn ở chóp răng và trám bít ống tuỷ vật
liệu như gutta percha. Do thành ngà mỏng, cần hạn chế hoặc không dùng dụng cụ
cơ học để sửa soạn ống tủy làm tổn thương thành ngà. Việc ốp bít ống tủy thường
rất khó và thường bị ốp quá chóp do lỗ chóp mở rộng. Các kỹ thuật trên cho phép

trám bít ống tuỷ nhưng khơng làm tăng kích thước chân răng về số lượng hay chất
lượng, cuối cùng là gãy chân răng và những gánh nặng điều trị sau này. Hầu hết
các nghiên cứu đã cho thấy hơn 50% những răng này sẽ mất đi trong 10 năm đầu
sau chấn thương dù đã được điều trị nội nha [8].
Các nhược điểm của các phương pháp điều trị thơng thường có thể được giải
quyết bằng quan điểm điều trị nội nha tái tạo. Phương pháp nội nha tái tạo được
thực hiện dựa trên nền tảng sinh học để thay thế cấu trúc răng bị hư hại, bao gồm
ngà răng và cấu trúc chân răng, cũng như phức hợp ngà tủy một cách sinh lý, từ
đó cải thiện tiên lượng lâu dài của răng.
Các tế bào gốc có nguồn gốc từ răng có khả năng hình thành mơ dạng tủy
răng và tạo ra ngà răng. Mặc dù được chứng minh in vitro, phương pháp điều trị
bằng tế bào (Hình 1.1) có nhiều vấn đề trong in vivo. Vấn đề trước tiên là nguồn
tế bào gốc. Hầu hết tế bào gốc phù hợp là tế bào gốc tủy răng từ răng cối lớn thứ
ba, răng dư, hoặc răng được nhổ theo chỉ định chỉnh nha. Cơ hội để có các nguồn
phù hợp tại thời điểm cần rất thấp. Hơn nữa các bước như nhổ răng, lấy tủy răng,

3

.


4
Bảng 1.1: Đặc điểm của ba phương pháp điều trị răng chưa đóng chóp [33]
Phương pháp

Đặc điểm

Thời gian điều trị dài
Kích thích đóng chóp
Nhiều lần hẹn

bằng Ca(OH)2
Tăng nguy cơ gãy răng do dùng Ca(OH)2
Một hoặc hai lần hẹn
Không tăng độ cứng chân răng và phát triển thêm
Gây đóng chóp bằng
chân răng sau này
MTA
Chân răng vẫn mỏng và dễ gãy
Nội nha tái tạo

Thúc đẩy phát triển chân răng
Có thể tăng cường lực cho ngà răng bằng cách lắng
đọng mô cứng

vận chuyển hoặc lưu trữ để không hư hại hoặc nhiễm khuẩn vào mơ tủy. Trong
ni cấy in vitro, tế bào có thể mất tính gốc và biệt hóa, và chúng có tiềm năng
phát triển khối u [61]. Chi phí điều trị cao cùng với các vấn đề thu thập và nuôi
cấy tế bào gốc làm cho phương pháp này không khả thi để điều trị các răng chưa
đóng chóp hoại tử tủy răng. Một lựa chọn khác là huy động tế bào gốc từ vùng
lân cận chân răng dường như khả thi hơn bằng cách gây chảy máu quanh chóp tạo
cục máu đơng trong ống tủy (Hình 1.2).
Bước đầu tiên để điều trị nội nha tái tạo là khử trùng ống tủy. Trong phương
pháp nội nha tái tạo, mức khử trùng cao hơn nội nha thông thường do hạn chế sử
dụng dụng cụ có thể tổn hại thành ngà, bề mặt và sâu trong các ống ngà cũng phải
được khử trùng để tạo điều kiện cho tế bào gốc phát triển [9]. Trong y văn, các
tác giả thường sử dụng hỗn hợp ciprofloxacin, metronidazol và minocyclin làm
thuốc băng nội nha cho kết quả điều trị đáng mong đợi [10].

.



5

Hình 1.1: Phương pháp tiếp cận bằng tế bào cho răng chưa đóng chóp tủy răng
hoại tử [61]
1.2. Thuốc kháng sinh dùng trong nội nha
Một trong những điều kiện để điều trị nội nha thành công là sát trùng hệ thống
ống tuỷ. Nhiều loại thuốc băng nội nha được dùng để hạn chế vi khuẩn phát triển
và có thể ức chế vi khuẩn như calcium hydroxide, các dẫn xuất của phenol, thuốc
kháng sinh…. Calcium hydroxide được dùng nhiều nhất để kiểm soát nhiễm trùng
nội nha và được chứng minh hiệu quả cao.
Kháng sinh cũng được dùng trong nội nha để hỗ trợ điều trị nội nha phẫu thuật
hoặc không phẫu thuật, kháng sinh toàn thân được dùng để ngăn chặn nhiễm trùng
trong ống tuỷ và/hoặc vùng quanh chóp. Để tiêu diệt vi khuẩn, kháng sinh dùng

.


6

Hình 1.2: Phương pháp tiếp cận khơng tế bào cho răng chưa đóng chóp tủy răng
hoại tử [61]
đường tồn thân cần được máu mang tới trong ống tuỷ để tiếp xúc trực tiếp vi
khuẩn. Do đó với trường hợp tuỷ hoại tử hoặc nhiễm trùng do thiếu cấp máu,
dùng kháng sinh tại chỗ có thể hiệu quả hơn đặc biệt là trong ống tuỷ hẹp [18].
Do bản chất nhiều loại vi khuẩn gây nhiễm trùng ống tuỷ [5], kháng sinh theo
kinh nghiệm riêng lẻ thì khơng đủ sát trùng hệ thống ống tuỷ. Khơng có loại kháng
sinh nào ngăn chặn hầu hết vi trùng và loại bỏ độc tố vi khuẩn để phục hồi lại ống
tuỷ. Vì vậy rất cần thiết dùng phối hợp các kháng sinh để chống lại tất cả mầm
bệnh của nội nha và ngăn chặn đề kháng của vi trùng.

Hỗn hợp kháng sinh thương mại phổ biến là Ledermix (Lederle Pharmaceuticals, Wolfratshausen, Germany) và Septomixine Forte (Septodont, Saint-Maur,
France). Cả hai loại thuốc này đều có chất chống viêm corticosteroid. Tuy nhiên
hai loại hỗn hợp này không có hoạt phổ đủ rộng để tiêu diệt vi trùng trong ống
tủy. Hỗn hợp ba kháng sinh (TAP) được giới thiệu dùng cho phương pháp nội
nha tái tạo để điều trị các răng chưa đóng chóp hoại tử tủy [41].
TAP là phối hợp của ciprofloxacin, metronidazol và minocyclin.
Ciprofloxacin là một floroquinolon tổng hợp với hoạt động diệt khuẩn

.


7
Bảng 1.2: Tác dụng của các thành phần trong hỗn hợp ba loại kháng sinh [9]
Thành phần

Phổ kháng khuẩn

Ciprofloxacin Phổ kháng khuẩn
hẹp

Metronidazol

Minocyclin

Phổ kháng khuẩn
hẹp

Phổ kháng khuẩn
rộng


.

Tính chất

Thuộc nhóm thuốc fluoroquinolone.
Hoạt động thông qua sự ức chế DNA
gyrase
Hiệu quả kháng sinh trong cả hai giai
đoạn vi khuẩn nhân đôi và giai đoạn
tiềm ẩn của pha phát triển vi khuẩn.
Hiệu quả chống lại vi khuẩn gram âm
Là một hợp chất của nitroimidazol.
Metronidazol thấm qua màng tế bào vi
khuẩn, kết hợp với DNA, làm gián
đoạn cấu trúc xoắn gây chết tế bào
nhanh chóng.
Hiệu quả chống lại cầu khuẩn kỵ khí,
trực khuẩn (cả gram dương và gram
âm) và động vật nguyên sinh.
Có hiệu quả khi dùng toàn thân cũng
như tại chỗ.
Hoạt động bằng cách ức chế tổng hợp
protein trên bề mặt của ribosome.
Ức chế collagenase và matrix
metalloproteinase và khơng độc tính
tế bào.
Hiệu quả chống lại cả vi khuẩn gram
dương và gram âm; xoắn khuẩn.
Làm tăng thêm sự phát triển của tế
bào chủ trên ngà răng, thông qua tiếp

xúc của sợi collagen hoặc yếu tố tăng
trưởng cho phép nội nha tái tạo thành
công và tiếp tục phát triển chân răng
tới chiều dài bình thường


8
nhanh. Hoạt động diệt khuẩn là kết quả của việc tiêu ADN bằng exonucleas mà
sản phẩm là tín hiệu từ ADN hư hại. Ciprofloxacin thể hiện hoạt động chống lại
vi khuẩn gram âm nhưng chống vi khuẩn gram dương rất hạn chế. Hầu hết các
vi khuẩn kỵ khí có khả năng kháng ciprofloxacin. Do đó ciprofloxacin thường
được kết hợp với metronidazol trong điều trị nhiễm trùng hỗn hợp.
Metronidazol kháng sinh nhóm nitroimidazol, thuộc nhóm thuốc kháng ký
sinh trùng, là kháng sinh phổ rộng chống lại động vật nguyên sinh và vi khuẩn
kỵ khí. Metronidazol kháng sinh thường được dùng để điều trị nhiễm trùng do vi
khuẩn kỵ khí. Thuốc liên kết với ADN, phá vỡ các cấu trúc xoắn dẫn đến tế bào
chết nhanh chóng [35].
Minocyclin là kháng sinh phổ rộng chống lại vi khuẩn gram âm và gram
dương, tác dụng chủ yếu là kìm khuẩn, ức chế tổng hợp protein bằng cách kết
hợp với ribosome 30S của vi khuẩn [37].

1.3. Các yếu tố cần thiết để tái tạo mô
Việc tái tạo mơ trong tuỷ răng địi hỏi xử lý viêm mạn và phục hồi mơ bị hư
hại trong đó có phức hợp ngà tuỷ. Mục đích chính của nội nha tái tạo là phục hồi
chức năng sinh lý bình thường của mô tuỷ hoại tử lẫn cơ chế bảo vệ (bao gồm sự
tạo ngà sửa chữa, sự nhạy cảm của với đau và lực nhai). Khi phục hồi các chức
năng của tuỷ răng sẽ giúp răng tồn tại lâu dài và giúp bệnh nhân giữ được bộ răng
tự nhiên. Vì vậy, cần phải phát triển kỹ thuật tái tạo mô để phục hồi sự sống của
tuỷ răng cũng như các chức năng sinh lý của phức hợp ngà tuỷ. Về nguyên tắc,
để bất kỳ kỹ thuật tái tạo nào thành công, cần hội đủ bốn yếu tố: sự hiện diện của

các tế bào gốc, các giá thể hợp, các tín hiệu phân tử thích hợp và mơi trường vơ
trùng cho các tế bào gốc tái tạo.

.


9
1.3.1. Sự vô khuẩn
Việc sử dụng hỗn hợp kháng sinh chứa ciprofloxacin, metronidazol và
minocyclin đã được chứng minh là có hiệu quả diệt khuẩn đủ để diệt các vi khuẩn
từ phần ngà răng bị nhiễm trùng trong ống tủy. Mới đây minocyclin đã được loại
bỏ hoặc thay thế bằng kháng sinh khác do nó có khả năng làm đổi màu răng. Cần
trám kín phần thân răng để đảm bảo sự vô khuẩn trong ống tủy. Việc sử dụng
MTA để tạo sự khín kín có thể làm ảnh hưởng tới màu răng, hầu hết các sản
phẩm MTA có trên thị trường đều chứa chất làm tăng độ cản quang như bismuth
oxide, một chất làm thay đổi màu răng. Xi măng Portland đã được chứng minh
là ít gây đổi màu răng hơn MTA, được Hội Nội Nha Mỹ khuyên dùng trong thủ
thuật nội nha tái tạo [38].

1.3.2. Tế bào gốc
Có nhiều nguồn tế bào gốc trong khoang miệng [24]. Theo kỹ thuật nội nha
tái tạo, dịng máu đi từ vùng chóp có thể mang theo tế bào gốc vào ống tuỷ để tái
tạo lại tuỷ răng. Ý kiến này được ủng hộ bởi nghiên cứu so sánh tín hiệu tế bào
gốc trung mô trong máu lấy trong ống tuỷ cao hơn 400 - 600 lần so với máu lấy
từ hệ tuần hoàn [61].
Tuỷ răng là mô liên kết chứa các tế bào, mạch máu và thần kinh, có chức năng
duy trì sự sống của răng. Tương tự như tủy xương, tủy răng có chứa các tế bào
gốc trung mơ, ngồi ra cịn có các tiền nguyên bào ngà, nguyên bào sợi, các tế bào
miễn dịch và tế bào tạo máu. Có thể nói tế bào từ tủy răng là nguồn nguyên liệu
quý cho các nghiên cứu trong lĩnh vực tái tạo mô răng và nha chu [4], [3]. Nhiều

nghiên cứu cho thấy ở răng được chẩn đốn hoại tử tuỷ có thể cịn tế bào tuỷ răng
sống đóng vai trị quan trọng trọng nội nha tái tạo [32], tế bào tuỷ răng có thể tồn
tại ở răng bị nhiễm trùng [18].

.


10

Hình 1.3: Nguồn tế bào và các yếu tố tăng trưởng trong nội nha tái tạo [61]
1.3.3. Giá thể thích hợp
Nhiều giá thể tự nhiên và tổng hợp đã được nói đến trong y văn. Những giá
thể này tạo cấu trúc ba chiều cho các tế bào gốc tăng sinh và biệt hoá thành các
nguyên bào ngà mong muốn. Hầu hết các quy trình nội nha tái tạo dựa vào sự
kích thích máu chảy vào trong ống tuỷ và sự hình thành cục máu đơng với vai trị
là giá thể. Việc sử dụng cục máu đông làm giá thể, mặc dù về nguyên tắc thỏa
mãn các yêu cầu của giá thể và cho thấy thúc đẩy thành công sự phát triển tiếp
tục của chân răng, được xem là môi trường khơng kiểm sốt với khả năng thúc
đẩy sự lành thương hơn là tái tạo các mơ mong muốn. Ngồi cục máu đông, các
giá thể tự nhiên khác cũng thường được sử dụng là huyết tương giàu tiểu cầu và
fibrin giàu tiểu cầu cũng được sử dụng [20]. Vì vậy cần có nghiên cứu thêm để
có hệ thống giá thể tốt hơn để có các kết quả nội nha tái tạo nhất quán và tin cậy.

.


11
1.3.4. Các tín hiệu phân tử
Các tín hiệu phân tử có thể thúc đẩy sự biệt hố các tế bào gốc là cần thiết
cho sự tái tạo thành công mô tuỷ răng. Việc sử dụng các tín hiệu phân tử có trong

thành ống ngà thơng bơm rửa EDTA 17% được khuyến cáo [54]. Tuy nhiên, có
ít bằng chứng cho rằng phương pháp này khởi phát các tín hiệu phân tử liên quan
để thúc đẩy sự tái tạo các mô cần cho sự thành cơng. MTA có khả năng kích thích
gen tiết khung khống hố, liên quan đến q trình khống hoá của tế bào tuỷ răng
và tế bào tạo xương, do đó MTA được dùng để che phủ bên trên cục máu đơng,
cung cấp tín hiệu phân tử cho sự phát triển của tế bào gốc. Cần tiếp tục nghiên
cứu các tín hiệu phân tử chun biệt có thể thúc đẩy sự biệt hoá các nguyên bào
ngà, sự tạo mạch và tạo mô thần kinh.

1.4. Mô học tuỷ răng được tái tạo
Bản chất của mơ cứng được hình thành bên trong ống tuỷ và chân răng được
phát triển thêm của răng vĩnh viễn chưa trưởng thành sau thủ thuật nội nha tái tạo
ở người chưa rõ, do chưa có nghiên cứu mơ học nào sẵn có. Có giả định rằng mơ
dây chằng nha chu có thể phát triển vào ống tuỷ và lắng đọng xê măng trên thành
ống tuỷ sau thủ thuật nội nha tái tạo. Vojinovic (1993) [57], dùng thử nghiệm ảnh
phóng xạ tự chụp cho thấy tế bào dây chằng nha chu có thể di chuyển vào lỗ chóp
sau khi lấy tuỷ tồn phần ở răng chưa trưởng thành của chó. Tế bào gốc trong dây
chằng nha chu có khả năng biệt hố thành tế bào dạng ngun bào xê măng và
dạng nguyên bào xương khi được kích thích bằng tín hiệu thích hợp. Mơ cứng ở
trong ống tuỷ có thể do sự phát triển trực tiếp của xê măng và xương từ mơ quanh
chóp vào ống tuỷ. Trong nghiên cứu sự thay đổi của mô tuỷ trong cấy lại răng và
cấy chuyển tự thân răng chưa trưởng thành của chó, Skoglund [50] chứng minh
mơ dạng xương hình thành bên trong ống tuỷ liên tục với xương ổ qua lỗ chóp
mở.
Các mơ trong ống tuỷ của răng chưa trưởng thành sau thủ thuật nội nha tái tạo

.


12

trong nghiên cứu trên chó được mơ tả là mơ dạng xê măng - dạng xương và mô
liên kết sợi dạng dây chằng nha chu. Khơng có mơ dạng tuỷ răng hiện diện bất kể
dùng loại thuốc băng nội nha nào [53].
Đối với răng vĩnh viễn chưa trưởng thành có viêm quanh chóp, có sự mở rộng
của viêm tuỷ ở chóp răng, lúc này tuỷ răng chưa hoại tử hồn tồn. Do đó viêm
quanh chóp có thể có sự hiện diện của một phần tuỷ răng sống bị viêm trong phần
chóp của ống tuỷ răng. Về mơ học, có sự hiện diện của mơ tuỷ sống trong phần
chóp của ống tuỷ ở răng cửa chưa trưởng thành được cấy lại, mặc dù vẫn có viêm
và áp xe quanh chóp [34]. Như vậy việc tái tạo mơ tuỷ răng có thể xảy ra sau thủ
thuật nội nha tái tạo, có khả năng một số mô tuỷ răng được tái tạo sau thủ thuật
này ở răng vĩnh viễn chưa trưởng thành có viêm quanh chóp. Rất cần bằng chứng
mơ học để xác nhận khả năng đó. Các nghiên cứu trên động vật khơng có bằng
chứng mơ học thuyết phục chỉ ra rằng mô tuỷ răng được tái tạo ở trong ống tuỷ
của răng chưa trưởng thành sau thủ thuật nội nha tái tạo.
Bao biểu mơ chân răng Hertwig đóng vai trị quan trọng trong quá trình phát
triển chân răng. Tương tự như q trình kích thích đóng chóp, nếu tế bào bao biểu
mô chân răng Hertwig tồn tại trong thủ thuật nội nha tái tạo, chúng có thể cảm
ứng tế bào tiền thân/tế bào gốc trong dây chằng nha chu để biệt hố thành tế bào
dạng xê măng và tạo ra mơ dạng xê măng để thúc đẩy phát triển chân răng [60].
Nếu nhú chóp cũng tồn tại trong thủ thuật nội nha tái tạo, tế bào bao biểu mô chân
răng Hertwig sẽ gửi tín hiệu để tế bào nhú chóp biệt hoá thành nguyên bào ngà
nguyên phát chân răng và thúc đẩy hình thành ngà chân răng [51]. Như vậy, chân
răng sẽ tiếp tục phát triển sinh lý bình thường sau thủ thuật nội nha tái tạo. Sự
phát triển chân răng được điều hịa bởi tế bào bao biểu mơ chân răng Hertwig [60]
và khơng phải bởi nhú chóp. Các tế bào bao biểu mô chân răng Hertwig phải tồn
tại để hướng dẫn sự phát triển tiếp tục của răng.

.



13
1.5. Một số thử nghiệm in vitro đánh giá khả năng gây độc tế bào
Các thử nghiệm in vitro có một số ưu điểm như dễ dàng kiểm soát điều kiện
thử nghiệm, được chuẩn hố, thực hiện nhanh, có thể lặp lại được. Nhược điểm
là các điều kiện thử nghiệm in vitro không giống như trên cơ thể sống do đó khó
áp dụng được các kết quả thử nghiệm
Các hợp chất khác nhau của tetrazolium được dùng để phát hiện tế bào sống.
Các hợp chất thường dùng nhất gồm: MTT, MTS, XTT và WST-1. Các hợp chất
này cơ bản được chia làm 2 loại: 1) MTT tích điện dương và dễ dàng xâm nhập
vào tế bào sống nhân chuẩn và 2) MTS, XTT và WST-1 khơng tích điện và khơng
xâm nhập vào tế bào. Nhóm sau (MTS, XTT, WST-1) thường được dùng với một
chất nhận electron trung gian để có thể chuyển điện từ từ tế bào chất hoặc màng
plasma để tạo điều kiện cho sự chuyển hoá tetrazolium thành hợp chất có màu
formazan.

1.5.1. Thử nghiệm MTT
Thử nghiệm MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) là thử nghiệm giảm tetrazolium đầu tiên được thử nghiệm sự sống tế bào
trên đĩa 96 giếng. Chất nền MTT được chuẩn bị trong dung dịch cân bằng sinh
lý, sau đó cho vào mơi trường ni cấy tế bào, thường nồng độ cuối cùng là 0,2 0,5 mg/ml, và ủ trong 1 đến 4 giờ ở 37°C. Số lượng của formazan (tỉ lệ thuận với
số lượng tế bào sống) được đo bằng cách ghi lại mật độ quang ở bước sóng 570
nm bằng máy đọc đĩa quang phổ kế.
Tế bào sống với hoạt động trao đổi chất chuyển đổi MTT thành formazan màu
tím với sự hấp thụ tối đa gần bước sóng 570 nm (Hình 1.4). Khi tế bào chết, chúng
mất khả năng chuyển MTT thành formazan, do đó màu formazan là một chỉ thị
hữu ích và thuận tiện để đánh dấu tế bào sống. Cơ chế chính xác của sự chuyển
MTT thành formazan chưa được hiểu rõ, nhưng có thể liên quan tới phản ứng với
NADH hoặc các phân tử tương tự khi chuyển electron đến MTT.

.



14

Hình 1.4: Phản ứng chuyển hóa MTT thành formazan
Sản phẩm formazan tích tụ kết tủa khơng tan trong tế bào cũng như lắng đọng
gần bề mặt tế bào và trong mơi trường ni cấy. Formazan phải được hồ tan trước
khi đọc chỉ số hấp thụ. Có nhiều phương pháp khác nhau để hòa tan sản phẩm
formazan, ổn định màu sắc, tránh bốc hơi, và giảm sự tương tác của phenol đỏ và
các thành phần khác của môi trường nuôi cấy. Các phương pháp gồm: acidified
isopropanol, DMSO, dimethylformamide, SDS, và sự kết hợp của chất làm sạch
và dung môi hữu cơ.
Lượng tín hiệu phụ thuộc vào nhiều tham số: nồng độ của MTT, thời gian ủ,
số lượng tế bào sống và hoạt động trao đổi chất. Tất cả các tham số này phải được
xem xét khi tối ưu điều kiện thử nghiệm để tạo ra lượng vừa đủ sản phẩm có thể
phát hiện được cao hơn nền.

1.5.2. Thử nghiệm MTS
Chất tetrazolium mới được phát triển có thể hình thành sản phẩm formazan
hồ tan trực tiếp vào mơi trường ni cấy. Hợp chất tetrazolium trong loại này
gồm MTS, XTT, và WST (Hình 1.5). Những cải tiến trong thuốc thử tetrazolium
làm giảm đi thao tác xử lý trong thử nghiệm, vì khơng cần bước hồ tan tinh thể
formazan, làm cho quy trình đơn giản hơn nhiều. Sản phẩm formazan tích điện
âm góp phần làm tan trong môi trường nuôi cấy tế bào, hạn chế sự thấm vào tế
bào của tetrazolium. Nhóm thuốc thử tetrazolium này được sử dụng kết hợp với

.


15


Hình 1.5: Phản ứng chuyển hóa MTS thành formazan
chất nhận electron trung gian như phenazine methyl sulfate (PMS) hoặc phenazine
ethyl sulfate (PES) có thể xâm nhập vào tế bào sống, giảm trong tế bào chất hoặc
ở bề mặt tế bào và thoát ra khỏi tế bào nơi chuyển đổi tetrazolium thành sản phẩm
formazan hòa tan [45].

1.5.3. Thử nghiệm trypan blue [52]
Thử nghiệm trypan blue để xác định số lượng tế bào sống có trong huyền phù
tế bào. Phương pháp này hoạt động trên nguyên tắc là màng tế bào nguyên vẹn
khơng cho thuốc nhuộm như trypan blue thấm qua, cịn tế bào chết thì cho thuốc
nhuộm đi qua màng tế bào. Phương pháp này đơn giản và thực hiện nhanh để
xác định tế bào sống, nhưng nó xác định tế bào sống một cách gián tiếp qua tính
nguyên vẹn màng tế bào. Một số trường hợp sự sống của tế bào đã bị xâm phạm
(đo được bằng khả năng tăng trưởng hoặc thực hiện chức năng) ngay cả khi màng

.