.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI APOPTOSIS
CỦA TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY GÂY BỞI DỊCH
CHIẾT CÂY LƯỢC VÀNG
Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: TS. LÊ NGUYỄN UYÊN CHI

Tp. Hồ Chí Minh, 12/2018

.


.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI APOPTOSIS

CỦA TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY GÂY BỞI DỊCH
CHIẾT CÂY LƯỢC VÀNG
Mã số:

Chủ nhiệm đề tài

TS. LÊ NGUYỄN UYÊN CHI

Tp. Hồ Chí Minh, 12/2018

.


.

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA

TS. LÊ NGUYỄN UYÊN CHI
Bộ môn Sinh học
Khoa Khoa học cơ bản
Đại học Y dược Tp. Hồ Chí Minh

.


.

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT


1

DANH MỤC HÌNH ẢNH

2

DANH MỤC BẢNG BIỂU

3

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

6

1.1. Tính cấp thiết

6

1.2. Mục tiêu

7

1.3. Cách tiếp cận

7


1.4. Đối tượng nghiên cứu

7

1.5. Phạm vi nghiên cứu

7

1.6. Nội dung nghiên cứu

7

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

8

2.1. Giới thiệu cây Lược vàng

8

2.1.1. Đặc điểm phân loại

8

2.1.2. Đặc điểm hình thái

8

2.1.3. Thành phần hóa học và dược chất


9

2.1.4. Công dụng làm thuốc của cây Lược vàng

13

2.2. Tình hình nghiên cứu tính kháng ung thư của cây Lược vàng

14

2.3. Ứng dụng của GFP trong nghiên cứu quan sát tế bào

15

2.3.1. Đặc điểm của gfp

15

2.3.2. Gen gfp

16

2.3.3. Ứng dụng của GFP

17

.


.


CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU – HÓA CHẤT - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU19
3.1. Vật liệu – Hóa chất

19

3.2. Phương pháp nghiên cứu

20

3.2.1. Thu mẫu

20

3.2.2. Thu nhận dịch chiết tổng

20

3.2.3. Nuôi cấy tế bào AGS

20

3.2.4. Tạo dòng tế bào AGS mang gen gfp

20

3.2.5. Thử nghiệm độc tính tế bào

21


3.2.6. Chụp ảnh hiển vi huỳnh quang

21

3.2.7. Tách chiết DNA bộ gen

21

3.2.8. Điện di DNA

22

3.2.9. Xử lý số liệu

22

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

23

4.1. Thu nhận dịch chiết Lược vàng

23

4.2. Độc tính của dịch chiết Lược vàng trên tế bào AGS

24

4.3. Biến đổi hình thái apoptosis trên tế bào AGS-gfp gây bởi dịch chiết Lược
vàng


27

4.4. Phân tích sự phân đoạn nhiễm sắc thể do apoptosis

30

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

32

TÀI LIỆU THAM KHẢO

.


.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATCC

American Type Culture Collection

bp

base pair

DNA

Deoxyribonucleic acid


DAPI

4′,6-diamidino-2-phenylindole

EDTA

Ethylenediamine tetraacetic acid

FBS

Fetal Bovine Serum

kb

kilobase

kDa

kiloDalton

KHV

kính hiển vi

KHVHQ

kính hiển vi huỳnh quang

kV


kiloVolt

LB

Luria Bertani

ms

milisecond (mili giây)

PBS

Phosphate Buffer Sodium

RNA

Ribonucleic acid

Rpm

round per minute (vòng/phút)

siRNA

small interfeing RNA

TAE

Tris Acetate EDTA


UV

Ultraviolet

1

.


.

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. Hình thái cây Lược vàng Callisia fragrans

9

Hình 2. Ba bước của sự apoptosis

14

Hình 3. Cắn khơ thu từ lá C. fragrans.

23

Hình 4. Quan sát tế bào nuôi cấy sau 24 và 48 giờ ở các giếng ni cấy

26

Hình 5: Tế bào AGS biểu hiện gen gfp


27

Hình 6. Biến đổi hình thái tế bào AGS kiểu apoptosis do tác động của các nồng
độ dịch chiết CT và CL khác nhau

28

Hình 7. Các dạng hình thái tế bào AGS kiểu apoptosis

29

Hình 8. Sự hình thành các phân mảnh DNA trong tế bào AGS

30

2

.


.

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. Hiệu suất thu cắn khô từ lá C. fragrans

23

Bảng 2. Hiệu suất thu cắn khô từ thân C. fragrans


23

Bảng 3. Tỷ lệ tế bào sống khi ủ 48 giờ với các nồng độ CL.

24

Bảng 4. Tỷ lệ tế bào sống khi ủ 48 giờ với các nồng độ CT.

24

3

.


.

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

1. Thơng tin chung:
－ Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI APOPTOSIS CỦA TẾ
BÀO UNG THƯ DẠ DÀY GÂY BỞI DỊCH CHIẾT CÂY LƯỢC VÀNG
－ Mã số:
－ Chủ nhiệm đề tài: TS. LÊ NGUYỄN UYÊN CHI
－ Điện thoại: 01216395936

Email:

－ Đơn vị quản lý: khoa Khoa học cơ bản, bộ môn Sinh học

－ Thời gian thực hiện: 9/2016 - 9/2018
2. Mục tiêu:
Đánh giá khả năng gây apoptosis trên dòng tế bào ung thư dạ dày người của dịch
chiết từ cây Lược vàng (Callisia fragrans).
3. Nội dung chính:
－ Tạo dịng tế bào AGS-gfp phát huỳnh quang ổn định.
－ Thu nhận dịch chiết lá và thân C. fragrans.
－ Đánh giá độc tính của dịch chiết C. fragrans trên dòng tế bào ung thư dạ dày.
－ Đánh giá khả năng gây chết apoptosis của dịch chiết trên tế bào AGS-gfp
qua hai chỉ tiêu biến đổi hình thái tế bào và sự phân đoạn DNA
4. Kết quả chính đạt được (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ...):
－ Về đào tạo (số lượng, chuyên ngành, trình độ…):

4

.


.

－ Cơng bố trên tạp chí trong nước và quốc tế (tên bài báo, tên tạp chí, năm xuất
bản):
－ Sách/chương sách (Tên sách/chương sách, năm xuất bản):
－ Patent, Giải pháp hữu ích (tên; trình trạng nộp đơn đối với giải pháp chưa
đăng ký sở hữu trí tuệ; mã số, ngày cấp, thời gian bảo hộ đối với patent và
giải pháp đã đăng ký sở hữu trí tuệ):
5. Hiệu quả kinh tế - xã hội do đề tài mang lại:
－ Kết quả nghiên cứu được chuyển giao:
 Báo cáo tổng kết về nghiên cứu khả năng ứng dụng dược chất trong cây C.
fragrans để ức chế tế bào ung thư dạ dày.

 Đơn vị nhận chuyển giao: Đại học Y dược Tp.HCM
 Giá trị chuyển giao: kết quả nghiên cứu làm cơ sở cho thử nghiệm in vivo
tiếp theo; làm tài liệu tham khảo cho sinh viên, nghiên cứu viên ngành
dược liệu.
－ Phạm vi và địa chỉ ứng dụng kết quả nghiên cứu:
 Đơn vị ứng dụng kết quả nghiên cứu: bộ môn Sinh học, Đại học Y dược
Tp.HCM
 Bài giảng được trích dẫn kết quả nghiên cứu trong giảng dạy: Cái chết của
tế bào

5

.


.

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT
Ung thư dạ dày là một trong những loại ung thư gây chết người nguy hiểm
nhất ở châu Á, mỗi năm có khoảng 800.000 ca tử vong, trở thành loại hiểm họa tử
vong do ung thư đứng hàng thứ hai trên thế giới. Ở Việt Nam, tỷ lệ ung thư dạ dày
đang gia tăng nhanh chóng, là bệnh ung thư đường tiêu hóa phổ biến nhất ở nam
giới và xếp thứ hai ở nữ giới, sau ung thư vú và ung thư cổ tử cung. Thống kê vào
năm 2000, bệnh ung thư dạ dày ở nam giới với tỷ lệ mắc thô là 14,5 và tỷ lệ mắc
chuẩn theo tuổi là 23,7 trên 100.000 dân; ở phụ nữ, tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi là
10,8 trên 100.000 dân. Ước tính đến năm 2020, cả nước sẽ có khoảng gần 27.000
nam giới mắc bệnh ung thư dạ dày và gần 13.000 nữ giới mắc căn bệnh ác tính
này [2].
Việc sử dụng thảo dược và dược chất từ thực vật là hướng bào chế thuốc

phòng chống bệnh an toàn hiện nay. Đối với bệnh nan y như ung thư, việc tìm ra
một nguồn dược chất điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh là cấp thiết. Có rất nhiều
bài thuốc dân gian, truyền miệng hiện đang lưu hành trong công đồng, đưa đến
những mặt lợi lẫn mặt hại. Vì vậy các nghiên cứu để làm sáng tỏ công dụng của
chúng là cần thiết. Cây lược vàng là loại cây cảnh du nhập vào Việt Nam. Từ năm
2006, một số dân cư ở Thanh Hóa xem cây lược vàng nguồn thuốc dân gian có
hiệu quả trong chữa bệnh viêm hô hấp, viêm răng lợi, viêm đường tiết niệu, viêm
dạ dày, đau xương khớp, bệnh tim mạch, huyết áp và cả ung thư. Trên thế giới,
chỉ có một số ít nghiên cứu tại Nga cơng bố thành phần hóa học và tác dụng sinh
học của cây Lược vàng. Ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh
học hay ứng dụng điều trị lâm sàng chính thức của loại cây này, đặc biệt là khảo
sát tính gây chết tế bào ung thư kiểu apoptosis.
Dựa trên những tài liệu tham khảo về thành phần hóa học của cây Lược
vàng đã công bố trên thế giới, chúng tôi thực hiện nghiên cứu in vitro về khả năng
gây chết apoptosis của dịch chiết từ cây Lược vàng (Callisia fragrans) trên dòng
6

.


.

tế bào ung thư dạ dày người với sự đánh giá những biến đổi hình thái apoptosis của
tế bào ung thư.

1.2. MỤC TIÊU
Đánh giá khả năng gây apoptosis trên dòng tế bào ung thư dạ dày người
của dịch chiết từ cây Lược vàng (Callisia fragrans).

1.3. CÁCH TIẾP CẬN

－ Tham khảo các tài liệu nghiên cứu trong và ngoài nước.
－ Thực nghiệm.

1.4. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
－ Dịng tế bào biểu mơ u dạ dày người AGS (ATCC, USA)
1.5. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
－ Dịch chiết nước từ lá và thân cây Lược vàng.
－ Tế bào ung thư dạ dày người AGS-gfp.
－ Chỉ thị apoptosis là sự biến đổi hình thái tế bào và sự phân đoạn DNA.
－ Nghiên cứu in vitro.

1.6. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
－ Tạo dòng tế bào AGS-gfp phát huỳnh quang ổn định.
－ Thu nhận dịch chiết lá và thân Lược vàng.
－ Thử nghiệm độc tính tế bào của dịch chiết trên tế bào AGS-gfp.
－ Đánh giá khả năng gây apoptosis của dịch chiết trên tế bào AGS-gfp qua
hai chỉ tiêu biến đổi hình thái tế bào và sự phân đoạn DNA

7

.


.

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. GIỚI THIỆU CÂY LƯỢC VÀNG
2.1.1. ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI
Ở Việt Nam, loài Lược vàng du nhập vào có tên khoa học là Callisia
fragrans (Lindl.) Woodson. Tên thường gọi: Lược vàng, Lan vịi, Bạch tuột, Giả

khóm, v.v…
- Giới: Plantae
- Ngành: Maggnoliophyta (Ngọc lan)
- Lớp: Liliopsida (Hành)
- Bộ: Commelinales (Rau trai)
- Họ: Commelinaceae (Thài lài)
- Chi: Callisia
- Loài: Callisia fragrans (Lindl.) Wood. [33]
2.1.2. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
Lược vàng là cây thảo, sống lâu năm, dễ trồng. Thân cây đứng, cao từ 15
đến 40 cm, chia nhiều đốt từ 1-2 cm và có nhánh tạo thân bị ngang (vịi).
Lá dạng đơn, mọc so le, phiến lá thn hình ngọn giáo, dài 15-20 cm, rộng
4-6 cm. Bề mặt lá nhẵn, mặt trên xanh đậm hơn mặt dưới, mọng nước. Bẹ lá ơm
khít lấy thân. Gân lá song song. Lá thường có màu tím ở những cây có nhiều ánh
sáng.
Hoa mọc thành cụm từ 2-3 hoa dạng xim trên phát hoa hình chùy dài
khoảng 60 cm. Mỗi căp xim được ơm bởi các lá bắc dạng răng cưa dài 10-15 mm.
Lá đài trong suốt, màu trắng, khô, dài 5-6 mm. Cánh hoa bóng, trong suốt, màu
trắng và mỏng [33].

8

.


.

Hình 1. Hình thái cây Lược vàng Callisia fragrans [49].
2.1.3. THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ DƯỢC CHẤT
Trong chi Callisia có một số loài như C. elegans, C. fragrans, C. insignis,

C. macdougallii, C. repens, C. soconusensis đã được Maria A. và cộng sự khảo
sát sơ bộ bằng sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng cho thấy đều có chứa flavon
C-glycosid phổ biến. Lá của C. elegans, C. insignis, C. macdougallii có cyanidin
3,7,3’-triglucosid acyl hóa. Một số nghiên cứu từ Nga cũng cho thấy trong thân
cây C. fragrans có các hợp chất phenol là anthraquinon (aloe-emodin) 0,008%,
coumarin (umbelliferon, scopoletin) 0,14%, acid phenolic (acid gallic, caffeic
và chicoric) 0,37%, flavonoid (kaempferol, quercetin) 0,05%, v.v [4, 36,
37-39].
Ở Việt Nam, nhóm tác giả Nguyễn Văn Hùng (2013) đã phân lập được 31
hợp chất, trong đó có 15 chất từ lá cây, 16 chất từ thân cây và 9 chất từ chồi nhánh
cây (một số chất tách từ 3 bộ phận trùng nhau), trong đó có 4 chất có cấu trúc mới
(1 chất từ lá cây và 3 chất từ thân cây) và một muối vô cơ. Nhóm nghiên cứu đã
phát hiện ra sự có mặt của lớp chất ecdysteroit trong cây Lược vàng và đã phân
lập được 19 hợp chất ecdysteroit từ các bộ phận lá, thân và chồi nhánh cây, trong
đó có 4 chất ecdysteroit mới là turkesterone2-O-β-D-glucopyranoside
(CFLW19.4) từ lá cây và callecdysterol A (CFT3), callecdysterol B (CFT5) và
callecdysterol C (CFT8) từ thân cây [15, 50].
2.1.3.1. Quercetin:
Quercetin là một flavonoid phổ biến ở thực vật, có cơng thức là
C15 H10O7, khối lượng phân tử 302,236 g/mol, điểm nóng chảy 316 oC.
9

.


.

Tác dụng sinh học đáng chú ý của quercetin như chống viêm bằng cách ức
chế biểu hiện của các gen iNOS, COX-2 và CRP, khóa các NF-kappaB hoạt động
và điều hịa tăng của các gen tiền viêm; chống oxy hóa mạnh và chống lão hóa

[7]; bảo vệ gan theo cách tăng cường hệ thống phịng vệ chống oxy hóa và ức chế
sự peroxy hóa lipid, điều biến miễn dịch [6].
Quercetin có thể phịng chống ung thư thơng qua cơ chế thúc đẩy hệ thống
phịng thủ chống oxy hóa enzyme và không enzyme trong giai đoạn khởi đầu của
ung thư gan [46]. Ở mức độ phân tử, quercetin tương tác với một số thụ thể, cụ
thể là thụ thể aryl hydrocarbon có liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư do
các chất hóa học nhất định gây ra. Quercetin điều chỉnh một vài tín hiệu của sự
truyền tính trạng trong chuỗi các phản ứng hóa sinh liên quan đến MER/ERK và
NRF2/KEAP1 của quá trình gây viêm và ung thư [29].
2.1.3.2. Kaempferol (3,4’,5,7-tertrahydroxyflavone)
Công thức phân tử C15H10O6, khối lượng phân tử 286,23 g/mol, điểm
nóng chảy 276-278 oC.
Đặc tính: kỵ sáng, tan trong DMSO hoặc ethanol.
Cấu trúc kaempferol tương tự quercetin và cũng có tác dụng chống oxy
hóa và chống viêm [12], được dùng chữa viêm nhiễm, dị ứng và bệnh đường tiết
niệu. Kaempferol cũng ngăn cản một cách hiệu quả sự phát triển của chứng viêm
dị ứng qua trung gian IgE của các mơ hình tế bào đường ruột [21].
Kaempferol cịn có tác dụng gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis)
trên nhiều dịng tế bào ung thư. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng tác dụng chống
oxy hóa của kaempferol có thể liên quan đến việc cảm ứng apoptosis ở tế bào
H460, liên quan đến sự thay đổi mức độ biểu hiện của caspase-3 và AIF. Sự biểu
hiện quá mức enzyme chống oxy hóa Mn-SOD được đẩy mạnh để tạo một loại
gen mới ức chế khối u trong một vài tế bào ung thư người, và có thể nó đóng vai
trị quan trọng vào tác dụng apoptosis trên tế bào H460 của kaempferol [22].
Kaempferol ức chế sự phát triển của tế bào bằng cách phá vỡ chu trình tế bào, kết
10

.



.

hợp mạnh với việc ngăn cản sự phân chia tế bào ở pha G2/M và có thể gây
apoptosis thơng qua sự phosphoryl hóa p53 ở các tế bào MDA-MB-453 trong
ung thư vú ở người [5].
Kaempferol cịn có thể giúp phịng ngừa hay chữa trị ung thư biểu mô tế
bào gan do ức chế hiệu quả hoạt động của HIF-1 và ngăn chặn sự sống sót của các
tế bào ung thư gan hiệu quả trong điều kiện oxy giảm [30].
2.1.3.3. Scopoletin
Công thức hóa học C10H8O4. Scopoletin là một coumarin có nhiều tác
dụng sinh học như chống oxy hóa, chống viêm khớp, chống ung thư, làm hạ
huyết áp và chống trầm cảm. Trong nghiên cứu của Manuele (2006), scopoletin
phân lập từ T. cordata Mill. và thử tác dụng kháng phân bào và gây độc tế bào
trên các u lympho bào [26]. Scopoletin gây ức chế sự tăng sinh của tế bào PC3
bằng cách cảm ứng quá trình apoptosis. Các tế bào xử lý với scopoletin cho thấy
những sự thay đổi về hình thái điển hình của apoptosis. Tỷ lệ chết apoptosis là
0,3%, 2,1%, 9,3%, và 35% tương ứng với liều scopoletin là 0, 100, 200, 400 mg/l
[24].
2.1.3.4. Aloe emodin
Cơng thức hóa học C15H10O5. Đây là một hydroxyanthraquinon, có khả
năng chống viêm vì nó ức chế sản xuất oxid nitric, TNF-alpha, và IL-12 [28].
Aloe emidin còn là một tác nhân kháng virus Japanese encephalitis do việc kích
thích sản xuất interferon [23]
Aloe emodin cũng là một loại tác nhân chống ung thư mới với hoạt tính
chọn lọc chống lại khối u thần kinh ngoại bì in vitro và in vivo [40]. Nghiên cứu
tác dụng chống ung thư của aloe emodin trên hai dòng tế bào ung thư gan ở người
là Hep G2 và Hep G3 cho thấy chất này ức chế sự phát triển tế bào và gây
apoptosis cho tế bào theo các cơ chế khác nhau. Ở tế bào Hep G2, aloe emodin
cảm ứng sự biểu hiện p53 và kèm theo biểu hiện của p21 kết hợp với việc ngăn
cản chu trình tế bào trong pha G1. Với những tế bào Hep G3 thiếu p53, tác dụng

11

.


.

ức chế tăng sinh tế bào của aloe emodin qua trung gian phụ thuộc p21 mà khơng
ngăn cản chu trình tế bào hoặc làm tăng lượng thụ thể Fas/APO1. Cơ chế chính là
aloe emodin gây cảm ứng apoptosis bằng cách tăng cường sự biểu hiện của Bax
[20]. Aloe emodin làm chết tế bào u dạ dày AGS và NCl-N87 theo cách phụ
thuộc thời gian và liều lượng. Nó giải phóng các yếu tố cảm ứng apoptosis và
cytochrome c từ ty thể, hoạt hóa caspase-3, dẫn đến co rút nhân và gây apoptosis.
[3, 13].
2.1.3.5. Gallic acid
Cơng thức hóa học C7H6O5. Đây là một polyphenol thực vật, có đặc tính
chống oxy hóa, bảo vệ gan [42], ức chế tyrosinase mạnh, ức chế đáng kể sự tăng
sinh tế bào và gây apoptosis trên nhiều dòng tế bào ung thư. Nghiên cứu in vitro
cho thấy acid gallic gây ra những biến đổi hình thái, giảm tỷ lệ tế bào sống sót và
gây apoptosis trên tế bào hắc sắc tố A375-S2 theo cơ chế điều hòa tăng các
protein pro-apoptotic như Bax và gây cảm ứng dòng caspase, nhưng lại điều hòa
ức chế các protein anti-apoptotic như Bcl-2. Gallic acid kích thích giải phóng
ngun sinh chất của các phân tử apoptosis, cytochrome c, thúc đẩy hoạt hóa
caspase 9 và caspase 3, dẫn đến chết tế bào [25]. Gallic acid ức chế sự phát triển
của tế bào ung thư cổ tử cung người bằng cách gây ra apoptosis [47]. Các thử
nghiệm khác cũng cho thấy tác dụng gây chết tế bào của acid gallic qua trung
gian của hydrogen peroxid, anion superoxid, các enzyme phụ thuộc calmodulin
[18].
2.1.3.6. Ecdysteroid
Các nghiên cứu in vitro ghi nhận ecdysteroid có nhiều hoạt tính sinh học

như gây độc trên tế bào ung thư, kháng viêm, chống oxy hoá, phân huỷ gốc tự do,
ức chế enzyme alpha-glucosidase làm hạ đường huyết, tăng sức đề kháng do kích
thích tế bào lympho. Nghiên cứu từ Nguyễn Thị Minh Hằng (2016) cho thấy chế
phẩm giàu ecdysteroid được điều chế từ cây lược vàng C. fragrans gây ức chế
khoảng 27,02 % thể tích của khối u từ tế bào ung thư phổi chuột so với lô đối
12

.


.

chứng ở mức liều 1000 mg/kg/ngày và không ảnh hưởng đến enzyme chức năng
gan và thận của chuột gây u [35].
2.1.4. CƠNG DỤNG LÀM THUỐC CỦA CÂY LƯỢC VÀNG
Lồi C. fragrans được dùng như một cây thuốc dân gian ở Nga để chữa
các bệnh dạ dày – ruột, bệnh túi mật, lá lách; các bệnh đường hô hấp như ho, viêm
họng, viêm phế quản, hen phế quản; các bệnh đường tiết niệu; các bệnh ngoài da
như viêm da, zona, chàm, bỏng, dị ứng, hắc lào, vết thương ngoài da và cả ung
thư… Trong nghiên cứu khoa học, người ta tìm thấy một số hoạt tính của C.
fragrans như sau:
- Chống oxy hóa: Dịch chiết từ thân C. fragrans có tác dụng chống oxy
hóa in vitro, cụ thể là phân đoạn chiết ethyl acetate, nước, butanol, chloroform
biểu hiện giá trị IC50 lần lượt là 0,024, 0,032, 0,087, 0,21 mg/ml. Dich chiết có
thể gây bất hoạt H2O2 (IC50 0,57mg/ml).
- Tăng cường miễn dịch: Khi cho chuột bị ức chế miễn dịch uống dịch
chiết thân C. fragrans (5 ml/kg/ngày) mỗi ngày, trọng lượng tuyến ức và lách
được phục hồi và gia tăng số lượng tế bào có nhân.
- Chống stress: Quan sát trên chuột được cho uống dịch chiết thân C.
fragrans (5 ml/kg/ngày) trước khi bị stress thì tỷ lệ bị loét dạ dày giảm cịn 25%

so với 100% ở nhóm chứng, khơng thấy có chuột nào có u dạng vân ở nhóm uống
lược vàng trong khi nhóm đối chứng bị u 100%. Tác dụng chống stress này cũng
được cho là do tác dụng chống oxy hóa của dịch ép này, biểu hiện ở việc làm
giảm 40% nồng độ MDA trong huyết thanh và làm tăng nồng độ glutation 3 lần,
tăng hoạt độ các enzym catalase (54%) và superoxid dismutase (20%).
- Tăng cường hoạt động: Thử nghiệm dịch chiết thân C. fragrans trên
chuột cống trắng với liều uống hằng ngày là 5- 10 ml/kg, quan sát thấy thời gian
bơi của chuột tăng gấp đơi so với nhóm đối chứng. Sự tăng cường khả năng hoạt
động là do hoạt chất trong dịch chiết đã hoạt hóa q trình tổng hợp ATP trong cơ
xương và cơ tim, làm tăng hàm lượng glycogen trong gan và giảm nồng độ acid
13

.


.

pyruvic và acid lactic trong máu. Ngoài ra, dịch ép này đã giúp làm giảm stress
oxy hóa của chuột bị cưỡng bức chạy, thể hiện ở việc làm giảm nồng độ MDA
trong huyết thanh, trong cơ xương và cơ tim chuột thí nghiệm cũng như làm tăng
hoạt độ enzyme catalase.

2.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG UNG THƯ
CỦA CÂY LƯỢC VÀNG
Tuy có các cơng bố về thành phần dược chất từ loài Callisia, nhưng những
thử nghiệm về khả năng thúc đẩy cái chết tế bào ung thư kiểu apoptosis vẫn chưa
được thực hiện.
Apoptosis là sự chết sinh lý của tế bào theo chương trình, được khởi phát
bởi những kích thích từ bên trong hoặc bên ngồi tế bào, gây kích hoạt những tín
hiệu caspase để thực hiện việc phân giải protein và tạo ra các biến đổi kiểu hình tế

bào như cô đặc chất nhiễm sắc, phân mảnh DNA, cuối cùng là tạo các thể
apoptosome bị đại thực bào phân hủy nhanh chóng và khơng gây phản ứng viêm.
[1].

Hình 2. Ba bước của sự apoptosis [43].
14

.


.

Mục tiêu của liệu pháp điều trị ung thư hiện nay là làm cho tế bào ung thư
chết đi mà khơng gây hại nhiều đến tế bào bình thường trong cơ thể, và liệu pháp
gây apoptosis cho tế bào tế bào ung thư được nghiên cứu rất nhiều. Có nhiều loại
thảo dược từ các cây thuốc cho thấy khả năng kháng u qua cơ chế apoptosis như
Caesalpinia sappan [44].
Trong các hợp chất có ở C. fragrans, người ta thấy thành phần
Kaempferol có thể gây cảm ứng apoptosis ở tế bào u phổi H460 [22] và tế bào u
vú MDA-MB-453 [5]; Scopoletin cảm ứng q trình apoptosis [24]; Aloe
emodin giải phóng các yếu tố cảm ứng apoptosis và cytochrome c từ ty thể, hoạt
hóa caspase-3, dẫn đến co rút nhân và gây apoptosis ở tế bào u dạ dày AGS và
NCl-N87 [3]; Acid gallic gây ra những biến đổi hình thái apoptosis trên tế bào
hắc sắc tố A375-S2 [25] và tế bào ung thư cổ tử cung Hela [47].

2.3. ỨNG DỤNG CỦA GFP TRONG NGHIÊN CỨU QUAN
SÁT TẾ BÀO
Huỳnh quang là sự phát xạ ánh sáng diễn ra khi đang hấp thụ ánh sáng
kích thích. Khi đó, một photon bức xạ tử ngoại va chạm với một electron trong
nguyên tử và đưa electron lên mức năng lượng cao hơn. Sau đó, electron kích

thích rơi xuống mức thấp hơn và phát ra ánh sáng dưới dạng một photon năng
lượng thấp hơn trong vùng ánh sáng thấy được có bước sóng 400 - 700 nm.
2.3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA GFP
Trong tự nhiên, một loài sinh vật có khả năng phát ra ánh sáng huỳnh
quang tự nhiên, chẳng hạn ở Sứa Aequorea victoria biểu hiện một protein huỳnh
quang màu xanh là GFP, viết tắt từ Green Fluorescent Protein, kích thước khoảng
27 kDa, gồm 238 amino acid. GFP có chứa một trình tự serine, tyrosine và
glycine có các chuỗi bên quay vịng một cách ngẫu nhiên để tạo nên một tâm
huỳnh quang chromophore màu xanh khi được chiếu bằng ánh sáng xanh lam.
15

.


.

Cấu trúc bậc ba của GFP bao gồm 11 phiến β xếp thành hình khối trụ, một
xoắn ɑ chạy dọc trong lòng và che phủ hai đầu khối trụ. GFP của Sứa A.
victoria có bước sóng kích thích trong ngưỡng 395 - 475 nm và bước sóng bức xạ
ở 509 - 540 nm [48].
Khác với protein phát huỳnh quang sinh học, GFP hồn tồn có khả năng
phát huỳnh quang tự thân mà không cần đến sự trợ giúp của bất kì enzyme hoặc
chất hỗ trợ nào khác ngồi oxi. Chính điều này giúp cho các nhà nghiên cứu có
thể quan sát những hoạt động, phản ứng đang diễn ra trong tế bào và cơ thể sống.
2.3.2. GEN GFP
Năm 1992, Douglas Prasher thành cơng trong việc thu nhận, giải trình tự
gen GFP hoang dại và tạo dòng cDNA [2]. Đến nay, gen gfp đã được ứng dụng để
phát huỳnh quang ở các lồi sinh vật. chẳng hạn như lồi giun
trịn Caenorhabditis


elegans

và

vi

khuẩn Escherichia

coli,

nấm

men Saccharomyces cerevisiae, ruồi giấm Drosophilia melanogaster cũng như
các loài động vật bậc cao hơn như cá ngựa, chuột, thỏ [11], v.v…
Tại Việt Nam, từ năm 1998 các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu lĩnh vực
chuyển gen vào tế bào gốc và đã đạt được một số thành tựu nhất định. Năm 2009,
một nhóm nghiên cứu tại đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh do
ThS Phan Kim Ngọc chủ trì đã chuyển thành cơng gen gfp của sứa biển bằng
phương pháp bắn gen vào trứng cá Ngựa Vằn và đã tạo ra được hơn 120 con cá
phát quang [51].
Cùng với hướng nghiên cứu trên, người ta cịn biến tính hoặc gây đột biến
gen gfp để thu được những GFP có màu khác nữa. Năm 1995, Roger Y. Tsien tại
đại học California đã thực hiện thành cơng một phương pháp biến tính quan
trọng, nâng cao được đặc trưng quang phổ của GFP, có cường độ phát quang cao
hơn, và bền hơn hàng chục lần [14]. Người ta đã lợi dụng tính phát quang của
GFP - dùng như một chất đánh dấu rất đặc trưng - để nghiên cứu những quá trình

16

.



.

xảy ra ở bên trong tế bào, các quá trình phức tạp dưới mức phân tử mà trước đây
khơng nhìn thấy được nên khơng có cách nào để theo dõi.
2.3.3. ỨNG DỤNG CỦA GFP
Các nghiên cứu y sinh học đòi hỏi một công cụ hiệu quả để định lượng và
theo dõi ở mức độ phân tử các quá trình diễn ra trong cơ thể sống. Nhiều kiến
thức thu thập được về các q trình này là thơng qua các thử nghiệm kiểm tra gián
tiếp. Việc nhuộm màu mô, tế bào hoặc các thành phần tế bào để quan sát thường
diễn ra trên các mẫu vật chết. Công nghệ ứng dụng GFP xuất hiện là một cuộc
cách mạng trong nghiên cứu khoa học: GFP có khả năng phát sáng khi có oxi
(tham gia vào q trình oxi hóa để hình thành chromophore hồn chỉnh) và kích
thích phù hợp; kích thước gen mã hóa GFP đủ nhỏ để dễ dàng thao tác và chuyển
vào các tế bào muốn nghiên cứu; quan trọng nhất là GFP không ảnh hưởng đến
hoạt động sinh học trong cơ thể sống và một khi đã chèn vào bộ gen, gen GFP có
thể được di truyền qua nhiều thế hệ tế bào [9]. Từ các đặc điểm đó, GFP giúp các
nhà nghiên cứu trực tiếp thấy được cách mà sự sống diễn ra ở mức độ vi mô. Rất
nhiều căn bệnh ở người đến từ những sai sót trong bộ máy làm việc của tế bào,
GFP cũng chính là một trong những công cụ hiệu quả giúp chúng ta xác định
được nguyên nhân của những sai sót đó [11].
Đối với những nghiên cứu sử dụng tế bào, nhu cầu theo dõi sự sống của tế
bào nuôi cấy in vitro, hoặc theo dõi hiện diện của tế bào phát triển trong cơ thể
động vật thí nghiệm là rất cần thiết. Điều đó địi hỏi sự hiện diện của một chất
đánh dấu (marker) tồn tại trong tế bào như GFP. Gen gfp được sử dụng như một
gen chỉ thị (reporter gen). Hiện nay, ứng dụng rộng rãi nhất của GFP là theo dõi
vị trí, sự chuyển động và phản ứng hóa học liên quan đến các protein trong tế bào
bằng cách kết hợp gen của protein muốn nghiên cứu với gen gfp [11]. Bằng kỹ
thuật tạo dòng DNA tái tổ hợp, gen gfp được chuyển vào trong tế bào, tổng hợp

protein huỳnh quang xanh, làm cho tế bào phát ra ánh sáng huỳnh quang có thể

17

.


.

nhìn thấy được bằng mắt thường hoặc dùng các thiết bị theo dõi đặc biệt, cho
phép nhà nghiên cứu có thể định vị và theo dõi hoạt động của gen và tế bào.
GFP được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu ung thư để đánh dấu và truy
tìm các tế bào ung thư. Các tế bào ung thư mang GFP cịn được sử dụng trong mơ
hình nghiên cứu sự di căn của tế bào ung thư đến các vùng cơ quan khác nhau
trong cơ thể [19].
Hoffman (2002) dùng retrovirus để chuyển gen gfp và rfp (protein huỳnh
quang đỏ) vào một số tế bào ung thư của người và chuột. Các tế bào ung thư biểu
hiện huỳnh quang bền vững và tạo khối u di căn sau khi được cấy ghép vào mơ
hình chuột. Bằng các cơng cụ huỳnh quang, các tế bào đơn từ khối u hay sự di căn
có thể được ghi hình [16, 17].
Năm 2004, Min JJ và các cộng sự đã cấu trúc vector chứa hai loại gen phát
huỳnh quang là luciferase và gfp trong lentivirus để chuyển gen vào tế bào ung
thư cổ tử cung Hela và T-lymphocyte, tạo ra dòng tế bào phát quang bền vững
[27].
Tại Việt Nam, chỉ có một số cơng trình nghiên cứu trong đó có sử dụng
việc chuyển gen vào tế bào vi khuẩn [8, 10, 31]. Nghiên cứu trong nước về
chuyển gen gfp vào tế bào động vật là rất ít. Nguyễn Hải Hà (2009) thực hiện
chuyển gen gfp vào tế bào buồng trứng chuột bằng plasmid pEGFP-N2, kết quả
thu được dòng tế bào CHO ổn định biểu hiện mạnh huỳnh quang xanh [32]. Cho
đến nay, ở Việt Nam chưa có một cơng bố nào về sử dụng gen gfp để tạo dòng tế

bào ung thư người AGS biểu hiện ổn định huỳnh quang.

18

.


.

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU - HÓA CHẤT - PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. VẬT LIỆU - HĨA CHẤT
－ Cây Lược vàng
－ Dịng tế bào biểu mô u dạ dày người AGS (ATCC), được nhận từ TS. Lã Thị
Huyền, Phịng Cơng nghệ tế bào động vật, Viện CNSH, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam.
－ Môi trường RPMI 1640 (with 25mM HEPES, with L-glutamine)
－ Huyết thanh bê FBS
－ Streptomycin-Penicilin
－ Đệm phosphate PBS 1X
－ Trypsin-EDTA 0,25%
－ Trypan Blue 0.4%
－ Bột LB (1% tryptone, 0,5% yeast extract và 1% NaCl)
－ Agar vi sinh
－ Kanamycine
－ Geneticine (G418)
－ E.N.Z.A Tissue DNA Kit
－ Agarose A
－ Dung dịch TAE 1X
－ 6X GelRed loading dye

－ Hyperladder 1 kb
19

.


.

3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Thu mẫu
Mẫu thực vật được thu vào lúc cây trồng được 4 tháng tuổi, chưa có hoa.
Thân có ít nhất 9 đốt, lá to.
3.2.2. Thu nhận dịch chiết tổng
Chọn lá (hoặc thân) tươi đã phát triển đầy đủ, không non, không gẫy giập,
không héo úa. Rửa thật sạch, vảy hết nước. Cân khối lượng mẫu tươi.
Xay mẫu cho nhuyễn, ép lấy dịch. Ngâm bã trong nước ấm 60 oC trong 30
phút rồi thu dịch ép. Lặp lại 3 lần. Thu tất cả dịch ép và lọc qua giấy lọc.
Sấy dịch lọc đến khô ở 55 oC đến khối lượng khơng đổi. Tính hiệu suất thu
được cao khô so với khối lượng dược liệu tươi:
H (%) = (m cao khô / m dược liệu tươi) x100
Khi sử dụng cho các thử nghiệm tiếp theo, cao khô được hịa tan với nước
cất thành dịch thử nghiệm có nồng độ xác định.
3.2.3. Nuôi cấy tế bào AGS
Tế bào được nuôi trong đĩa petri 100-mm chứa 20 ml môi trường
RPMI-1640 hồn chỉnh có bổ sung 10% FBS, 100 mg/ml streptomycin và 100
IU/ml penicillin. Điều kiện nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 oC, khơng khí ẩm,
5% CO2. Các đĩa tế bào được dùng trong các thí nghiệm đều đạt mật độ khoảng
70 – 80%.
Khi chuyển gen, tế bào được thu hoạch bằng 0,25% Trypsin-EDTA, rửa
sạch bằng PBS, sau đó hịa với mơi trường RPMI hồn chỉnh với hàm lượng tế

bào theo nhu cầu.
3.2.4. Tạo dòng tế bào AGS mang gen gfp
Quy trình tạo dịng được mơ tả cụ thể trong đề tài cấp trường “Chuyển gen
gfp (Green Fluorescent Protein) ổn định vào tế bào ung thư dạ dày người” (chủ
20

.