ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP BÀO TỬ ĐƠN CỦA
NẤM CORDYCEPS MILITARIS

LÊ THỊ TÚ ANH

Đà Nẵng, năm 2020


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP BÀO TỬ ĐƠN CỦA
NẤM CORDYCEPS MILITARIS

Ngành: Công nghệ sinh học
Khóa: 2016-2020
Sinh viên: Lê Thị Tú Anh
Người hướng dẫn: TS. Trịnh Đăng Mậu

Đà Nẵng, năm 2020


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực. Đây là
kết quả nghiên cứu chưa từng được công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác trước đây.
Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kỳ quy định về đạo đức khoa học.

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Tú Anh

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Trịnh Đăng Mậu- là giảng
viên hướng dẫn, cũng là người đã đóng góp ý kiến, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi
trong suốt q trình thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn đến các quý thầy cô giảng dạy tại khoa Sinh - Môi
trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã trang bị cho em một nền tảng
kiến thức vững chắc để có thể vận dụng kiến thức trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã giúp đỡ động viên em trong quá
trình thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn !
Đà Nẵng, tháng 7 năm 2020
Sinh viên thực hiện

Lê Thị Tú Anh

ii


MỤC LỤC


LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................ 1
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... ii
MỤC LỤC ......................................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ......................................... v
DANH MỤC BẢNG...........................................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................... vii
TĨM TẮT ........................................................................................................................ viii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1
1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ................................................................................. 1
1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .......................................................................................... 2
1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .......................................................................................... 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3
1.1. GIỚI THIỆU NẤM CORDYCEPS MILITARIS ........................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm sinh học, sinh thái, phân bố của nấm Cordyceps militaris ................... 3
1.1.2. Chu trình sống của nấm Cordyceps militaris ........................................................ 4
1.1.3. Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris ...................................................... 4
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT CORDYCEPS MILITARIS HIỆN NAY .. 6
1.2.1. Trên thế giới ........................................................................................................... 6
1.2.2. Việt Nam ................................................................................................................ 7
1.3. GIỚI THIỆU VỀ BÀO TỬ ........................................................................................... 8
1.4 CƠ CHẾ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI DUNG DỊCH KHỬ TRÙNG TỚI KHẢ
NĂNG XỬ LÝ HỆ SỢI VÀ BÀO TỬ NẤM. ..................................................................... 9
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 10
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 10
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................... 10
2.2.1 Phương pháp chuẩn bị dịch bào tử........................................................................ 10
2.2.2. Phương pháp xác định dịch khử trùng ................................................................. 10
2.2.3. Phương pháp xác định nồng độ dịch khử trùng và thời gian khử trùng lên thời
gian xử lý mẫu................................................................................................................ 11


iii


2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi tới khả năng phát triển của sợi nấm
phát sinh từ bào tử đơn................................................................................................... 11
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 13
3.1. HÌNH THÁI BÀO TỬ ................................................................................................ 13
3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI DỊCH KHỬ TRÙNG LÊN KHẢ NĂNG KHẢ NĂNG
NẢY MẦM CỦA HỆ SỢI VÀ BÀO TỬ .......................................................................... 14
3.2.1. Ảnh hưởng của loại dung dịch khử trùng lên khả năng phát triển của hệ sợi ..... 14
3.2.2. Ảnh hưởng của loại dung dịch khử trùng lên khả năng nảy mầm của bào tử ..... 14
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ HCL VÀ THỜI GIAN XỬ LÝ TỚI KHẢ NĂNG
NẢY MẦM CỦA HỆ SỢI VÀ BÀO TỬ NẤM. .............................................................. 15
3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG TỚI TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG
CỦA SỢI NẤM PHÁT TRIỂN TỪ BÀO TỬ ĐƠN ......................................................... 17
3.5. QUY TRÌNH PHÂN LẬP BÀO TỬ NẤM CORDYCEPS MILITARIS .................... 21
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 23
KẾT LUẬN .................................................................................................................... 23
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................... 23
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 24

iv


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

CDA

Czapek – Dox Agar


CS

Cộng sự

PDA

Potato Dextro Agar

SDAY1

Abouraud’s dextrose agar with yeast extract

TH

Tổng hợp

WA

Water Agar

v


DANH MỤC BẢNG

Số hiệu

Bảng 2.1


Tên bảng
Bảng thành phần dinh dưỡng của mơi trường PDA, CDA,
SDAY1 và TH (trong 1 lít môi trường).

vi

Trang

11


DANH MỤC HÌNH

Số hiệu

Hình 1.1

Hình 3.1

Hình 3.2

Hình 3.3

Hình 3.4

Hình 3.5

Hình 3.6

Hình 3.7


Hình 3.8

Tên hình
Nấm Cordyceps militaris được ni tại phịng thí nghiệm cơng
nghệ sinh học nấm- khoa Sinh-mơi trường
Hình thái bào tử (A), sử nảy mầm của bảo tử (B)
Ảnh hưởng của dung dịch khử trùng lên khả năng nảy mầm của
của hệ sợi
Ảnh hưởng của loại dung dịch khử trùng lên khả năng nảy mầm
của bào tử
Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch khử trùng lên khả năng nảy
mầm của hệ sợi
Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch khử trùng lên khả năng nảy
mầm của bào tử
Diện tích khuẩn lạc quan sát từ ngày 9 đến ngày 21 ở bốn mơi
trường khác nhau
Diện tích hệ sợi ở bốn mơi trường (a) PDA, (b) CDA, (c) TH,
(d) SDAY1 tại ngày quan sát thứ 21
Tốc độ sinh trưởng của khuẩn lạc bào tử nấm ở bốn môi trưởng
khác nhau trong 21 ngày khảo sát (tính từ ngày thứ 9 quan sát)

Trang

3

13

14


15

16

17

18

19

19

Sắc tố kết cấu hệ sợi nấm của khuẩn lạc sau khi đưa ra ánh sáng
Hình 3.9

14 ngày ở bốn loại mơi trường (a) PDA, (b) CDA, (c) TH,

20

(d)SDAY1

Hình 3.10

Quy trình phân lập bào tử đơn từ quả thể Cordyceps militaris
bằng dung dịch HCl.

vii

21



TĨM TẮT
Đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng quy trình phân lập bào tử đơn của nấm Cordyceps
militaris” được thực hiện nhằm mục tiêu tìm ra được hóa chất và thời gian khử trùng
thích hợp sao cho tỉ lệ nảy mầm của hệ sợi nấm Cordyceps militaris là thấp nhất và tỉ lệ
nảy mầm của bào tử nấm Cordyceps militaris là cao nhất, xác định môi trường dinh
dưỡng phù hợp cho tốc độ sinh trưởng sợi nấm gốc được phát triển từ bào tử. Đề tài được
bố bao gồm các thí nghiệm như sau: Thí nghiệm chuẩn bị dịch bào tử. Thí nghiệm này
đưa ra được tổng quan quy trình chuẩn bị dịch bào tử. Thí nghiệm ảnh hưởng của dịch
khử trùng. Hai loại dịch khử trùng được xử dụng là HCl và Javel, nước cất làm mẫu đối
chứng. Thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ dịch khử trùng và thời gian khử trùng lên tỉ lệ
nảy mầm của hệ sợi và bào tử. Sau khi tìm được dịch khử trùng thích hợp, tiến hành chia
dịch khử trùng đó thành nhiều nồng độ và các thời gian khử trùng khác nhau là 5, 10, 15,
20 phút. Thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên tốc độ sinh trưởng của
sợi nấm được cấy chuyển từ bào tử qua đĩa Petri. Bốn nghiệm thức được bố trí gồm bốn
mơi trường dinh dưỡng khác nhau gồm: PDA (Potato dextrose agar), CDA (Czapek-dox
agar), TH (tổng hợp), SDAY1(Sabouraud dextrose agar plus yeast extract). Kết quả cho
thấy, ta chủ động thu được bào tử không lẫn hệ sợi ở nồng độ HCl 0,3N với thời thời gian
xử lý 15 phút (3,328 ± 1,23%). Môi trường PDA được đánh giá thích hợp nhất cho sự
phát triển của khuẩn lạc (đường kính hệ sợi đạt 67,52 ± 11,48mm vào ngày quan sát thứ
21). Kết cấu và sắc tố hệ sợi Cordyceps militaris biểu hiện tốt nhất ở hai môi trường giàu
dinh dưỡng là SDAY1 và PDA. Việc tạo ra quy trình phân lập bào tử tạo điều kiện cho
q trình tuyển chọn giống nấm có năng suất và chất lượng.

viii


MỞ ĐẦU
1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris là hai loại nấm ký sinh trên giá thể

nhộng tằm có nguồn gốc từ Trung Quốc. Cordyceps sinensis được phân bố ngoài tự nhiên
trên độ cao 2000-3000m ( Li SP và cs 2006; Wang GD. 1995). Cordyceps militaris được
nuôi trồng trên giá thể ở môi trường nhân tạo. Những năm gần đây cordyceps militaris
được sử dụng rộng rãi như một bài thuốc dân gian để hỗ trợ điều trị bệnh. Nhiều nghiên
cứu cho rằng cordyceps militaris có nhiều dược lý như chống viêm (Das SK và cs, 2010),
chống oxy hóa và lão hóa (Khan và cs, 2010), chống đông máu (Zhang và cs, 2010),
chống vi trùng (Chen và cs, 2004), kháng khuẩn (Shih và cs, 2007), cải thiện tiết insulin
và chống đái tháo đường (Ahn và cs, 2000), hỗ trợ điều trị ung thư (shonker và cs, 2010),
chống mệt mỏi (Jung và cs, 2004), bảo vệ gan ( Won và cs, 2005) nhờ chứa các hợp chất
quan trọng như cordycepin, mannitol, adenosine, cordy polysac... (Das SK và cs, 2010; J
và cs, 2012).
Hiện nay, việc sử dụng phổ biến và tình trạng khai thác ngày càng nhiều đang làm
lồi nấm này ngày càng trở nên khan hiếm trong tự nhiên (Bhushan shrestha và cs, 2012).
Việc nuôi trồng Cordyceps militaris trên mơi trường nhân tạo do đó đã và đang được
nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất để đảm bảo nguồn cung cho nhu cầu của con người
mà vẫn bảo tồn được quần thể nấm trong tự nhiên. Tuy nhiên q trình này cịn gặp nhiều
khó khăn về quy trình cơng nghệ, đặt biệt là trong khâu tuyển chọn và nhân giống nấm bước có ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng nấm. Cordyceps militaris đang
được nhân giống chủ yếu bằng phương pháp phân lập mô tế bào, các chủng giống được
tạo ra từ phương pháp này có chất lượng khơng đồng đều, hệ sợi nấm khơng thuần nhất
(Seulmee S và cs, 2009). Bên cạnh đó, một số nghiên cứu khác cho thấy giống phân lập
từ mơ tế bào có thời gian thối hóa nhanh, hiện tượng thối hóa bắt đầu xuất hiện ở thế hệ
thứ 2 (Das SK và cs, 2010; QT Tan và cs, 2011).
Bào tử nấm đã được nghiên cứu sử dụng để thay thế cho mô tế bào trong việc
tuyển chọn và nhân giống nhằm khắc phục những nhược điểm trên. Choi và cộng sự
(1999) phát biểu rằng quá trình xác định các chủng nấm khơng chỉ dựa vào hình thái, tính
năng của quả thể mà còn dựa vào việc phân lập được các bào tử đơn từ việc nuôi cấy quả
thể nấm. Phương pháp này không chỉ tạo ra giống nấm có hệ gen thuần nhất mà cịn hạn
1



chế sự thối hóa giống. Đến nay, một số phương pháp phân lập bào tử đơn đã được phát
triển như phương pháp chụp-thả bào tử (Kang và cs, 2017), phương pháp bắt bào tử bằng
ống mao dẫn (Goh và cs, 1999), hay phương pháp tạo dịch bào tử (QI Tan và cs, 2011).
Trong số đó, phương pháp tạo dịch bào tử được đánh giá có ưu điểm hơn vì có thể thu
được một lượng lớn bào tử. Tuy nhiên, điểm hạn chế của phương pháp này là trong dịch
bào tử có thể tồn tại hệ sợi nấm. Do vậy, cần phát triển một kỹ thuật loại bỏ sợi nấm hay
bất hoạt khả năng phát triển của sợi nấm trong dịch bào tử. Trong nghiên cứu này, chúng
tôi nghiên cứu sử dụng dung dịch khử trùng để loại bỏ/bất hoạt khả năng nảy mầm của
sợi nấm trong dịch bào tử nhằm thu được dịch bào tử thuần.

1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch khử trùng lên khả năng xử lý mẫu.
Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ dịch khử trùng và thời gian khử trùng lên khả năng
xử lý mẫu.
Nghiên cứu ảnh hưởng của loại môi trường tới tốc độ sinh trưởng của sợi nấm hình
thành từ bào tử.
Xây dựng quy trình phân lập nấm Cordyceps militaris

1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Đưa ra được loại dung dịch và thời gian khử trùng thích hợp tới khả năng phát
triển của bào tử nấm và hệ sợi nấm Cordyceps militaris.
Xây dựng được quy trình phân lập bào tử nấm Cordyceps militaris
Tìm ra loại mơi trường thích hợp cho tốc độ sinh trưởng của sợi nấm hình thành từ
bào tử.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1. GIỚI THIỆU NẤM CORDYCEPS MILITARIS
1.1.1. Đặc điểm sinh học, sinh thái, phân bố của nấm Cordyceps militaris
Nấm Đơng trùng hạ thảo (cịn gọi là Đông trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo đông
trùng) là các loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số lồi
cơn trùng. Lồi nấm đầu tiên các nhà khoa học Trung Quốc xác định trên vùng núi trên
cao nguyên Tây Tạng thuộc chi Cordyceps là C. sinensis ký sinh vào ấu trùng của loài
bướm thuộc chi Thitarodes. Năm 1878, các nhà khoa học phát hiện ra loài Cordyceps
militaris cũng ký sinh trên ấu trùng của các lồi cơn trùng thuộc chi Thitarodes (Wang
GD. 1995). Cordyceps militaris là loại nấm được nuôi trên giá thể nhân tạo, mơi trường
dinh dưỡng có thể trên ấu trùng hoặc khơng. Quả thể có kích thước to đều từ trên xuống
dưới, hơi cong, chiều dài khoảng 5cm, có màu vàng cam.

Hình 1.1 Nấm Cordyceps militaris được ni tại phịng thí nghiệm cơng nghệ sinh học
nấm khoa Sinh-mơi trường
Giới: Cordyceps
Ngành: Ascomycota
Ngành phụ: Ascomycotina
Lớp: Ascomycetes/Pyrenomycetes
Phân lớp: Monogononta
Bộ: Hypocreales
Họ: Clavicipitaceae
Loài: Cordyceps milita
3


Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo hay các loài thuộc chi Cordyceps phụ
thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng của môi trường. Chúng thường phân bố ở vùng núi
có độ cao từ 2000-3000m so với mực nước biển. Dựa trên đặc điểm hình thái cũng như
đặc điểm về thơng tin di truyền, các lồi nấm thuộc họ này bao gồm các chi chủ yếu là:
Cordyceps, Elaphocordyceps, Metacordyceps và Ophiocordyceps (Sung và cs, 2007).

Nấm Đông trùng hạ thảo dùng để sản xuất dược liệu được xác định gồm hơn 680 loài
khác nhau, chỉ riêng Trung Quốc đã tìm thấy hơn 60 lồi (Park và cs, 2001). Trong công
bố của các nhà khoa học Hàn Quốc, 25 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Hàn
Quốc được mơ tả đặc điểm hình thái và hình ảnh (Sung và cs, 2000). Và theo một số
nghiên cứu cho thấy, các lồi của chi nấm Cordyceps cịn được tìm thấy ở Thái Lan, Nhật
Bản và Việt Nam (John và cs, 2005). Như vậy, có thể thấy thành phần lồi nấm Đông
trùng hạ thảo khá phong phú ở trên các vùng sinh thái khác nhau và nhiều lồi có phạm vi
phân bố rộng, các lồi có đặc điểm phân bố đặc hữu cho từng vùng.

1.1.2. Chu trình sống của nấm Cordyceps militaris
Giống như hầu hết các loài Cordyceps khác, C. militaris là một lồi nấm ký sinh
trên cơn trùng và ấu trùng của cơn trùng. Lồi này chủ yếu lây nhiễm ở giai đoạn nhộng
củ a các loài bướm khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ vào mùa đơng. Bào tử
nấm theo gió dı́nh vào bên ngồi ký chủ , sau đó từ bào tử hı̀nh thành các ống nảy mầm
có các thể bám. Các ống này tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease là m tan vỏ
ngoài của ký chủ và xâm nhâp vào bên trong cơ thể. Sau đó hê ̣ sơi nấm hút dinh dưỡng
và sinh trưởng mạnh mẽ chiếm tồn bơ cơ thể và gây chết ký chủ. Đến cuối hè hoăc thu
quả thể nhơ ra bên ngồi để phát tán bào tử vào khơng khí (Kobayasi và cs, 1982;
Kamble và cs, 2012). Các quả thể nấm Cordyceps militaris thường có màu vàng nhạt
hoặc màu da cam (Zheng và cs, 2011). Nấm Cordyceps militaris có các dạng bào tử khác
nhau trong chu trı̀nh sống của nấm. Ở các điều kiên môi trường khác nhau, sự hình thành
các dạng bào tử cũng cho thấy sự khác biệt.

1.1.3. Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris
Trong Cordyceps militaris chứa 17 loại axit amin trong số đó có nhiều loại axit
amin mà cơ thể chúng ta không tự tổng hợp được như axit cordiceptic, cordycepin,
adenosin, hydroxyethyl- adenosine…, chúng cịn chứa chất D-mannitol có tác dụng giãn
cơ tim và mạch máu não, giúp máu lưu thông một cách dễ dàng hơn.
4



Các hợp chất chống ung thư: Hợp chất cordycepin (3′-deoxyadenosine) từ nấm cho
thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch (.
Hoạt tính kháng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy chất CM-hs-CPS2 chứa trong
dịch chiết nấm Cordyceps militaris có tính kháng DPPH, hoạt tính khử và tạo phức ở
nồng độ (8mg/m) là 89%, 1,188 và 85% (Shonkor và cs, 2010).
Tăng số lượng tinh trùng: Nghiên cứu trên lợn cho thấy khi dùng chế phẩm từ
Cordyceps militaris số lượng tinh trùng tăng, số phần trăm tinh trùng di động và hình
dạng bình thường tăng. Hiệu quả này được duy trì thậm chí sau 2 tuần ngưng sử dụng chế
phẩm. Lượng Cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian sử dụng chế phẩm nên có khả
năng chất này làm tăng lượng tinh dịch và chất lượng tinh trùng ở lợn (Fengyao và cs,
2011).
Hạn chế virus cúm: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps
militaris ni trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng trong điều trị cúm A.
Chất này góp phần điều hịa hoạt động miễn dịch của các đại thực bào (Lin và cs, 2007)
Kháng khuẩn, kháng nấm và kháng ung thư: protein (CMP) tách chiết từ Cordyceps
militaris có kích thước 12kDa, pI 5,1 và có hoạt tính trong khoảng pH 7-9. Protein này ức
chế nấm Fusariumoxysporum và gây độc đối với tế bào ung thư bàng quang (Seulmee và
cs, 2009). Hợp chất cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn Clostridium. Các
hợp chất dẫn xuất từ nấm được mong đợi ứng dụng trong việc điều trị các bệnh nhiễm
khuẩn đường ruột (Byung-Tae và cs, 2009). Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D
chịu trách nhiệm điều hịa bệnh tiểu đường thơng qua việc ức chế các đáp ứng viêm phụ
thuộc NF-κB, do đó được hi vọng sẽ ứng dụng được như một chất điều hòa miễn dịch
dùng trong điều trị các bệnh về miễn dịch (Young-Joon và cs, 2000).
Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có
hoạt tính gắn fibrin và đo đó xúc tiến việc phân hủy fibrin. Enzyme này có khả năng sử
dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzyme fibrinolytic mạnh khác như
nattokinase và enzyme chiết từ giun đất. Khi enzyme này có thể sản xuất ở quy mô lớn sẽ
là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzyme fibrinolytic giá thành cao hiện đang
được sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở người (Jae-Sung và cs, 2006). Tính kháng viêm: Để

xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch chiết từ quả thể nấm Cordyceps militaris
(CMWE) đã được thử nghiệm về tác dụng kiểm soát lipopolysaccharide (LPS) (chịu
5


trách nhiệm kích thích việc sản xuất nitric oxide), việc giải phóng các yếu tố hoại tử khối
u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) của tế bào RAW 264,7. Các đại thực bào được xử lý
với nồng độ khác nhau của CMWE làm giảm đáng kể LPS, TNF- α và IL-6 và mức độ
giảm theo nồng độ của dịch chiết. Những kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng
ức chế mạnh đến việc sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào (Wol và cs, 2010).

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT CORDYCEPS MILITARIS
HIỆN NAY
1.2.1. Trên thế giới
Hiện nay trên thế giới có nhiều nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm phân lập bào tử
nấm để khảo sát sự phát triển của nấm Cordyceps militaris.
Vào năm 2013, K.ZHANG và cộng sự đã nghiên cứu một giao thức thích hợp hóa
phân lập bào tử đơn cho nấm. Ở đây mẫu khử trùng bề mặt nhẹ nhàng bằng dung dịch
đệm với 75% ethanol, nghiền thành từng mảnh bằng cách sử dụng thêm kẹp và chuyển
vào nước khử trùng trong ống ly tâm. Ống ly tâm được đậy nắp nhanh chóng và khuấy
với xốy để thu được huyền phù bào tử đồng nhất. Sau đó được chuyển vào đĩa vật liệu
bằng micropipette trong tủ cấy. Sau đó, đĩa petri được ủ dưới nhiệt độ phòng (khoảng 25
° C). Thời gian ủ phụ thuộc vào tính năng nảy mầm của các loại nấm khác nhau
(K.Zhang, 2013)
Trong nghiên cứu của God (1999), bào tử nấm được bắt và phân lập bằng ống mao
dẫn tự tạo từ 2 ống thủy tinh rỗng. Hai đầu của hai ống thủy tinh khác nhau se cho chạm
vào nhau và cùng được đốt nóng trên ngọn lửa đèn cồn. Sau khi chúng bị nóng chảy ra thì
lập tức kéo hai ống ra xa nhau để tạo thành một đoạn ống dài và cực nhỏ. Theo nghiên
cứu cho thấy chiều dài ống mao dẫn lý tưởng là 2cm, khơng bị cong và tịt đầu. Quy trình
sử dụng ống mao dẫn tự chế trong thao tác phân lập bào tử nấm được trình bày rất chi tiết

trong nghiên cứu này. Các ví dụ phân lập bào tử nấm thành công bằng phương pháp này
đã được đưa ra và thảo luận. Gol cũng đưa ra kết luận tỉ lệ nảy mầm của bào tử phụ thuộc
vào từng loại nấm (Goh, 1999).
Năm 2005, Sandra C. Stringer đã thực hiện thí nghiệm chuẩn bị dịch bào tử và xác
định sự phân bố thời gian để đưa ra các giai đoạn nảy mầm của nấm Clostridium
botulinum như sau: Thu quả thể nấm, thêm 20ml nước muối vô trùng 0,85%, ủ trong 7
6


ngày ở 30 độ C sau đó đem ly tâm (6000 vòng, 4 độ, 15 phút), thu dịch bào tử và siêu âm
trong 5 phút nhằm phá vỡ các cụm bào tử , tiếp tục rửa sạch trong nước muối để thu được
dịch bào tử. Bào tử sau khi cấy chuyển vào môi trường agar và được quan sát dưới kính
hiển vi. Sau khi quan sát ở các giai đoạn thời gian khác nhau Sandra C. Stringer đưa ra
kết luận sự phân bố thời gian ảnh hưởng đáng kể đến giai đoạn nảy mầm của sợi nấm (
Sandra C. Stringer và cs, 2005)
1.2.2. Việt Nam
Hiện nay, nấm Cordyceps militaris ở nước ta chủ yếu tập trung nghiên cứu quy trình
sản xuất, đánh giá giá trị dược liệu nhưng trong việc nhân giống nấm vẫn chưa được đầu
tư và phát triển nhiều.
Ở một số bài báo được đăng trước đó, các tác giả đưa ra được một số quy trình phân
lập bào tử thực hiện theo tài liệu tham khảo nước ngồi nhằm mục đích định danh các
chủng nấm Cordyceps.spp ngồi tự nhiên như bài báo của Nguyễn Thị Thanh Lan đã
phân lập theo phương pháp của Choi và cs (1999), để phục vụ cho quá trình định danh
chủng nấm Cordyceps.spp thu tại vườn quốc gia Pù Mát, Nghệ An (Nguyễn Thị Thanh
Lan, 2016)
Nguyễn Đình Sỹ và cs đã sử dụng Javel ở các nồng độ khác nhau để khử trùng mầm,
chồi từ cây trưởng thành của một số giống điều. Kết quả cho thấy các mẫu khử trùng có tỉ
lệ nhiễm 100% sau 6 ngày ở tất cả các nồng độ Javel đã được sử dụng là 20%, 30%, 40%.
Tỉ lệ mẫu nhiễm thấp nhất (27%), tỉ lệ mẫu nhiễm cao nhất (63%) khi cành non phát triển
trong mùa khô thu được sau 30 ngày xử lý với Javel 30%, trong thời gian 40 phút (2008).

Tại hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần 7 năm 2017
Nguyễn Thị Thanh Mai đã đưa ra các dẫn chứng chứng minh ni cấy lỏng có thể tạo ra
nguồn sản phẩm sinh khối cao hơn trong cùng một diện tích sử dụng và với thời gian
ngắn hơn (Nguyễn Thị Thanh Mai và cs, 2017).
Trong q trình ni trồng nấm thì sự thối hóa của hệ sợi nấm ảnh hưởng rất nhiều
đến chất lượng quả thể. Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp phân lập bằng
mô tế bào thì trong thời gian gần đây có nhiều nghiên cứu ứng dụng bào tử nấm để thay
thế cho mô tế bào. Với ưu điểm giống nấm tạo ra từ bào tử đơn có hệ gen thuần
nhất,giảm thời gian thối hóa giống. Trái với giống phân lập bằng mơ tế bào hiện tượng
thối hóa xuất hiện ở thế hệ thứ 2 giống từ bào tử đơn đến thế hệ thứ 5 mới bước vào giai
7


đoạn thối hóa và dấu hiệu thối hóa chỉ xuất hiện rõ ở thế hệ thứ 8 ( Nhóm nghiên cứu
thuộc viện nghiên cứu và ứng dụng khoa học công nghệ cao thuộc Trường Đại học Đà
Lạt, 2016; Bhushan Shrestha và cs 2012) Hơn nữa, việc nhân giống bào tử đơn hạn chế
hiện tượng bị lẫn hay nhiễm tạp các chủng loại vi sinh vật, các giống nấm khác và có khả
năng thích nghi với nhiều điều kiện mơi trường. Do đó, việc nghiên cứu ni trồng
Cordyceps militaris bằng phương pháp nhân giống bào tử đơn giúp duy trì chất lượng
giống là rất cần thiết để bảo tồn được nguồn gen ban đầu và cung cấp nguyên liệu phục
vụ cho các quá trình nghiên cứu sau.

1.3. GIỚI THIỆU VỀ BÀO TỬ
Bào tử là đơn vị sinh sản vơ tính có thể được tồn tại và phát triển do sự phân tán
trong cả những khoảng thời gian kéo dài, trong những điều kiện không thuận lợi. Bào tử
được sinh ra trong chu trình sống của thực vật, nấm, tảo,… Ở nấm, bào tử chia thành hai
loại bào tử là bào tử vơ tính và bào tử hữu tính.
Bào tử của Cordyceps militaris thuộc bào tử túi. Sinh sản ở cả hai hình thức vơ tính
và hữu tính được sinh ra từ các sợi nấm đơn nhân khác nhau sinh ra các thể sinh túi và
các túi đực. Ở hình thức sinh sản hữu tính từ túi đực mọc ra các sợi thụ tinh vươn đến thể

sinh túi để thực hiện quá trình trao đổi nguyên sinh chất. Từ thể sinh túi đã trao đổi
nguyên sinh chất sẽ mọc ra các sợi sinh túi. Đầu sợi này mọc ra phần móc câu. Trong
móc xảy ra sự phân bào giảm nhiễm để tạo thành 4 nhân con. Sau đó tách thành 3 tế bào.
Tế bào ở ngọn và ở gốc sẽ nối với nhau. Sợi nấm gồm các tế bào song nhân này được gọi
là sợi phát triển. Tế bào giữa sẽ phát triển lên thành tế bào mẹ của túi. Xảy ra sự kết hợp
nhân để tạo thành nhân tiếp hợp lưỡng bội. Sau đó xảy ra liên tiếp 2 lần phân bào giảm
nhiễm và một lần phân bào nguyên nhiễm để tạo ra 8 nhân con đơn bội. Mỗi nhân này về
sau phát triển lên thành 1 bào tử túi nằm trong túi. Túi ngồi hình viên trụ cịn có thể có
hình cầu , hình chùy…Vỏ túi gồm 2 lớp, lớp ngồi thường mỏng cà khơng thấm nước,
lớp trong thấm nước. Nếu lớp vỏ trong dày thì là loại khi túi mở lớp vỏ trong bong ra
khỏi lớp vỏ ngoài. Loại khác có lớp vỏ trong mỏng dính chặt vào lớp vỏ ngồi và khơng
bong ra khi túi mở.

8


1.4 CƠ CHẾ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI DUNG DỊCH KHỬ TRÙNG
TỚI KHẢ NĂNG XỬ LÝ HỆ SỢI VÀ BÀO TỬ NẤM.
Javel(NaClO) là hợp chất tính oxi hóa mạnh, HCl là hợp chất có tính axit mạnh. Vì
vậy cả hai dung dịch này đều có khả năng phá vỡ được cấu trúc sinh học của vi sinh vật
trong đó bao gồm các tế bào nấm. Quá trình tiêu diệt tế bào xảy ra qua hai giai đoạn: đầu
tiên chất khử trùng khuếch tán xuyên qua vỏ tế bào, sau đó phản ứng với các men bên
trong tế bào, phá hoạt quá trình trao đổi chất dẫn đến diệt vong tế bào. Tốc độ của quá
trình khử trùng tăng khi nồng độ của chất khử trùng và nhiệt độ nước tăng đồng thời phụ
thuộc vào dạng không phân li của chất khử trùng, vì quá trình khuếch tán qua vỏ tế bào
xảy ra nhanh hơn quá trình phân ly. Tốc độ khử trùng giảm đi rất nhiều khi trong nước có
các chất hữu cơ , cặn lơ lửng và các chất khử khác đồng thời trong quá trình xử lý dịch
chiết của nấm dung dịch khử trùng giúp làm kháng khuẩn, loại cặn bẩn.

9



CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Quả thể nấm Đông trùng hạ thảo có tên khoa học là Cordyceps militaris, thuộc họ
Cordycipitaceae, bộ Hypocreales được ni tại phịng cơng nghệ sinh học nấm khoa sinh
– môi trường, đại học Sư Phạm- Đại học Đà Nẵng.

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Phương pháp chuẩn bị dịch bào tử
Thu phần đầu quả thể nấm cordyceps militaris vào ống eppendorf. Hút 1ml nước cất
vô trùng cho vào ống eppendorf, dùng chày nghiền mẫu nghiền nát mẫu. Sau đó ly tâm
mẫu ở tốc độ 11000 vịng/phút trong 15 phút, loại bỏ phần dịch nổi phía trên. Hình thái
và kích thước bào tử được quan sát và đo bằng kính hiển vi hai mắt ZEISS Thêm 1ml
dung dịch khử trùng, đảo và khuấy nhẹ trong khoảng thời gian cần khảo sát. Tiếp tục ly
tâm 11000 vòng/15 phút rồi thu phần lắng. Sau khi ly tâm với nước cất lần 2 ta thu được
dịch bào tử đã được xử lý qua dung dịch khử trùng.

2.2.2. Phương pháp xác định dịch khử trùng
Thí nghiệm xác định dịch khử trùng được thực hiện với các loại dung dịch HCl
(0,1N, 0,2N, 0,3N) và nước javen (1%, 3%, 5%). Nước cất được sử dụng làm mẫu đối
chứng. Mẫu nghiền được ngâm trong các loại dung dịch khử trùng với thời gian 10 phút.
Sau khi xử lý, tiến hành cấy trans 20µm dịch bảo tử lên môi trường nước agar (WA),
nuôi trong điều kiện tối ở 22ºC. Tỷ lệ nảy mầm của bào tử và hệ sợi nấm được xác định
sau 24 giờ nuôi cấy và tiếp tục quan sát trong 24 giờ tiếp theo để quan sát sự phát triển
của bào tử, quan sát dưới kính soi nổi ZEISS Stemi 508 Apochromatic Compact. Đánh
giá ảnh hưởng của loại dung dịch khử trùng dưới các chỉ tiêu sau:
- Tỉ lệ phát triển của hệ sợi

- Tỉ lệ nảy mầm của bảo tử

10


2.2.3. Phương pháp xác định nồng độ dịch khử trùng và thời gian khử trùng
lên thời gian xử lý mẫu
Sau khi xác định được loại dịch khử trùng thích hợp nhất tôi tiếp tục khảo sát nồng
độ và thời gian nảy mầm của bào tử và hệ sợi trên loại dịch khử trùng đó. Thí nghiệm
được thực hiện trên các nồng độ và thời gian xử lý mẫu khác nhau. Sau khi xử lý, tiếp tục
tiến hành cấy dịch bảo tử lên môi trường nước agar (WA), nuôi trong điều kiện tối ở
22ºC. Tỷ lệ nảy mầm của bào tử và hệ sợi nấm được xác định sau 3 - 4 ngày ni, quan
sát dưới kính soi nổi ZEISS Stemi 508 Apochromatic Compact. Đánh giá ảnh hưởng của
loại dung dịch khử trùng dưới các chỉ tiêu sau:
- Tỉ lệ phát triển của hệ sợi
- Tỉ lệ nảy mầm của bào tử

2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi tới khả năng phát triển của
sợi nấm phát sinh từ bào tử đơn.
Thí nghiệm được tiến hành với bốn loại mơi trường dinh dưỡng: PDA (Potato dextrose
agar), CDA (Czapek-dox agar), TH (tổng hợp), SDAY1 (Sabouraud dextrose agar plus
yeast extract) (bảng 1). Môi trường nuôi hấp được khử trùng ở điều kiện: 121ºC, 1 atm
trong 20 phút. Bào tử vừa nảy mầm được chuyển vào các loại mơi trường thí nghiệm (1
bào tử/đĩa) để tiến hành khảo sát sự sinh trưởng của hệ sợi nấm. Bào tử được nuôi dưới
điều kiện tối ở nhiệt độ 22ºC trong 21 ngày. Tốc độ sinh trưởng của sợi nấm được xác
định thơng qua đường kính hệ sợi ở các ngày nuôi thứ 9, 12, 15, 18 và 21.
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng của môi trường PDA, CDA, SDAY1 và TH (trong 1
lít mơi trường).
Dinh dưỡng


PDA

CDA

SDAY1

TH

Agar (g/l)

20

20

20

20

Khoai tây (g/l)

200

-

-

-

Glucose (g/l)


20

-

40

20

Saccharose (g/l)

-

30

-

-

11


Cao nấm men (g/l)

-

-

2

2,5


Peptone (g/l)

-

-

10

2,5

KH2PO4 (g/l)

-

-

-

0,25

K2HPO4 (g/l)

-

1

-

-


MgSO4.7H2O (g/l)

-

0,5

-

0,5

KCl (g/l)

-

0,5

-

-

FeSO4.7H2O (g/l)

-

0,01

-

-


NaNO3 (g/l)

-

2

-

-

12


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. HÌNH THÁI BÀO TỬ
Bào tử nấm C. militaris có dạng hình oval với đường kính 3,122 ± 0,45µm (Hình
1A). Các bào tử bắt đầu nảy mầm sau 24 giờ trong môi trường WA, agar được thêm vào
môi trường để giữ các cá thể bào tử ở một vị trí cố định. Thời gian một bào tử đính trong
mơi trường thạch tồn tại lâu hơn các bào tử tự do trong nước (Stringer và cs, 2005). Kết
quả này cũng tương tự như trong kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Lan & cs đã
quan sát hình thái bào tử nấm từ chủng B6 được phân lập từ mẫu nấm Cordyceps.spp
ngoài tự nhiên thu ở Vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An (Nguyễn Thị Thanh Lan và cs,
2016). Hình ảnh bào tử nảy và mầm được mơ tả ở hình 1B. Sợi nấm hình thành đơn
hướng bắt đầu từ bào tử và phát triển chiều dài sau khoảng 36 giờ nuôi cấy. Kết quả quan
sát này tương tự với kết quả của Bhushan và cs khi quan sát đặc điểm hình thái của bào
tử qua các giai đoạn trưởng thành của nấm Cordyceps militaris. Bhushan đã đưa ra hình
ảnh và nhận xét cho thấy sợi nấm hình thành từ bào tử dài từ 2-8um và xuất hiện trong
khoảng thời gian từ 36 đến 48 giờ, bào tử nảy mầm nảy mầm càng nhiều thì hệ sợi càng
phát triển (Bhushan và cs, 2005).


Hình 3.1: Hình thái bào tử (A), sử nảy mầm của bảo tử (B)
13


3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI DỊCH KHỬ TRÙNG LÊN KHẢ NĂNG KHẢ
NĂNG NẢY MẦM CỦA HỆ SỢI VÀ BÀO TỬ
3.2.1. Ảnh hưởng của loại dung dịch khử trùng lên khả năng phát triển của hệ
sợi
Kết quả nghiên cứu cho thấy, các loại dung dịch khử trùng có ảnh hưởng khác nhau
đến khả năng nảy mầm của cả bào tử và sự phát triển hệ sợi nấm . Hệ sợi nấm bị bất hoạt
hoàn toàn trong dung dịch Javel ( tỷ lệ nảy mầm bằng 0%) và 99,77 % trong dung dịch
HCl 0,1N (tỷ lệ nảy mầm chỉ đạt 0,23 ± 0,1%). Trong khi đó, trong mơi trường nước cất,
tỷ lệ phát triển của hệ sợi được ghi nhận lên đến 2,01 ± 0,96%.

Hình 3.2. Ảnh hưởng dung dịch khử trùng lên khả năng phát triển của hệ sợi

3.2.2. Ảnh hưởng của loại dung dịch khử trùng lên khả năng nảy mầm của
bào tử
Đối với bào tử nấm, tỷ lệ nảy mầm cao nhất 18,54 ± 10,68% trong môi trường đối
chứng sử dụng nước cất (Hình 3.2). Khi tăng nồng độ HCl thì tỉ lệ nảy mầm của bào tử
giảm. Ở nồng độ HCl 0.3N, khả năng nảy mầm của bào tử đạt 0,64 ± 0,34% và ức chế sự
phát triển của hệ sợi. Bào tử bị bất hoạt hoàn toàn ở các nồng độ của dung dịch Javen.
Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu sử dụng Javen xử lý mẫu của Nguyễn
Đình Sỹ và cộng sự (2008). Mẫu có tỷ lệ nhiễm thấp nhất (27%) khi sử dụng Javen ở
nồng độ cao nhất (30%). Năm 2014, Khi thực hiện thí nghiệm ni cấy mơ lá đinh lăng
14


Nguyễn Trung Hậu và cs đã nghiên cứu về nồng độ chất khử trùng javel và thời gian khử

trùng mẫu lên lá cây đinh lăng. Kết quả thu được với nồng độ javel 50% và thời gian khử
trùng mẫu 10 phút có tỉ lệ mẫu chết 4,7% và tỷ lệ mẫu sống vô trùng là 96,3% đạt hiệu
quả tốt nhất trong q trình khử trùng mẫu so với các cơng thức khác . Nồng độ javen
50%, khử trùng mẫu trong 10 phút thích hợp cho khử trùng mẫu lá cây đinh lăng còn ở
nồng độ Javel 100% mẫu chết và bất hoạt hồn tồn. Như vậy, có thể kết luận Javen có
tính chất tẩy rửa cao, dù ở nồng độ rất nhỏ javel cũng có khả ức chế sự nảy mầm của hệ
sợi lẫn bào tử nấm. Từ kết quả về ảnh hưởng của dung dịch khử trùng lên sự phát triển
của hệ sợi nấm và nảy mầm bào tử nấm, có thể nhận định rằng việc sử dụng HCl với
nồng độ phù hợp cho phép chúng ta thu được dịch bào tử khơng cịn lẫn hệ sợi.

Hình 3.3: Ảnh hưởng của loại dung dịch khử trùng đến khả năng nảy mầm của bào tử

3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ HCL VÀ THỜI GIAN XỬ LÝ TỚI KHẢ
NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA HỆ SỢI VÀ NẢY MẦM BÀO TỬ NẤM.
Tỷ lệ nảy mầm của hệ sợi tỉ lệ nghịch với nồng độ dung dịch HCl và thời gian khử
trùng mẫu (Hình 4). Đối với nồng độ HCl 0.1N và HCl 0.2N, tỷ lệ nảy mầm của hệ sợi là
cao nhất ở nghiệm thức 5 phút khử trùng mẫu (đạt 5,79 ± 0,735% và 4,16 ± 2,432%),
thấp nhất ở thời gian 20 phút khử trùng mẫu (đạt 0,475 ± 0,219 và 0,415 ± 0,148%). Tuy
nhiên ở nồng độ HCl 0,3N hệ sợi nảy mầm ở các khoảng thời gian 5 và 10 phút xử lý ban
đầu (tỷ lệ đạt 7,585 ± 0,87% và 0,378 ± 0,382%). Khi tăng dung dịch khử trùng lên nồng
độ 0,4N, hệ sợi nấm không thể phát triển khi được xử lý trong khoảng thời gian lớn hơn
15