ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC ỨC CHẾ NẤM PHYTOPHTHORA SP.
GÂY BỆNH SƯƠNG MAI TRÊN CÂY CÀ CHUA CỦA
VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS

VÕ LƯƠNG Ý NHI

Đà Nẵng, năm 2020


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC ỨC CHẾ NẤM PHYTOPHTHORA SP.
GÂY BỆNH SƯƠNG MAI TRÊN CÂY CÀ CHUA CỦA
VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS

Ngành: Cơng nghệ sinh học
Khóa: 2016-2020
Sinh viên: Võ Lương Ý Nhi
Người hướng dẫn: ThS. Lê Vũ Khánh Trang

Đà Nẵng, năm 2020
i


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực. Đây là kết quả
nghiên cứu của tác giả và chưa từng được công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác trước đây.
Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức khoa học.
Đà Nẵng, tháng 07 năm 2020
Sinh viên thực hiện

Võ Lương Ý Nhi

i


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới ThS. Lê
Vũ Khánh Trang đã định hướng nghiên cứu, sửa khóa luận và tạo mọi điều kiện cho tơi trong
q trình thực hiện đề tài này.
Tơi xin cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm
Đà Nẵng đã tạo điều kiện và giúp đỡ cho tơi trong q trình nghiên cứu cũng như chia sẻ
những kinh nghiệm chuyên môn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình bạn bè đã giúp đỡ, tạo điều
kiện, động viên trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp này.
Đà Nẵng, tháng 07 năm 2020
Sinh viên thực hiện

Võ Lương Ý Nhi


ii


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI .................................................................................. 1
2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI ...................................................................................................... 2
3. Ý NGHĨA ĐỀ TÀI......................................................................................................... 2
3.1. Ý nghĩa lý luận ........................................................................................................ 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................................... 2
4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .......................................................................................... 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 4
1.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM PHYTOPHTHORA SP. GÂY BỆNH SƯƠNG MAI TRÊN
CÂY CÀ CHUA ................................................................................................................ 4
1.1.1. Tổng quan về nấm bệnh Phytophthora sp. ............................................................ 4
1.1.2. Triệu chứng bệnh sương mai trên cây cà chua....................................................... 5
1.2. VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG ...................................................................................... 6
1.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS ......................................... 7
1.4. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU............................................................... 9
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................................ 9
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................................ 10
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................ 11
2.1. VẬT LIỆU ................................................................................................................ 11
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................. 11
2.2.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................. 11
2.2.2. Phương pháp ....................................................................................................... 13
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................ 17
3.1. SÀNG LỌC KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA SP. TỪ CÁC THÀNH
PHẦN TRONG CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS . 17

3.2. ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA SP. TỪ CÁC THÀNH
PHẦN TRONG CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS . 18
3.2.1. Đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp. từ tế bào vi
khuẩn B. velezensis ....................................................................................................... 18
iii


3.2.2. Đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp. từ dịch ngoại
bào của vi khuẩn B. velezensis ...................................................................................... 22
3.2.3. Đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp. từ các thành
phần phi enzyme trong dịch ngoại bào .......................................................................... 24
3.2.4. Đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp. từ enzyme ngoại
bào của vi khuẩn B. velezensis ...................................................................................... 26
3.2.5. Kết luận .............................................................................................................. 27
3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS
VELEZENSIS ................................................................................................................... 28
3.3.1. Khả năng sinh enzyme protease .......................................................................... 28
3.3.2. Khả năng sinh enzyme chitinase ......................................................................... 29
3.3.3. Khả năng sinh enzyme cellulase ......................................................................... 29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 31
1. Kết luận ....................................................................................................................... 31
2. Kiến nghị ..................................................................................................................... 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 33
PHỤ LỤC ........................................................................................................................... 38

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
B. subtilis


Bacillus subtilis

B. velezensis

Bacillus velezensis

FAO

Foods and Agriculture Organization

LB

Luria-Bertani

MMHL

Minimal Medium recommended by Hsu and Lockwood

OD

Optical Density

PCA

Plate Count Agar

PDA

Potato Dextrose Agar


PSM

Môi trường chọn lọc Phytophthora

SD

Standard Deviation

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng

Tên bảng

Trang

3.1

Hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bệnh từ sinh khối tế bào
không gia nhiệt

19

3.2

Hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bệnh từ sinh khối tế bào

gia nhiệt ở 55°C

20

3.3

Hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bệnh từ dịch ngoại bào

22

3.4

Hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bệnh từ các thành phần
phi enzyme trong dịch ngoại bào

24

3.5

Hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bệnh từ dịch enzyme
ngoại bào

26

3.6

Hiệu lực kháng nấm cao nhất của các thành phần trong canh
trường nuôi cấy vi khuẩn B. velezensis sau 5 ngày

27


vi


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Bào tử của nấm bệnh Phytophthora sp.

5

1.2

Hình thái khuẩn lạc và bào tử vi khuẩn B. velezensis

8

2.1

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

12

3.1


Khả năng kháng nấm Phytophthora sp. của các thành phần trong
canh trường nuôi cấy vi khuẩn B. velezensis

17

3.2

Khả năng đối kháng nấm từ tế bào không gia nhiệt của vi khuẩn B.
velezensis sau 7 ngày ở các nồng độ

19

3.3

Khả năng đối kháng nấm từ tế bào được gia nhiệt ở 55°C của vi khuẩn
B. velezensis sau 7 ngày ở các nồng độ

21

3.4

Khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp. từ dịch ngoại bào của vi
khuẩn B. velezensis sau 7 ngày ở các nồng độ

23

3.5

Khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp. bằng dịch phi enzyme của

vi khuẩn B. velezensis sau 7 ngày ở các nồng độ

25

3.6

Khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp. từ dịch enzyme sau 7
ngày ở các nồng độ

26

3.7

Vi khuẩn B. velezensis phân giải casein

29

3.8

Vi khuẩn B. velezensis phân giải huyền phù chitin

29

3.9

Vi khuẩn B. velezensis phân giải CMC

30

vii



TĨM TẮT
Vi khuẩn Bacillus velezensis, thuộc nhóm vi khuẩn Bacillus subtilis, hiện nay đang được
quan tâm nghiên cứu bởi có nhiều tiềm năng trong việc ứng dụng sản xuất các chế phẩm sinh
học phòng trừ bệnh hại và giúp tăng năng suất cho cây trồng. Trong nghiên cứu của Hứa Thị
Vy (2019) đã phân lập được chủng vi khuẩn B. velezensis có khả năng đối kháng mạnh với
nấm Phytophthora sp. với hiệu lực đối kháng lên đến hơn 80%. Do đó, nghiên cứu này tiếp
tục được thực hiện để sàng lọc và đánh giá các thành phần từ canh trường ni cấy vi khuẩn
B. velezensis có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp. gây bệnh sương mai
trên cây cà chua với mục đích phát triển và đa dạng hóa các sản phẩm chế phẩm sinh học từ
vi khuẩn B. velezensis. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy các thành phần từ canh trường nuôi
cấy vi khuẩn B. velezensis bao gồm tế bào vi khuẩn, dịch ngoại bào, dịch enzyme và các thành
phần phi enzyme đều có khả năng đối kháng với nấm bệnh Phytophthora sp.. Hơn nữa, khả
năng đối kháng của tế bào vi khuẩn và dịch ngoại bào với nấm bệnh Phytophthora sp. là rất
mạnh thể hiện qua hiệu lực ức chế nấm lần lượt là 84,44% và 80% sau 5 ngày. Ngoài ra,
nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn B. velezensis cịn có khả năng sinh ra các enzyme ngoại bào
như protease, chitinase và cellulase, đây là những enzyme đóng vai trị quan trọng trong việc
phá hủy thành tế bào nấm bệnh Phytophthora sp.. Hiệu lực đối kháng mạnh với nấm bệnh
được chứng minh trong nghiên cứu này sẽ góp phần phát triển ứng dụng sản xuất các loại chế
phẩm sinh học từ chủng vi khuẩn Bacillus velezensis phục vụ vào cơng cuộc phịng trừ bệnh
sương mai ở cây trồng nói chung và cây cà chua nói riêng, hướng đến một nền nơng nghiệp
xanh và bền vững.

viii


MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) thuộc họ cà (Solanaceae) là loại cây phổ biến

trên thế giới, rất được ưa chuộng bởi giá trị dinh dưỡng và mang lại hiệu quả kinh tế cao. Ở
Việt Nam, cà chua được trồng từ rất lâu và nó là loại rau ăn quả được nhà nước ưu tiên phát
triển. Năm 2010 diện tích cà chua khoảng 17,6 nghìn ha, năng suất đạt 11,6 tấn/ha (theo FAO).
Tuy nhiên việc sản xuất cà chua còn nhiều hạn chế do năng suất và chất lượng cà chua trong
nước còn thấp so với thị trường nước ngồi. Ngun nhân chính là do giống có năng suất thấp
cùng với khí hậu nước ta dễ dàng tạo điều kiện thuận lợi cho một số loại bệnh trên cây phát
triển, chủ yếu là các bệnh do vi sinh vật gây ra như: bệnh héo xanh, bệnh đốm vi khuẩn, bệnh
đốm quả, bệnh sương mai...
Bệnh sương mai là loại bệnh phổ biến thứ hai trên cây cà chua, gây ra nhiều ảnh hưởng
như làm giảm năng suất và chất lượng cà chua. Tác nhân chính gây bệnh là do nấm
Phytophthora sp.. Hiện nay người ta thường sử dụng các loại thuốc hóa học để diệt nấm nhưng
biện pháp này thường để lại một số hậu quả như: diệt hết tất cả các vi sinh vật có lợi trong đất
làm mất cân bằng hệ vi sinh, tạo điều kiện cho các loài gây hại phát triển, dư lượng thuốc diệt
nấm làm ô nhiễm nguồn đất, nước, gây hại đối với sức khỏe của người... Do đó việc sử dụng
biện pháp sinh học để thay thế biện pháp hóa học đang được nhiều nhà khoa học quan tâm.
Một trong những biện pháp sinh học được ứng dụng nhiều đó là việc sử dụng các chế phẩm
sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn để đối kháng nấm bệnh.
Hiện nay, có rất nhiều chủng vi khuẩn đối kháng như Pseudomonas, Bacillus… đã và
đang được nghiên cứu vì chúng có khả năng tổng hợp được một số hợp chất ngoại bào ức chế
sự phát triển của nấm bệnh gây hại cho cây trồng. Trong đó chủng Bacillus sp. được đánh giá
là có khả năng kiểm sốt nấm Phytophthora sp. gây bệnh sương mai cho cây trồng rất tốt.
Trong nghiên cứu của Hứa Thị Vy (2019) đã phân lập và tuyển chọn được 21 chủng vi khuẩn
có khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp. gây bệnh sương mai từ các vùng đất trồng
cà chua của thành phố Đà Nẵng. Trong đó có chủng vi khuẩn kí hiệu VK15 có khả năng tiêu
diệt nấm gây bệnh mạnh nhất và đã được xác định đó là lồi Bacillus velezensis (B. velezensis).
1


Trong công nghiệp sản xuất các loại chế phẩm sinh học thì điều quan trọng là cần phải
xác định được cơ sở khoa học của việc ứng dụng vi sinh vật đối kháng, ví dụ như xác định

được các cơ chế, con đường và những thành phần có thể đối kháng mầm bệnh hại của vi sinh
vật đối kháng để làm nền tảng cho việc sản xuất các loại chế phẩm sinh học đa dạng hơn. Do
vậy, đề tài: “Đánh giá hiệu lực ức chế nấm Phytophthora sp. gây bệnh sương mai trên cây
cà chua của vi khuẩn Bacillus velezensis” được thực hiện để tìm ra thành phần nào của canh
trường ni cấy vi khuẩn có khả năng kháng nấm bệnh Phytophthora sp. ở cây cà chua mạnh
nhất, làm cơ sở để sản xuất các chế phẩm Bacillus sp. ứng dụng trong nông nghiệp, hướng
đến sự phát triển của một nền nông nghiệp xanh và bền vững.

2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Sàng lọc và đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển nấm Phytophthora sp. gây bệnh sương
mai trên cây cà chua của các thành phần trong canh trường nuôi cấy vi khuẩn B. velezensis để
tìm ra được thành phần nào tiềm năng nhất trong việc sản xuất chế phẩm vi sinh.

3. Ý NGHĨA ĐỀ TÀI
3.1. Ý nghĩa lý luận
Đề tài sẽ cung cấp những luận cứ và cơ sở khoa học về việc ứng dụng vi sinh vật đối
kháng trong phịng chống bệnh sương mai trên cây trồng nói chung, cây cà chua nói riêng. Cụ
thể là việc sử dụng các thành phần trong canh trường nuôi cấy của vi khuẩn B. velezensis để
đối kháng với nấm bệnh Phytophthora sp.. Từ đó chọn ra thành phần có hiệu lực ức chế nấm
cao nhất để làm cơ sở sản xuất các sản phẩm chế phẩm sinh học.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học cho việc sản xuất các chế phẩm sinh học
từ vi khuẩn B. velezensis trong lĩnh vực phòng ngừa dịch bệnh cho cây trồng tại địa phương,
góp phần nâng cao năng suất cây trồng, xây dựng một nền nông nghiệp sạch và bền vững.

4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Sàng lọc khả năng kháng nấm Phytophthora sp. gây bệnh sương mai trên cây cà chua
từ các thành phần trong dịch ni cấy vi khuẩn B. velezensis ở điều kiện phịng thí nghiệm.
2



- Đánh giá khả năng kháng nấm Phytophthora sp. gây bệnh sương mai trên cây cà chua
từ các thành phần trong dịch nuôi cấy vi khuẩn B. velezensis ở điều kiện phịng thí nghiệm.
- Khảo sát khả năng sinh một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn B. velezensis.

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM PHYTOPHTHORA SP. GÂY BỆNH SƯƠNG MAI
TRÊN CÂY CÀ CHUA
1.1.1. Tổng quan về nấm bệnh Phytophthora sp.
a. Đặc điểm sinh thái của nấm bệnh Phytophthora sp.
Phytophthora sp. là tác nhân gây bệnh sương mai trên cây cà chua, chúng phát tán bào
tử trong gió từ cây này sang cây khác. Nấm sinh sản theo hai hình thức là vơ tính và hữu tính,
trong đó phương thức sinh sản vơ tính là quan trọng nhất bằng cách phát tán bào tử. Nếu nhiệt
độ môi trường nằm trong khoảng từ 20 – 24°C thì bào tử nấm sẽ nảy mầm trực tiếp tạo thành
sợi nấm xâm nhập vào tế bào mô cây. Bệnh lan truyền từ cây này sang cây khác do gió hoặc
có thể do nước rửa trơi bào tử từ nơi này sang nơi khác. Nếu vườn cà chua được bón đạm
nhiều, mất cân đối hoặc trồng quá dày, tiêu thoát nước kém, trồng liên tục khơng có thời vụ
rõ ràng, xen kẽ, không phân khu vực là những điều kiện thuận lợi để bệnh phát sinh và phát
triển (Phan Thúy Hiền và cs, 2009).

b. Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora sp.
Nấm Phytophthora sp. là nấm ký sinh chuyên tính, sống trong tế bào thực vật tạo thành
những vòi hút sinh sản vơ tính chủ yếu tạo bào tử phân sinh (conidi) trên các cành conidi đâm
nhánh hơi phình rộng. Cành conidi tương đối dài, conidi đơn độc hình trứng hay hình quả
chanh. Chỉ có một conidi trên đỉnh nhánh tạo cho bề mặt của bộ phận bị bệnh có màu trắng
rất dễ nhận dạng (William W. Kirk và cs, 2009).


4


Hình 1.1. Bào tử của nấm bệnh Phytophthora sp. (Hứa Thị Vy, 2019)
Hình thức sinh sản của nấm Phytophthora sp. quyết định đến khả năng phát dịch. Theo
nghiên cứu của Andre và David (2004) cho thấy chu kỳ sống của nấm Phytophthora sp. có
thể bao gồm tới 3 dạng sinh sản vơ tính – bào tử nang, du động bào tử, hậu bào tử và bào tử
noãn với dạng sinh sản hữu tính. Sợi nấm sinh dưỡng lưỡng bội sản sinh ra bào tử nang vơ
tính mà có thể nảy mầm trực tiếp hoặc có thể phân chia để sản sinh ra các bào tử động, mỗi
bào tử động trải qua một quá trình lan truyền và bơi vào nang trước khi nảy mầm.
Kết quả của Letter W. Burgess (2008) cho rằng Phytophthora sp. thuộc lớp nấm trứng,
không phải nấm thực và sinh sản ra di động bào tử. Vì vậy, phòng trừ nấm này khác với phòng
trừ các bệnh do nấm thực gây ra và các thuốc dùng trong phòng trừ cũng khác. Theo tác giả,
các bệnh do nấm này gây hại cho cây lâu năm, rau và các cây trồng khác làm tổn thất đáng kể
về kinh tế cho các nước vùng Đơng Nam Á. Các lồi Phytophthora sp. sản sinh bọc bào tử
trên môi trường chọn lọc PSM nếu được đặt trong điều kiện có chiếu sáng. Một số lồi cũng
sản sinh bọc bào tử trên mơi trường PCA hoặc môi trường potato-dextrose agar (PDA).

1.1.2. Triệu chứng bệnh sương mai trên cây cà chua
Tác giả William W. Kirk và cs (2009) cho biết, bệnh sương mai có nguồn gốc từ Nam
Mỹ, nơi đây cũng chính là nguồn gốc ra đời của cây khoai tây. Sau đó, bệnh đã lan ra các nước
châu Âu, châu Á... cùng với việc di thực của cây này. Bệnh được chính thức xác định đầu tiên
năm 1930 ở Đức, 15 năm sau bệnh trở thành dịch nguy hiểm ở Bắc Âu, đặc biệt ở Ai-xơ-len.
Tác nhân gây bệnh do nấm thuộc loài nấm Phytophthora sp.. Triệu chứng của bệnh thường
biểu hiện chủ yếu trên lá và thân cây cà chua.
5


Đối với lá cà chua: bệnh thường xuất hiện ở mép của chóp lá tạo ra vết xám xanh nhạt

sau đó lan rộng vào phiến lá. Ở phần giữa vết bệnh sẽ chuyển dần sang màu nâu đen và xung
quanh có lớp bào tử màu trắng xốp bao phủ như sương muối làm cho lá chết lụi. Ở phần dưới
lá bệnh có một lớp mốc trắng như sương.
Đối với thân cành cà chua: bệnh sẽ biểu hiện từng đoạn dài, lúc đầu thân cây sẽ có màu
nâu hoặc màu thâm đen, sau đó sẽ thối rửa thành màu nâu đen có lớp nấm trắng như sương
muối bao phủ xung quanh. Khi bị nhiễm bệnh thì phần thân hoặc cành sẽ nhỏ tóp lại dễ làm
cho cây gãy gục.

1.2. VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG
Vi sinh vật đối kháng là những loài có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của các
loài vi sinh vật khác trong tự nhiên. Việc lợi dụng hiện tượng đối kháng này trong việc bảo vệ
thực vật được gọi là biện pháp phòng trừ sinh học. Đây được xem là một phương pháp phòng
trừ bệnh hại cây trồng một cách trực tiếp bằng cách sử dụng các thành phần trong hệ sinh thái
để giúp cho cây trồng chống lại những tác nhân gây bệnh, nó cũng chính là chìa khóa để tạo
ra một nền nơng nghiệp bền vững (Azcon-Augiler và Barea, 1996).
Những loài vi khuẩn đối kháng luôn tồn tại ở trong tự nhiên, đa số chúng đều có lợi cho
con người. Trong nơng nghiệp những loài vi khuẩn đối kháng đều thuộc hệ vi sinh vật sống ở
vùng rễ cây, trong quá trình sinh trưởng chúng sẽ tiết ra các chất trao đổi thứ cấp như: chất
kháng sinh, enzyme thủy phân, siderophore, chất điều hịa sinh trưởng... Những chất này rất
có lợi cho sự phát triển của cây trồng, giúp cây kháng bệnh, tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng,
kích thích sự sinh trưởng của cây, hịa tan nguồn dinh dưỡng từ dạng khó hấp thụ thành dạng
dễ hấp thụ cho cây...
Một số cơ chế đối kháng của vi sinh vật:
- Cơ chế do kháng sinh: Kháng sinh là một chất sinh ra trong quá trình sinh trưởng của
vi sinh vật nhằm tiêu diệt những mầm bệnh có trong đất trồng cây, giúp cho cây trồng phát
triển. Nó có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hoặc là kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn một
cách đặc hiệu.

6



- Cơ chế do siderophore: Vi sinh vật đối kháng có khả năng cạnh tranh một cách trực
tiếp với nguồn gây bệnh về dinh dưỡng, oxy, không gian sống, khả năng sinh kháng sinh, tạo
siderophore...để sinh trưởng. Trong đó, siderophore là một loại protein sinh ra trong quá trình
sinh trưởng của vi sinh vật, nó có khả năng hấp thụ các ion Fe3+ trong mơi trường có ái lực
cao nhằm giúp phục vụ trực tiếp cho sự sinh trưởng và hô hấp của vi sinh vật, làm cho môi
trường xung quanh nghèo sắt, dẫn đến các loại vi sinh vật khác khơng có đủ ion Fe3+ cho q
trình sinh trưởng của mình, do đó chúng sẽ khơng sinh trưởng được.
- Cơ chế do enzyme thủy phân: enzyme ngoại bào là những enzyme được vi sinh vật sinh
tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân các hợp chất hữu cơ
bên ngồi mơi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

1.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS
Hiện nay, theo hệ thống phân loại thì chi Bacillus có khoảng gần 300 lồi và các loài phụ
dưới loài (Parte, 2014). B. velezensis là một trong số tám lồi vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis
(Rooney và cs, 2009). Chi Bacillus là một nhóm các lồi vi khuẩn hiếu khí, Gram dương, hình
que, phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái, phát triển tốt ở nhiệt độ từ 25-37°C và thích nghi
nhanh ở pH trung tính. Hầu hết các chi Bacillus có khả năng sinh nội bào tử là một dạng nghỉ
của tế bào để giúp vi khuẩn có thể chống chịu và tồn tại trước các điều kiện bất lợi của môi
trường.
Vi khuẩn B. velezensis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 2005 tại bờ sông Velez ở
Malaga – miền Nam Tây Ban Nha (Ruiz-Garcia và cs, 2005). B. velezensis là vi khuẩn Gram
dương, hình que, kích thước tế bào vi khuẩn khoảng 0,7 – 0,9 x 1,6 – 3 μm, có khả năng sinh
acid từ aesculin, amygdalin, arbutin,.. (Wang và cs, 2008). Loài này còn được biết đến như là
một tác nhân phòng trừ sinh học bệnh cây hiệu quả với khả năng sản sinh tốt kháng sinh, các
enzyme phân giải vách tế bào nấm bệnh và các hợp chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng
(Mc Spadden, 2004).

7



Hình 1.2. Hình thái khuẩn lạc và bào tử vi khuẩn B. velezensis. (Hứa Thị Vy, 2019)
Đây là loài vi khuẩn an tồn, sở hữu nhiều đặc tính q có lợi cho cây trồng như khả
năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh hormone kích thích
sinh trưởng thực vật, sản sinh các enzyme thủy phân và có khả năng tăng cường tính miễn
dịch của cây chống lại sự xâm nhiễm của các loại vi sinh vật gây bệnh (Chowdhury và cs,
2015; Shao và cs, 2015; Li và cs, 2015). Do sở hữu các đặc tính quý, vi khuẩn B. velezensis
được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ở mọi cấp độ từ giải mã hệ gen (genome) đến
nghiên cứu các chất trao đổi, nghiên cứu phân loại, nghiên cứu ứng dụng trong nhà kính và
ngồi thực địa; nhiều chủng vi khuẩn B. velezensis đã được phân lập, đánh giá các đặc tính có
lợi và ứng dụng trong đấu tranh sinh học để phòng ngừa các loại dịch bệnh hại cây trồng phục
vụ nông nghiệp.
Theo phần lớn các nghiên cứu trước đây đã sử dụng B. velezensis để ứng dụng trong
nông nghiệp, thay thế cho phân bón tổng hợp hiện nay và thuốc trừ sâu hóa học. Các tác giả
đã chỉ ra tiềm năng kiểm sốt sinh học của B. velezensis có khả năng thơng qua bốn cơ chế
chính: kháng sinh qua trung gian chất chuyển hóa kháng khuẩn, sản xuất các hormone tăng
trưởng để hấp thu chất dinh dưỡng, cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật khác và sản sinh
các hợp chất dễ bay hơi cùng với các hợp chất lipopeptide bề mặt (Adetomiwa Ayodele
Adeniji và cs, 2019).
B. velezensis sản sinh ra nhiều loại chất trao đổi bậc hai có hoạt tính kháng nấm và kháng
vi khuẩn gây bệnh cây. Các chất trao đổi đó bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide,
siderophore và protein kháng khuẩn (Arguelles-Arias và cs, 2009; Huang và cs, 2014).
8


1.4. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Vi sinh vật đối kháng với một số loài gây bệnh trên cây trồng đã được nhiều nhà khoa
học trên thế giới nghiên cứu và ứng dụng từ những năm đầu của thế kỷ XX. Một số tiến bộ đã
đạt được trong việc nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng như:

Nghiên cứu của Galindo (1992) đã thí nghiệm kiểm tra thành cơng khả năng phịng trừ
sinh học đối với nấm Phytophthora palmivora ở cây ca cao bằng cách sử dụng các vi sinh vật
đối kháng như Bacillus spp. và Pseudomonas fluorescens.
Theo nghiên cứu của tác giả Jensen và cs (2002) thì chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
GBO3 được sử dụng để xử lý hạt làm giảm bệnh thối rễ cây đậu và tăng năng suất 31% so với
đối chứng. Bên cạnh đó, một số vi khuẩn như Bacillus spp., xạ khuẩn Streptomyces spp. cũng
được sử dụng nhiều để phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại do các nhóm vi khuẩn
này có nhiều tiềm năng như phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có tính đối kháng cao với các lồi
vi sinh vật gây hại và an toàn với các vi sinh vật khác cũng như môi trường.
Tại Hàn Quốc, theo nghiên cứu của Dong và cs (2006) đã sử dụng sản phẩm vi khuẩn có
chứa enzyme chitinase và β-1,3-glucanase đã hạn chế được 64% tỷ lệ bệnh sương mai so với
đối chứng trên cây ớt ở nhà lưới. Tác giả cũng sử dụng các giống chống chịu, vệ sinh đồng
ruộng, luân canh với các cây khác… kết quả đã hạn chế được 54-70% bệnh trên ớt ngồi đồng.
Hai dịng vi khuẩn Bacillus là BB1 và FH17 với bã nho đã phân hủy theo nghiên cứu
của Zhi-Qiang Jiang và cs (2006) có thể tiêu diệt tới 81% nấm Phytophthora capcisi gây bệnh
sương mai trên cây ớt.
Nghiên cứu của Lee. K. J và cs (2008) cho thấy Bacillus spp. dịng R33 và R13 có khả
năng hạn chế sự phát triển của nấm Phytophthora capcisi tới 86,8%.
Tại trường Đại học Florida của Mỹ đã ứng dụng được một số chủng vi sinh vật đối kháng
để hạn chế bệnh trên cây cà chua như các chủng PGPR Bacillus pumilus SE 34, EQTY và
Pseudomonas putida 89B61 với tỷ lệ bệnh giảm từ 10-25% so với đối chứng. Ngoài ra thì tác
giả cũng có sử dụng 2 chủng vi khuẩn Bacillus là Bacillus amyloliquefaciens IN937a và
9


Bacillus subtilis GB03 để hạn chế khả năng bị bệnh héo xanh và bệnh sương mai trên cây cà
chua.

1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam hiện nay đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng để

làm cơ sở khoa học sản xuất các loại chế phẩm sinh học phòng trừ một số bệnh hại trên cây
trồng. Đặc biệt, trong những năm gần đây đã có một số cơng trình nghiên cứu về việc sử dụng
vi khuẩn Bacillus sp. để tạo chế phẩm sinh học đối kháng phòng trừ một số bệnh trên cây
trồng:
- Chế phẩm BC (Bacillus subtilis) của Viện Bảo vệ Thực vật (1999) ứng dụng trong
phòng trừ bệnh chết nhanh hồ tiêu do nấm Phytophthora capsici.
- Nguyễn Quang Huy và cs (2012), Trường đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Hà
Nội, đã phân lập hai chủng vi khuẩn ký hiệu U1.3 và U3.7 đều thuộc chi Bacillus trong đó
U1.3 gần với lồi Bacillus subtilis cịn chủng U3.7 gần với lồi Bacillus velezensis. Hai chủng
vi khuẩn phân lập đều có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp.
- Trịnh Thành Trung và cs (2016), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(3): 563-571, đã tiến
hành tách chiết, tinh sạch và xác định đặc tính sinh học của chất kháng nấm và chất kháng
khuẩn từ chủng vi khuẩn Bacillus velezensis CP1604.
- Trịnh Thành Trung và cs (2017), Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(1): 169-179, đã
nghiên cứu tiềm năng ứng dụng tạo chế phẩm làm phân bón hữu cơ sinh học từ các chủng
Bacillus velezensis phân lập từ các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam.
- Tác giả Trần Ngọc Khánh và cs (2015) đã tuyển chọn và định danh được 2 chủng vi
sinh vật là Bacillus amyloliquefaciens và xạ khuẩn Streptomyces toxytricini có khả năng kháng
nấm Phytophthora infestans.

10


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
- Chủng nấm Phytophthora sp. gây bệnh sương mai trên cây cà chua đã được phân lập
tại một số vùng trồng cà chua ở Đà Nẵng và được bảo quản tại khoa Sinh – Môi trường, trường
Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
- Vi khuẩn B. velezensis đã được phân lập tại một số vùng đất trồng cà chua ở Đà Nẵng
và được bảo quản tại khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng.


2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Bố trí thí nghiệm
Tiến trình thực hiện nghiên cứu được bố trí theo Hình 2.1.

11


Vi khuẩn
Bacillus velezensis

Nấm bệnh
Phytophthora sp.

Hoạt hóa
Hoạt hóa

Lên men

Lên men

Canh trường ni
cấy (OD600=0,7)

Sinh khối

Ly tâm 10 000vịng/10 phút

Dịch nổi


Tế bào

Kết tủa bằng (NH4)2SO4
Ly tâm 10000v/10p ở 4˚C

Enzyme

Phi enzyme

Gia nhiệt

Đánh giá hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

12

Khơng gia
nhiệt


2.2.2. Phương pháp
a. Phương pháp giữ giống vi sinh vật
Vi khuẩn B. velezensis được giữ giống trên môi trường thạch LB, nấm Phytophthora sp.
được giữ giống trên môi trường thạch PDA. Tất cả các giống vi sinh vật được bảo quản ở 4°C
và thực hiện cấy chuyền hàng tháng.

b. Phương pháp hoạt hóa vi sinh vật
- Đối với vi khuẩn: Từ ống thạch nghiêng lấy sinh khối vi khuẩn để tiến hành hoạt hóa
trong bình tam giác 250 ml chứa 50ml môi trường LB đã được khử trùng ở điều kiện 121°C,

1 atm trong thời gian 20 phút, tiến hành ni cấy lắc 150 vịng/ phút trong 18 giờ ở nhiệt độ
phòng.
- Đối với nấm: Chủng nấm gây bệnh sương mai Phytophthora sp. từ ống thạch nghiêng
được hoạt hóa lại trong môi trường thạch PDA đĩa bằng cách cắt một khoanh thạch trong ống
thạch nghiêng rồi úp sang môi trường PDA mới trong khoảng 5 – 7 ngày ở 30°C để thực hiện
các phương pháp đối kháng.

c. Phương pháp thu sinh khối tế bào, enzyme ngoại bào và các thành phần phi
enzyme từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus velezensis
Vi khuẩn B. velezensis được tăng sinh trong bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi
trường LB và 1% thể tích chủng vi khuẩn đã được hoạt hóa. Sau 12 giờ ni cấy lắc ở nhiệt
độ phịng, tiến hành ly tâm ở 10000 vòng/ 10 phút để thu dịch ngoại bào và sinh khối tế bào
vi khuẩn. Sinh khối tế bào vi khuẩn được tái huyền phù trong nước cất vô trùng.
Để thu enzyme ngoại bào và các thành phần phi enzyme, tiến hành nuôi cấy lắc vi
khuẩn đã hoạt hóa trong mơi trường LB lỏng trong vịng 48 giờ, sau đó thực hiện như trên để
thu dịch ngoại bào. Lấy 50ml dịch ngoại bào cho vào bình 250ml. Tiến hành tủa phân đoạn
dịch ngoại bào bằng cách cho từ từ muối amoni sunfat (NH4)2SO4 bão hòa và khuấy đều để
lắng. Sau 12 giờ tiến hành ly tâm 10000 vòng/10 phút ở 4°C thu được phần dịch nổi là các
thành phần phi enzyme, phần kết tủa được hòa tan trong đệm acetate pH=3,8.

13


d. Sàng lọc khả năng kháng nấm Phytophthora sp. từ các thành phần trong canh
trường nuôi cấy vi khuẩn B. velezensis ở điều kiện phịng thí nghiệm
Phương pháp sàng lọc khả năng kháng nấm được thực hiện theo phương pháp cấy kép
và theo dõi sự phát triển của sợi nấm sau 48 giờ. Trong đó, đĩa petri chứa mơi trường thạch
PDA được chia làm hai phần đối xứng, nấm được cấy vào một bên đĩa và một bên là mẫu thí
nghiệm. Đĩa petri được ủ ở nhiệt độ 30°C, tiến hành quan sát sự phát triển của sợi nấm và kết
luận khả năng ức chế sự phát triển của nấm bởi các mẫu.

Các mẫu thí nghiệm được sử dụng để sàng lọc khả năng kháng nấm Phytophthora sp.
bao gồm:
+ 0,1ml dịch sinh khối tế bào vi khuẩn B. velezensis không gia nhiệt.
+ 0,1ml dịch sinh khối tế bào vi khuẩn B. velezensis được gia nhiệt ở 55ºC trong vòng
15 phút.
+ 0,1ml dịch ngoại bào.
+ 0,1ml dịch enzyme ngoại bào.
+ 0,1ml dịch phi enzyme.

e. Đánh giá hiệu lực ức chế nấm Phytophthora sp. từ các thành phần trong canh
trường nuôi cấy vi khuẩn B. velezensis ở điều kiện phịng thí nghiệm
Ngun tắc
Các phương pháp đánh giá hiệu lực ức chế nấm bệnh của vi khuẩn được thực hiện theo
phương pháp cấy kép và theo dõi sự phát triển của sợi nấm sau 5 ngày và 7 ngày ủ ở nhiệt độ
30oC. Hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bởi vi khuẩn được tính theo cơng thức (Han và
cs, 2015):
I=
Trong đó:

(R − r)x 100
%
R

I là hiệu lực đối kháng (ức chế sự phát triển của nấm bởi vi khuẩn).
R là bán kính hệ sợi nấm đối chứng (cm).
r là bán kính hệ sợi nấm có chủng vi khuẩn (cm).

14



Phương pháp thực hiện
Đĩa petri chứa môi trường PDA được chia làm hai phần đối xứng, nấm được cấy vào
một bên đĩa và một bên là 0,1ml dịch mẫu được pha lỗng với nước cất vơ trùng đến các nồng
độ thích hợp sau đó nhỏ vào lỗ thạch ở bên đĩa còn lại. Ủ ở nhiệt độ 30°C, tiến hành quan sát
sự phát triển của sợi nấm và tính hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bởi vi khuẩn. Các mẫu
thí nghiệm đánh giá khả năng kháng nấm Phytophthora sp. bao gồm:
+ Dịch sinh khối tế bào vi khuẩn B. velezensis không gia nhiệt.
+ Dịch sinh khối tế bào vi khuẩn B. velezensis được gia nhiệt ở 55ºC trong vòng 15 phút.
+ Dịch ngoại bào.
+ Dịch enzyme ngoại bào.
+ Dịch phi enzyme.

g. Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme của vi khuẩn B. velezensis
Nguyên tắc
Các quá trình thủy phân bên ngoài tế bào chủ yếu là cung cấp nguyên liệu cho quá trình
sinh tổng hợp của tế bào. Vì bên ngồi mơi trường xung quanh, các hợp chất làm nguồn dinh
dưỡng cho vi sinh vật tồn tại và phát triển là các hợp chất cao phân tử không thể vận chuyển
qua màng tế bào nên vi sinh vật đã tiết ra ngoài các enzyme thủy phân để xúc tác các phản
ứng thủy phân tạo các hợp chất có phân tử lượng thấp có thể đi qua màng tế bào.
Phương pháp thực hiện
Phương pháp đục lỗ trên thạch trên mơi trường có chứa cơ chất tương ứng với từng loại
enzyme được hấp khử trùng, đổ vào đĩa petri. Chờ mơi trường nguội, dùng ống đục lỗ (đường
kính 6mm). Nhỏ dịch nuôi cấy của vi khuẩn vào lỗ thạch. Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong
thời gian 24 - 72 giờ. Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm tương ứng để xem hoạt tính sinh enzyme.
+ Xác định khả năng sinh enzyme chitinase: Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường
MMHL bổ sung 1% dịch huyền phù chitin, ủ ở 30°C trong 3 ngày (Jami và cs, 2008). Khả
năng phân giải chitin được xác định bằng cách nhuộm với dung dịch Lugol 1%.
15