KY THUAT SX DUOC PHAM

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.09 MB, 176 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

Bé y tÕ

Kü thuËt

s¶n xuÊt dợc phẩm

Tập II

Kỹ thuật sản xuất thuốc bằng ph

ơng pháp sinh tổng hợp

Sỏch o to dc s i hc

M số: Đ20.Z.09

Chủ biên: PGS.TS. Từ Minh Kỗng

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

Chỉ đạo biên soạn

Vơ Khoa học & Đo tạo, Bộ Y tế

Chủ biên:

PGS.TS. Từ Minh Koóng

Các tác giả biên soạn:

PGS.TS. Từ Minh Koóng
Đàm Thanh Xuân

Hiu ớnh:

Đàm Thanh Xuân

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

Lời giới thiệu

Thực hiện một số điều của Luật Giáo dục, Bộ Giáo dục vμ Đμo tạo vμ Bộ
Y tế đã ban hμnh ch−ơng trình khung đμo tạo đối t−ợng lμ D−ợc sỹ Đại học. Bộ
Y tế tổ chức biên soạn tμi liệu dạy – học các môn cơ sở, chun mơn vμ cơ bản
chun ngμnh theo ch−ơng trình trên nhằm từng b−ớc xây dựng bộ sách chuẩn
về chuyên môn để đảm bảo chất l−ợng đμo tạo nhân lực y tế.

Sách “Kỹ thuật sản xuất d−ợc phẩm, tập 2” đ−ợc biên soạn dựa trên
ch−ơng trình giáo dục của Tr−ờng Đại học D−ợc Hμ Nội trên cơ sở ch−ơng
trình khung đã đ−ợc phê duyệt. Sách đ−ợc các nhμ giáo giμu kinh nghiệm vμ
tâm huyết với công tác đμo tạo biên soạn theo ph−ơng châm: Kiến thức cơ bản,
hệ thống; nội dung chính xác, khoa học; cập nhật các tiến bộ khoa học, kỹ
thuật hiện đại vμ thực tiễn Việt Nam.

Sách “Kỹ thuật sản xuất d−ợc phẩm, tập 2” đã đ−ợc Hội đồng chuyên
môn thẩm định sách vμ tμi liệu dạy – học chuyên ngμnh D−ợc sỹ Đại học của
Bộ Y tế thẩm định vμo năm 2006. Bộ Y tế ban hμnh lμm tμi liệu dạy – học
đạt chuẩn chuyên môn của ngμnh y tế trong giai đoạn 2006-2010. Trong quá
trình sử dụng, sách phải đ−ợc chỉnh lý, bổ sung vμ cập nhật.

Bộ Y tế xin chân thμnh cảm ơn các cán bộ giảng dạy ở Bộ môn Công
nghiệp D−ợc của Tr−ờng Đại học D−ợc Hμ Nội đã giμnh nhiều công sức hoμn
thμnh cuốn sách nμy, cảm ơn GS. Lê Quang Toμn vμ PGS. TS. Hoμng Minh
Châu đã đọc, phản biện để cuốn sách đ−ợc hoμn chỉnh, kịp thời phục vụ cho
công tác đμo tạo nhân lực y tế.

Vì lần đầu xuất bản, chúng tơi mong nhận đ−ợc ý kiến đóng góp của
đồng nghiệp, các bạn sinh viên vμ các độc giả để lần xuất bản sau đ−ợc hoμn

thiện hơn.

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4></div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

Lời nói đầu

Cun giỏo trình "Kỹ thuật sản xuất d−ợc phẩm" đ−ợc biên soạn để giảng
cho sinh viên Đại học D−ợc vμo học kỳ 8 đã đ−ợc xuất bản lần thứ nhất năm
2001, gồm 2 tập. Theo ch−ơng trình cũ, thời l−ợng giảng dạy mơn học nμy lμ
q ít so với những kiến thức chung của D−ợc sỹ Đại học. Đặc biệt trong tình
hình hiện nay, sau khi có nghị quyết của Bộ Chính trị (NQ-46/BCT-2005) về
phát triển nền Cơng nghiệp D−ợc của đất n−ớc trong tình hình mới, phải −u
tiên phát triển công nghiệp sản xuất nguyên liệu lμm thuốc, trong đó chú
trọng Cơng nghiệp Hóa d−ợc vμ Cơng nghệ Sinh học. Ban ch−ơng trình nhμ
tr−ờng quyết định tăng thêm một đơn vị học trình cho học phần "Sản xuất
thuốc bằng Công nghệ sinh học".

Bộ môn đã biên soạn lại để xuất bản cuốn giáo trình mới gồm 3 tập. Cả
ba tập đều có tên chung của giáo trình: “Kỹ thuật sản xuất d−ợc phẩm”.

Giáo trình đ−ợc biên soạn theo hai nội dung:
1. Kỹ thuật sản xuất các nguyên liệu lμm thuốc.
2. Kỹ thuật sản xuất các dạng thuốc thμnh phẩm.
Trong đó:

Néi dung thø nhÊt gåm 2 tËp lμ:

* TËp 1. Kü thuËt s¶n xuất thuốc bằng phơng pháp tổng hợp hóa dợc
v chiết xuất dợc liệu.

* Tập 2. Kỹ thuật sản xuất thuốc bằng phơng pháp sinh tổng hợp.
Nội dung thø hai gåm 1 tËp lμ:

* TËp 3. Kü thuật sản xuất các dạng thuốc.

So vi ln xut bản tr−ớc, các tác giả biên soạn đã cố gắng chắt lọc những
kiến thức chủ yếu nhất để cung cấp cho ng−ời học hiểu đ−ợc ngμnh khoa học
vừa hấp dẫn vừa quan trọng nμy. Tuy nhiên, với nội dung phong phú, đa dạng
vμ thời l−ợng hạn chế nên khơng thể đi sâu hơn đ−ợc. Vì vậy cuốn giáo trình
khơng tránh khỏi những thiếu sót. Các tác giả mong nhận đ−ợc sự góp ý của
đọc giả để chỉnh sửa cho lần xuất bản sau đ−ợc hoμn chỉnh hơn. Xin chân
thμnh cảm ơn.

</div>
(6)<div class='page_container' data-page=6></div>
(7)<div class='page_container' data-page=7>

Mơc lơc

phÇn I. tỉng quan vỊ Công nghệ sinh học

Ch

ơng 1. Giới thiệu về công nghệ sinh học

1.1. Công nghệ sinh học l gì?

1.2. C«ng nghƯ sinh häc - mét sù theo ®i ®a ngμnh

1.3. C«ng nghƯ sinh học - hạt nhân trung tâm ba thnh phần
1.4. An toμn s¶n phÈm

1.5. Nhận thức của cộng đồng về công nghệ sinh học
1.6. Công nghệ sinh học vμ các n−ớc đang phát triển
Ch−ơng 2. Nguyên liệu cho công nghệ sinh học

2.1. ChiÕn l−ỵc sinh khèi

2.2. Nguyên liệu thô thiên nhiên

2.3. Tính sẵn có của sản phẩm phụ
2.4. Nguyên liệu hoá học v hoá dầu

2.5. Nguyên liệu thô v tơng lai của công nghệ sinh học
Chơng 3. Kỹ thuật lên men

3.1. Giới thiệu tổng quát

3.2. Các giai đoạn phát triển của vi sinh vật
3.3. Thiết bị lên men vi sinh vật

3.4. Cung cÊp kh«ng khÝ v« trïng cho nh máy lên men vi sinh vật
3.5. Khử trùng môi trờng trong công nghệ lên men

3.6. Läc vμ thiÕt bÞ lọc trong công nghiệp sản xuất kháng sinh
3.7. Trình tự quá trình lên men

3.8. Thiết kế môi trờng cho quá trình lên men
3.9. Lên men trên cơ chất rắn

3.10. K thut nuôi cấy tế bμo động vật vμ thực vật
3.11. Quá trình tinh chế để thu sản phẩm

</div>
(8)<div class='page_container' data-page=8>

4.1. Đại cơng

4.2. Các ứng dơng cđa enzym

4.3. Kü tht di trun trong công nghệ enzym
4.4. Kỹ thuật sản xuất enzym

4.5. Ph−ơng pháp bất động enzym (immobilised enzym)
Ch−ơng 5. Sản xuất Protein đơn bμo

5.1. Sự cần thiết sản xuất protein đơn bμo
5.2. Sản xuất sinh khối nấm men

5.3. Sản xuất tảo đơn bμo
5.4. Sản xuất nm si

5.5. Sản xuất nấm ăn 64

Ch−ơng 6. Sản xuất các sản phẩm trao đổi chất bậc một dùng trong Y học
6.1 Sản xuất các aminoacid 66

6.2. S¶n xuÊt acid glutamic 67
6.3. S¶n xuÊt Dextran 70

6.4. Sinh tổng hợp Vitamin B12 73
6.4.1. Đại cơng 73

6.4.2. Cấu trúc hoá học v tÝnh chÊt 74
6.4.3. Lªn men sinh tỉng hợp 75

6.4.4. Quy trình sản xuất 76
6.4.5. Quy trình chiết xuất 78

phần II. Công nghệ sản xuất kháng sinh
Chơng 7. Đại cơng về kháng sinh
7.1. Định nghĩa kháng sinh 83
7.2. Đơn vị kháng sinh 83

7.3. Phân loại kháng sinh 83

7.4. Các phơng pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 84

7.5. Ph−ơng pháp gây đột biến vi sinh vật để nâng cao hiệu suất 87
7.6. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vt sinh

kháng sinh phân lập đợc 89

</div>
(9)<div class='page_container' data-page=9>

7.8. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn vμ độc tính 89
7.9. Nghiên cứu về d−ợc lý vμ điều trị của kháng sinh 90
7.10. Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh 90

7.11. Ph−ơng pháp định l−ợng kháng sinh 91
7.12. ứng dụng kháng sinh ngoμi lĩnh vực y học 94
Ch−ơng 8. Sản xuất kháng sinh nhóm β-lactam
8.1. Đại c−ơng về các β -lactam 100

8.2. Sinh tổng hợp các kháng sinh Penicillin 100

8.3. S¶n xuÊt 6-APA vμ các Penicillin bán tổng hợp 110
8.4. Sản xuất các Cephalosporin 116

8.5. Sản xuất 7ACA; 7ADCA v các kháng sinh bán tổng hợp
nhóm cephalosporin 120

8.6. Sinh tỉng hỵp acid clavulanic 122

Chơng 9. sản xuất kháng sinh nhóm Tetracyclin
9.1. Đại cơng 128

9.2. Công thức cấu tạo vμ tÝnh chÊt 128

9.3. Sinh tỉng hỵp các Tetracyclin tự nhiên 130
9.4. Sinh tổng hỵp Clotetracyclin 134

9.5. Sinh tỉng hỵp Tetracyclin 136
9.6. Sinh tỉng hỵp Oxytetracyclin 139
9.7. Các Tetracyclin bán tổng hợp 142

Chơng 10. sản xuất kháng sinh nhóm aminoglycosid
10.1. Đại cơng chung vỊ c¸c aminoglycosid 146
10.2. Sinh tỉng hỵp Streptomycin 150

10.3. Sinh tỉng hỵp Gentamicin 157

Chơng 11. sản xuất kháng sinh nhóm macrolid
11.1. Tỉng quan vỊ c¸c Macrolid 162

11..2. Sinh tổng hợp Erythromycin 165
chơng 12. sản xuất kháng sinh chống ung th
12.1. Đại cơng 168

</div>
(10)<div class='page_container' data-page=10>

12.3. Các kháng sinh chèng ung th− nguån gèc sinh häc 170
12.4. Sinh tổng hợp Daunorubicin 172

chơng 13. sản xuất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn
13.1. Sinh tỉng hỵp Polymyxin 175

</div>
(11)<div class='page_container' data-page=11>

phần I. tổng quan về Công nghệ sinh học

Ch

ơng 1

giới thiệu về công nghệ sinh học

Mục tiêu

Sau khi học xong chơng ny, sinh viên phải trình by đợc:

1. Tờn cỏc lnh vực khoa học có liên quan đến Cơng nghệ sinh học vμ

phạm vi ứng dụng của Công nghệ sinh học trong cỏc ngnh ú.

2. Tầm quan trọng của Công nghƯ sinh häc trong xu thÕ ph¸t triĨn chung 
cđa khoa häc trong thÕ kû 21.

1. C«ng nghƯ sinh häc lμ g×?

Ngμy nay khơng ai cịn nghi ngờ gì nữa về những thμnh tựu của cơng
nghệ sinh học đem lại cho loμi ng−ời. Chẳng thế mμ trong hai thập kỉ cuối
cùng của thế kỉ XX, khoảng 20 giải Nobel đã đ−ợc trao cho những khám phá
trong lĩnh vực nghiên cứu nμy. Để hiểu công nghệ sinh học lμ gì ta có thể nêu
ra đây một vμi định nghĩa về công nghệ sinh học.

− “ViƯc øng dơng nh÷ng sinh vËt, hƯ thèng vμ quá trình chế biến vo
sản xuất v công nghiệp dÞch vơ”.

− “Việc kết hợp sử dụng hố sinh, vi sinh vμ khoa học công nghệ để tạo
ra những khả năng ứng dụng các vi sinh vật, mô tế bμo vμ các bộ
phận của chúng”.

− “Công nghệ sử dụng các hiện t−ợng sinh học để sao chép vμ sản xuất
ra những vật phẩm hữu ích”.

− “Việc ứng dụng các ngμnh khoa học vμ kỹ thuật vμo quá trình biến
đổi nguyên liệu bằng các tác nhân sinh học để sản xuất hμng hoá vμ
cung cấp dịch vụ”.

− “Công nghệ sinh học thực sự chỉ lμ một cái tên đ−ợc đặt cho một tập
hợp các quá trình vμ kỹ thuật.”

</div>
(12)<div class='page_container' data-page=12>

Công nghệ sinh học l việc giải mÃ v sư dơng c¸c kiÕn thøc vỊ sinh
häc”.

Có thể coi định nghĩa về công nghệ sinh học sau đây của Liên đoμn công
nghệ sinh học châu Âu (EFB) lμ hoμn chỉnh hơn cả:

"C«ng nghƯ sinh häc lμ sự kết hợp của các ngnh khoa học tự nhiên vμ

khoa học công nghệ để đạt tới những sự ứng dụng của vi sinh vật, các tế bμo, 
một số thμnh phần của tế bμo nhằm tạo ra những sản phẩm vμ những sự phục 
vụ (services) có lợi cho con ng−ời”.

Sở dĩ nói đến cả một số thμnh phần của tế bμo vì ngμy nay cơng nghệ
enzym (enzyme technology) với các enzym bất động hoá (immobilized enzymes)
không cần tới tế bμo vẫn tạo ra đ−ợc sản phẩm ở qui mô lớn. Sở dĩ nói đến
những sự phục vụ vì trong việc xử lý chống ơ nhiễm môi tr−ờng tuy công nghệ
sinh học không tạo ra sản phẩm gì nh−ng có một vai trị rất quan trng.

Công nghệ sinh học đang phát triển nhanh chóng trên cơ sở của một số

kỹ thuật hon ton mới mẻ thờng gọi l kỹ thuật chìa khoá
(Key-Technology). §ã lμ kü tht di trun (genetic engineering); kü tht dung
hỵp tÕ bμo (cell fusion); kü tht sư dơng ph¶n øng sinh thĨ (bioreaction
technology) bao gåm kü thuËt lªn men (fermentation technology), kü thuËt
enzym (enzyme technology) v bình phản ứng sinh vật (bioreactor); kỹ thuật
nuôi cÊy tÕ bμo (cell culture technique); kü thuËt nu«i cÊy m« (tissue culture
technique); kü tht chun ph«i (embryo tranplantation) vμ kü tht chun
nh©n tÕ bμo (nucleus tranplantation).

2. Công nghệ sinh học - một sự theo đuổi đa ngμnh

Công nghệ sinh học lμ sự −u tiên của quá trình theo đuổi đa ngμnh.
Trong những thập kỉ gần đây, nét đặc tr−ng của sự phát triển khoa học vμ
công nghệ lμ ph−ơng pháp dùng những chiến l−ợc đa ngμnh để đạt đ−ợc giải
pháp cho các vấn đề khác nhau. Điều nμy dẫn đến sự ra đời những lĩnh vực
nghiên cứu đa ngμnh vμ cuối cùng sẽ tạo ra những ngμnh mới với những khái
niệm vμ ph−ơng pháp đặc tr−ng. Kĩ thuật hoá học vμ hố sinh lμ hai ví dụ dễ
nhận thấy nhất của những ngμnh khoa học đã cho chúng ta hiểu sâu sắc về
q trình hố học vμ những cơ sở hoá sinh của các hệ thống sinh học.

</div>
(13)<div class='page_container' data-page=13>

Công nghệ sinh học đã xuất hiện thông qua sự tác động qua lại lẫn nhau giữa
những phần khác nhau của sinh học vμ kỹ thuật.

Một nhμ cơng nghệ sinh học
có thể sử dụng các kỹ thuật: hoá
học, vi sinh học, hoá sinh vμ tin
học (Hình 1.1). Mục đích chính lμ
sự sáng tạo, phát triển vμ tối −u
hố các q trình, trong đó chất
xúc tác hố sinh giữ vai trị nền

tảng vμ khơng gì có thể thay thế
đ−ợc. Nhμ công nghệ sinh học phải
biết hợp tác chặt chẽ với các
chuyên gia trong những lĩnh vực
liên quan nh− y học, dinh d−ỡng
học, hoá học, d−ợc học, bảo vệ môi
tr−ờng vμ xử lý chất thải. Việc ứng
dụng công nghệ sinh học ngμy
cμng cho thấy tính chất phụ thuộc
lẫn nhau của khoa học liên ngμnh,
muốn đạt đ−ợc thμnh công trong
nghiên cứu của ngnh mỡnh, cn

hiểu đợc ngôn ngữ kỹ thuật của các ngnh khác, hiểu đợc những tiềm năng
cũng nh những hạn chế của các ngnh khác.

Cụng ngh sinh học có yêu cầu rất cao các kỹ năng về chuyên môn,
nghiệp vụ. Biết đầu t− vμo việc phát triển ngμnh cơng nghệ nμy sẽ đ−ợc h−ởng
lợi ích lâu dμi. Cơng nghệ sinh học có một số lĩnh vực hoạt động nh− sau:

− Điều trị học: các d−ợc phẩm dùng để điều trị bệnh cho ng−ời bao gồm
kháng sinh, vaccin, liệu pháp gen.

− Chẩn đoán: các kít dùng để xét nghiệm chẩn đốn trong lâm sμng,
thực phẩm, môi tr−ờng, nông nghiệp.

− Nông nghiệp, lâm nghiệp, lμm v−ờn: các giống cây mới, động vật,
thuốc trừ sâu.

− Thực phẩm: bao gồm sản xuất thực phẩm, đồ uống, các phụ gia, phân

bón.

− Môi trờng: xử lý chất thải, các chất có bản chất sinh học, sản xuất
năng lợng.

Cỏc hoỏ chất trung gian: các hố chất cần thiết cho cơng nghệ sinh
học nh−: các enzym, ADN, ARN, các hoá cht c bit.

Thiết bị: phần cứng, phần mềm tin học, bình phản ứng sinh học v
những thiết bị khác có tính hỗ trợ cho công nghệ sinh học.

</div>
(14)<div class='page_container' data-page=14>

Nhiều q trình cơng nghệ sinh học hiện nay có nguồn gốc từ các q
trình lên men cổ truyền nh− lên men r−ợu, bia, men bánh mì, sữa chua, pho
mát, dấm. Chỉ khi cơng nghệ lên men sản xuất Penicillin trên qui mơ lớn thì
ngμnh cơng nghệ lên men mới thực sự có những b−ớc nhảy vọt. Từ đó đến nay
chúng ta đã chứng kiến sự phát triển phi th−ờng của công nghệ nμy. Biết bao
sản phẩm mới do công nghệ lên men cung cấp lμm phong phú thêm cuộc sống
vμ cứu chữa đ−ợc bao nhiêu mạng sống thoát khỏi tử thần. Nhìn về t−ơng lai,
các nhμ khoa học đều cho rằng thế kỷ XXI sẽ lμ kỷ nguyên của cơng nghệ sinh
học cũng nh− hố học vμ vật lý lμ đặc tr−ng của thế kỷ XX.

Về mặt lý thuyết, cơng nghệ sinh học có thể chuyển một gen từ một sinh
vật bất kỳ sang một sinh vật khác, vi sinh vật khác, thực vật hay động vật
khác (xem Ch−ơng 3), trên thực tế có rất nhiều yếu tố chi phối nh− những gen
nμo phải tạo dịng vơ tính vμ cách chọn gen đó nh− thế nμo. yếu tố hạn chế
nhất trong việc ứng dụng kỹ thuật di truyền lμ sự thiếu kiến thức khoa học cơ
bản về cấu trúc của gen chức năng. Đối với thực vật phải l−u ý rằng chỉ
khoảng 150 gen thực vật trong tổng số 10.000 cho đến nay đã biết đ−ợc đặc
điểm ở mức ADN.

Công nghệ sinh học đang phát triển với tốc độ gần với tốc độ phát triển
của vi điện tử vμo những năm 70. Tuy nhiên, các nhμ nghiên cứu về công nghệ
sinh học luôn h−ớng các nghiên cứu vμo mục đích th−ơng mại nhằm mục đích
vừa phục vụ, vừa thu lợi nhuận. Công nghệ sinh học mới sẽ có những ảnh
h−ởng to lớn đến tất cả các ứng dụng công nghiệp của các khoa học về sự sống.
Cμng ngμy ng−ời ta cμng nhận thấy rằng nguồn nhiên liệu lỏng có nguồn gốc
hố thạch trên trái đất chẳng bao lâu nữa sẽ hết, các nguồn năng l−ợng khác
sẽ đ−ợc nghiên cứu để thay thế, công nghệ sinh học sẽ giúp các nhμ nghiên
cứu tìm ra các nguồn năng l−ợng mới vừa rẻ tiền vừa an toμn hơn. Những quốc
gia có điều kiện khí hậu phù hợp với điều kiện sản xuất sinh khối sẽ có những
−u thế lớn lao về mặt kinh tế hơn các quốc gia có điều kiện kém phù hợp.
Những n−ớc nhiệt đới phải nắm đ−ợc tiềm năng to lớn của mình để đẩy mạnh
phát triển công nghệ sinh học.

Công nghệ sinh học mới d−ờng nh− xuất hiện sớm nhất trong lĩnh vực
bảo vệ sức khoẻ vμ y học, tiếp sau lμ công nghệ thực phẩm. Năm 1982, bằng
công nghệ gen đã tạo ra đ−ợc insulin để chữa bệnh đái tháo đ−ờng. Gen để sản
xuất insulin từ tuyến tuỵ của ng−ời đã đ−ợc tách ra đem ghép vμo ADN của E. 
coli, nuôi cấy vi khuẩn E. coli thu lấy insulin bằng các kỹ thuật thích hợp của
hố sinh. Trong việc chẩn đốn lâm sμng hiện nay đã có hμng trăm bộ kít
chuẩn khác nhau vừa chính xác vừa cho kết quả nhanh chóng. Đặc biệt để
phát hiện các mầm gây bệnh có trong máu giúp cho việc truyền máu an toμn
hơn. Công nghệ sinh học giúp cho việc cải thiện chất l−ợng thực phẩm, tăng
dinh d−ỡng, tạo ra các thực phẩm chức năng giúp cho con ng−ời sống lâu hơn
vμ chất l−ợng cuộc sống cũng tốt hơn.

</div>
(15)<div class='page_container' data-page=15>

Nhiều công ty công nghệ sinh học mới ra đời do những doanh nhân lμ
những nhμ khoa học từ môi tr−ờng hμn lâm, họ muốn xây dựng vμ phát triển
một ngμnh khoa học mới có hμm l−ợng chất xám cao, một ngμnh cơng nghệ
mang tính “bác học”.

Những cơng ty cơng nghệ sinh học mới có những đặc điểm mμ th−ờng
không gặp ở những công ty khác. Có thể tóm tắt nh− sau:

− Cơng nghệ có thể điều chỉnh vμ gồm nhiều ngμnh, việc phát triển sản
phẩm có liên quan đến các nhμ sinh học phân tử, các nhμ nghiên cứu
lâm sμng.

− Môi tr−ờng th−ơng mại đ−ợc đặc tr−ng bởi sự thay đổi nhanh chóng
vμ sự rủi ro đáng kể, một sự đổi mới cơng nghệ sinh học có thể nhanh
chóng lμm thay đổi cái khác.

− Cần phải quản lý: các cơ quan chức năng, nhận thức của cộng đồng,
các vấn đề về sức khoẻ vμ an toμn, đánh giá về sự rủi ro.

− Sù ph¸t triĨn về thơng mại công nghệ sinh học phụ thuộc rất nhiều
vo sự đầu t, thờng l nhu cầu đầu t rất lớn, trớc khi thu đợc
lợi nhuận.

3. Cụng nghệ sinh học - hạt nhân trung tâm ba thμnh phần 
Nhiều q trình cơng nghệ sinh học có thể đ−ợc coi lμ có hạt nhân trung
tâm ba thμnh phần. Trong đó thμnh phần thứ nhất liên quan đến chất xúc tác
sinh học lμm nhiệm vụ đặc biệt của quá trình. Thμnh phần thứ hai giúp cho
thμnh phần thứ nhất thực hiện đ−ợc quá trình kỹ thuật tốt nhất, còn thμnh
phần thứ ba th−ờng gọi lμ q trình xi dịng (downstream processing) liên
quan đến việc tách vμ tinh chế sản phẩm chính, hoặc các sản phẩm của quá
trình lên men.

Trong đa số các chất xúc tác đã đ−ợc sử dụng đến nay, hiệu quả bền vững
vμ thuận tiện nhất của quá trình sinh học lμ vi sinh vật nguyên vẹn. Vì vậy

phần lớn các q trình cơng nghệ sinh học đều liên quan đến các quá trình vi
sinh. Điều nμy cũng không loại trừ việc sử dụng các sinh vật bậc cao, đặc biệt
các tế bμo động vật vμ thực vật ngμy cμng có vai trị quan trọng trong công
nghệ sinh học hiện đại.

Trong thiên nhiên, các vi sinh vật đ−ợc coi nh− nhân tố đầu tiên trong
việc cố định năng l−ợng quang hợp, cũng nh− những hệ thống dẫn đến những
thay đổi về hoá học trong hầu hết các loại phân tử hữu cơ tự nhiên vμ tổng
hợp. Vi sinh vật chứa một nguồn gen vô cùng phong phú vμ khả năng tổng hợp
cũng nh− phân huỷ hầu nh− vô tận. Mặt khác, vi sinh vật có tốc độ sinh
tr−ởng cực kỳ nhanh mμ khơng động vật nμo có đ−ợc.

</div>
(16)<div class='page_container' data-page=16>

bằng các kỹ thuật di truyền thông th−ờng, hay các kỹ thuật di truyền hiện đại
để thu đ−ợc con giống có những −u điểm mμ ta mong muốn (Ch−ơng 3).

Những vi sinh vật đã đ−ợc chọn lọc cần phải nghiên cứu các biện pháp
nuôi giữ để sao cho khơng bị mất hoạt tính để có thể dùng sản xuất lâu dμi.
Một số tr−ờng hợp chất xúc tác đ−ợc dùng ở dạng đã tách vμ tinh chế nh− các
enzym. Việc tách vμ tinh chế enzym cho mục đích xúc tác sinh học sẽ trình bμy
ở Ch−ơng 5.

4. An toμn s¶n phÈm

Trong công nghệ sinh học, những qui định của Nhμ n−ớc sẽ quyết định về
đầu t− cho nghiên cứu vμ cho phép đ−a sản phẩm nghiên cứu vμo sử dụng.
Các cơ quan chức năng có thể đóng vai trị “ng−ời gác cổng” cho phép nghiên
cứu hay sản xuất một sản phẩm mới vμ sử dụng chúng. Các qui định có thể lμ
các rμo cản đáng kể cho sự phát triển của công nghệ sinh học. Trên thực tế
những rμo cản nμy có nguồn gốc từ chi phí cho việc thử các sản phẩm có đáp
ứng các tiêu chuẩn qui định hay không? Sự chậm trễ vμ hay thay đổi trong

việc thông qua các qui định vμ thậm chí phản đối thẳng thừng những sản
phẩm mới vì lý do an toμn. Việc sử dụng cơng nghệ tái tổ hợp ADN đã tạo ra
mối lo ngại về độ an toμn của sản phẩm. Thái độ của cộng đồng đối với công
nghệ sinh học phần lớn liên quan đến vấn đề về sự nguy hiểm t−ởng t−ợng hay
cảm tính trong kỹ thuật thao tác gen.

5. Nhận thức của cộng đồng về công nghệ sinh học

Trong khi công nghệ sinh học thể hiện tiềm năng to lớn trong việc bảo vệ
sức khoẻ vμ phát triển sản xuất, việc chế biến vμ đảm bảo chất l−ợng thực
phẩm bằng kỹ thuật gen, sản xuất phân bón, thuốc trừ sâu sinh học, vaccin,
các loại động vật vμ các giống cây khác nhau, sự liên quan của những q
trình cơng nghệ sinh học mới nμy v−ợt ra ngoμi những lợi ích về mặt kỹ thuật.
Việc thực hiện những kỹ thuật mới nμy sẽ phụ thuộc rất nhiều vμo sự chấp
nhận của ng−ời tiêu dùng. Trong báo cáo về phát triển ngμnh công nghệ sinh
học của ủy ban t− vấn về khoa học vμ công nghệ Mỹ đã viết: "Nhận thức của
cộng đồng về cơng nghệ sinh học sẽ có một ảnh h−ởng to lớn đến tốc độ vμ
ph−ơng h−ớng phát triển của công nghệ sinh học, vμ hiện đang có sự lo ngại
ngμy cμng tăng về những sản phẩm biến đổi gen. Liên quan đến việc thao tác
gen lμ các câu hỏi khác nhau về độ an toμn, đạo đức vμ việc bảo vệ".

</div>
(17)<div class='page_container' data-page=17>

lại kỹ thuật gen với giọng điệu cảm động vμ thiếu cơ sở lμm cho các chính trị
gia vμ cộng đồng nhầm lẫn. Những lợi ích to lớn của công nghệ sinh học đem
lại sẽ tự nó nói lên vμ sẽ đ−ợc bμn đến trong những chng sau.

6. Công nghệ sinh học v các nớc ®ang ph¸t triĨn

Một nền nơng nghiệp thắng lợi lμ câu trả lời cho việc rút ngắn khoảng
cách giữa các n−ớc giμu vμ các n−ớc nghèo. ở những n−ớc phát triển khoa học
về nông nghiệp phát triển rất mạnh, sản xuất ra một l−ợng lớn các sản phẩm

chất l−ợng cao. Công nghệ sinh học nông nghiệp sẽ cμng cải tiến chất l−ợng,
chủng loại vμ sản l−ợng nông nghiệp. Liệu những loμi cây mới đ−ợc cải biến
bằng kỹ thuật gen có tìm đ−ợc đ−ờng đến với những n−ớc đang phát triển đảm
bảo năng suất cao hơn, sức đề kháng bệnh tốt hơn vμ dễ đ−ợc thị tr−ờng chấp
nhận hơn? Ch−a có gì rõ rμng, cái gì sẽ xảy ra khi các n−ớc giμu ngμy cμng
đ−ợc cung cấp thừa thãi thực phẩm. Liệu có đủ l−ơng thực cho mọi ng−ời
nh−ng vẫn tiếp tục phân bố không đều không? Sự phát triển công nghệ sinh
học rất cần đầu t− cả tiền của vμ lực l−ợng lao động lμnh nghề cao. Cả hai yếu
tố chính đó các n−ớc đang phát triển đều thiếu.

Tr−ớc đây một số quốc gia đang phát triển đã hợp tác có hiệu quả với các
công ty công nghệ sinh học ph−ơng Tây. Song ngμy cμng thấy sự đầu t− nμy bị
giảm dần. Ví dụ từ năm 1986 - 1991, tỷ lệ các thoả thuận đ−ợc các công ty sinh
học Mỹ thực hiện với các n−ớc đang phát triển giảm từ 30% cịn 3%! Các n−ớc
đang phát triển cần nhìn rõ tiềm năng của cơng nghệ sinh học mμ có ph−ơng
h−ớng phát triển sao cho phù hợp với trình độ vμ tiềm năng của đất n−ớc
mình, phải biết đi tắt đón đầu, nhanh chóng hội nhập vμ cố gắng có những
phát minh riêng của mình.

Cuối cùng cũng cần nói rằng hầu hết các ngμnh khoa học đều trải qua
thời kỳ vμng son của mình khi mμ những cách tiếp cận mới mở ra con đ−ờng
cho sự phát triển cơ bản vμ nhanh chóng. Cơng nghệ sinh học chỉ mới bắt đầu,
hãy nhớ lấy lời nhắn nhủ “hoặc bắt đầu ngay hoặc không bao giờ”. T−ơng lai
sáng lạn đang chờ ta phớa trc.

</div>
(18)<div class='page_container' data-page=18>

Ch

ơng 2

Nguyên liệu cho công nghệ sinh học

Mục tiêu

Sau khi học xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc:
1. Tên các nguồn nguyên liệu chủ yếu của CNSH.

2. Ưu thế của CNSH so với các ngnh khác trong việc tận dụng các sản 
phẩm phụ.

1. ChiÕn l−ỵc sinh khèi

Ước tính sản l−ợng hμng năm sinh khối thực vật tạo ra do quang hợp
khoảng 120 tỉ tấn chất khô trên mặt đất vμ khoảng 5 tỉ tấn từ đại d−ơng.
Trong số sinh khối sản ra trên mặt đất có khoảng 50% ở d−ới dạng
lignocellulose. Tỉ lệ lớn nhất của sinh khối trên mặt đất (44%) lμ từ rừng
(bảng 2.1).

Bảng 2.1. Phân chia sản l−ợng sinh khối sản xuất trên trái đất

Sinh khối sản xuất trên trái đất Năng suất thực 
(% trên tổng số )

Rừng và vùng có cây cối
Đồng cỏ

Đất canh tác

Hoang mạc và bán hoang mạc
Nớc ngọt

Đại dơng

44,3%
9,7%
5,9%
1,5%
3,2%
35,4%

</div>
(19)<div class='page_container' data-page=19>

của công nghệ sinh học ở những vùng đang phát triển nơi có sự tăng tr−ởng
thực vật trội hơn, có khả năng dẫn đến thay đổi trong cán cân kinh tế.

Cần nhận thấy rằng nguồn nguyên liệu năng l−ợng không tái chế đ−ợc
mμ xã hội hiện đại quá phụ thuộc nh− dầu mỏ, than đá đều có nguồn gốc từ
sinh khối cổ đại. Những quốc gia có cơng nghiệp hiện đại ngμy cμng phụ thuộc
vμo dự trữ nguồn năng l−ợng nμy cũng nh− nguồn nguyên liệu cho hμng loạt
các ngμnh sản xuất.

B¶ng 2.2. Sản lợng hàng năm của một số sản phẩm nông, lâm nghiệp trên thế giới
(Nguồn: từ tổ chức vì sự phát triển và hợp tác kinh tế, 1992)

Ngành Sản phẩm Sản lợng 
(tấn)

Trị giá 
(tỷ $)

Ngũ cèc 1,8 tû 250

MÝa 120 triÖu -

Đờng

Củ cải 1,8 triệu -

Cá 85 triƯu

Tinh bét th« 1,0 tû 17

Lơng thực
và thức ăn
gia súc

Tinh bt ó tinh ch 20 triu -

Tiềm năng gỗ 13 tỷ -

Gỗ thu hoạch 1,6 tỷ -

Gỗ nhiên liệu - 100

Gỗ ca 200 triệu 60

Vật liệu

Giấy - 110

Dầu và glycerin 70 -

Dầu đậu tơng 17 8

DÇu cä 10 3

DÇu h−íng dơng 8 4

Dầu hạt cải 8 3

Tinh bét 2 -

Ho¸ chÊt

Cao su tự nhiên 4 4

Các loại hoa 4 10

Kh¸c

</div>
(20)<div class='page_container' data-page=20>

Gần một thế kỷ qua, thế giới cơng nghiệp hố đã phải nhờ đến nguyên
liệu hoá thạch mμ phải mất hμng trăm triệu năm để hình thμnh d−ới lịng đại
d−ơng hay sâu trong lòng đất. Hơn nữa việc sử dụng lại rất không công bằng:
Hiện tại n−ớc Mỹ với 6% dân số vμ Tây Âu với 8% dân số thế giới sử dụng 31%
vμ 20% t−ơng ứng toμn bộ sản l−ợng dầu vμ khí trên thế giới.

Trong khi dự trữ than có thể kéo dμi hμng trăm năm thì nguồn dầu vμ khí
với mức tiêu thụ nh− hiện nay sẽ cạn kiệt vμo một lúc nμo đó của thế kỷ XXI
nμy. Câu trả lời về vấn đề nμy lμ phải dùng sinh khối từ quang hợp để cung cấp
năng l−ợng vμ nguyên liệu cho công nghiệp. Những năm gần đây cho thấy hμng
năm năng l−ợng đ−ợc sinh ra từ quang hợp gấp hơn 10 lần so với l−ợng con
ng−ời sử dụng. Việc khai thác sinh khối qui mô lớn dùng cho nhiên liệu vμ
nguyên liệu bị hạn chế bởi giá thμnh còn đắt hơn giá nguyên liệu hoá thạch.

Sử dụng sinh khối trực tiếp nh− lμ nguồn nguyên liệu chỉ ở những vùng

cơng nghiệp hố nh− Mỹ la tinh, ấn Độ, châu Phi. ở những n−ớc phát triển, sinh
khối từ nông nghiệp vμ lâm nghiệp đ−ợc dùng chủ yếu trong công nghiệp vμ thực
phẩm (bảng 2.2). Hiện nay sinh khối đ−ợc sử dụng để sản xuất những sản phẩm
công nghiệp vμ th−ơng mại quan trọng (bảng 2.3) vμ những chất dùng trong công
nghệ sinh học sẽ đ−ợc nêu bật vμ nói rõ trong những ch−ơng sau.

Bảng 2.3. Những sản phẩm quan trọng từ sinh khèi

Nhiªn liƯu

- Methan (biogas) đặc biệt ở các n−ớc phát triển
- Sản phẩm của sự nhiệt phân (khớ, than)

- Ethanol (thông qua lên men rỉ đờng và cellulose)
- Dầu (từ hydro hoá)

- Đốt trực tiếp chất thải sinh khối

Nguyên
liệu

- Ethanol (nguồn nguyên liệu có tiềm năng cho công nghiệp)
- Khí tổng hợp (từ quá trình khí hoá)

- Phân bón.

- Phân trộn (compot)
- Bùn

Thức ăn

gia sóc

- Bổ sung trực tiếp vào thức ăn gia sỳc
- m n bo

2. Nguyên liệu thô thiên nhiên

</div>
(21)<div class='page_container' data-page=21>

Bảng 2.4. Các loại sản phẩm phụ có thể làm cơ chất trong CNSH

Ngành Các sản phẩm phụ có thể dùng làm cơ chất

Nông
nghiệp

Rơm

BÃ mía, củ cải đờng
Lõi ngô

Vỏ cà phê, côca, dừa
Vỏ, lá trái cây

ChÊt th¶i cđa chÌ

Bánh ép từ các hạt để ly du
Cht thi t bụng

Cám

Thịt quả cà chua, cà phê, chuối, dứa, chanh, ô liu

Chất thải cđa gia sóc

L©m
nghiƯp

Chất thải dung dịch thuỷ phân gỗ
Dung dịch n−ớc quả đã sulfat hoá
Vỏ cây, mùn c−a, các cành cây
Giấy và cellulose

Sỵi phíp

Công
nghiệp

Mật đờng

Chất thải của nhà máy ch−ng cÊt r−ỵu

Chất lỏng giống nh− n−ớc sau khi sa chua ụng li

Nớc thải công nghiệp từ CN thực phẩm (ô liu, dầu cọ, cà chua, chà là,
chanh, s¾n)

N−ớc thải (từ ngành sữa, đóng hộp, bánh kẹo, n−ớng bánh mỳ, đồ uống
không cồn, mạch nha, nc ngõm ngụ)

Chất thải ngành thuỷ sản

Sn phm phụ của ngành chế biến thịt

Rác đơ thị

N−íc cống

Chất thải ở lò sát sinh.

Nhng nguyờn liu thơ có chứa đ−ờng nh− củ cải đ−ờng, mía rất sẵn vμ
thích hợp để dùng lμm ngun liệu cho cơng nghệ sinh học. Do việc sử dụng
đ−ờng truyền thống có thể đ−ợc thay thế bằng các đ−ờng có hiệu quả t−ơng
đ−ơng sẽ dẫn đến thừa đ−ờng hμng hoá vμ khuyến khích phát triển những
cách sử dụng mới. Nhiều ngμnh kinh tế nhiệt đới sẽ phá sản nếu nh− thị
tr−ờng đ−ờng bị mất đi. Đ−ờng mía đ−ợc sử dụng ở Brazil lμm nguyên liệu cho
ch−ơng trình khí gas, một số quốc gia khác cũng đang nghiên cứu để áp dụng
tiềm năng to lớn nμy.

</div>
(22)<div class='page_container' data-page=22>

Nguồn nguyên liệu vô tận từ thiên nhiên lμ cellulose sẽ trở thμnh ngun
liệu chính cho cơng nghệ sinh học. Bởi vì khơng có cây xanh thì sự sống trên
trái đất cũng khơng cịn. Tuy nhiên hμng loạt khó khăn về mặt cơng nghệ cần
phải khắc phục tr−ớc khi có đ−ợc lợi ích kinh tế từ hợp chất phong phú nμy.
Cellulose nguyên chất có thể phân huỷ bằng hoá học hoặc enzym thμnh đ−ờng,
sau đó lên men để tạo thμnh các sản phẩm khác nhau nh− ethanol, aceton,
protein đơn bμo metan vμ các sản phẩm khác. Ng−ời ta tính tốn rằng hμng
năm có khoảng 3.3 x 1014 kg CO

2 đ−ợc cố định trên bề mặt trái đất vμ khoảng

6% sè ny, tức 22 ngn triệu tấn một năm sẽ thnh cellulose. Trên thế giới cây
cối hng năm sản xuất 24 tấn cellulose trên một đầu ngời. Thời gian sẽ cho
chóng ta thÊy r»ng lignocellulose lμ ngn carbon h÷u ích cho sự phát triển
của công nghệ sinh học.

3. Tính sẵn có của sản phẩm phụ

Nhiu quỏ trình cơng nghệ sinh học sử dụng sản phẩm nơng nghiệp nh−
đ−ờng, tinh bột, dầu thực vật... lμm nguyên liệu thì rất nhiều chất thải từ
nơng nghiệp hiện nay ch−a đ−ợc dùng, chắc chắn sẽ đ−ợc nghiên cứu để sử
dụng trong t−ơng lai không xa. Chất thải nông nghiệp vμ lâm nghiệp rất đa
dạng về chủng loại nh−: rơm ngũ cốc, vỏ vμ lõi ngô, chất thải từ đậu t−ơng, vỏ
dừa, vỏ hạt cμ phê, rỉ đ−ờng mía. Chất thải lâm nghiệp gồm: vỏ gỗ, mùn c−a vỏ
cây, ... (bảng 2.4) mới chỉ lμ một phần nhỏ của những chất thải trên đ−ợc dùng
ở qui mơ cơng nghiệp, phần cịn lại hiện ch−a đ−ợc sử dụng.

Mục đích chủ yếu của cơng nghệ sinh học lμ cải tiến cách quản lý vμ sử
dụng một số l−ợng lớn các chất thải hữu cơ của nông nghiệp, công nghiệp vμ
đô thị trên toμn cầu. Xử lý các chất thải đó sẽ lμm giảm thiểu các nguồn ô
nhiễm, đặc biệt lμ ô nhiễm n−ớc vμ biến một số chất thải thμnh những sản
phẩm có ích.

Xử lý n−ớc thải ơ nhiễm có thể bằng công nghệ sinh học, hoặc bằng
ph−ơng pháp siêu lọc. Ng−ời ta sử dụng một mμng xốp cho n−ớc đi qua nh−ng
không cho các chất rắn hoặc các chất có phân tử lớn đi qua. Tuy nhiên ph−ơng
pháp nμy giá thμnh đắt, hiện đ−ợc dùng ở một số lĩnh vực nh− sản xuất n−ớc
ngọt phục vụ cho những ng−ời đang sống trên biển thiếu n−ớc ngọt, hoặc
những chất rắn không độc ra khỏi n−ớc.

</div>
(23)<div class='page_container' data-page=23>

tồn tại với một khoảng thời gian kéo di thì một phơng pháp sử dụng phù
hợp mới đợc xem xét (bảng 2.5).

Bảng 2.5. Chiến lợc CNSH sử dụng chất thải hữu cơ phù hợp

Nõng cp cht l−ợng chất thải thực phẩm để biến chúng thành sản phẩm thích hợp
phục vụ việc sử dụng của con ngi.

Đa chất thải thực phẩm trực tiếp hoặc qua xử lý vào làm thức ăn cho lợn, gia cầm, cá
hoặc các vật nuôi khác.

Sản xuất biogas (methan) và những sản phẩm lên men khác nếu chi phí cho việc xử lý
chất thải làm thức ăn gia sóc qu¸ tèn kÐm.

Những mục đích chọn lọc khác nh− dùng trực tiếp làm nhiên liệu, vật liệu xây dựng ...

Hai chất thải có nhiều đ−ợc ứng dụng để lên men lμ rỉ đ−ờng vμ n−ớc thải
của công nghệ sản xuất sữa chua. Rỉ đ−ờng lμ sản phẩm phụ của cơng nghệ
đ−ờng có chứa khoảng 50% đ−ờng khử. Rỉ đ−ờng đ−ợc sử dụng rộng rãi lμm
nguyên liệu lên men sản xuất kháng sinh, acid amin, acid hữu cơ, nấm men
th−ơng mại để sản xuất bánh mì vμ dùng trực tiếp để ni gia súc. N−ớc thải
của công nghệ sữa chua, phomát cũng đ−ợc s dng cho cụng ngh lờn men.

Những chất thải nh rơm rạ, bÃ mía rất sẵn v ngy cng đợc sử dụng
nhiều hơn do quá trình phân huỷ lignocellulose ngy cng đợc cải tiến
(bảng 2.6).

Bng 2.6. Các xử lý cần thiết để cơ chất có th s dng lờn men

Nguyên liệu Cơ chất Xử lý

Các nguyên liệu
chứa đờng

Mía, củ cải đờng, rỉ

đờng, nớc ép hoa
quả, nớc sữa

Cần pha loÃng hoặc khử trùng

Các nguyên liệu
chứa tinh bét

Ngị cèc, rau qu¶,
chÊt th¶i láng tõ quá
trình chế biến

Cần xử lý thuỷ phân bằng acid hoặc
enzym, có thể tách những thành phần
không phải tinh bột ra trớc

Các nguyên liệu
chứa lignocellulose

Lõi ngô, trấu, rơm
rạ, bÃ mía, chất thải
gỗ, dung dịch sulfat,
chất thải giấy

Cn lm vn nguyờn liệu sau đó thuỷ
phân bằng hố học hoặc enzym, đòi
hỏi nhiều năng l−ợng và đắt tiền

</div>
(24)<div class='page_container' data-page=24>

4. Nguyên liệu hoá học v hoá dầu

Bên cạnh việc phát triển sản xuất protein đơn bμo (single cell protein,
viết tắt lμ SCP) vμ các sản phẩm hữu cơ khác, một số nguyên liệu hoá dầu,
hoá học đã trở thμnh nguyên liệu quan trọng cho cơng nghệ lên men. Những
ngun liệu nμy có nhiều −u điểm nh− sẵn có với khối l−ợng lớn vμ có cùng
chất l−ợng ở các địa điểm khác nhau trên thế giới. Do vậy khí tự nhiên hay
methan vμ dầu khí đ−ợc coi nh− ngun liệu thơ bởi chúng dễ chế biến. Mối
quan tâm chính về mặt th−ơng mại lμ các n-parafin, methanol, ethanol. Các
chất nμy đ−ợc sử dụng vμo mục đích khác nhau của công nghệ sinh học, đặc
biệt để sản xuất SCP sẽ đ−ợc nói kỹ ở phần sau. Trong t−ơng lai các q trình
cơng nghệ sinh học ngμy cμng tận dụng đ−ợc những nguyên liệu có thể tái chế
trong thiên nhiên, bởi vì các chất thải kém giá trị hiện nay gây ơ nhiễm mơi
tr−ờng. Bảng 2.7 tóm tắt về mặt kỹ thuật cần l−u ý khi tiếp cận với các chất
thải muốn sử dụng lμm nguyên liu.

Bảng 2.7. Những cân nhắc về kỹ thuật cho việc sử dụng chất thải

Nội dung Đặc điểm

Sự sẵn có về mặt sinh
học

ã Thấp (cellulose)

ã Trung bình (tinh bột, lactose)

ã Cao (rỉ đờng, đờng hoa quả)

Nng

ã Chất rắn (phần còn lại sau khi xay rác)

ã Cụ c (mt mớa)

ã LoÃng (lactose, đờng trong hoa quả)

ã Rất loÃng (dung dịch xử lý trong quá trình)

Chất lợng

ã Sạch (mật mía, lactose)

ã Trung bình (rơm)

ã Bẩn (rác, chất thải gia súc)

Vị trí

ã Tp trung (ni t cỏc thit b ln)

ã Tập trung chuyên môn hoá (dầu cọ, ô liu, chà là, cao su, hoa
quả)

ã Phân tán (rơm, rừng)

Mùa ã Kéo dài (dầu cọ, lactose)

ã Rt ngn (cht thi ca ngnh úng hp rau qu)

Cách sử dụng tơng
đơng

ã Một số cách (rơm)

ã Không có (rác)

ã Cách tiêu cực (nớc thải)
Tiềm năng công nghệ

ca a phng

ã Cao (Mỹ)

ã Trung bình (Brazil)

</div>
(25)<div class='page_container' data-page=25>

5. Nguyên liệu thô vμ t−ơng lai của công nghệ sinh học 
Chúng ta biết rằng sự phát triển trong t−ơng lai của các q trình cơng
nghệ sinh học qui mô lớn không thể tách rời việc cung cấp các nguyên liệu thô
vμ giá trị của chúng. Tiêu chuẩn quan trọng nhất quyết định việc chọn ngun
liệu thơ cho một q trình cơng nghệ sinh học bao gồm sự sẵn có, giá cả, thμnh
phần vμ hình thức, tình trạng oxy hố nguồn carbon. Nguyên liệu đ−ợc sử
dụng rộng rãi nhất lμ ngô, đ−ờng thơ, rỉ đ−ờng, methanol.

Tóm lại, ngũ cốc sẽ lμ những ngun liệu thơ chính ngắn hạn vμ trung
hạn cho các q trình cơng nghệ sinh học vμ có giá trị th−ơng mại, nhất lμ
tinh bột. Tuy nhiên việc nμy khơng ảnh h−ởng gì đến sự cung cấp l−ơng thực
cho ng−ời vμ vật nuôi. Sự khủng hoảng thừa ngũ cốc xảy ra ở những nơi mμ
công nghệ sinh học đ−ợc ứng dụng rộng rãi. Đây lμ một ví dụ chứng minh về
hiệu quả cho sự đầu t− phát triển ngμnh khoa học đầy triển vọng nμy.

Mặc dù ng−ời ta chú ý nhiều đến việc sử dụng những chất thải trong

công nghệ sinh học, nh−ng vẫn cịn nhiều khó khăn to lớn cần v−ợt qua. Ví dụ:
chất thải nơng nghiệp chỉ có theo mùa vμ theo vùng địa lý, đôi khi các chất
thải nμy còn chứa cả độc tố. Sự tồn tại các chất thải nμy sẽ gây ơ nhiễm mơi
tr−ờng, vì vậy vẫn phải tìm mọi biện pháp để xử lý. Về lâu dμi cơng nghệ sinh
học phải tìm cách sử dụng cellulose vμ lignocellulose lμm nhiên liệu hay
nguyên liệu, tuy có khó khăn về mặt kỹ thuật.

Gỗ lμ nguồn cung cấp nhiên liệu, vật liệu cho xây dựng, nguyên liệu cho
công nghiệp giấy. Việc cung cấp cho nhu cầu trên hiện đang giảm đi nhanh
chóng. Nguyên nhân lμ việc phá rừng trμn lan ở nhiều quốc gia. Phá rừng dẫn
đến sa mạc hoá vμ xói mịn đất. Cơng nghệ sinh học đã tạo ra những cây trồng
mới để phủ xanh đồi trọc nh− cây keo lá trμm. Những cây phát triển nhanh
nh− keo lá trμm cịn hấp thụ nhiều khí CO2 nên cịn có tác dụng khắc phục

hiệu ứng nhμ kính. Công nghệ sinh học sẽ tạo ra những cây trồng biến đổi gen
có khả năng kháng sâu bệnh, năng suất cao chất l−ợng v−ợt trội so với giống
cũ, vì vậy trong t−ơng lai một nền nơng nghiệp sạch, hiệu quả vμ tiên tiến sẽ
lμm cho nhiều ng−ời mun tr thnh nụng dõn hn.

Tự lợng giá

</div>
(26)<div class='page_container' data-page=26>

Ch

ơng 3

Kỹ thuật lên men

Mục tiêu

Sau khi học xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc:

1. Trình by đợc tên các phơng pháp lên men, các quá trình cơ bản của

công nghệ lên men.

2. Kể tên đợc các thiết bị cơ bản của công nghệ lên men.

3. Nờu c tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy tế bμo động vật vμ

thùc vËt.

1. Giíi thiƯu tỉng qu¸t

Từ xa x−a loμi ng−ời đã biết nấu r−ợu để uống, biết lμm t−ơng, muối d−a,
biết ủ chua các thực phẩm để giữ đ−ợc lâu dμi... Các quá trình đó đ−ợc gọi lμ
lên men (bảng 3.1).

B¶ng 3.1. Các sản phẩm lên men phân theo lĩnh vực công nghiệp

Lĩnh vực công nghiệp Hoạt chất

Hữu cơ

(Số lợng lớn) Ethanol, aceton, butanol
Hoá

học

Hữu cơ
(Số lợng ít )

Acid hữu cơ (citric, itaconic), enzym
Các chất dùng cho mỹ phẩm

Các polymer (các polysaccharid)
Dợc phẩm

Các chất kháng sinh, vitamin

Các kit chẩn đốn (enzym, kháng thể đơn dịng)
Các enzym ức chế, các steroid, các vaccin
Năng l−ợng Ethanol (gasohol), methan (biogas)

Thực phẩm

Các sản phẩm từ sữa (phomát, sữa chua, ...)

Đồ uống (các loại rợu, trà, cà phê), men làm nở bánh
mì, các chÊt phơ gia cho thùc phÈm (chÊt chèng oxy
ho¸, chất màu, chất bảo quản)

Cỏc thc phm c bit (đậu t−ơng lên men, các loại
n−ớc xốt để trộn), cỏc acid amin, vitamin.

Các sản phẩm từ tinh bét

</div>
(27)<div class='page_container' data-page=27>

N«ng nghiƯp

Protein đơn bào, các vaccin cho động vật

ủ thức ăn cho gia súc, ủ phân bón
Vi sinh vật trừ sâu hại, cơn trùng
Rhizobium và các vi khuẩn cố định nitơ

Lên men mô và tế bào để nhân giống cây trồng…

Chỉ khi cơng nghệ lên men chìm sản xuất penicillin ra đời (1947) thì cơng
nghệ lên men mới thực sự phát triển vμ trở thμnh một ngμnh khoa học thực sự
– ngμnh công nghệ lên men.

Các quá trình lên men truyền thống chủ yếu sản xuất các thực phẩm vμ
đồ uống, hiện tại vẫn còn nguyên giá trị th−ơng mại. Song hiện nay các quá
trình đó đã đ−ợc sản xuất trên qui mơ cơng nghiệp với các thiết bị hiện đại vμ
tự động hoá, nên giá thμnh sản phẩm hạ đi rất nhiều. Có thể gọi các q trình
lên men đó bằng các tên sau:

− C¸c chÊt chun ho¸ bËc mét nh−: acid acetic, acid lactic, glycerol,
alcol butylic, amino acid, vitamin vμ polysaccharid;

− Các chất chuyển hoá bậc hai, lμ những chất ít đóng vai trị trong
chuyển hố vμ tạo ra sản phẩm. Nó phụ thuộc nhiều vμo thμnh phần
mơi tr−ờng lên men chúng. Ví dụ nh− sự hình thμnh các chất kháng
sinh (penicillin, streptomycin), kích tố sinh tr−ởng cây (giberellin),…
− Các enzym sử dụng trong công nghiệp gồm enzym ngoại bμo

(amylase, pectinase, protease), c¸c enzym néi bμo (invertase,
asparaginase, endonuclease ...).

Các quá trình lên men để sản xuất ra các sản phẩm nêu trên hiện nay
vẫn lμ những đòi hỏi thiết yếu của xã hội hiện đại. Bên cạnh những sản phẩm
đó, kỹ thuật sinh học cũng tạo ra những sản phẩm mới rất quan trọng từ tế
bμo thực vật vμ động vật. Lên men tế bμo thực vật nhằm mục đích tạo ra các
sản phẩm chuyển hố bậc hai (các tinh dầu, các chất gia vị, các d−ợc liệu). Lên
men tế bμo động vật để chế tạo vaccin. Kỹ thuật lên men cịn tạo ra các protein

có hoạt tính nh− interferon, interleukin…

Một số sản phẩm do cơng nghệ sinh học tạo ra, bằng ph−ơng pháp hố
học khơng thể sản xuất đ−ợc (bảng 3.2). Có những sản phẩm nếu vi sinh vật
sinh tổng hợp thì chỉ cần thực hiện ở nhiệt độ bình th−ờng. Song nếu thực hiện
bằng ph−ơng pháp hố học địi hỏi phải có áp suất đến hμng trăm kg/cm2.

</div>
(28)<div class='page_container' data-page=28>

Bảng 3.2.Ưu nhợc điểm của phơng pháp sinh tổng hợp

(so với phơng pháp hoá học)

u điểm

ã Các phân tử phức tạp nh protein, kháng sinh không thể tổng
hợp bằng hoá học.

ã Bin i sinh học cho năng suất cao hơn.

• Sinh tổng hợp thc hin nhit thp.

ã pH gần trung tÝnh.

• Xúc tác phản ứng có nhiều đặc điểm hơn.

• Sản phẩm thu đ−ợc khơng có đồng phân.

Nhợc điểm

ã Sinh tổng hợp dễ bị nhiễm trùng.

ã Các sản phẩm mong muốn thờng lẫn trong phức hợp, cần phải
tách riêng.

ã Cần xử lý một thể tích môi trờng lớn.

ã Quỏ trỡnh lờn men cần thời gian lâu hơn so với biến đổi hoá hc.

2. Các giai đoạn phát triển của vi sinh vật

Quá trình sinh trởng của vi sinh vật diễn ra theo các giai đoạn khác
nhau đợc gọi l c¸c pha ph¸t triĨn, bao gåm pha tiỊm ph¸t, pha logarit, pha
cân bằng v pha suy vong (hình 3.1).

Hình 3.1. Đặc điểm phát triển của vi sinh vật trong lên men chu kỳ

1. Pha tiềm phát
2. Pha nhân lên chậm
3-4. Pha logarit
5. Pha cân b»ng
6. Pha suy vong

</div>
(29)<div class='page_container' data-page=29>

Nghiên cứu quá trình sinh tr−ởng vμ phát triển của vi sinh vật trong
bình lên men để điều khiển quá trình sao cho vi sinh vật phát triển tốt nhất
vμ tạo ra đ−ợc tối đa sản phẩm mμ ta mong muốn. Để theo dõi sự phát triển
của vi sinh vật trong bình lên men th−ờng tiến hμnh phân tích một số chỉ tiêu
cơ bản nh− trọng l−ợng sinh khối trong một đơn vị thể tích, hμm l−ợng protein
hoặc ADN trong tế bμo, số l−ợng tế bμo/đơn vị thể tích. Sự tăng sinh khối
trong một đơn vị thể tích bao hμm sự tăng về số l−ợng tế bμo vμ sự tăng về
kích th−ớc mỗi tế bμo.

Thời gian trung bình để tăng gấp đơi tế bμo đối với các vi sinh vật nh− sau:
− Vi khuẩn : 0,25 - 1 giờ

− Nấm men : 1-2 giờ
− Nấm mốc : 2 - 6,5 giờ
− Tế bμo thực vật : 20 - 70 giờ
− Tế bμo động vật : 15 - 48 giờ

Để đạt đ−ợc tốc độ sinh tr−ởng của vi sinh vật theo mong muốn vμ tạo ra
sản phẩm với hiệu suất tối đa cũng cần phải nghiên cứu thêm các điều kiện
khác nữa nh− thμnh phần mơi tr−ờng các chất kích thích sinh tr−ởng, các tiền
chất (precusor) để h−ớng dẫn vi sinh vật tạo ra các sản phẩm mong muốn. Ví
dụ, thêm acid phenylacetic vμo môi tr−ờng lên men sinh tổng hợp penicillin ta
thu đ−ợc benzylpenicillin (penicillin G), còn nếu ta thêm vμo môi tr−ờng chất
acid phenoxyacetic ta lại thu đ−ợc phenoxymethylpenicillin (penicillin V), rõ
rμng lμ có thể điều khiển đ−ợc quá trình lên men theo ý muốn. Trên thực tế
các viện nghiên cứu, các nhμ máy sản xuất các chế phẩm sinh học đều có
phịng nghiên cứu v cụng ngh lờn men.

Trong công nghệ lên men, ngời ta cũng phân ra các kiểu lên men (nuôi
cấy) sau: lên men chu kỳ (batch fermentation), lên men bán liên tục (semi
continuous fermentation) v lên men liªn tơc (continuous fermentation).

Trong lên men chu kỳ, vi sinh vật đ−ợc ni cố định trong bình lên men
với một thể tích mơi tr−ờng xác định. Vi sinh vật phát triển theo giai đoạn
(hình 3.1) vμ tạo ra các sản phẩm. Kết thúc quá trình, ng−ời ta tiến hμnh các
công đoạn cần thiết để thu lấy sản phẩm. Ph−ơng pháp lên men chu kỳ đ−ợc
ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng nh− acid amin, các chất
kháng sinh.

Lên men chu kỳ có cải tiến cũng đ−ợc áp dụng nhằm nâng cao hiệu
quả sử dụng bình lên men. Ví dụ ni các nấm men để thu sinh khối tế bμo,
nhằm thu đ−ợc năng suất cao trong một đơn vị thể tích ni cấy, trong q
trình ni th−ờng bổ sung thêm dinh d−ỡng (hydrat carbon) vμ các yếu tố cần
thiết khác nhằm lμm cho mật độ tế bμo trong bình tăng lên.

</div>
(30)<div class='page_container' data-page=30>

sinh khối cần thiết ng−ời ta lấy bớt đi một thể tích mơi tr−ờng bao gồm cả sinh
khối, đồng thời bổ sung thêm một thể tích mơi tr−ờng mới bằng chính l−ợng
mơi tr−ờng đã lấy đi. Bằng cách lμm nh− vậy chỉ cần truyền giống một lần vẫn
có thể thu hoạch sản phẩm nhiều lần.

Hình 3.2. Sơ đồ đơn giản mô tả nguyên tắc lên men liên tục

Lên men liên tục lμ quá trình ni vi sinh vật trong thiết bị đ−ợc cấu
tạo đặc biệt để sao cho khi vật nuôi đã phát triển đến một giai đoạn nμo đó
thích hợp cho việc lấy đi một thể tích mơi tr−ờng lên men cùng tế bμo vμ các
sản phẩm trao đổi chất của chúng, lại bổ sung đúng một thể tích mơi tr−ờng
dinh d−ỡng mới vμo bình ni cấy, lúc đó ta có đ−ợc trạng thái cân bằng động.
Vi sinh vật trong bình ni ln ln ở pha logarit (hỡnh 3.2).

Đặc điểm của các phơng pháp lên men vi sinh vật. 
Bảng 3.3. Đặc điểm của các phơng pháp lªn men

Ph−ơng pháp lên men Các đặc điểm thao tỏc

Môi trờng xốp Đơn giản, rẻ, có thĨ chän läc

Ni bề mặt Các khuẩn lạc từ tế bào đơn; kiểm tra quá trình bị giới hạn

Lên men chìm đồng thể

phân phối tế bào chu kỳ

Các kiểu bình lên men khác nhau; lọc tia, đĩa quay, ống quay
bình phản ứng tạo bọt tự động phản ứng, các kiểu bình phản
ứng khác nhau: liên tục bình phản ứng có khuấy, bình elip,
vịng ... có máy khuấy, hoặc khuấy bằng khí nén, có thể kiểm
tra các hằng số vật lý trong chất lỏng, nh−ng chủ yếu là kiểm
tra các hằng số hoá học và sinh học.

Chu kỳ có bổ sung Ph−ơng phápđơn giản kiểm tra và điều chỉnh hiệu quả.
Liên tục đồng nhất một

giai đoạn

</div>
(31)<div class='page_container' data-page=31>

Phng phỏp lờn men liờn tục đ−ợc ứng dụng để sản xuất protein đơn
bμo (nấm men) sản xuất acid acetic, ethanol vμ xử lý n−ớc thải của một số nhμ
máy. Tuy nhiên do nhiều nguyên nhân nên ph−ơng pháp lên men chu kỳ vẫn
hay c ng dng hn.

Ưu điểm của kỹ thuật lªn men chu kú vμ chu kú cã bỉ sung môi trờng

ã Cung cp sn phm theo yờu cu với số l−ợng nhỏ ở bất kỳ thời
gian nμo, hoặc đơi khi có u cầu.

• Vịng đời của sản phẩm ngắn.

• Sản xuất với nồng độ cao trong dịch lên men yêu cầu quá trình
thao tác phi ti u.

ã Một vi sản phẩm chuyển hoá đợc tạo ra chỉ ở pha cân bằng của

chu kỳ phát triển.

ã Tớnh khụng n nh ca mt vμi chủng sản xuất cần l−u ý th−ờng
xuyên phải chọn lọc.

• Q trình lên men liên tục địi hỏi kỹ thuật phức tạp.
3. Thiết bị lên men vi sinh vật (fermentor)

1. Th©n nåi

2. Bộ phận trao đổi nhiệt
3. ống đựng nhiệt kế
4. ống dẫn khí vào
5. Giằng trục khuấy
6. Trục khuấy
7. Cánh khuấy
8. Bệ đỡ nồi
9. Nối trục

10. Bộ phận truyền động
11. Động cơ

</div>
(32)<div class='page_container' data-page=32>

Trong công nghệ lên men vi sinh vật thiết bị lên men lμ vấn đề vô cùng
quan trọng. Vi sinh vật sống vμ phát triển trong điều kiện vô trùng tuyệt đối,
phải cung cấp đủ oxy hoμ tan trong môi tr−ờng cho vi sinh vật hô hấp. Thiết bị
khuấy trộn có cấu tạo đặc biệt vì vừa phải hoμ tan oxy vμo mơi tr−ờng, vừa
phải khuấy trộn một hỗn hợp các tế bμo sống đặc quánh không tan trong n−ớc,
lại lμm việc liên tục trong thời gian dμi (th−ờng từ 4-7 ngμy). Thiết bị lên men
cần có bộ phận trao đổi nhiệt hữu hiệu, vì đa số vi sinh vật sống vμ phỏt trin
nhit t 260C-300C.

Hình 3.4. Các dạng thiết bị lên men vi sinh vật

</div>
(33)<div class='page_container' data-page=33>

Kể từ khi penicillin đ−ợc sản xuất bằng ph−ơng pháp lên men chìm
(1947), cho đến nay thiết bị lên men đã đ−ợc cải tiến vμ hoμn thiện rất nhiều.
Về nguyên lý chung đó lμ một thiết bị có hình trụ chế tạo bằng thép khơng rỉ
(stainless steel) có dung tích khác nhau từ 5-10 lít dùng trong phịng thí
nghiệm, 50-500 lít ở qui mơ pilot, 50.000-150.000 lít dùng lên men tạo kháng
sinh, 300.000 - 500.000 lít dùng lên men sản xuất acid amin (hình 3.3).

Các thiết bị lên men hiện nay đ−ợc chế tạo theo kiểu dáng khơng khác
tr−ớc. Song nó đ−ợc gắn các điện cực để đo pH, nhiệt độ, oxy hoμ tan, điện cực
dò bọt vμ các bộ cảm biến (sensor) đ−ợc khuếch đại vμ gắn với các máy phân
tích tự động các thμnh phần mơi tr−ờng, rồi lại tự động điều chỉnh mở các van
điện từ bổ sung các chất cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật. Nhờ q
trình tự động hố vμ máy tính cμi đặt sẵn ch−ơng trình điều khiển nên công
nghệ lên men đã trở thμnh một ngμnh cơng nghệ vừa hiện đại vừa có sức hấp
dẫn những ai đang lμm việc trong lĩnh vực nμy.

4. Vấn đề cung cấp khơng khí vơ trùng cho nhμ máy lên 
men vi sinh vật

Hình 3.5. Sơ đồ hệ thống thiết bị lọc khơng khí vơ trùng
1. Lọc sơ bộ; 2. Máy nén khí; 3, 5. Thiết bị làm nguội khí;
4. Bình chứa khí; 6. Thiết bị lọc khí lần thứ nhất;

7. ThiÕt bÞ sÊy khÝ; 8. Thiết bị lọc khí lần hai.

</div>
(34)<div class='page_container' data-page=34>

vμ các vi sinh vật có kích th−ớc (0,5-2,0 μm). Chi phí điện năng cho cơng nghệ
lọc khí vơ khuẩn cũng rất lớn. Thμnh công hay thất bại của cơng nghệ lên men

chính lμ vấn đề vơ khuẩn của khơng khí.

1.Bé phËn Ðp vËt liƯu läc
2.L−íi trên

3.Vật liệu lọc
4.Than hoạt

5.Ngn cha vt liệu lọc
6.L−ới đỡ vật liệu lọc
7.Thân thiết bị lc
8.V ngoi.

Hình 3.6. Thiết bị lọc khí vô trùng

5. Khử trùng môi trờng trong 
công nghệ lên men

Trong cơng nghệ lên men chìm để thu
sản phẩm, nếu các thiết bị lên men có dung
tích từ 30 lít đến 10.000 lít th−ờng mơi tr−ờng
đ−ợc pha chế trực tiếp trong thiết bị lên men.
Sau đó dùng hơi nóng đun đến nhiệt độ khử
trùng qua bộ phận truyền nhiệt giữ nhiệt độ
vμ thời gian khử trùng thích hợp. Khử trùng
xong, mơi tr−ờng đ−ợc lμm nguội đến nhiệt độ
thích hợp (25-30OC). Khi lên men vi sinh vật ở

thiết bị lớn hơn (50.000-300.000 lít) nếu đun
nóng trực tiếp để khử trùng thì địi hỏi cơng

suất của thiết bị cung cấp hơi lớn, nếu không
thời gian đun đến nhiệt độ khử trùng quá dμi
sẽ lμm ảnh h−ởng đến chất l−ợng các thμnh
phần dinh d−ỡng có trong mơi tr−ờng, từ đó sẽ
ảnh h−ởng đến sự phát triển của vi sinh vật
lên men để thu sản phẩm. Vì vậy trong công

2
1

7
6
5
4

Hình 3.7. Sơ đồ cấu tạo thiết bị
khử trùng liên tục

</div>
(35)<div class='page_container' data-page=35>

nghệ lên men chìm ng−ời ta đã chế tạo ra thiết bị khử trùng liên tục (cột khử
trùng) để khắc phục các nh−ợc điểm trên. Cột khử trùng liên tục còn có −u
điểm nữa lμ: cho phép pha chế riêng từng thμnh phần môi tr−ờng vμ khử
trùng ở những chế độ riêng nên môi tr−ờng dinh d−ỡng không bị phá huỷ
(hình 3.7).

6. Läc vμ thiÕt bÞ läc trong công nghiệp sản xuất kháng 
sinh

Trong cụng nghip vi sinh vật nói chung vμ cơng nghiệp kháng sinh nói
riêng, th−ờng phải lọc một thể tích lớn mơi tr−ờng lên men trong đó chứa vi
sinh vật (xạ khuẩn, nấm mốc, vi khuẩn). Chúng lμ những cá thể kích th−ớc
vừa nhỏ lại nằm trong mơi tr−ờng có độ nhớt cao do các sản phẩm trao đổi
chất của vi sinh vật cùng với thμnh phần môi tr−ờng dinh d−ỡng ch−a sử dụng
hết, dầu phá bọt... nồng độ các chất kháng sinh trong môi tr−ờng thấp, nhiều
chất lại khơng bền vững. Vì vậy để chiết xuất vμ tinh chế đ−ợc hoạt chất, công
đoạn quan trọng bậc nhất lμ phải lọc để phân riêng sinh khối vμ dịch lọc trong
khoảng thời gian ngắn cho phép. Để lọc đ−ợc nhanh cần phải thêm các chất trợ
lọc, các chất có khả năng lμm đơng vón protein... Tuy nhiên thiết bị lọc cũng
rất quan trọng. Có thể dùng lọc ép khung bản để lọc dịch lên men. Song nh−ợc
điểm của thiết bị lọc ép lμ lμm việc không liên tục. Khi sinh khối đã chất đầy
các khoang lại phải tháo bã vμ lắp lại thiết bị rồi mới tiến hμnh lọc tiếp đ−ợc.
Vì vậy trong các nhμ máy sản xuất kháng sinh th−ờng sử dụng thiết bị lọc
trống quay (hình 3.8). Ưu điểm của thiết bị nμy lμ có thể lμm việc liên tục, tự
động hoá việc loại bã. Máy chỉ ngừng lμm việc khi nμo năng suất lọc giảm,
máy có diện tích bề mặt lọc lớn nên năng suất lọc cao.

Hình 3.8. Sơ đồ cắt ngang máy lọc chân khơng hình trống
1. Thùng rỗng

2. BĨ chøa hun phï
3. V¶i läc

4. Dao cạo bÃ
5. Cánh khuấy
6. Các ngăn
7. ống nối

</div>
(36)<div class='page_container' data-page=36>

7. Trình tự quá trình lên men

chun b cho lờn men qui mô công nghiệp, tr−ớc tiên giống đ−ợc
chọn lọc trên hộp petri, lấy một khuẩn lạc nuôi trên thạch nghiêng rồi ni
cho phát triển ở nhiệt độ thích hợp, tiếp sau chuyền vμo bình tam giác
(erlanmayer) ni trên máy lắc để cho vi sinh vật tiếp tục phát triển. Các b−ớc
tiếp sau đó giống đ−ợc ni trong các bình lên men có khuấy trộn từ thể tích
nhỏ đến thể tích lớn hơn (2 cấp). Giống ni trên bình nhân giống cấp hai đ−ợc
kiểm tra cẩn thận về tất cả các tiêu chuẩn cần thiết, nếu đạt yêu cầu mới
chuyền vμo thiết bị lên men ni tiếp để thu sản phẩm (hình 3.9).

Hình 3.9. Sơ đồ quá trình chuẩn bị giống để lên men
a. ống giống; b. Giống nuôi trên thạch nghiêng;
c. Giống ni trên máy lắc; d. Bình nhân giống cấp 1;
e. Bình nhân giống cấp 2; f. Bình lên men tạo sản phẩm.

8. ThiÕt kÕ môi trờng cho quá trình lên men

</div>
(37)<div class='page_container' data-page=37>

Bảng 3.5. Nguồn hydrat carbon và nitơ dùng cho công nghiệp lên men

Nguồn hydrat

carbon Dạng dùng

Nguồn nitơ 
(% nitơ/ trọng lợng)

Glucose Monohydrat tinh khiết, tinh bột thuỷ

phân Lúa mạch (1,5-2,0)

Lactose Lactose tinh khiết, bột sữa Mật rỉ củ cải ®−êng (1,5-2,0)

Tinh bét Lóa m¹ch, bét l¹c, n mạch, bột
gạo, bột đậu tơng

Cao ngô (4,5)
Bột lạc (8,0)

Bột yến mạch (1,5-2,0)
Bột đậu tơng (8,0)
Saccharose Mật rỉ củ cải đờng, đờng thô, mật,

đờng kính tinh khiết Bột sữa (4,5)

Trong mt vμi tr−ờng hợp còn cần các nhân tố phát triển hoặc các tiền
chất để điều khiển vi sinh vật tạo ra các chất mμ ta yêu cầu. Ví dụ lên men
sinh tổng hợp vitamin B12 nhờ vi khuẩn Propioni bacterium shermanii cần bổ
sung vμo môi tr−ờng chất 5, 6 dimetylbenzimidasol để tạo ra phân tử vitamin
B12 thật, vμ hiệu suất cũng cao hơn. Các nhân tố phát triển hay các tiền chất
chỉ cần với số l−ợng nhỏ mg/lít, thiếu nó q trình sinh tổng hợp sẽ thất bại.

Môi tr−ờng nuôi vi sinh vật cần đ−ợc khử trùng để loại đi tất cả các vi
sinh vật tạp nhiễm lẫn trong nguyên liệu. Công đoạn khử trùng mơi tr−ờng

cũng rất quan trọng. Vì nếu còn lại những cá thể vi sinh vật lạ ch−a bị tiêu
diệt, chúng sẽ tiếp tục phát triển cùng với vi sinh vật ni cấy lμm hỏng q
trình lên men. Th−ờng gọi đây lμ sự nhiễm trùng. Trong những năm 50 của
thế kỷ XX, công nghệ lên men cho phép nhiễm trùng 10% vì khi đó kỹ thuật
lên men mới bắt đầu phát triển. Vấn đề khử trùng mơi tr−ờng vμ lọc khơng
khí để đạt đ−ợc tuyệt đối vơ trùng lμ điều cực kỳ khó khăn. Từ những năm 70
của thế kỷ XX, công nghệ lên men không cho phép đ−ợc nhiễm trùng. Quá
trình lên men nếu bị nhiễm trùng phải đổ đi sẽ lμm thiệt hại to lớn về kinh tế.
Quá trình lên men có thμnh cơng hay khơng phụ thuộc chính vμo chất l−ợng
mơi tr−ờng dinh d−ỡng vμ kỹ thut kh trựng mụi trng.

9. Lên men trên cơ chÊt r¾n

</div>
(38)<div class='page_container' data-page=38>

chất rắn lμ cơng nghệ gia đình, cơng nghệ lên men truyền thống. Chính cơng
nghệ nμy đã bổ sung đ−ợc rất nhiều sản phẩm quí hiếm, đặc biệt lμ những
thực phẩm lên men cần số l−ợng ít giμu dinh d−ỡng trong khi cơng nghệ lên
men chìm khơng thể thực hiện đ−ợc (bảng 3.6).

Bảng 3.6. Một vài ví dụ lên men trên cơ chất rắn

Ví dụ Cơ chất Vi sinh vËt sư dơng

Trồng nấm
(Âu châu và
phng ụng)

Rơm, phân Agaricus bisporus, Lentinula edodes, Volvariella

volvaceae

Da cải bắp Cải bắp Vi khuẩn lactic

Tơng Đậu tơng và gạo Rhizopus oligosporus

Chao Đậu tơng Rhizopus oligosporus

Phomát Bột sữa Penicillium roquefortii

Acid hữu cơ Rỉ đờng Aspergillus niger

Các enzym Cám gạo, mì Aspergillus niger

Phân trộn Hỗn hợp các chất

hữu cơ Nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn

Xử lý nớc thải Các thành phần

của nớc thải Vi khuẩn, nấm mèc vµ protozoa

Các n−ớc ph−ơng tây th−ờng áp dụng ph−ơng pháp lên men nμy để trồng
nấm, sản xuất phomát. Một −u điểm nữa của kỹ thuật lên men trên cơ chất
rắn lμ có thể lên men cùng một lúc một hoặc hai, ba vi sinh vật trên cơ chất đó
mμ khơng gọi lμ nhiễm trùng. Một vi sinh vật tạo ra sản phẩm lên men chính,
vi sinh vật thứ hai có thể tạo ra h−ơng vị ... lμm cho sản phẩm lên men thêm
hấp dẫn vμ giá trị. Nấu r−ợu bằng bánh men thuốc bắc lμ ví dụ điển hình.

Ng−ời ta cũng chế tạo ra các thiết bị để lên men các cơ chất rắn, tuy nhiên
cấu tạo của nó đơn giản hơn nhiều so với thiết bị lên men chìm (hình 3.3).

10. Kỹ thuật nuôi cấy tế bμo động vật vμ thực vật

</div>
(39)<div class='page_container' data-page=39>

vμ có thể chấp nhận đ−ợc nếu nh− tiến hμnh trên đối t−ợng lμ những cây có
giá trị kinh tế cao nh− cây d−ơng địa hoμng (digitalis), nhμi (jasmine), l−u
lan h−ơng (spearmint).

Nuôi cấy tế bμo thực vật bằng ph−ơng pháp nuôi cấy chìm có khuấy trộn
vμ sục khơng khí vơ trùng về nguyên tắc cũng giống nh− lên men vi sinh vật.
Tuy nhiên mức độ cung cấp khơng khí vμ tốc độ khuấy ở đây thấp hơn nhiều
so với lên men vi sinh vật. Tuy đã có những sản phẩm nuôi cấy tế bμo thực vật
trên thị tr−ờng nh−ng ng−ời ta cũng ít hy vọng lμ nó sẽ có những sản phẩm
hμng hố cạnh tranh trên thị tr−ờng trong t−ơng lai. Nuôi cấy mô tế bμo thực
vật đ−ợc áp dụng để nhân giống vơ tính, sạch bệnh cung cấp giống cây trồng.
Nuôi cấy tế bμo vμ mô động vật trong vμi chục năm trở lại đây cũng phát triển
rộng rãi do áp dụng kỹ thuật di truyền. Hμng loạt tế bμo vμ mô đã đ−ợc nuôi
cấy nhân tạo nh−: tế bμo tuỷ x−ơng, sụn, gan, phổi, vú, da, ruột, thận, thần
kinh, tuyến yên vμ nhiều loại tế bμo ung th− khác. Sử dụng ph−ơng pháp nuôi
cấy tế bμo trên qui mô công nghiệp để sản xuất ra những chế phẩm sinh học có
giá trị cao dùng trong y học nh− các vaccin (bại liệt, sởi, quai bị, dại ...),
interferon, các hormon, insulin, plasminogen vμ các kháng thể. Vấn đề khó
khăn chính trong kỹ thuật ni cấy tế bμo lμ: tế bμo nuôi rất nhạy cảm với
những vi sinh vật nhiễm trong mơi tr−ờng. Do đó nuôi cấy tế bμo phải thực
hiện ở điều kiện vô trùng tuyệt đối. Khi tách lấy một tế bμo từ một cơ quan
của động vật đã biết gọi lμ tế bμo gốc chuẩn bị cho nuôi cấy tiếp sau, ở giai
đoạn nμy các tế bμo th−ờng khơng đồng nhất, sau đó phải tìm ra đ−ợc tế bμo
đại diện cho tế bμo kiểu cha mẹ biểu hiện những đặc điểm của mô học. Sau
một vμi lần nuôi cấy trên môi tr−ờng chọn lọc, dịng tế bμo chọn đ−ợc chẳng
những khơng chết mμ chuyển thμnh dòng tế bμo liên tục. So sánh với dịng tế
bμo ni ban đầu thì thấy rõ chúng đã có những thay đổi trong hình thái của
tế bμo chất, tế bμo phát triển nhanh hơn, tăng thêm một số đặc điểm ở nhiễm

sắc thể. Tế bμo động vật không những phát triển khi nuôi cấy ở dạng nhũ dịch
mμ còn mọc đ−ợc trên bề mặt môi tr−ờng đặc. Các tế bμo nh− kiểu Hela (các tế
bμo đã biến đổi từ một tế bμo u ác ở ng−ời) cũng có thể phát triển trong mơi
tr−ờng ni cấy huyền dịch, trong khi đó các tế bμo gốc hoặc tế bμo diploid
bình th−ờng chỉ mọc trên bề mặt môi tr−ờng đặc. Nuôi cấy bề mặt các tế bμo
động vật bị ảnh h−ởng bởi diện tích bề mặt mμ tế bμo tiếp xúc, do vậy phải tạo
ra các thiết bị nuôi sao cho bề mặt tiếp xúc của tế bμo đạt đ−ợc tối đa. Có
nhiều kiểu bình ni đ−ợc thiết kế theo các hình dáng khác nhau nh− dạng
ống, hoặc chai bẹt cốt để cho mặt thoáng rộng để tế bμo dễ dμng hơ hấp.

Ni cấy dạng huyền dịch có thể tiến hμnh trong các bình lên men nh−
ni vi sinh vật. Gần đây cịn kết hợp ni cấy dạng huyền dịch có bề mặt tiếp
xúc rộng bằng cách nuôi tế bμo trên những hạt mang tế bμo dạng đặc biệt
giống nh− Sephadex - DEAE. Các hạt nμy có diện tích bề mặt 7 cm2/mg. Các

</div>
(40)<div class='page_container' data-page=40>

11. Quá trình tinh chế để thu sản phẩm 
Sau khi kết thúc công đoạn nuôi cấyvi sinh vật hoặc
tế bμo động vật, phải tìm cách chiết xuất lấy hoạt chất vμ
tinh chế sản phẩm đạt đ−ợc các tiêu chuẩn cần thiết theo
qui định dùng điều trị. Q trình nμy gọi lμ q trình
xi dịng (downstream processing), tuỳ theo sản phẩm
chứa trong môi tr−ờng lên men mμ chọn ph−ơng pháp xử
lý thích hợp.

Cơng đoạn tinh chế sản phẩm địi hỏi nhiều nhân
cơng, những nhân cơng nμy phải có kiến thức vμ kỹ năng
cao về chuyên môn. Th−ờng sử dụng các cán bộ hố sinh,
hố học, ví dụ ở nhμ máy Eli Lilly sản xuất insulin có 200
cán bộ thì hơn 90% số ng−ời nμy lμm việc ở cơng đoạn tinh
chế sản phẩm.

Công đoạn chiết xuất để thu sản phẩm cịn quan
trọng hơn cơng đoạn lên men bởi vì các sản phẩm thuộc
nhóm nμy th−ờng rất không bền vững, hμm l−ợng chứa
trong môi tr−ờng lên men hoặc trong tế bμo th−ờng rất
thấp (0,1-3,0%). Do đó chiết để lấy ra đ−ợc lμ vơ cùng khó
khăn. Cơng đoạn tinh chế sản phẩm cịn quyết định tới giá
thμnh của sản phẩm. Ví dụ công nghệ lên men sản xuất
penicillin, những năm 60 của thế kỷ XX chiết xuất chỉ lấy
ra đ−ợc 60% hiệu suất môi tr−ờng. Hiện nay do cải tiến kỹ
thuật đã có thể chiết ra đ−ợc 90% hiệu sut mụi trng.

Các phơng pháp sử dụng bao gồm: lọc, ly tâm, chiết
bằng dung môi, bốc hơi chân không, hấp phụ, điện di,
thẩm tích, lọc mng chọn lọc...

Công đoạn chiết xuất v tinh chế sản phẩm bao gồm
nhiều bớc (hình 3.10).

Tự lợng giá

1. Kể tên các bộ phận v yêu cầu thiết kế của thiết bị lên men vi sinh vật.
2. Trình by các phơng pháp lọc không khí vô trùng v tầm quan

trọng của lọc khí vô trùng cho nh máy lên men.

3. Tại sao phải khử trùng môi trờng trong công nghệ lên men?

4. Nêu cấu tạo các thiết bị lọc trong công nghiệp sản xuất kháng sinh.
5. Nêu trình tự quá trình lên men.

</div>
(41)<div class='page_container' data-page=41>

Ch

ơng 4

Kỹ thuật sản xuất enzym

Mục tiêu

Sau khi học xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc:

1. Kỹ thuật sản xuất enzym nói chung vμ enzym dùng trong y học để điều 
trị bệnh.

2. Nguyên tắc vμ ứng dụng của ph−ơng pháp bất động enzym.

1. Đại cơng

Enzym l nhng phõn t protein phc tp tồn tại trong các tế bμo sống,
tại đó chúng đóng vai trị xúc tác sinh học lμm biến đổi hoá học các cơ chất. Do
sự phát triển của hoá sinh phân tử ng−ời ta đã hiểu biết khá rõ vai trò của các
enzym trong tế bμo sống. Cho dù enzym đ−ợc hình thμnh trong tế bμo sống,
nh−ng nếu tách rời enzym ra khỏi tế bμo nó vẫn thực hiện đ−ợc chức năng xúc
tác sinh học in vitro. Nhờ tính chất kì diệu đó đã lμm tăng khả năng sử dụng
enzym trong các quá trình công nghiệp. Hμng năm công nghiệp enzym thế giới
sản xuất hμng ngμn tấn tập trung vμo một số enzym sau: proteinase,
amyloglucosidase, amylase, glucose isomerase, rennet, pectinase…

Hoạt tính của enzym lμ đặc điểm xúc tác tự nhiên của nó. Mỗi enzym thực
hiện xúc tác cho một phản ứng, trong tế bμo sống có hμng loạt enzym khác nhau
để thực hiện một chuỗi phản ứng liên tục nh− các enzym trong mạch hô hấp tế
bμo. Các phản ứng xúc tác của enzym đ−ợc thực hiện ở nhiệt độ bình th−ờng,

cũng phản ứng ấy nếu thực hiện bằng hố học địi hỏi ở nhiệt độ vμ áp suất cao.
Khả năng phân giải của enzym cũng thật kỳ diệu, ví dụ 1 gram vi khuẩn lactic
có thể biến đổi một tấn lactose thμnh acid lactic trong vòng 1 giờ! Enzym tách
khỏi tế bμo d−ới dạng tinh khiết có thể thực hiện phản ứng xúc tác biến đổi cơ
chất nhiều lần với kỹ thuật đặc biệt có thể kéo dμi thời gian sử dụng enzym đến
6 tháng! Chức năng xúc tác của enzym còn phụ thuộc vμo cấu hình khơng gian
của chúng, chỉ cần lμm thay đổi cấu hình khơng gian bằng pH hay nhiệt độ lμ
enzym bị bất hoạt. Một vμi enzym có gắn thêm coenzym, các coenzym nμy có
thể lμ các ion kim loại, các nucleotid, các vitamin ...

</div>
(42)<div class='page_container' data-page=42>

khơng địi hỏi các thiết bị chống ăn mịn nh− trong cơng nghệ hố học. Kỹ
thuật enzym bao gồm lên men vi sinh vật, chiết xuất, tinh chế rồi sử dụng
enzym ở dạng hoμ tan hoặc dạng enzym bất động. Enzym đ−ợc sử dụng trong
nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống hμng ngμy, trong các lĩnh vực nghiên
cứu khoa học, dùng trong y học vμ bảo vệ mơi tr−ờng.

2. C¸c øng dơng cña enzym

Hμng ngμn năm tr−ớc đây loμi ng−ời đã biết ủ chua để giữ thực phẩm
đ−ợc lâu hơn, biết lμm bánh mì, phomát, lμm t−ơng, nấu r−ợu vμ lμm vang từ
quả nho (bảng 4.1). Hai tr−ờng ca nổi tiếng cổ Hy lạp lμ Iliad vμ Odysei
(khoảng 700 năm tr−ớc cơng ngun) cũng nói tới cách lμm phomát, chế r−ợu
nho nh−ng chẳng ai biết đ−ợc thủ phạm của q trình đó lμ enzym vi sinh vật.

ở các n−ớc ph−ơng Tây, công nghiệp enzym đ−ợc hiểu biết chỉ xung
quanh vấn đề nấm men vμ malt, nghề truyền thống của họ xem nh− chỉ có
cơng nghiệp lμm bánh mỳ lμ phát triển. Do đó ở nhiều n−ớc phát triển hoá
sinh tập trung vμo lên men sản xuất men cho công nghiệp lμm bánh mỳ vμ
biến đổi tinh bột thμnh đ−ờng. Trái lại các n−ớc ph−ơng Đông chú ý nhiều đến
chế biến thực phẩm bằng lên men. Họ sử dụng các nấm ăn lμm nguồn enzym.

Năm 1896 ở các n−ớc ph−ơng Tây có giới thiệu bán enzym đầu tiên từ vi sinh
vật lμ takadiastase từ Aspergillus oryzae, đó lμ enzym thuỷ phân. Ph−ơng
pháp sản xuất enzym nμy đã đ−ợc bắt đầu hμng ngμn năm tr−ớc ở Châu á.
Otto Rohm nhμ hoá học nổi tiếng ng−ời Đức đã tách đ−ợc protease đầu tiên từ
phân chó, sau đó đã tiến hμnh chiết enzym nμy từ các tạng của động vật.

Năm 1905, ng−ời ta đã tách đ−ợc pancrease từ gan bò vμ lợn. Vμo giữa
những năm 1950 kỹ thuật enzym phát triển nhanh chóng. Do cơng nghệ lên
men chìm sản xuất penicillin đòi hỏi những hiểu biết mới để lên men ở qui mô
lớn vi sinh vật sản xuất enzym, ng−ời ta đặc biệt chú trọng đến enzym từ vi
sinh vật vì các lý do sau:

Sự hiểu biết cơ bản về các đặc điểm của enzym đã đẫn đến việc sử dụng
rộng rãi enzym vμo các lĩnh vực khác nhau của đời sống.

</div>
(43)<div class='page_container' data-page=43>

một số enzym khác cũng đ−ợc sản xuất công nghiệp, nh−ng lại lμ enzym nội
bμo. Ví dụ glucose oxydase dùng bảo quản thực phẩm, asparaginase dùng điều
trị ung th− máu, penicillinamidase (penicillinacylase) dùng để sản xuất 6-APA
từ penicillin lμm nguyên liệu bán tổng hợp kháng sinh nhúm beta lactam.

Bảng 4.1. Các enzym vi sinh vật vµ øng dơng cđa chóng

Enzym Vi sinh vËt ứng dụng Công nghiệp

Amylase (phân giải
tinh bột)

• NÊm mèc

• Vi khuÈn

• NÊm mèc

• Vi khuÈn

• NÊm mèc

• Vi khuÈn

• Vi khuẩn

ã Bánh mì

ã Bao bột

ã Sản xuất glucose

ã Hồ hoá vải

ã Trợ giúp tiêu hoá

ã Rũ hồ vải

ã Tẩy vết bẩn

ã Bánh mì

ã Giấy

ã Thực phẩm

ã Tinh bột

ã Dợc phẩm

ã Dệt

ã Giặt là

Protease (phân giải
protein)

• NÊm mèc

• Vi khuÈn

• Vi khuẩn

ã Vi khuẩn

ã Bánh mì

ã Tẩy vết bẩn

ã Làm mềm thịt

ã Làm sạch vết thơng

ã Xử lý sợi

ã gia ỡnh

ã Bánh mì

ã Giặt khô

ã Thịt

ã Y học

ã Dệt

ã Giặt là
Invertase (thuỷ

phân saccharose) NÊm men KĐo xèp cã nh©n KÑo xèp

Glucose oxydase NÊm mèc • Lo¹i bá glucose

• KÝt giÊy thư tiĨu đờng

ã Thực phẩm

ã Dợc phẩm

Glucose isomerase Vi khuẩn Siro fructose từ ngô Đồ ng nhĐ

Pectinase NÊm mèc Läc lµm trong Vang, n−íc qu¶

Rennin NÊm mốc Đông tụ sữa Phomát

Cellulase Vi khuẩn Tẩy rửa Giặt là

Nghiên cứu các enzym nội bμo vẫn còn lμ vấn đề hấp dẫn nhằm tìm ra
các enzym đặc hiệu dùng trong chẩn đoán vμ điều trị. Việc phát hiện ra tính
chất tẩy rửa của enzym đã lμm cho cơng nghệ nμy phát triển nhanh chóng
trong những năm gần đây, nó lμm giảm bớt đi lao động đơn giản, giảm đi sự ô
nhiễm môi tr−ờng. Các n−ớc Tây âu th−ờng giặt quần áo bằng n−ớc nóng
(65-700C) để quần áo đ−ợc sạch, trong khi đó ở Mỹ vμ Canada th−ờng giặt ở 550C.

</div>
(44)<div class='page_container' data-page=44>

Do kỹ thuật sản xuất enzym ngμy cμng đ−ợc cải tiến nên giá thμnh liên
tục giảm đi trong những năm qua. Theo thống kê của Phịng Th−ơng mại vμ
Cơng nghiệp Hoa Kỳ thì doanh thu enzym trên toμn thế giới khoảng 750 - 850
triệu USD. 80% doanh số nμy thuộc vμo 3 enzym sau đây: biến đổi tinh bột
40%, tẩy rửa 30%, chế biến sữa 10%.

B¶ng 4.2. Sản xuất enzym công nghiệp ở một số nớc phơng Tây

Một số nớc phơng tây Sản lợng enzym

(

tÊn

)

Tû lÖ %

USA 6.360 12

NhËt 4.240 8

Đan Mạch 24.910 47

Pháp 1.590 3

§øc 3.180 6

Hµ Lan 10.070 19

Anh 1.060 2

Thuỵ Sĩ 1.060 2

Các nớc khác 530 1

Tæng sè 53.000 100

Trong những năm gần đây, kỹ thuật tái tổ hợp ADN ngμy cμng có nhiều
ứng dụng, những vi sinh vật đ−ợc biến đổi gen có năng suất tạo enzym cao
hơn, cùng với kỹ thuật lên men vμ thu hồi sản phẩm ngμy cμng hoμn thiện nên
giá thμnh enzym liên tục giảm. Những enzym dùng trong y học lμm kít chẩn
đốn hay điều trị một sổ bệnh hiểm nghèo số l−ợng dùng rất nhỏ (mg hoặc
microgram) nh−ng giá cực kỳ đắt (100.000 đôla/kg). Đặc biệt, kỹ thuật bất
động enzym ra đời đã lμm cho các q trình sản xuất tự động hố nên hiệu
quả sử dụng enzym rất cao. Kỹ thuật bất động enzym có thể coi nh− những vi
chíp điện tử trong máy tính, lμm cho cơng nghệ enzym trở thμnh một ngμnh
khoa học hấp dẫn vμ hiệu quả. Chỉ cần 1 kg penicillinamidase bất động trên
mạng polyacriamid có thể sản xuất đ−ợc 1000 kg 6-APA.

Sự tăng tr−ởng của thị tr−ờng enzym trên thế giới theo hai xu h−ớng sau:
sản xuất các enzym dùng trong công nghiệp với số l−ợng lớn vμ các enzym có
độ tinh khiết cao với số l−ợng nhỏ dùng trong phân tích, chẩn đốn vμ điều trị.
Hai quốc gia nhỏ bé ở Châu âu lμ Hμ Lan vμ Đan Mạch đ−ợc coi lμ những

“c−ờng quốc" sản xuất enzym dùng trong công nghiệp (bảng 4.2).

</div>
(45)<div class='page_container' data-page=45>

3. Kü tht di trun trong c«ng nghƯ enzym

Kỹ thuật tái tổ hợp ADN cho phép chuyển một gen điều khiển sinh tổng
hợp một enzym có ích nμo đó từ cơ thể nμy sang một cơ thể khác. Cơ thể nhận
gen ngoại lai gọi lμ vật chủ. Mục đích của q trình chuyển gen nμy lμ để tạo
ra một vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym có ích mμ việc ni vi
sinh vật nμy trong điều kiện đơn giản hơn, quá trình chiết xuất vμ tinh chế
enzym dễ dμng hơn. Nh− vậy sẽ hiệu quả kinh tế hơn. Nguyên tắc chuyển gen
để tạo enzym đ−ợc minh hoạ ở sơ đồ hình 4.1.

Bằng kỹ thuật chuyển gen nêu trên, hãng Novo Nordisk đã thực hiện
chuyển đoạn ADN gen từ nấm mốc Humicola languinosa sang cho Aspergillus 
oryzae tạo đ−ợc enzym lipolase sản xuất thích hợp trên qui mơ cơng nghiệp
dùng trong nghiên cứu enzym. Công nghiệp tẩy rửa đạt hiệu quả kinh tế cao.
Lipolase bền vững ở nhiệt độ vμ các pH khác nhau. Sự biến đổi các enzym
nhằm cải thiện đặc điểm xúc tác của chúng chỉ mới thực hiện trong vμi thập
kỷ vừa qua. Tr−ớc đây, cơng việc đó xảy ra một cách ngẫu nhiên, còn hiện nay
mọi sự thay đổi đều có thể thiết kế mơ hình vμ thực hiện nó một cách chủ động
vμ có hiệu quả. Bảng 4.4 cho ta thấy các mục tiêu chính để nghiên cứu enzym.

Sự phát triển của VSV
với enzym đợc sử dụng

Tinh chế
mARN tổn g hợp

mARN
Tinh chế

enzym

Phân tích một phần
chuỗi amino acid

Tổng hợp các mẫu
oligonu cleotid

Xỏc nh cADN si n
bng cỏch lai vi mu oligo

Tái tổ hợ p AND
vào E.coli(c.ADN)

Chuyển vào vật chủ SX công nghiệp
(Aspergillus oryzae)

Sản xt c«ng nghiƯp
enzym

</div>
(46)<div class='page_container' data-page=46>

Bảng 4.4. Những vấn cn nghiờn cu bin i enzym

ã Nâng cao hoạt tính của enzym.

ã Tng n nh.

• Cho phép enzym hoạt động ở mơi tr−ờng thay đổi.

• Thay đổi pH hoặc nhiệt độ tối −u.

• Thay đổi hẳn đặc tính của enzym nh− chúng có thể xúc tác cho
sự biến đổi một cơ chất hồn tồn khác.

• Thay đổi phản ứng xúc tỏc.

ã Nâng cao hiệu quả của quá trình.

K thuật protein còn đ−ợc gọi lμ “phẫu thuật phân tử” đã đ−ợc sử dụng
để thực hiện biến đổi các phân tử enzym. Kỹ thuật protein của enzym có liên
quan đến mơ hình khơng gian ba chiều của một enzym tinh khiết khi tiến
hμnh nhiễu xạ phân tử bằng tia X. Sự thay đổi cấu trúc của enzym cũng có thể
lμ kết quả lμm tăng tính ổn định của enzym. Ví dụ, pH vμ nhiệt độ, yêu cầu
biến đổi phân tử enzym đ−ợc thực hiện bằng chính sự thay đổi mã di truyền
của vi sinh vật tạo ra enzym. Có hai con đ−ờng chính để nghiên cứu thực hiện
mục tiêu đó. Thứ nhất lμ đột biến gen để vi sinh vật tạo ra enzym có cấu trúc
mμ thμnh phần vμ trình tự các amino acid thay đổi. Ph−ơng pháp thứ hai có
liên quan đến chiết xuất enzym tự nhiên vμ lμm biến đổi cấu trúc phân tử của
chính enzym đó bằng hố học - đơi khi cịn gọi lμ đột biến “hố học”. Một ví dụ
để minh hoạ cho điều đó lμ: đã lμm biến đổi cấu trúc của enzym phospholipase
A2 bền vững hơn trong môi tr−ờng acid vμ enzym nμy đ−ợc ứng dụng rộng rãi
trong công nghiệp chế biến sữa. Rõ rμng lμ kỹ thuật gen vμ vμ kỹ thuật
protein đã đóng vai trị quan trọng trong việc nghiên cứu enzym dùng trong
công nghiệp. Kỹ thuật gen góp phần lμm giảm giá thμnh sản phẩm, tạo ra các
enzym mới từ vi sinh vật, các ch−ơng trình nghiên cứu sẽ phát triển nhanh
hơn ...

4. Kü thuËt s¶n xuÊt enzym

Mặc dù có nhiều enzym đ−ợc sử dụng có nguồn gốc từ thực vật vμ động

vật, song nguồn enzym đó khơng thể thoả mãn nhu cầu của cuộc sống, vì vậy
phải tìm nguồn enzym phong phú từ vi sinh vật. Ngay cả q trình đ−ờng hố
tinh bột tr−ớc đây sử dụng malt (thóc mầm), thì ngμy nay cũng đã đ−ợc thay
thế bằng amylase từ vi sinh vật hiệu quả hơn.

Sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzym có mấy lợi thế sau:

− Hoạt tính cao trên một đơn vị sản phẩm tính theo trọng l−ợng khô.
− Không phụ thuộc vμo thời tiết, thời vụ do quá trình thực hiện trong

</div>
(47)<div class='page_container' data-page=47>

− Các enzym vi sinh vật có đặc điểm lμ hoạt độ mạnh trong phạm vi
rộng của pH vμ nhiệt độ, đồng thời cũng có tính chọn lọc cao
(asparaginase).

− Di truyền cơng nghiệp cho phép lựa chọn vμ tạo ra những vi sinh vật
cho hiệu suất enzym cao, dễ dμng lên men vμ chiết xuất, tinh chế...
Các enzym đặc biệt khó sản xuất th−ờng đ−ợc chuyển gen vμo những
vật chủ nh− Aspergillus oryzae vì đã biết rõ đặc điểm phát triển của
chúng nên không cần phải nghiên cứu tốn kém.

Để chọn những vi sinh vật sản xuất enzym cần chú ý các tiêu chuẩn sau
đây: vi sinh vật đó địi hỏi điều kiện lên men đơn giản, enzym ngoại bμo, qui
trình thu sản phẩm vμ tinh chế không phức tạp, enzym ổn định trong khoảng
nhiệt độ vμ pH rộng. Tuỳ theo mục đích sử dụng mμ chọn các enzym cho phù
hợp. Ví dụ, các enzym dùng trong y học cần hoạt tính enzym cao ở pH trung
tính. Các enzym dùng trong cơng nghiệp tẩy rửa cần có hoạt tính cao ở pH
kiềm. Nguyên liệu cho công nghiệp lên men sản xuất enzym phải đơn giản, rẻ
tiền. Th−ờng dùng bột của các loại ngũ cốc hoặc rỉ đ−ờng, cao ngô. Sản xuất
enzym cơng nghiệp có thể dùng ph−ơng pháp lên men xốp hay lên men chìm
nh− đã mơ tả ở Ch−ơng 3. Kỹ thuật lên men.

Ph−ơng pháp lên men xốp sản xuất enzym th−ờng áp dụng nuôi nấm mốc
đã đ−ợc ứng dụng từ lâu ở một số n−ớc nh− Nhật Bản, các n−ớc vùng Viễn
Đông để sn xut amylase, protease, pectinase v cellulase.

Lên men chìm sản xuất enzym đợc tiến hnh trong các thiết bị giống
nh lên men sản xuất kháng sinh (hình 4.2).

Hình 4.2. Sơ đồ minh hoạ các giai đoạn sản xuất enzym dạng dung dịch

</div>
(48)<div class='page_container' data-page=48>

Môi tr−ờng lên men cũng bao gồm các chất cung cấp năng l−ợng nh−
hydrat carbon, nguồn nitơ, môi tr−ờng đ−ợc khử trùng trong thiết bị lên men,
sau đó truyền giống vμ tiến hμnh lên men từ 30 - 150 giờ tuỳ theo chủng vi
sinh vật. Công nghiệp sản xuất th−ờng sử dụng thiết bị từ 10 - 50 m3.

Enzym thơng phẩm đợc sản xuất dới hai dạng: dạng bột khô v dạng
lỏng, có thể l dạng thô hoặc dạng tinh khiết (hình 4.3).

Hỡnh 4.3. S đồ chiết xuất và tinh chế enzym

</div>
(49)<div class='page_container' data-page=49>

Cho đến nay mới chỉ có một số l−ợng nhỏ vi sinh vật đ−ợc sử dụng để sản
xuất enzym. Vì vậy h−ớng nghiên cứu tìm kiếm enzym từ vi sinh vật vẫn còn
lμ vấn đề thời sự vμ hấp đẫn.

5. Ph−ơng pháp bất động enzym (immobilised enzym)

Việc sử dụng enzym để phân giải cơ chất cần l−u ý đến tính chất sau đây
của enzym để khỏi lãng phí: nếu enzym ở dạng hoμ tan hoặc tự do trộn vμo
cùng với cơ chất để tiến hμnh phản ứng thì enzym chỉ sử dụng đ−ợc một lần.
Vì khi phản ứng kết thúc ta không thể lấy lại enzym đó để sử dụng lần sau.

Do đó kỹ thuật bất động enzym ra đời, về nguyên lý có thể mơ tả tóm tắt nh−
sau: enzym đã tinh chế ở dạng tinh khiết đ−ợc gắn hoặc gói trong những
polymer không hoμ tan trong n−ớc, hoặc hấp phụ trên các chất trơ vô cơ hoặc
hữu cơ. Các hạt enzym nμy đ−ợc nhồi vμo các cột hình trụ có kích th−ớc thích
hợp, sau đó cho dung dịch cơ chất chảy qua, enzym sẽ thực hiện phản ứng
phân cắt cơ chất thμnh sản phẩm t−ơng ứng. Thu lấy sản phẩm để thực hiện
các b−ớc tinh chế tiếp sau. Có thể bất động hố các enzym hoặc các tế bμo vi
sinh vật chứa enzym t−ơng ứng (hình 4.4).

Khi enzym hoặc tế bμo đã bất động hố thì phản ứng phân giải cơ chất
đ−ợc thực hiện liên tục với hiệu suất cao, nếu duy trì đ−ợc các điều kiện phản
ứng khơng thay đổi thì q trình có thể giữ đ−ợc hμng ngμn giờ, có những quá
trình phản ứng kéo dμi đ−ợc 100 ngμy mới phải thay đổi enzym mới. Do đó
enzym đ−ợc sử dụng nhiều lần, giá thμnh sản xuất một đơn vị sản phẩm sẽ
giảm đi rất nhiều.

Enzym đ−ợc bất động bằng cách nμo? Trên thực tế sử dụng cả ph−ơng
pháp vật lý vμ hoá học để bất ng enzym.

Bằng phơng pháp vật lý enzym có thể đợc hấp phụ lên trên một cái
khuôn không ho tan, hoặc đợc gói vo trong một gel, hoặc trong capsul
thnh các hạt vi nang, hoặc dán vo phía sau một mng bán thấm (hình 4.4).

a. Các kiểu bất động enzym b. Bất động enzym với glutaraldehyd

</div>
(50)<div class='page_container' data-page=50>

Bằng ph−ơng pháp hoá học, phân tử enzym đ−ợc nối lại với nhau tạo
thμnh các sợi ngang dọc bằng phản ứng giữa các nhóm amin của enzym với tác
nhân polymer hoá của một hoá chất nh− glutaraldehyd. Có nhiều phản ứng

hố học có thể sử dụng để bất động enzym bằng cách nμy các nhóm chức năng
khơng chính yếu của chúng đ−ợc gắn với các chất mang vô cơ nh− gốm, thuỷ
tinh, sắt, titan ... hoặc với các polymer thiên nhiên nh− sepharose vμ cellulose,
với các polymer tổng hợp nh− nilon, polyacriamid, các polymer vinyl khác vμ
chính các polymer nμy giữ đ−ợc các nhóm hố chức hoạt động trở lại. Trong
nhiều thủ thuật thực hiện để gói enzym với chất mang bằng ph−ơng pháp nμy
nhận thấy các nhóm hoạt động hố học bị phân tán lộn xộn. Vì thế các nghiên
cứu gần đây đã chú ý đến kỹ thuật bất động enzym sao cho các enzym khi gắn
với chất mang khơng bị mất hoặc giảm đi hoạt tính của mình. Giới hạn của kỹ
thuật bất động enzym đ−ợc trình bμy ở bảng 4.5.

Bảng 4.5. Những hạn ch ca k thut bt ng enzym

Phơng pháp Ưu điểm Nhợc điểm

Sự gắn kết
đơng lợng

Không bị ảnh h−ởng của
pH, ion của môi tr−ờng
hoặc nồng độ cơ chất

L−ới hoạt động có thể bin i giỏ thnh
t

Polymer hoá
đơng lợng

Enzym hoạt động mạnh,
chậm mất hoạt tính

Hoạt tính bị mất trong khi không hiệu quả
đối với các cơ chất có phân tử l−ợng lớn;
khơng có khả năng tái sinh

HÊp phô

Đơn giản, enzym không bị
biến đổi, có thể thu hồi
chất mang, giá thành thấp

Bị thay đổi trong mơi tr−ờng ion hố mạnh,
enzym bị đẩy ra dùng cho protease

BÉy b»ng ho¸
häc

Enzym khơng bị biến đổi
về hố học

Cơ chất khuếch tán vào trong sản phẩm đi
ra ngoài, chuẩn bị khó khăn, enzym bị mất
hoạt tính, khơng hiệu quả đối với cơ chất
có phân tử lớn

Kỹ thuật “bẫy” enzym vμo trong các gel lμ một thμnh cơng khi tiến hμnh
polymer hố hoặc tạo hạt bằng các phản ứng đông tụ. Polyacriamid, collagen,
silicagel ... lμ những chất tỏ ra thích hợp cho kỹ thuật nμy. Tuy nhiên q
trình tạo gel khó khăn vμ hiệu quả hoạt tính của enzym thấp.

Trên thực tế th−ờng có khuynh h−ớng bất động tế bμo hơn lμ bất động
enzym vì bỏ qua đ−ợc cơng đoạn chiết xuất vμ tinh chế enzym mất thời gian,
tốn kém.

</div>
(51)<div class='page_container' data-page=51>

a. Bình phản ứng có khuấy trộn

b. Các bình phản ứng liên
tục dạng kín

Bng 4.6. Những −u điểm của các chất xúc tác sinh học bất động

• Cho phÐp sư dơng enzym nhiều lần

ã Có thể tiến hành quá trình liên tục

ã Sản phẩm là những enzym tự do

ã Cho phép kiểm tra chặt chẽ hơn quá trình xúc tác

ã Ci thin c n nh ca enzym

ã Cho phép phát triển hệ thống phản ứng nhiều enzym

ã Cung cấp tiềm năng to lớn cho công nghiƯp vµ y häc.

Do kết quả ứng dụng thμnh cơng các ph−ơng pháp bất động enzym vμ tế
bμo tạo ra các nang, các hạt, các cột vμ các mμng chứa các enzym, nhiều kiểu
bình phản ứng sinh học đ−ợc chế tạo để đáp ứng cho nghiên cứu trong phịng
thí nghiệm cũng nh− trong sản xuất cơng nghiệp.

Trên thực tế các đặc điểm xúc tác cúa các enzym cô lập, bất động các
enzym hay tế bμo đ−ợc thực hiện trong các bình phản ứng sinh học. Hệ thống
bình phản ứng sinh học có nhiều kiểu dáng khác nhau, nó phụ thuộc vμo kiểu
phản ứng vμ độ ổn định của các enzym (hình 4.2).

</div>
(52)<div class='page_container' data-page=52>

Hình 4.5. Các kiểu bình phản ứng sinh học chứa enzym hoặc tế bào bất động

Hμng ngμn tấn siro fructose đã đ−ợc sản xuất bằng ph−ơng pháp bất
động enzym (hình 4.6).

Hình 4.6. Sơ đồ sản xuất fructose từ tinh bột

Một đối t−ợng khác cũng rất quan trọng đó lμ sử dụng ph−ơng pháp bất
động enzym aminoacylase để sản xuất acid amin. Các cột chứa aminoacylase
đ−ợc sử dụng ở Nhật Bản để sản xuất hμng ngμn kilogram L - methionin, L -
phenylalanin, L - tryptophan vμ L - valin.

Enzym liên kết dạng polymer đ−ợc sử dụng rộng rãi trong phân tích hố
học vμ hố lâm sμng. Các cột enzym bất động đ−ợc sử dụng nhiều lần coi nh−
những xúc tác đặc biệt để phát hiện cơ chất. Các điện cực enzym đ−ợc chế tạo
giống nh− những detector kiểu mới hoặc cái cảm biến sinh học (biosensor)
dùng thử nghiệm đo thế hoặc dòng điện dùng cho cơ chất nh− urê, amino acid,

</div>
(53)<div class='page_container' data-page=53>

glucose, alcol vμ acid lactic. Trong thiết kế chế tạo sao cho điện cực có tác dụng
nh− cái cảm biến điện hố khi đóng mạch enzym có thể thấm qua mμng bán
thấm để phản ứng với cơ chất (hình 4.7).

Hình 4.7. Sơ đồ đơn giản của biosensor gắn với điện cực điện hoá
và enzym bất động trên màng bán thấm

Các enzym gắn vμo mμng tạo oxy, các ion hydro, amoni, carbonic vμ các
phân tử nhỏ khác tuỳ thuộc vμo phản ứng của enzym. Mặc dù các thμnh phần
sinh học ở cái cảm biến sinh học có thể lμ enzym hoặc hệ thống nhiều enzym,
nó cũng có thể lμ một kháng thể, một tế bμo vi sinh vật hoặc các mẩu của mô.
Kỹ thuật enzym thực nghiệm lμ một quá trình rất lý thú, nh− các quá trình
chế biến thực phẩm, d−ợc phẩm, cơng nghiệp hố học, xử lý n−ớc thải ... có ý
nghĩa rất to lớn sẽ lần l−ợt đ−ợc xem xét ở các ch−ơng tiếp theo. Trong t−ơng
lai những thμnh tựu nghiên cứu mới trong lĩnh vực enzym sẽ giải quyết những
vấn đề thiết yếu của cuộc sống nh−: để bảo vệ môi tr−ờng, vấn đề năng l−ợng,
thực phẩm vμ những nhu cầu cao cấp khác của loi ngi.

Tự lợng giá

1. K tờn cỏc vi sinh vật đ−ợc sử dụng trong công nghiệp để sản xuất
enzym. Nêu −u thế của vi sinh vật trong sản xut enzym.

2. Kể tên các phơng pháp lên men đợc dùng chủ yếu trong sản xuất
enzym.

3. K tên các các ph−ơng pháp bất động enzym, tên vμ đặc điểm các cơ
chất th−ờng đ−ợc sử dụng trong bất động enzym?

</div>
(54)<div class='page_container' data-page=54>

Ch

−

¬ng 5

Sản xuất Protein đơn b

μ

o

Mơc tiªu

Sau khi häc xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc:

1. Tm quan trọng của sản xuất protein đơn bμo, các −u nh−ợc điểm cơ
bản của protein đơn bμo.

2. Tên các chủng vi sinh vật th−ờng sử dụng để sản xuất protein đơn
bμo vμ đặc điểm của quá trình lên men từng chủng.

1. Sự cần thiết sản xuất protein đơn bμo

Vấn đề chính bao trùm thế giới lμ vấn đề dân tộc vμ dân số. Vấn đề dân
tộc hay sắc tộc thuộc phạm trù của chính trị xã hội. Vấn đề dân số lμ vấn đề
phát triển riêng của mỗi quốc gia. Hiện nay dân số thế giới khoảng 6 tỉ ng−ời.
Mức tăng bình quân hμng năm khoảng 95 triệu. Dự tính đến năm 2050 dân số
thế giới lμ 10 tỉ. Với trình độ phát triển nơng nghiệp nh− hiện nay thì khơng
thể cung cấp đủ l−ơng thực thực phẩm cho nhân loại, đặc biệt lμ nguồn protein
không thể thoả mãn đòi hỏi của nhu cầu. Tổ chức L−ơng thực vμ nông nghiệp
thế giới (FAO) đã cảnh báo về sự thiếu hụt protein giữa các quốc gia phát triển
vμ các quốc gia đang phát triển. ít nhất 25% dân số thế giới hiện nay đói vμ
thiếu dinh d−ỡng. Đại đa số trong số nμy lμ ở các n−ớc đang phát triển. Dân số
ở các n−ớc đang phát triển tiêu thụ protein chỉ ở mức 12 g protein động
vật/ng−ời/ngμy. Việc trồng các giống cây có hμm l−ợng protein cao nh− đậu
t−ơng, lạc cũng khó khăn vì cịn phải phụ thuộc nhiều vμo thời tiết m−a nắng
không thuận hoμ, sâu bệnh phá hoại ... Để đảm bảo nguồn protein cần thiết đó
cho loμi ng−ời khơng thể có con đ−ờng nμo khác lμ con đ−ờng sản xuất protein
từ vi sinh vật.

</div>
(55)<div class='page_container' data-page=55>

Từ cổ x−a cả hai nền văn hố ph−ơng Đơng vμ ph−ơng Tây đã biết chế
biến thực phẩm bằng vi sinh vật. Trong khẩu phần ăn đã có chứa các vi sinh
vật đó cho cả ng−ời vμ vật ni. Sữa chua, d−a chua, chao, t−ơng, mắm chua ...
đều chứa vi sinh vật. Tuy nhiên quá trình sản xuất công nghiệp đầu tiên các vi
sinh vật cho mục đích dinh d−ỡng đã xảy ra ở Đức vμo thời kỳ Đại chiến thế

giới lần thứ nhất, lúc đó đ−ợc gọi lμ nấm men “Torula”. Sau chiến tranh mối
quan tâm của Đức giảm đi, song nó lại đ−ợc phục hồi vμo những năm 30, vμ
trong Đại chiến thế giới lần thứ hai khoảng 15.000 tấn nấm men đã đ−ợc sản
xuất mỗi năm nhằm phục vụ nhu cầu protein cho binh lính vμ th−ờng dân.
Chủ yếu để nấu súp vμ lμm xúc xích. Sau thế chiến thứ hai Mỹ vμ Anh cũng
quan tâm đến sản xuất sinh khối nấm men để phục vụ nhu cầu chăn nuôi
công nghiệp. Từ giữa những năm 50, công nghiệp sản xuất nấm men mới đ−ợc
thúc đẩy mạnh mẽ.

Bảng 5.1. Thành phần hoá học của tế bào một số loại nấm
c s dng lm protein n bo (SCP)

Thành phần Pacilomyces vaioti Fusarium 
graminearum

Candida 
utilis

Trọng lợng khô (%) 96,0 94,2 91,0

Protein th« (% N x 6,25) 55,0 54,1 48

ChÊt bÐo (%) 1,0 1,0 1,35

Tro (%) 5,0 6,1 11,0

Lysin (g/16g N) 6,5 3,5 7,2

Methionin (g/16 g N) 1,9 1,23 1,0

Cystin vµ Cystein (g/16 g N) 1,0 0,75 1,0

Hội nghị lần thứ nhất về SCP tại Viện kỹ thuật Massachusett năm 1967
đã có nhiều dự án thực nghiệm sản xuất SCP. Riêng Hãng British Petroleum
(BP) đã trình bμy báo cáo về sản xuất công nghiệp SCP. Đến hội nghị lần thứ
hai vμo năm 1973 thì nhiều hãng thuộc nhiều n−ớc khác nhau đã sản xuất
trên qui mô công nghiệp vμ chứng minh đ−ợc khả năng kỹ thuật của họ. Cũng
chính năm 1973 sản xuất SCP từ hydrocarbon cũng đ−ợc đẩy mạnh.

Nguyên nhân nμo đã thúc đẩy nhiều n−ớc phải sản xuất SCP?

</div>
(56)<div class='page_container' data-page=56>

So với sản xuất các nguồn protein truyền thống, sản xuất SCP có những
u thế sau:

Tc độ sản xuất tăng nhanh.

− Hμm l−ỵng protein cao (30-80% tính theo trọng lợng khô).

Có thể dùng các nguồn carbon khác nhau (m một số chất đợc coi lμ
chÊt th¶i).

− NhiỊu chđng vi sinh vËt cho năng suất cao, hm lợng protein cao v
chất lợng tốt.

Diện tích sản xuất nhỏ, sản lợng cao.
Kh«ng phơ thc vμo mïa vơ, thêi tiÕt.

Một nh−ợc điểm quan trọng của SCP lμ do chúng chứa một hμm l−ợng acid
nucleic cao, đặc biệt lμ ở vi khuẩn vμ nấm men. Nếu các loại nμy đ−ợc sử dụng
cho ng−ời thì sẽ lμ một vấn đề cần quan tâm, vì ở ng−ời thiếu enzym uricase xúc

tác cho sự oxy hoá acid uric thμnh allantoin dễ hoμ tan. Nếu ăn nhiều các dẫn
chất chứa purin sẽ lμm tăng hμm l−ợng acid uric trong máu, acid nμy sẽ tạo
thμnh các sỏi đọng lại ở khớp x−ơng vμ trong bể thận, dễ sinh ra sỏi thận. Hμng
ngμy mỗi ng−ời lớn chỉ nên ăn 20 g nấm men (tính theo trọng l−ợng khơ). Đã có
những ph−ơng pháp nêu ra nhằm lμm giảm hμm l−ợng acid nucleic trong SCP.
Tuy nhiên các ph−ơng pháp xử lý ấy sẽ dẫn đến việc lμm giảm giá trị sinh học
của protein đơn bμo. Các ph−ơng pháp đó có thể l:

Thuỷ phân bằng kiềm.
Chiết bằng hoá chất.

Hoạt hoá ARNase (bằng xử lý nhiệt).

V hiệu suất sinh tổng hợp protein của vi sinh vật thì cao hơn nhiều lần
so với động vật chăn nuôi trong các trang trại (bảng 5.2). Th−ờng so sánh năng
suất tạo protein của một con bò nặng 250 kg với 250 g vi sinh vật. Trong khi
con bò chỉ tổng hợp đ−ợc 200 g protein mỗi ngμy thì vi sinh vật nếu tính trên
lý thuyết (trong điều kiện phát triển lý t−ởng) chúng có thể tạo đ−ợc 25 tấn
cũng trong thời gian ấy. Tuy nhiên con bị cũng có khả năng đặc biệt của nó đó
lμ biến đổi cỏ thμnh sữa giμu protein.

Bảng 5.2. Thời gian cần thiết để tăng gấp đôi sinh khi ca mt s loi

Tên loài Thời gian

Vi khn vµ nÊm men 20-120 phót

NÊm vµ tảo 2- 6 giờ

Cỏ và một vài thực vật 1-2 tuần

Gà con 2-6 tuần

Bồ câu 4-6 tuần

Trâu, bò (còn nhỏ) 1-2 th¸ng

</div>
(57)<div class='page_container' data-page=57>

Protein từ SCP cũng chứa khá đầy đủ các chất dinh d−ỡng quan trọng
nh− acid amin, vitamin các nguyên tố vô cơ cần thiết cho cơ thể (bảng 5.3).

Cũng có thể điều khiển quá trình lên men vi sinh vật để tạo ra sinh khối
có chứa những chất cần thiết có giá trị sử dụng cao. Ví dụ nh− ni
Saccharomyces uvarum trong mơi tr−ờng có chứa selenid sẽ tạo ra sinh khối
có chứa các hợp chất selen hữu cơ dùng lμm thuốc antioxydant vμ điều trị ung
th−, nuôi tảo Spirullina cha caroten

Bảng 5.3. Thành phần acid amin trong protein cđa tÕ bµo Saccharomyces

Acid amin mmol/100 g protein

nÊm men Acid amin

mmol/100 g protein 
nÊm men

Alanin 114,70 Leucin 74,08

Arginin 40,18 Lysin 1,54

Asparagin 25,43 Methionin 12,66

Acid aspartic 74,38 Phenylalanin 33,44

Cystein 1,65 Prolin 41,13

Acid glutamic 75,45 Serin 46,33

Glutamin 26,33 Threonin 47,85

Glycin 72,56 Tryptophan 7,10

Histidin 16,55 Tyrosin 25,49

Isoleucin 48,17 Valin 66,18

Nuôi vi sinh vật để sản xuất SCP có nhiều −u điểm chính nh− sau:

− Vi sinh vật phát triển với tốc độ nhanh ở điều kiện tối −u, một vμi
loμi có thể tăng gấp đơi sinh khối sau 0,5 - 1 giờ.

− Vi sinh vật dễ dμng bị biến đổi gen hơn thực vật vμ động vật, do đó có
thể tạo ra các loμi mới bằng biến đổi gen nhằm tăng tốc độ phát triển,
chịu đ−ợc các điều kiện sống khắc nghiệt vμ điều kiện lên men dễ
dμng.

− Vi sinh vËt chøa hμm l−ỵng protein cao v giá trị dinh dỡng cao.
Vi sinh vật có thể tạo ra một lợng sinh khối lớn trong mét thiÕt bÞ

lên men dung tích nhỏ vμ thực hiện quá trình liên tục điều khiển tự
động. Diện tích để sản xuất nhỏ, khơng phụ thuộc vμo thời vụ, thời

tiết.

</div>
(58)<div class='page_container' data-page=58>

2. S¶n xuÊt sinh khèi nÊm men

Trong công nghiệp sản xuất sinh khối nấm men th−ờng hay dùng
Saccharomyces cerevisiae lμ loμi đ−ợc sử dụng vμo nhiều lĩnh vực của công
nghiệp thực phẩm (lên men r−ợu, bia, lμm nở bột mì, lμm thức ăn gia súc ...).
Tuỳ theo điều kiện lên men hiếu khí hay kỵ khí mμ ta có các sản phẩm khác
nhau. Khi lên men kỵ khí để tạo ra alcol ethylic, nấm men đã biến đổi đ−ờng
theo phản ứng sau:

C12H22O11 + H2O C2H5OH + CO2 + H2O

Trong điều kiện lên men hiếu khí, nấm men sử dụng đ−ờng để phát triển
tăng tích luỹ sinh khối lμ chính. Tuy nhiên vẫn tạo thμnh một l−ợng nhỏ
alcol ethylic. Ph−ơng trình biểu diễn biến đổi đ−ờng trong lên men hiếu khí
nh− sau:

C12H22O11 + H2O Sinh khèi + CO2 + H2O
2.1. S¶n xuÊt sinh khèi nÊm men tõ rØ ®−êng

Trong cơng nghệ sản xuất đ−ờng từ củ cải đ−ờng hoặc từ mía, sau khi
kết tinh đ−ờng, phần cịn lại khơng kết tinh đ−ợc nữa gọi lμ rỉ đ−ờng. Rỉ đ−ờng
dùng lμm nguyên liệu cho nhiều quá trình lên men vì có giá thμnh rất rẻ.
Trong rỉ đ−ờng ngoμi thμnh phần chính lμ saccharose nó cịn chứa một số chất
vơ cơ, hữu cơ vμ vitamin có giá trị. Sản l−ợng trung bình của rỉ đ−ờng chứa
50% saccharose, dao động từ 3,5% đến 4,5% tính theo nguyên liệu dùng chế
đ−ờng. Hμm l−ợng saccharose chứa trong rỉ đ−ờng phụ thuộc rất nhiều vμo
hμm l−ợng các muối vô cơ. Muối K vμ Na lμm cản trở quá trình kết tinh đ−ờng,
ng−ợc lại muối Mg lại lμm tăng khả năng kết tinh đ−ờng. Thμnh phần của rỉ

đ−ờng mía vμ củ cải lμ khác nhau (bảng 5.4).

B¶ng 5.4. Thành phần của rỉ đờng củ cải và rỉ đờng mía chứa 75% chất khô

Thành phần Đơn vị tính Rỉ đờng củ cải Rỉ đờng mÝa

§−êng tỉng sè (%) 48-52 48-56

Chất hữu cơ (%) 12-17 9-12

Protein (Nx 6,25) (%) 6-10 2-4

K (%) 2,0-7,0 1,5-5,0

Ca (%) 0,1- 0,5 0,4- 0,8

Mg (%) 0,09 0,06

P (%) 0,02-0,07 0,6-2,0

Biotin (mg/kg) 0,02-0,15 1,0-3,0

Acid pantothenic (mg/kg) 50-110 15-55

Inositol (mg/kg) 5.000-8000 2.500-6.000

</div>
(59)<div class='page_container' data-page=59>

Sự khác biệt giữa rỉ đ−ờng mía vμ rỉ đ−ờng củ cải lμ hμm l−ợng biotin. Rỉ
đ−ờng mía chứa khoảng 2,5 mcg biotin/g, gấp khoảng 20 lần rỉ đ−ờng củ cải. Rỉ
đ−ờng củ cải có hμm l−ợng acid pantothenic gấp 2-4 lần rỉ đ−ờng mía. Vì vậy
khi sử dụng rỉ đ−ờng mía để sản xuất men bánh mì cần phải bổ sung acid nμy.

Rỉ đ−ờng cần đ−ợc xử lý tr−ớc khi pha chế môi tr−ờng để nuôi cấy.
Th−ờng đ−ợc acid hoá bằng acid sulfuric tới pH 4 vμ nâng nhiệt độ lên 120 -
1250C trong 1 phút để kết tủa một số chất lơ lửng. Đồng thi b sung thờm

những thnh phần cần thiết cho men phát triển. Rỉ đờng cũng l môi trờng
tốt cho một số vi sinh vật lạ phát triển lm hỏng quá trình nuôi men, nên môi
trờng pha chế xong cần đợc khử trùng.

sn xut men bánh mì th−ờng chỉ sử dụng S. cerevisiae. Cũng có
nhiều nghiên cứu tìm cách sử dụng các loμi Torula, Candida vμOspora để sản
xuất men bánh mì nh−ng ch−a thμnh cơng trong sản xuất cơng nghiệp.

ở Anh có loại ”nấm men bơng” lên men nổi, có xu h−ớng tạo thμnh bơng
mạnh vμ do đó chúng dễ dμng tách khỏi môi tr−ờng mμ không cần đến ly tâm,
rất thuận tiện cho sản xuất. Chúng cũng đ−ợc sử dụng lμm men bánh mì.

S. cerevisiae lμ loại vi sinh vật có thể sống vμ phát triển trong cả điều
kiện có oxy vμ khơng có oxy. Khi sinh tr−ởng trong điều kiện hiếu khí chúng
cần biotin, còn nhu cầu về inositol vμ acid pantothenic thay đổi theo từng
chủng. Ngoμi các nhu cầu trên, nấm men còn cần các thμnh phần khác nh−
acid béo khơng no vμ ergosterol, một số chủng cịn cần cả acid nicotinic. Trong
điều kiện kỵ khí bắt buộc nếu thiếu các thμnh phần nμy, nấm men chỉ phát
triển trong một vμi thế hệ sau đó dừng lại hoμn toμn.

Quan hệ của nấm men với oxy lμ mối quan hệ phức tạp, điều nμy đã
đ−ợc kiểm chứng qua nghiên cứu về hiệu ứng trao đổi ôxy của nấm men. Ngoμi
hiệu ứng Pasteur, cịn có hiệu ứng Pasteur ng−ợc, hiệu ứng glucose hay sự
kiềm chế dị hoá. Tốc độ sinh tr−ởng của nấm men phụ thuộc rất nhiều vμo
nồng độ oxy trong môi tr−ờng (hình 5.1).

</div>
(60)<div class='page_container' data-page=60>

Nồng độ oxy chứa trong mơi tr−ờng có ảnh h−ởng gián tiếp lên các enzym
điều khiển q trình biến đổi glucose. Có thể kiềm chế dị hố đó bằng cách
ni nấm men ở nồng độ glucose thấp nh− trong hệ thống lên men liên tục. Có
thể tính tốn nồng độ glucose cần thiết để men phát triển bình th−ờng, sau đó
bổ sung đ−ờng theo chu kỳ, khống chế để men phát triển với tốc độ tối đa. Nếu
đ−ờng nạp vμo thừa thì nấm men sẽ chuyển h−ớng trao đổi chất từ thuần t
hơ hấp sang lên men, lúc đó có thể phát hiện thấy ethanol trong khí thải ra.
Qui trình sản xuất men bánh mỳ có thể minh họa bằng sơ đồ (hình 5.2).

Hình 5.2. Sơ đồ qui trình sản xuất men bánh mì

1. Men gièng, 2. Nuôi trên máy lắc, 3. Nhân giống,

4. Nhõn giống, 5. Nuôi để thu sản phẩm, 6. Lọc để thu men

• Men gièng

Năng suất vμ chất l−ợng của men thu hoạch phụ thuộc rất nhiều vμo việc
chuẩn bị men giống. Men thμnh phẩm sau khi thu hoạch có thể lẫn vi sinh vật
lạ, nên không thể sử dụng lμm men giống đ−ợc. Một vμi nhμ máy đã sử dụng
men thμnh phẩm lμm men giống, song hiệu quả khơng cao. Vì vậy phải bắt
đầu bằng một ống giống thuần khiết, sau đó nhân ging dn dn trong iu
kin vụ trựng.

ã Nhân gièng

Giống đ−ợc nuôi trong điều kiện vô trùng, th−ờng chuẩn bị giống theo ba
cấp. Môi tr−ờng nuôi men giống cấp 1 vμ cấp 2 ngoμi đ−ờng lμ thμnh phần
chính, cần có thêm nitơ dạng hữu cơ để men phát triển nhanh. Đến bình nhân

giống cấp 3 vμ bình lên men để thu hoạch men thì chỉ cần nguồn nitơ vô cơ.

</div>
(61)<div class='page_container' data-page=61>

Trong quá trình nhân giống phải theo dõi sự phát triển của men, đồng thời
cung cấp khơng khí với l−u l−ợng cần thiết. Khi truyền giống từ cấp độ lên
men nμy sang cấp độ lên men khác tỉ lệ giống truyền th−ờng lμ 10% vμ giống
đang phát triển ở pha logarit.

• Lên men để thu hoạch sinh khối nm men

Thiết bị nuôi men dùng trong sản xuất cã dung tÝch tõ 50-300 m3. M«i

tr−ờng ni chiếm 70% dung tích của thiết bị ni. Nhiệt độ ni men th−ờng
giữ ở 30oC - 32oC. Cấp khí liên tục với l−u l−ợng 1VVM (1 thể tích khơng khí/1

thể môi trờng/phút).

ã Thu sinh khối nấm men

Tiêu chuẩn chủ yếu dùng để xem xét men bánh mì th−ơng phẩm khi kết
thúc ni men lμ có sản l−ợng cao, tế bμo men phải đảm bảo các tính chất của
nấm men, có hoạt tính lên men cao vμ chất l−ợng bảo quản tốt hay không.
Tiêu chuẩn nμy dễ dμng đ−ợc đánh giá chính xác nhờ vμo việc phân tích hμm
l−ợng mARN vμ các loại ARN khác hoặc hμm l−ợng protein tổng số. Trong
công nghiệp để thu hoạch men th−ờng sử dụng ph−ơng pháp ly tâm vắt để loại
bỏ mơi tr−ờng sau đó rửa bằng n−ớc sạch 2-3 lần để loại bỏ toμn bộ mơi tr−ờng
cịn dính bám vμo tế bμo men nhằm khơng cho các tế bμo men cịn có thể lên
men tiếp. Tế bμo men thu đ−ợc ở dạng men ép có độ ẩm khoảng 80% đ−ợc bao
gói thμnh từng đơn vị nhỏ từ 1-5 kg trong giấy nhơm vμ bảo quản ở nhiệt độ
4-8˚C. Cũng có thể sấy khô men ở điều kiện áp suất vμ nhiệt độ thấp đến độ ẩm
còn 4-6% vμ vẫn giữ đ−ợc hoạt tính lên men cao.

• Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình sản xuất sinh khối nÊm men

Trong sản xuất men nếu thực hiện trong điều kiện vô trùng tuyệt đối
nh− sản xuất các chất kháng sinh thì khơng có vi sinh vật tạp nhiễm. Trong
điều kiện đó địi hỏi phải đầu t− lớn, đặc biệt lμ các mμng lọc khơng khí vơ
trùng. Lúc đó giá thμnh sản xuất men sẽ cao vì chi phí lớn. Trên thực tế sản
xuất men bánh mì, th−ờng sử dụng qui trình đơn giản, thiết bị khơng cần đắt
tiền, hệ thống lọc khơng khí khơng cần hiện đại. Thủ thuật chính để đảm bảo
q trình ni men thμnh cơng lμ xử lý môi tr−ờng rỉ đ−ờng bằng acid sulfuric
đến pH = 2,5 - 3,0. Đun sôi môi tr−ờng để khử trùng ban đầu, sau điều chỉnh
pH = 3,5 - 4,0. Trong khoảng 4 - 5 giờ đầu ni men ở điều kiện kỵ khí hoặc
hiếu khí nhẹ. Nấm men sẽ lên men r−ợu vμ tạo ra một l−ợng cồn nhất định có
khả năng ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật nếu nhiễm vμo môi
tr−ờng trong điều kiện pH môi tr−ờng thấp. Sau đó tiếp tục ni men ở điều
kiện hiếu khí mạnh để cho men phát triển tối đa.

</div>
(62)<div class='page_container' data-page=62>

Nếu q trình ni men có lẫn các loμi men khác nh−Torula, Candida...,
chúng th−ờng phát triển rất nhanh vμ lấn át S. cerevisiae. Các loμi nấm men
kể trên th−ờng khó ép vμ lμm giảm đáng kể năng lực lên men của men ép.

Hμng loạt vi sinh vật khác xâm nhập về sau vμo men ép lμm hỏng men.
Đáng sợ nhất lμ Oidiumlactis th−ờng gây cho men có mùi ủng khó chịu. Các
nấm khác nh− Penicillium tạo nên các đám mμu lục trên men ép, Aspergillus
tạo nên các đám mμu vμng nhạt tới mμu xám, Mucor vμ Fusarium tạo các vết
vμng vμ đỏ trên men ép. Dematium pullutans tạo nên các vết mμu nâu bẩn,
còn các vi khuẩn acetic tạo nên những vùng ố trên bề mặt, còn Serratia 
marcescens lại tạo nên các vết đỏ trên men ép.

2.2. øng dơng cđa men Ðp

Men bánh mì đ−ợc sử dụng trong cơng nghiệp sản xuất bánh mì, bánh
bao vμ các loại bánh lμm từ bột nhμo dùng trong gia đình. Để sản xuất bánh
mì trắng cần một tỉ lệ nấm men khoảng 2%, với các loại bánh ngọt nhỏ cần từ
3-5%, bánh sữa 4-5% (so với trọng l−ợng bột mì). Th−ờng nhμo bột mì với men
giống trộn đều vμ ủ men ở nhiệt độ thích hợp. Nấm men sẽ lên men
saccharose, glucose vμ fructose có sẵn trong bột, sau đó lên men maltose hoặc
glucose đ−ợc tạo thμnh nhờ các amylase có trong bột nhμo. Thơng th−ờng thì
bột nhμo khơng chứa đủ l−ợng amylase cần thiết nên th−ờng ng−ời ta cần bổ
sung α-amylase bền với nhiệt vμo men bánh mì. CO2 đ−ợc tạo ra do quá trình
lên men lμm khối bột nở phồng lên. Quá trình lên men tạo ra khoảng 0,5%-1%
r−ợu vμ có mùi thơm đặc biệt. Khi n−ớng bánh, nhiệt độ trong lị đạt tới
50-60˚C thì nấm men sẽ bị chết.

Men ép còn đ−ợc sử dụng để sản xuất cao nấm men hay bột nấm men
dùng lμm môi tr−ờng lên men các vi sinh vật trong các phịng thí nghiệm.
Cách chế tạo cao nấm men hay bột nấm men rất đơn giản. Men ép đem hoμ
trong n−ớc tỉ lệ 1/4 rồi để ở nhiệt độ 35-37˚C, các protein nội bμo sẽ thuỷ phân
protein của nấm men (autolyse) để tạo ra các acid amin vμ giải phóng các
vitamin có trong tế bμo men ra mơi tr−ờng n−ớc. Để q trình thuỷ phân đ−ợc
triệt để hơn có thể thuỷ phân tiếp bằng acid hoặc papain. Điều chỉnh pH về
trung tính rồi lọc trong, cô d−ới áp suất giảm đến dạng cao mềm hay sấy phun
để tạo ra bột nấm men. Bột hay cao nấm men chứa hμm l−ợng cao vitamin
nhóm B vμ các acid amin khơng thay thế. Có thể bμo chế ra các dạng viên nén,
viên nang, viên bao đ−ờng hoặc dạng thuốc n−ớc dùng lμm thuốc bồi bổ cơ thể
rất q.

Cũng bằng ph−ơng pháp ni S. cerevisiae trong những điều kiện đặc biệt,
chúng sẽ tạo ra hμm l−ợng cao vitamin D hoặc ergosterin lμ những thuốc q. 
3. Sản xuất tảo đơn bμo

§Ĩ s¶n xuÊt SCP th−êng dïng ba chi lμ Chlorella, Scenedesmus vμ

</div>
(63)<div class='page_container' data-page=63>

hoặc dị d−ỡng. Ph−ơng pháp nuôi tảo nhờ quang hợp đ−ợc ứng dụng nhiều vì
giá thμnh rẻ nhất. Nhân tố quyết định cho quá trình nμy lμ ánh sáng mặt trời.
Vì vậy th−ờng sử dụng các ao hồ hoặc ruộng để nuôi tảo d−ới ánh sáng mặt
trời. Tuy nhiên khi tiến hμnh nuôi trên qui mơ lớn thì khó giữ đ−ợc các điều
kiện vô trùng. Trong những tr−ờng hợp nμy nguy cơ nhiễm tạp lμ nghiêm
trọng. Hơn nữa mật độ tế bμo ni theo ph−ơng pháp nμy th−ờng thấp
(khoảng 1-2 g/lít SCP tính theo trọng l−ợng khơ). Riêng tảo sợi Spirulina phát
triển mạnh hơn, hμm l−ợng protein cao hơn vμ đặc biệt lμ chứa betacaroten,
vitamin B12 lμ những thuốc quí. Dân c− ở Mehico vμ vùng bờ Bắc hồ Tchad

thuộc châu Phi th−ờng sử dụng loμi tảo nμy lμm nguồn dinh d−ỡng protein.
Nhật Bản sử dụng Chlorella nh− một nguồn protein vμ vitamin để bổ sung vμo
một vμi thực phẩm nh− sữa chua, kem vμ bánh mì. Gần đây cịn chứng minh
đ−ợc tác dụng chống phóng xạ của các chất có trong tảo Spirulina.

4. Sản xuất nấm sợi

Nm si cng l ngun protein đơn bμo phong phú. Tốc độ sinh tr−ởng
của nấm sợi thấp hơn vi khuẩn vμ nấm men, tuy nhiên cũng có những chủng
nấm sợi có tốc độ sinh tr−ởng nhanh nh− nấm men, đặc biệt những chủng nμy
nếu nuôi trên cơ chất đặc vμ bằng ph−ơng pháp bề mặt. Hμm l−ợng protein
thô trong nấm sợi đạt 50-55%, khi sinh tr−ởng nhanh hμm l−ợng acid nucleic
có thể rất cao (ARN tới 15%). Cần l−u ý đến thμnh phần kitin chứa trong
thμnh tế bμo nấm. Công nghiệp sản xuất penicillin đã tạo ra l−ợng lớn sinh
khối nấm Penicillium chrysogenum. L−ợng sinh khối nμy coi nh− chất phế
thải của cơng nghệ penicillin có thể sấy khơ vμ sử dụng vμo nhiều mục đích
khác nhau nh− lμm thức ăn giμu protein cho chăn nuôi, hoặc thuỷ phân để tạo

ra các acid amin lμm môi tr−ờng giầu dinh d−ỡng để nuôi vi khuẩn (Bacillus 
subtilis) sinh tổng hợp protease hoặc amylase rất kinh tế. Có những loμi nấm
sợi phát triển rất nhanh trên môi tr−ờng bột sắn hoặc sắn lát nghèo protein
(~1,0-1,5%) có bổ sung thêm khống vi l−ợng ni trong 40-48 giờ, nấm phát
triển, đem sấy khô vμ nghiền thμnh bột lμm thức ăn cho gia súc. Bột nμy có
hμm l−ợng protein tổng số lên tới 10%.

</div>
(64)<div class='page_container' data-page=64>

Bảng 5.5. Hàm lợng protein thô, N -amin và N phi protein ë mét sè loµi nÊm

Loµi nÊm Nguån C Protein 
th«

N 
α-amin

N phi protein 
(kĨ c¶ kitin)

Aspergillus oryzae tinh bét 50,2 28,7 42,6

A. oryzae rØ ®−êng 42,3 26,1 38,2

A. niger rØ ®−êng 47,9 25,5 46,6

P. chrysogenum đờng sữa 56,3 41,5 26,0

P. chrysogenum rØ ®−êng 48,2 26,8 44,3

Neurospora sitophila tinh bét 65,7 35,6 45,6

N. sitophyla rØ ®−êng 50.6 33,7 33,5

Fusarium graminearum tinh bét 54,0 42,1 22,0

F.moniliorme rØ ®−êng 51,5 35,6 30,9

Alternaria tenuis tinh bét 51,5 28,3 49,4

A. tenuis rØ ®−êng 49,5 22,3 55,0

Agaricus bispora - 32,8 19,4 41,0

Paecilomyces elegans, Aspergillus oryzae, Myrothecium verrucaria vμ
Trichodermareesei lμ những loμi nấm thích hợp đối với sự tạo thμnh sinh khối
trên n−ớc thải của công nghiệp sản xuất cμ phê vμ r−ợu rum. Nếu lên men ở
điều kiện vô trùng pH ban đầu 4,2 thì sau 6-8 ngμy lên men sản l−ợng sinh
khối có thể đạt 20-30 g/lít dịch ni, vμ hμm l−ợng protein đạt 20-34%. Sau
khi nuôi nấm hμm l−ợng chất hữu cơ trong n−ớc thải giảm đi, từ 13-15% giảm
còn 2-3%. Các kết quả t−ơng tự cũng thấy khi lên men Verticillium sp. trên
n−ớc thải sản xuất cμ phê; Aspergillus fumigatus trên bã mía, n−ớc thải của
công nghiệp thực phẩm, bột giấy từ gỗ; Penicillium digitatum trên n−ớc thải
sản xuất tinh bột khoai tây ...

Trong tr−ờng hợp dùng nấm sợi để cho ăn trực tiếp, cần l−u ý đến hμm
l−ợng kitin cao trong thμnh tế bμo nấm vμ độc tố của nấm có thể có trong
thμnh phẩm. Cần tiến hμnh kiểm tra tr−ớc khi sử dụng. Về chất l−ợng protein
của nấm sợi, nhiều phân tích cho thấy rằng hμm l−ợng các acid amin chứa l−u
huỳnh nh− cystein vμ methionin trong nấm sợi thấp hơn protein của động vật.
5. Sản xuất nấm ăn

</div>
(65)<div class='page_container' data-page=65>

phân giải đ−ợc dùng lμm phân bón hữu cơ, hoặc chế biến thμnh các thức ăn
cho cá hoặc một số động vật có giá trị kinh tế.

Các bã thải hữu cơ nhờ công nghệ trồng nấm đã mang lại những hiệu quả
sau:

• Chất thải đ−ợc loại bỏ đã đ−ợc xử lí thμnh những sản phẩm an toμn
trả lại cho môi tr−ờng xung quanh vμ hoμ nhập vμo môi tr−ờng sinh
thái nhờ các q trình chuyển hố tự nhiên.

• Chất thải rắn hay chất thải lỏng đều có thể dùng lμm cơ chất cho cơng
nghệ trồng nấm.

• Lignhin khơng tiêu hoá đ−ợc cùng các thμnh phần của thμnh tế bμo đã
bị lignhin hoá cao nh− cellulose vμ hemicellulose đều có thể bị phân
huỷ nhờ các enzym của nm lm bin i hon ton.

ã Các nguồn carbon từ các chất thải hầu nh không sử dụng đợc nhờ
trồng nấm ta thu đợc sinh khối giu protein có giá trị dinh dỡng cao
(nấm rơm, nấm mỡ, nấm sò, nấm hơng, mộc nhĩ...), nÊm d−ỵc liƯu
(linh chi ...).

* Qui trình trồng nấm ăn có thể tổng quát về nguyên tắc nh− sau: 
Giống nấm đ−ợc chuẩn bị vμ nhân giống trong phịng thí nghiệm nhằm
tạo ra một số l−ợng lớn bμo tử. Sau đó đem rắc bμo tử nấm lên cơ chất trồng
nấm đã đ−ợc chuẩn bị sẵn, cơ chất có thể ủ thμnh luống nhỏ (trồng nấm rơm),
hay bó lại thμnh các bịch hình trụ vμ xếp thứ tự trên các giá, ni trong nhμ
kính, hay ni hở ngoμi trời, hoặc nhμ có mái che. Điều quan trọng lμ giữ đ−ợc
nhiệt độ vμ độ ẩm thích hợp để bμo tử nấm nẩy mầm, sau đó tạo quả thể.
Trong q trình chăm sóc cho quả thể phát triển th−ờng t−ới hoặc phun thêm

các dung dịch có chứa dinh d−ỡng (N,P,K, ...). Nếu chăm sóc đúng kỹ thuật sẽ
thu hoạch quả thể đ−ợc nhiều lần vμ năng suất sẽ cao. Trồng nấm hiện nay lμ
một nghề phụ của nhiều gia đình nơng dân Việt Nam góp phần xố đói giảm
nghèo, lμm trong sạch mơi tr−ờng sống.

</div>
(66)<div class='page_container' data-page=66>

Nấm ăn đ−ợc trồng ở nhiều n−ớc trên thế giới ở các điều kiện khí hậu
khác nhau. Các chất thải của nông vμ công nghiệp lμ những cơ chất thích hợp
của nghề trồng nấm. Nấm mỡ đ−ợc trồng nhiều ở châu á, châu úc vμ bắc Mĩ.
Đμi Loan lμ nơi sản xuất nấm ăn đứng thứ ba thế giới. Trung Quốc lμ n−ớc
sản xuất nấm rơm nhiều nhất, nấm nμy cũng đ−ợc trồng nhiều ở Philipin, Việt
nam vμ Indonecia.

Tù lợng giá

1. Phõn tớch cỏc u nhc im cơ bản của protein đơn bμo

2. Các chủng nμo th−ờng đ−ợc dùng trong sản xuất sinh khối nấm men?
Nêu ứng dụng của nấm men vμ sinh khối nấm men trong đời sống vμ
trong ngμnh D−ợc.

</div>
(67)<div class='page_container' data-page=67>

Ch

−

¬ng 6

Sản xuất các sản phẩm trao đổi chất

bậc một dùng trong Y học

Mơc tiªu

Sau khi học xong chơng ny, sinh viên phải trình by đợc:

1. Nêu đợc khái niệm v tên các chủng loại sản phẩm bậc một của vi

sinh vật.

2. Trình by đợc quy trình sản xuất một sè s¶n phÈm cơ thĨ.

Vi sinh vật sống vμ phát triển trong điều kiện tự nhiên hay trong điều
kiện đ−ợc ni trong phịng thí nghiệm. Chúng muốn tồn tại cần phải đồng
hố các chất dinh d−ỡng có chứa trong mơi tr−ờng xung quanh. Q trình hấp
thu vμ biến đổi các chất dinh d−ỡng ở môi tr−ờng xung quanh để tạo ra năng
l−ợng cần thiết cho sự phát triển của chúng gọi lμ q trình đồng hố. Vi sinh
vật sử dụng năng l−ợng của quá trình đồng hoá để tổng hợp nên các thμnh
phần cấu trúc của tế bμo, để sinh tr−ởng, phát triển vμ duy trì nịi giống.
Trong q trình đó, một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp thừa ra một
số l−ợng các chất mμ chính tế bμo không dùng hết thải ra môi tr−ờng ngoμi
nh− các acid amin, vitamin, các enzym ... Các chất đó đ−ợc gọi lμ các chất trao
đổi bậc một. Lợi dụng những đặc điểm tự nhiên đó của vi sinh vật, các nhμ
khoa học đã tìm ra đ−ợc ph−ơng pháp chọn giống vμ tác động lμm biến đổi một
số đặc điểm di truyền của chúng vμ nghiên cứu các đặc điểm sinh lý hố sinh
của chúng nhằm ni cấy các vi sinh vật đó để “siêu tổng hợp” ra những hoạt
chất mμ ta mong muốn.

1. S¶n xuÊt c¸c acid amin

</div>
(68)<div class='page_container' data-page=68>

quan trọng trên cần phải nghiên cứu sản xuất bằng ph−ơng pháp công nghiệp.
Sản xuất bằng ph−ơng pháp tổng hợp hoá học th−ờng bao giờ cũng tạo ra một
acid amin dạng DL, việc tách riêng để chỉ lấy đồng phân dãy L vừa khó, giá
thμnh lại đắt. Sinh tổng hợp acid amin thuận tiện hơn vì chỉ tạo ra dạng acid
amin dãy L. Trên thế giới hiện nay hμng năm sản xuất trên 500 ngμn tấn acid
amin, doanh thu khoảng 4,5 tỉ USD. Hai acid amin sản xuất với số l−ợng lớn
nhất lμ acid glutamic vμ lysin. Trong giáo trình nμy giới thiệu ph−ơng pháp
sinh tổng hợp acid glutamic.

2. Sản xuất acid glutamic 
2.1. Đại cơng

Acid glutamic đ−ợc sản xuất với số l−ợng lớn nhất trong tất cả các acid
amin vì acid nμy đ−ợc dùng một phần trong sản xuất d−ợc phẩm, còn số l−ợng
lớn đ−ợc dùng trong thực phẩm lμm chất điều vị đ−ợc sản xuất d−ới dạng
mononatri glutamat. Acid glutamic có thể sản xuất bằng ph−ơng pháp thuỷ
phân protein của bột lúa mì (gluten). Hiện nay các nhμ máy sản xuất acid
glutamic trên thế giới đều tiến hμnh bằng ph−ơng pháp lên men vi sinh vật vì
vừa có năng suất cao giá thμnh lại thấp hơn nhiều so với ph−ơng pháp sản
xuất bằng hoá học.

</div>
(69)<div class='page_container' data-page=69>

Sản xuất acid glutamic bằng ph−ơng pháp lên men vi sinh vật cũng có
hai cách. Lên men trực tiếp một vi sinh vật có khả năng siêu tổng hợp acid
glutamic sau đó chiết xuất vμ tinh chế thu lấy sản phẩm. Một số vi sinh vật
khác lại có khả năng sinh tổng hợp với một số l−ợng lớn acid α-cetoglutarat. Vì
vậy có thể nuôi cấy các vi sinh vật nμy để chúng tạo ra acid α-cetoglutarat.
Sau đó biến đổi bằng enzym hoặc hố học acid nμy thμnh acid glutamic theo
hình 6.1.

2.2. Lên men sinh tổng hợp acid glutamic

2.2.1. Chủng giống

Có nhiều chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp acid glutamic. Tuy
nhiên những chủng sau đây đ−ợc nhiều nhμ máy sử dụng để sản xuất vì cho
hiệu suất cao (80-120 g/lít): Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium 
flavum, B. divaricatum. Đây lμ những vi khuẩn Gram (+) hiếu khí. Nhiệt độ
ni cấy thích hợp 34-37OC vμ thời gian lên men lμ 40 - 48 giờ.

2.2.2. Nhu cÇu dinh d−ìng

Mơi tr−ờng dinh d−ỡng dùng để lên men sinh tổng hợp acid glutamic rất
đơn giản. Tuỳ theo đặc điểm chủng sản xuất yêu cầu cần nghiên cứu để có mơi
tr−ờng tối −u cho năng suất sinh tổng hợp cao nhất. Nguồn carbon th−ờng lμ
glucose, sacharose. Thực tế sản xuất th−ờng sử dụng glucose từ dịch thuỷ
phân tinh bột kết hợp với sacharose trong rỉ đ−ờng (mía hoặc củ cải đ−ờng).
Đây lμ những nguyên liệu rẻ tiền. Nguồn nitơ th−ờng dùng lμ urê với tỉ lệ 1,5 -
2,0%, cũng có thể dùng (NH4)2SO4, NH4Cl với nồng độ 0,5%. Quá trình lên
men tạo ra acid glutamic lμm cho pH môi tr−ờng giảm xuống. Vì vậy th−ờng
bổ sung urê để giữ cho pH mơi tr−ờng đạt trung tính, đảm bảo khơng ảnh
h−ởng đến sự phát triển của vi khuẩn lμm giảm hiệu suất sinh tổng hợp,
đồng thời urê lại có tác dụng bổ sung thêm nguồn nitơ lμm chất dinh d−ỡng
cho vi khuẩn.

</div>
(70)<div class='page_container' data-page=70>

2.2.3. Quy trình lên men v chiết xuất

Sn xut acid glutamic th−ờng áp dụng ph−ơng pháp lên men chu kì
(theo mẻ) trên các thiết bị lên men có dung tích từ 100.000 - 300.000 lít trong
điều kiện hiếu khí vμ vơ trùng tuyệt đối.

§Ĩ chiÕt xt vμ tinh chế acid glutamic có nhiều phơng pháp. Tuy nhiên
chỉ có hai phơng pháp đợc áp dụng trong công nghiƯp.

• Ph−ơng pháp điểm đẳng điện

Sau khi kết thúc quá trình lên men, dịch lên men đ−ợc cô chân không ở
nhiệt độ 50-60OC đến nồng độ nhất định. Sau đó tẩy mμu bằng than hoạt, lọc

loại than, điều chỉnh pH bằng acid clohydric đến điểm đẳng điện lμ 3,2. Acid
glutamic kết tinh. Lọc hay ly tâm lấy tinh thể. Ph−ơng pháp thu hồi sản phẩm
nμy khá đơn giản, tuy nhiên hiệu suất thu hồi thấp th−ờng chỉ đạt 50 - 60%.

• Ph−ơng pháp trao đổi ion

Trong công nghiệp hiện nay để chiết xuất acid glutamic th−ờng áp dụng
ph−ơng pháp chiết bằng trao đổi ion theo hình 6.2.

</div>
(71)<div class='page_container' data-page=71>

2.3. Sản xuất mì chính

Trong thc t, acid glutamic đ−ợc dùng chủ yếu để chế tạo mì chính dùng
trong thực phẩm lμm chất điều vị. Để sản xuất mì chính chỉ cần hoμ tan acid
glutamic đến nồng độ nhất định, sau đó tạo muối mononatri glutamat bằng
Na2CO3 hoặc NaOH ở pH 6,8-7,0, khử sắt, tẩy mμu. Dung dịch glutamat Natri
đem cô d−ới áp suất giảm đến nồng độ khoảng 30 - 30,5 độ Bé. Thêm vμi tinh
thể mì chính lμm mầm kết tinh. Tiếp tục cô đến đậm độ 31 - 31,8 Bé, các tinh
thể mì chính kết tinh dạng hình trụ đều đặn. Điều kiện để kết tinh mì chính
cần tn thủ lμ: áp suất chân không: 600 mmHg; nồng độ glutamat: 31,5 -
31,8 Bé. Nhiệt độ cô đặc: 60 - 65OC.

Sản phẩm có hμm l−ợng mononatri glutamat đạt 98 - 98,5%. Hiệu suất
chuyển đổi thμnh glutamat đạt 85 - 90%. Ly tâm lấy tinh thể. N−ớc ót không
kết tinh đ−ợc bổ sung thêm natri clorid để tạo ra dạng bột ngọt có chứa 20 -
25% mononatri glutamat dùng lμm bột gia v.

3. Sản xuất dextran 
3.1. Đại cơng

Dextran l các polysaccharid có trọng

lợng phân tử rất khác nhau, th−êng lμ
dextran 1, 40, 60, 70 hay 110 kDa t−¬ng
øng víi 1.000, 40.000, 60.000, 70.000 vμ
110.000. Dextran lμ một polymer đợc
trùng hợp bởi nhóm vi khuẩn Lactic nhờ
các liên kết 1,6 glucosid.

Dextran đợc sử dụng trong y häc

nh− một chất dùng thay thế huyết t−ơng khi bị choáng do mất máu, chấn
th−ơng, bỏng, nhiễm độc, viêm tuỵ, viêm mμng bụng. Dextran “gia công” hay
sephadex đ−ợc coi nh− những sμng phân tử dùng trong kỹ thuật lọc gel để tinh
chế các protein có trọng l−ợng phân tử khác nhau th−ờng dùng để tinh chế các
enzym hoặc các peptid lμm thuốc. Dextran cũng đ−ợc sử dụng lμm các chất
keo bảo vệ, hoặc các chất độn có tính trơ dùng trong dc hc.

3.2. Phơng pháp sản xuất

Có nhiều chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp dextran nh
Streptobacterium dextranicum, Streptococcus mutans. Tuy nhiên trong công
nghiệp th−êng sư dơng chđng Leuconostoc mesenteroides ATCC10830, chđng
nμy t¹o ra tíi 95% polymer dextran cã liªn kÕt α-1,6 glucosid (phần còn lại l
liên kết -1,3) v trọng lợng phân tư lμ 4-5 x 107 dalton.

Mơi tr−ờng để sinh tổng hợp dextran rất đơn giản gồm có saccharose 6%,
cao ngô hoặc cao nấm men 2%, KH2PO4 0,1% vμ các vi l−ợng, pH 5,0-6,0. Quá

O
OH

OH
OH
C
H2

O CH2
O
OH

OH
OH

</div>
(72)<div class='page_container' data-page=72>

trình lên men đợc tiến hnh ở 25OC, lúc ban đầu thông khí nhẹ v khuấy

trn liờn tc. Khi dextran đ−ợc hình thμnh dung dịch trở nên đặc sánh vμ có
độ nhớt cao thì phải tăng tốc độ khuấy vμ cung cấp đủ khơng khí vơ trùng. Kết
thúc lên men sau 72-96 giờ. Sản phẩm chính lμ khối keo dextran đ−ợc hình
thμnh, một ít fructose tự do, acid lactic.

3.3. Tinh chÕ vμ chÕ t¹o dextran d−ỵc dơng

Kết thúc q trình lên men dùng methanol để kết tủa dextran (1/3). Lọc
thu dextran để tinh chế tiếp. Dịch thải đ−ợc cất để thu hồi methanol.

Dextran có trọng l−ợng phân tử lớn đ−ợc thuỷ phân bằng acid hydrocloric
ở nhiệt độ 95-100OC. Khống chế trọng l−ợng phân tử bằng ph−ơng pháp đo độ

</div>
(73)<div class='page_container' data-page=73>

4. Sinh tổng hợp vitamin B12 (Cyanocobalamin) 
4.1. Đại c−¬ng

Các vitamin đã đ−ợc sản xuất ở quy mơ công nghiệp nhờ vi sinh vật lμ
vitamin B12 (Cyanocobalamin), vitamin B2 (Riboflavin).

Từ giữa thế kỷ XIX (1849) đến đầu thế kỷ XX, nguyên nhân của bệnh
thiếu máu ác tính khơng ai giải thích đ−ợc. Mãi đến năm 1926, khi G. R.
Minot vμ W. P. Murphy phát hiện đ−ợc tác dụng điều trị bệnh thiếu máu ác
tính của cao gan thì h−ớng nghiên cứu mới đ−ợc mở ra. Năm 1927, Castle
nhận xét rằng trong dịch tiêu hố có 1 chất đ−ợc gọi lμ "nhân tố nội", khi nó
kết hợp với 1 chất gọi lμ "nhân tố ngoại" có trong protein của gia súc giúp cho
cơ thể hấp thu đ−ợc "tác nhân chống thiếu máu ác tính". Đến năm 1948,
Ricker vμ cộng sự ở Mỹ vμ Smith-Parkers ở Anh đã chiết vμ kết tinh đ−ợc
những tinh thể hình kim mμu đỏ đậm từ cao gan động vật vμ gọi lμ vitamin
B12. Parker chứng minh đ−ợc đó lμ "nhân tố ngoại" vμ cũng lμ tác nhân chữa
thiếu máu ác tính. Từ 1 tấn gan lấy đ−ợc 20 – 25 mg vitamin B12.

Cấu trúc hoá học của vitamin B12 do D. C.
Hodgkin (giải th−ởng Nobel 1964) xác định. Trong
động vật vμ thực phẩm B12 tồn tại dạng coenzym liên
kết với acid amin.

Vitamin B12 lμ yếu tố sinh tr−ởng, điều trị bệnh
thiếu máu ác tính. Nhu cầu cho ng−ời bình th−ờng 1
mcg/ngμy. Thiếu vitamin B12 sẽ ảnh h−ởng đến chức
năng tạo hồng cầu gây ra suy nh−ợc toμn thân. Cơng
dụng chính của vitamin B12 lμ chữa bệnh thiếu máu ác
tính vμ các chứng thiếu máu khác. Vitamin B12 phối
hợp với vitamin B1, B6 dùng điều trị viêm dây thần
kinh gây đau khớp, liệt chân, tay rất hiệu quả. Calci -
B12 giúp trẻ con chống còi x−ơng, chậm lớn...

Vitamin B12 tham gia vμo nhiều phản ứng trao đổi chất ở cơ thể, kích
thích q trình tổng hợp protein (th−ờng gọi lμ nhân tố protein động vật) vì
vậy gia súc, gia cầm ăn thức ăn có chứa B12 sẽ tăng trọng nhanh (10 - 15%).

Tăng tỷ lệ đẻ trứng ở gμ vμ tăng tỷ lệ trứng nở thμnh gμ con.

Vitamin B12 thuộc loại hợp chất hoạt động sinh lý vμ đ−ợc tổng hợp trong
tự nhiên hoμn toμn bởi vi sinh vật. Sinh vitamin B12 mạnh nhất lμ các vi

khuÈn propionic vμ vi khuÈn metan, vitamin B12 n»m trong tÕ bμo cđa c¸c vi
khn nμy. Ngoi ra còn một số xạ khuẩn cũng sinh vitamin B12 nh−: Str. 
griseus, Str. aureofaciens, Str. rimosus…

Thực vật không tạo đ−ợc vitamin B12. ở ng−ời, vitamin B12 do vi sinh vật
tạo ra ở ruột giμ vì thế nó khơng đ−ợc hấp thu vμo máu. Phân ng−ời, gia súc có
vitamin B12. ở động vật: thịt bị, gan, thận, tim (10 mcg/100 g); ở hải sản: cua,

</div>
(74)<div class='page_container' data-page=74>

cá, trứng cá; trong các sản phẩm phomát, kem, sữa… đều có chứa 1 l−ợng nhỏ
vitamin B12.

4.2. Cấu trúc hoá học v tính chất

Công thức cÊu t¹o cyanocobalamin (C63H88CoN14O14 P; 1355) theo BP 2003

TT Tªn gäi Tªn cobalamin R

1 Vitamin B12 Cyanocobalamin CN

2 Vitamin B12a Hydroxocobalamin OH

3 Vitamin B12b Aquacobalamin H2O

4 Vitamin B12c Nitrosocobalamin NO

5 Coenzym B12 5'-deoxy-adenosylcobalamin

6 Methyl vitamin B12 Methylcobalamin CH3

Phân tử vitamin B12 có dạng coenzym liên kết với acid amin, bao gồm 2
phần chính: phần Corin (còn gọi l nhân tố B) v phần nucleotid gồm base
chứa nitơ l 5, 6 dimetylbenzimidazol, đờng ribose v phân tử H3PO4. Nhân

Corin phức hợp với nguyên tử cobalt; cobalt gắn với 1 gèc R vμ gäi chung lμ
cobalamin. Tuú theo gèc R mμ ta cã c¸c vitamin B12 cã t¸c dơng sinh häc.

Tất cả các cobalamin đều có thể chuyển đ−ợc thμnh cyanocobalamin khi
cho tác dụng với nhóm -CN. Cyanocobalamin vμ hydroxocobalamin lμ 2 dạng
hay dùng trong y học.

</div>
(75)<div class='page_container' data-page=75>

550 nm. Đỉnh 361 nm dùng để định l−ợng vitamin B12 bằng quang phổ.

Vitamin B12 bị ánh sáng phân huỷ.
4.3. Lên men sinh tổng hợp

Để sản xuất vitamin B12 có 3 con đờng sau:
4.3.1. Chiết từ bùn cống hoạt hoá

Một số vi sinh vật đặc biệt thuộc nhóm vi khuẩn sinh metan sống kỵ khí
trong bùn cống, ruộng, ao... có khả năng sản sinh ra vitamin B12 với hμm
l−ợng 0,5 - 1 mcg/1g bùn khô. Nếu ủ bùn trong điều kiện kỵ khí hμm l−ợng

vitamin B12 có thể tăng lên. Có thể chiết lấy vitamin B12 thô từ bùn rồi bổ sung
vμo thức ăn chăn nuôi gμ lợn. Hiện nay không sử dụng ph−ơng pháp nμy để
sản xuất mμ chỉ để kiểm tra độ ơ nhiễm mơi tr−ờng.

4.3.2. ChiÕt tõ n−íc th¶i cđa công nghiệp kháng sinh

Mt s x khun nh Streptomyces griseus sinh tổng hợp streptomycin,
Str. aureofaciens tạo ra tetracyclin, Str. rimosus tạo oxytetracyclin..., ngoμi
các kháng sinh còn sinh tổng hợp ra 1 l−ợng vitamin B12 từ 0,5 ữ 1cg/ml mơi
tr−ờng. Vì vậy sau khi chiết kháng sinh lμ sản phẩm chính ng−ời ta cịn chiết
lấy vitamin B12 từ n−ớc thải bỏ đi đó. Từ 100 lít n−ớc thải có thể thu đ−ợc 40 mg

vitamin B12.

4.3.3. Lên men sinh tổng hợp

Chủng giống: trong sản xt dïng vi khn Propionibacterium 
shermanii v× cho hiƯu st cao nhÊt.

Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn sinh vitamin B12: vi khuẩn
Propionibacterium shermanii thuộc Gram (+), lμ trực khuẩn nhỏ, xếp thμnh
đôi hoặc chuỗi ngắn khơng di động, sống kỵ khí hay hiếu khí khơng bắt buộc.
Trong điều kiện kỵ khí có hình cầu đ−ờng kính 0,5 - 0,6 μm, trong điều kiện
hiếu khí lại có hình que. Phát triển mạnh mẽ khi ở điều kiện kỵ khí.

Điều kiện ni cấy: sinh tr−ởng trong phạm vi pH 4,5 - 7,5 nh−ng thích
hợp nhất lμ pH = 6,8 - 7,0. Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp vitamin B12 lμ
28 - 30OC. Giới hạn tối đa cho sinh tổng hợp l 32OC.

Nguồn carbon: lên men đợc nhiều loại đờng nhng thích hợp nhất l

glucose.

Nguồn nitơ: các acid amin, các muối amoi. Methionin có tác dụng lm
tăng hiệu st sinh tỉng hỵp B12 tõ 10 - 12%.

Các ion kim loại: bổ sung một l−ợng nhỏ muối cobalt (clorid hoặc nitrat)
sẽ tăng đáng kể hiệu suất sinh tổng hợp B12, còn các kim loại sắt, đồng, kẽm,

</div>
(76)<div class='page_container' data-page=76>

C¸c vitamin: cã t¸c dơng kÝch thích sinh trởng v lm tăng hiệu suất
sinh tỉng hỵp vitamin B12 gåm (thiamin, biotin, acid nicotinic, acid folic).
4.4. Quy trình sản xuất

Môi trờng thạch giữ giống có thnh phần gồm (%): 
Glucose 3,0

Cao ng« 0,5
KH2PO4 0,1

CoCl2. 6H2O 0,01
Agar-agar 1,0
pH 6,8 ÷ 7,2

Khư trïng 110°C/20 phót, cÊy vi khn vμ nu«i trong điều kiện kỵ khí
bắt buộc ở 30C trong 72 giờ.

Môi trờng nhân giống (%):

Glucose 3,0

Cao ng« 1,5

CoCl2. 6H2O 0,015
pH 6,8 ÷ 7,2.

Khử trùng 115C/30'. Nuôi giống trong điều kiện kỵ khÝ ë 30°C/48 giê.
CÊy gièng víi tû lƯ 10% l thích hợp.

Môi trờng lên men tạo vitamin B12 (%):

Glucose 8,0

Cao ng« 2,5

CoCl2. 6H2O 0,015

5,6 DMB 0,015

pH 6,8 ÷ 7,2

Khư trïng 115°C/30 phót. Lªn men trong 6 - 7 ngμy.

Vi khuẩn Propionibacterium shermanii sống kỵ khí tuỳ thích nh−ng
khơng thể phát triển đ−ợc trong điều kiện hiếu khí mạnh. Hμm l−ợng vitamin
B12 tạo thμnh nhiều trong điều kiện kỵ khí, do đó trong 50h đầu nếu hiếu khí
sẽ lμm giảm sinh khối vμ hiệu suất sinh tổng hợp. Trong lên men công nghiệp
nhất thiết phải kỵ khí ở 2 - 3 ngμy đầu, từ ngμy thứ t− thổi khí nhẹ hoặc cách
1 giờ cấp khí khoảng 15 phút.

</div>
(77)<div class='page_container' data-page=77>

trình lên men vi khuẩn phát
triển sẽ tạo ra acid propionic

lμm pH môi tr−ờng giảm
xuống. Một trong những dấu
hiệu của quá trình lên men tốt
lμ pH môi tr−ờng nuôi cấy
giảm rõ rệt trong những ngμy
đầu. Vì vậy ln ln phải
kiểm tra pH môi tr−ờng vμ
điều chỉnh bằng amoniac để
giữ pH luôn bng 7,0.

Môi trờng nhân giống
v môi trờng lên men về cơ
bản giống nhau, tuy nhiên ở

môi tr−ờng lên men l−ợng glucose cần nhiều hơn vμ cần bổ sung tiền chất 5,6
DMB (dimethylbenzylmidazol) với nồng độ 1 - 10 mg/l. Do vi khuẩn có khả
năng tạo thμnh hμng loạt chất t−ơng tự vitamin B12 nên cần bổ sung 5,6 DBM

lμ base trong nucleotid cña vitamin B12, nã cã nhiƯm vơ chun toμn bé c¸c
nh©n tè B thμnh vitamin B12 thËt vμ hiƯu st sinh tổng hợp cao hơn. Thời
gian bổ sung 5,6 DMB cã thĨ bÊt kú nh−ng nÕu cho mn qu¸ nhân tố B cha
kịp chuyển hết thnh vitamin B12 sẽ lm giảm hiệu suất sinh tổng hợp.

Thi gian lên men kéo dμi 6 - 7 ngμy. Ba ngμy đầu ni kỵ khí rồi bổ
sung 5,6 DMB vμo giờ thứ 72. Nếu cho muộn quá nhân tố B không chuyển hết
thμnh vitamin B12 đ−ợc. Trên qui mơ 100 m3 hiện nay hiệu suất có thể đạt

80 ữ 100mg/1 lít môi trờng.
4.5. Quy trình chiÕt xuÊt

Vitamin B12 lμ sản phẩm nội bμo nên tồn tại trong sinh khối vi khuẩn.
Sau khi kết thúc lên men, dịch lên men đ−ợc đem lọc hoặc ly tâm thu lấy sinh
khối, loại dịch trong. Tiến hμnh chiết xuất bằng dung môi hữu cơ hoặc nhựa
trao đổi ion.

Hoμ sinh khối vμo n−ớc tạo hỗn dịch vμ chỉnh pH về 4,5 bằng HCl 10%
vμ thêm chất ổn định. Đun nóng hỗn dịch lên 80oC trong 30 phút để giải

phãng vitamin B12 vμo dung dịch. Lọc lấy dịch lọc, bỏ bÃ hoặc tận thu lm thức
ăn chăn nuôi. Chiết vitamin B12 từ dung dịch nớc sang pha hữu cơ bằng hỗn

hp dung môi phenol: n-butanol (1:1) với tỷ lệ V pha hữu cơ: V pha n−ớc lμ
1:10. Dịch chiết hữu cơ nμy đ−ợc pha loãng bằng tricrezol vμ carbon tetraclorid
(CCl4) – sau đó chiết vitamin B12 trở lại pha n−ớc nhiều lần bằng n−ớc.

Chỉnh pH pha dung dịch n−ớc về 8,0 - 8,5 vμ tiến hμnh cyanid hoá. Sử
dụng KCN để chuyển dạng vitamin B12 coenzym thμnh Cyanocobalamin trong
3 giờ. Chỉnh pH về trung tính, cơ chân không ở ≤ 60°C đến nồng độ vitamin
B12 đạt khoảng 10.000 mcg/ml.

6,0 7,5 pH

</div>
(78)<div class='page_container' data-page=78>

Quá trình tinh chế Vitamin B12 đợc tiến hnh trên cột oxyd nhôm

(Brochman alumium oxide) đã hoạt hoá 3000C/1 giờ. Hấp phụ dung dịch

vitamin B12 lên cột trong dung dịch aceton - n−ớc 75%. Chuyển dịch vitamin
B12 trên cột bằng aceton - n−ớc (80%). Sau đó phản hấp phụ bằng aceton - n−ớc

(50%) thu lấy phân đoạn đậm đặc nhất. Pha loãng dịch đậm đặc bằng aceton,
khuấy nhẹ vμ để kết tinh 12 giờ ở 4°C. Lọc thu tinh thể hình kim mμu đỏ đậm,
rửa bằng aceton nguyên chất vμ sấy khô ở nhiệt độ thấp (≤ 50OC). Trong cơng

nghiƯp s¶n xt vitamin B12 hiện nay ngời ta dùng phơng pháp chiết bằng

nhựa hấp phụ XAD2 (hình 6.5)

Lọc

Dịch lọc

Chiết lần 1

ChiÕt lÇn 2

Cyanid hãa

Tinh chÕ

KÕt tinh

Sản phẩm

Dịch lọc

Sinh khối
Hoà trong nớc cất

Chỉnh pH 4,5 = HCl

§un 800C/30 phót

Phenol: n-butanol = 1:1

N−íc cÊt

KCN
pH 8,5

Cét oxyd nh«m (3000C/1 giê)

aceton/n−íc

Aceton 40C

sấy khô 500C

Dịch lên men

Lọc, ly tâm

</div>
(79)<div class='page_container' data-page=79>

Hình 6.5b. Các công đoạn chiết xuất và tinh chÕ vitamin B12 b»ng nhùa hÊp phô

Läc, ly tâm

Phá vỡ tế bào

Lọc

Hấp phụ

Phản hấp phụ

Cô chân không

Cyanid hóa

Sắc ký

Phản hấp phụ

Kết tinh

Sản phẩm

Dịch lọc

Sinh khèi
Hoµ trong n−íc cÊt

ChØnh pH 4,5 = HCl
§un 800C/30 phót

Nhùa XAD2

KCN
pH 8,5

Cét oxyd nhôm (3000C/1 giờ)

aceton/nớc

Aceton 40C

sấy khô 500C

Lọc, ly tâm

Dd aceton 20%

</div>
(80)<div class='page_container' data-page=80>

Vitamin B12 tinh thể phải có hμm l−ợng ≥ 95%. Định l−ợng vitamin B12
bằng quang phổ tử ngoại ở b−ớc sóng 361 nm. Cũng có thể định l−ợng vitamin
B12 bằng ph−ơng pháp vi sinh vật - chủng kiểm định lμE. coli M113-3.

Tù lợng giá

1. Trình by quy trình lên men sinh tổng hợp acid glutamic v các
phơng pháp chế tạo mì chính.

2. Trình by quy trình lên men sinh tổng hợp, phơng pháp tinh chế
v chế tạo dextran dợc dụng.

3. Kể tên các phơng pháp sản xuất vitamin B12.

</div>
(81)<div class='page_container' data-page=81>

phần II. Công nghệ sản xuất kháng sinh

Ch

ơng 7

Đại c

ơng về kháng sinh

Mục tiêu

Sau khi học xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc:

1. Các bớc cần tiến hnh khi đi tìm một chất kháng sinh dùng trong y
häc.

2. Các ph−ơng pháp gây đột biến vi sinh vật để nâng cao hiệu suất.
3. Các ứng dụng kháng sinh ngoμi lĩnh vực y học.

Hiện nay các nhμ khoa học đã thông báo phát minh ra hơn 8.000 chất
kháng sinh, trong đó có khoảng hơn 100 chất đã đ−ợc nghiên cứu kỹ vμ đ−a
vμo sử dụng trong y học vμ một số lĩnh vực khác. Các chất còn lại hoặc lμ độc
tính cao, hoặc lμ mất tác dụng khi vμo cơ thể. Do vậy việc tìm ra một kháng
sinh mới lμ rất khó. Nếu khơng có ph−ơng pháp đặc biệt sẽ dễ nhầm lẫn với
các kháng sinh đã đ−ợc phát hiện lμm tiêu tốn công sức vμ tiền của vơ ích. Ví
dụ: theo tính tốn của các nhμ khoa học Mỹ, muốn phát minh ra một kháng
sinh có hoạt phổ rộng cần 55 nhμ khoa học lμm việc liên tục 2,5 năm để phân
tích 100 ngμn mẫu đất vμ tiêu tốn khoảng 4 triệu đôla. Để phát minh ra một
kháng sinh điều trị lao cần 11 năm nghiên cứu vμ tiêu tốn vμi triệu đơla.

Vậy thì ngun nhân nμo đã kích thích các nhμ nghiên cứu, các hãng sản
xuất d−ợc phẩm lớn lao vμo con đ−ờng nghiên cứu tìm ra các kháng sinh mới?
Có lẽ do các nguyên nhân sau đây:

1. Nhiều chất kháng sinh lμ những hoá trị liệu khơng có gì thay thế
đ−ợc để điều trị các bệnh nhiễm trùng hiểm nghèo, bệnh ung th−.
2. Một số kháng sinh mang lại hiệu quả cao cho cây trồng vμ vật ni.
3. Ngμy cμng có nhiều vi sinh vật gây bệnh kháng lại thuốc kháng sinh

nªn phải nghiên cứu tìm ra các chất kháng sinh mới thay thế các
chất kháng sinh cũ ít còn tác dơng.

</div>
(82)<div class='page_container' data-page=82>

Vì vậy nghiên cứu để phát minh ra các chất kháng sinh mới luôn lμ vấn
đề thời sự hấp dẫn các nhμ kinh tế vμ các nhμ nghiên cứu thuộc nhiều lĩnh vực
khác nhau nh−: vi sinh vật học, hoá sinh học, di truyền học, hoá học, d−ợc lý
học vμ các nhμ kỹ thuật... Nghiên cứu kháng sinh lμ ví dụ điển hình về sự kết
hợp nhiều nhμ khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau, chỉ có biết phối hợp
chặt chẽ mới đem lại thắng lợi vμ hiệu qu.

1. Định nghĩa kháng sinh

Cú rt nhiu định nghĩa khác nhau về chất kháng sinh, song có thể nêu
lên một định nghĩa đ−ợc coi lμ hoμn chỉnh nhất: "Kháng sinh lμ những sản 
phẩm đặc biệt nhận đ−ợc từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt 
tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên 
một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, protozoa...) hay tế bμo ung th−"
ở nồng độ thấp.

Cần phân biệt một số chất cũng do vi sinh vật tạo ra nh−ng không đ−ợc
gọi lμ kháng sinh nh−: r−ợu ethylic, các acid hữu cơ... vì chúng tác dụng lên vi
sinh vật khác khơng mang tính chọn lc v nng cao.

2. Đơn vị kháng sinh

Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính của chất kháng sinh - trong 1 ml
(đv/ml) dung dịch hay 1 mg chế phẩm (đv/mg) th−ờng dùng đơn vị (đv) kháng
sinh. Đó chính lμ l−ợng kháng sinh tối thiểu hoμ tan trong một thể tích mơi
tr−ờng xác định có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định.

Ví dụ: Đơn vị hoạt tính của penicillin G lμ l−ợng penicillin G ít nhất hoμ
tan vμo 50 ml canh thang có tác dụng ức chế sự phát triển của Staphylococcus 
aureus 209 P. Đơn vị hoạt tính của Streptomycin lμ l−ợng Streptomycin ít
nhất hoμ vμo 1 ml canh thang có tác dụng ức chế sự phát triển của E. coli... Vì
mỗi kháng sinh có đơn vị hoạt tính sinh học riêng nên phải ghi rõ để tiện khi
sử dụng. Ví dụ: penicillin G 1 đơn vị bằng 0,6 mcg, nghĩa lμ 1mg chứa 1.667
đơn vị; còn streptomycin 1 đơn vị = 1 mcg (1 mg = 1.000 đv); 1mg Neomycin
chứa 300 đơn vị (1 đv = 3,3 mcg); 1 n v bacitracin cha 20 mcg...

3. Phân loại kh¸ng sinh

Danh sách các chất kháng sinh đ−ợc phát minh ngμy cμng dμi thêm mãi.
Việc phân loại các kháng sinh lμ cần thiết vì nó giúp cho các nhμ khoa học tốn
ít thời gian khi nghiên cứu các kháng sinh mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác
dụng, độc tính...

</div>
(83)<div class='page_container' data-page=83>

bμo, lên tổng hợp protein, tổng hợp ADN, ARN ...). Cách phân loại nμy thích
hợp cho các nhμ D−ợc lý học. Các nhμ Hố học thì đề nghị phân loại kháng
sinh theo cấu trúc hoá học. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hoá học lμ
khoa học nhất vì nó giúp cho ng−ời nghiên cứu nhanh chóng định h−ớng đ−ợc
các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết đ−ợc cấu trúc hoá học
của nó, tránh lãng phí thời gian để nghiên cứu về các đặc điểm khác. Phân loại
kháng sinh theo cấu trúc hố học th−ờng chia ra các nhóm chất sau đây:

+ C¸c chÊt kh¸ng sinh cã cÊu tróc β-lactam (penicillin, cephalosporin)
+ Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol)

+ C¸c kh¸ng sinh cã cÊu tróc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin)
+ Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (các tetracyclin)

+ C¸c kh¸ng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin)
+ C¸c kh¸ng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)
+ C¸c kh¸ng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)

+ C¸c kh¸ng sinh chèng ung th− nhãm antracyclin (daunorubicin)
+ C¸c kh¸ng sinh chèng ung th− nhãm actinomycin (dactinomycin D)
+ …

4. Các ph−ơng pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 
Để phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh ng−ời ta phải lấy mẫu từ các
nguồn cơ chất khác nhau: đất ở ruộng, đất quanh rễ cây, đất nền ở chuồng gia
cầm, gia súc, bùn, n−ớc ở sông hồ... Từ các mẫu trên đem phân lập thuần khiết
những vi sinh vật sinh kháng sinh mμ ta mong muốn bằng các ph−ơng pháp
đặc tr−ng vμ trên cỏc mụi trng chn lc.

Để phân lập xạ khuẩn thờng dùng môi trờng có thnh phần sau:

Môi tr−êng 1 M«i tr−êng 2 
(NH4)2SO4

K2HPO4

NaCl
MgSO4

Tinh bột
Agar – agar
N−ớc máy vừa đủ

1 g

1 g
1 g
1 g
10 g
20 g
1.000 ml
KNO3
K2HPO4

NaCl
MgCO3

Tinh bét
FeSO4

CaCO3
Agar - agar
N−ớc máy vừa đủ

</div>
(84)<div class='page_container' data-page=84>

Để phân lập nấm mốc thờng sử dụng môi trờng có thnh phần: 
NaNO3

KH2PO4
MgSO4
Saccharose
Agar agar
Nc máy vừa đủ

6 g
1 g

0,05 g
20 g
20 g
1.000 ml
pH tr−íc khi tiƯt trïng 6,0 ÷ 6,2.

Ví dụ: Đa số vi khuẩn phát triển tốt trên mơi tr−ờng có thμnh phần giμu
dinh d−ỡng (pepton, canh thang - thạch) ở pH 7,0 vμ nhiệt độ 30 ữ 37°C. Trong
các điều kiện trên nấm mốc vμ xạ khuẩn phát triển chậm hơn.

Có thể khái qt hố thμnh ngun tắc để thực hiện dễ dμng nh− sau:

1. Mỗi chất kháng sinh đ−ợc tạo ra bởi một hoặc vμi loμi vi sinh vật xác
định. Ví dụ: tetracyclin do Str. aureofaciens, Str. viridifaciens tạo ra;
penicillin do P. chrysogenum hoặc P. notatum tạo ra.

2. Mỗi loμi vi sinh vật xác định có thể sinh tổng hợp ra một hoặc vμi
chất kháng sinh theo đặc điểm di truyền của chúng. Ví dụ: Str. 
fradiae có thể tạo ra neomycin A, neomycin B, neomycin C. Str. 
rimosus tạo ra oxytetracyclin … Biết đ−ợc nguyên tắc trên việc đi tìm
các kháng sinh đã đ−ợc mơ tả rất dễ dμng. Ví dụ: muốn có kháng
sinh streptomycin chỉ cần phân lập xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces
vμ loμi lμ griseus. Muốn có kháng sinh fumagillin ta cần phân lập
nấm mốc thuộc chi Aspergillus vμ loμi fumigatus. Muốn có kháng
sinh gramyxidin chỉ cần phân lập vi khuẩn có bμo tử chi Bacillus loμi
brevis...

Rõ rμng để phân lập một vi sinh vật cho một chất kháng sinh đã biết
công việc không phức tạp lắm, song để phân lập những vi sinh vật sinh chất
kháng sinh mới đòi hỏi công việc phức tạp hơn nhiều, nhất lμ những kháng

sinh chống virus vμ ung th−.

4.1. Ph−ơng pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch

</div>
(85)<div class='page_container' data-page=85>

4.2. Ph−ơng pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa sẵn vi 
sinh vật kiểm định

Trên hộp petri có mơi tr−ờng dinh d−ỡng vμ chứa vi sinh vật kiểm định,
đem gieo cấy trực tiếp các "hạt" đất lên bề mặt thạch, để tủ ấm 24 - 48 giờ
mang ra quan sát. Nếu xung quanh các hạt đất có vịng vơ khuẩn, ta biết
đ−ợc vi sinh vật trong hạt đất đó có sinh ra chất kháng sinh chống lại vi sinh
vật kiểm định. Từ cục đất đó ta tiến hμnh phân lập vμ đ−ợc vi sinh vật sinh
kháng sinh để nghiên cứu tiếp. Ph−ơng pháp nμy cho biết đ−ợc ngay lμ vi
sinh vật đối kháng phân lập đ−ợc có khả năng ức chế đ−ợc vi sinh vật gây
bệnh thuộc loại gì.

4.3. Ph−ơng pháp lμm giμu đất

Đất tr−ớc khi đem phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh đ−ợc đ−a vμo
chậu thuỷ tinh, giữ độ ẩm xác định - thỉnh thoảng ta lại cho thêm một ít vi
sinh vật kiểm định vμo, trộn đều. Nuôi ở tủ ấm sau một thời gian đem ra phân
lập theo ph−ơng pháp nêu ở mục 4.1. Bằng ph−ơng pháp nμy ng−ời ta dễ dμng
thu đ−ợc vi sinh vật đối kháng với vi sinh vật kiểm định mặc dù ban đầu vi
sinh vật đối kháng đó có trong đất rất ít.

4.4. Ph−ơng pháp thêm kháng sinh vμo trong môi tr−ờng phân lập 
Xạ khuẩn phát triển chậm hơn vi khuẩn vμ nấm mốc. Vì vậy để dễ dμng
phân lập xạ khuẩn, ng−ời ta cho thêm kháng sinh chống nấm vμ kháng khuẩn
với nồng độ từ 5 - 25 mcg/ml vμo môi tr−ờng phân lập. Các kháng sinh
th−ờng dùng lμ: tetracyclin, neomycin, nystatin, streptomycin, penicillin,

chloramphenicol. Bằng cách nμy ng−ời ta dễ dμng phân lập đ−ợc xạ khuẩn
sinh chất kháng sinh.

4.5. Ph©n lËp vi sinh vËt sinh kh¸ng sinh chèng ung th−

</div>
(86)<div class='page_container' data-page=86>

dùng vi sinh vật đột biến có độ nhạy hơn. Khi đã chọn lọc ban đầu đ−ợc chất
kháng sinh chống ung th− rồi, cần phải thử tiếp trên các dòng tế bμo ung th−
in vitro vμ in vivo để khẳng định chính xác xem chất kháng sinh tìm thấy có
tác dụng trên tế bμo ung th− hay không? Công việc nμy hiện nay thực hiện
t−ơng đối dễ dμng vì đã có nhiều dịng tế bμo ung th− đ−ợc ni cấy thuần
chủng trong phịng thí nghiệm.

5. Ph−ơng pháp gây đột biến vi sinh vật để nâng cao hiệu 
suất

Vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh phân lập đ−ợc từ cơ chất thiên
nhiên th−ờng có hoạt tính rất thấp. Ví dụ: các chủng Penicillium phân lập từ
đất chỉ đạt từ 30 - 50đv/ml dịch ni cấy. Vì vậy để thu đ−ợc các chủng có hoạt
tính cao đ−a vμo sản xuất địi hỏi phải cải tạo chọn giống bằng các ph−ơng
pháp khác nhau vμ nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp.

5.1. Chän chđng cã ho¹t tÝnh cao b»ng phÐp chän läc tù nhiªn

Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống
giống thuần khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh gấp 10 - 20 lần những
cá thể khác. Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để
nghiên cứu tiếp.

Tiến hμnh cấy giống trên hộp petri sao cho mỗi hộp chỉ có 10 - 20 khuẩn
lạc tách riêng biệt, sau đó tiến hμnh kiểm tra hoạt tính kháng sinh của chúng

bằng các cách sau:

− Đổ lớp thạch có chứa vi khuẩn kiểm định lên bề mặt hộp petri đã
nuôi vi sinh vật sinh kháng sinh. Đặt hộp petri vμo tủ ấm, 24 giờ sau
đọc kết quả. Vịng ức chế cμng lớn hoạt tính kháng sinh do khuẩn lạc
tạo ra cμng mạnh.

− Có thể khoan các cục thạch có chứa các khuẩn lạc vi sinh vật sinh
kháng sinh đặt lên hộp petri khác đã chứa sẵn vi sinh vật kiểm định,
sau đó nuôi ở tủ ấm 24 giờ vμ đọc kết quả. Từ khuẩn lạc có hoạt tính
kháng sinh mạnh nhất cấy ra thạch nghiêng để nghiên cứu tiếp tục.
Waskman N.S. vμ cộng sự (1946) đã sử dụng streptomycin cho vμo
môi tr−ờng nuôi cấy Str. griseus lμ xạ khuẩn sinh ra streptomycin với
nồng độ 100 mcg/ml. Kết quả cho thấy chỉ những cá thể nμo có khả
năng tạo ra streptomycin với nồng độ lớn hơn 100 mcg/ml mới sống
sót vμ phát triển. Đây cũng lμ ph−ơng pháp để chọn các chủng cho
hoạt tính cao.

</div>
(87)<div class='page_container' data-page=87>

5.2. §ét biến nhân tạo

Cỏc tỏc nhõn gõy t bin mạnh nh− tia UV, X hay những hoá chất:
iperit, ethylenimin, dimethylsulfat... Cho tác dụng với liều l−ợng vμ thời gian
thích hợp sẽ giết chết các vi sinh vật. Những cá thể nμo nếu cịn sống sót sẽ có
sự đột biến gen, lμm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc lμ mất khả năng tạo
ra kháng sinh (đột biến âm tính) hoặc lμm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng
sinh lên nhiều lần (đột biến dng tớnh).

Bảng 7.1. Kết quả chọn giống các chủng vi sinh vật sinh kháng sinh

Hiệu suất tạo kháng sinh (đv/ml)

Vi sinh vật sinh

kháng sinh

Tác nhân

gây đột biến Chủng ban đầu Chủng sau gây đột biến

Penicillin R, UV, I, EI 220 5200

Streptomycin R, UV 250 4200

Clotetracyclin R, UV 600 2200

Erythromycin UV, EI 500 1000

Chó thÝch: R - R¬nghen UV - Cùc tÝm

I - Iperit EI - Etylenimin

Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến
hμnh đột biến bậc thang, kết hợp với các ph−ơng pháp di truyền phân tử nh−
tái tổ hợp định h−ớng các gen. Kĩ thuật tách dòng gen, kĩ thuật tạo vμ dung
hợp tế bμo trần đã đem lại nhiều kết quả không những nâng cao đ−ợc hiệu
suất sinh tổng hợp của chủng giống mμ còn rút ngắn đ−ợc thời gian tạo giống
mới. Sơ đồ chọn giống bậc thang P. chrysogenum NRRL 1951 cho thấy sự phức
tạp của cơng việc vμ lịng kiên trì khơng biết mệt mỏi của các nhμ nghiên cứu
để đạt đ−ợc hiệu quả cho một chủng giống dùng trong cơng nghiệp sản xuất
penicillin (hình 7.1).

6. Nghiªn cứu điều kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vật 
sinh kháng sinh phân lập đợc

Sau khi ó gõy đột biến vμ chọn lọc đ−ợc các chủng cho năng suất cao cần
phải nghiên cứu tiếp điều kiện nuôi cấy thích hợp nh−: thμnh phần mơi
tr−ờng, nhu cầu oxy hoμ tan, pH, nhiệt độ, tiền chất... có thể tăng hiệu suất
lên 2 - 3 lần. Ví dụ: để lên men sản xuất penicillin V ng−ời ta cho thêm tiền
chất (precursor) lμ acid phenoxyacetic, để tạo penicillin G cho thêm acid
phenylacetic.

</div>
(88)<div class='page_container' data-page=88></div>
(89)<div class='page_container' data-page=89>

7. Nghiên cứu chiết xuất v tinh chế kháng sinh

Kháng sinh lμ những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Tuỳ theo đặc tính
của loμi mμ sản phẩm thứ cấp đó đ−ợc tiết vμo mơi tr−ờng nuôi cấy (penicillin,
streptomycin...) hay giữ lại trong tế bμo (gramicidin, tetracyclin...). Để thu lấy
các hoạt chất có độ tinh khiết cao cần tìm ph−ơng pháp chiết thích hợp. Nếu
chiết bằng dung mơi hữu cơ thì dung mơi cần thoả mãn các yêu cầu sau:

− Dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, khơng độc, khó cháy.

− Cã tÝnh chän läc cao: hoμ tan tèt ho¹t chÊt Ýt hoμ tan t¹p chÊt.
− DƠ cÊt thu håi.

Có kháng sinh lại chiết bằng ph−ơng pháp kết tủa (các tetracyclin,
fumagillin...), hoặc bằng nhựa trao đổi ion (kháng sinh nhóm aminoglycosid,
polymyxin...), vì vậy phải nghiên cứu chọn đ−ợc chất phụ gia cho quá trình kết
tủa (các amoni bậc 4) hoặc các cationit có dung l−ợng trao đổi lớn, dễ phản hấp
phụ để không phá huỷ hoạt chất. Kỹ thuật chiết xuất vμ tinh chế kháng sinh
thích hợp lμm cho sản phẩm đạt chất l−ợng cao, bảo quản đ−ợc lâu hơn đồng
thời còn lμm tăng tỷ lệ thu hồi vμ hạ giá thμnh sản phẩm. Ví dụ: trong những

năm 60 - 70 tỷ lệ chiết xuất penicillin từ môi tr−ờng lên men chỉ đạt 60 - 70%.
Hiện nay tỷ lệ đó đã đạt 90 - 92%.

8. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn vμ độc tính

Sau khi chiết xuất vμ tinh chế đ−ợc kháng sinh tinh khiết, phải kiểm tra
hoạt lực của nó (phổ tác dụng) đối với vi sinh vật kiểm định: vi khuẩn Gram
(+), Gram (-), nấm... xác định đ−ợc MIC (nồng độ tối thiểu có tác dụng ức chế).
Ngoμi ra còn phải kiểm tra độ vơ trùng của kháng sinh xem có lẫn vi sinh vật
lạ, đặc biệt các bμo tử của vi sinh vật gây bệnh. Để lμm đ−ợc việc đó phải khử
hoạt tính của kháng sinh, sau đó cấy trên các môi tr−ờng đặc biệt: canh thang,
thạch máu..., khử hoạt tính penicillin bằng penicillinase hay clohydrat
hydroxylamin; streptomycin khử bằng hydroxylamin hay cystein. Nhiều
kháng sinh khơng có chất khử đặc tr−ng thì độ vơ trùng của nó chỉ xác định
đ−ợc đối với những vi sinh vật không bị tác dụng của kháng sinh đó.

Độc tính kháng sinh đ−ợc kiểm tra bằng động vật thí nghiệm. Ng−ời ta
th−ờng dùng chuột, tiêm tĩnh mạch, phúc mạc hay d−ới da, uống các liều
l−ợng kháng sinh cần nghiên cứu. Theo dõi chúng cẩn thận sau 12 - 15 ngμy
thí nghiệm mới có kết luận về độc tính ca khỏng sinh em th.

9. Nghiên cứu về dợc lý v điều trị của kháng sinh

</div>
(90)<div class='page_container' data-page=90>

(LD100). LD50 đ−ợc coi lμ liều gây chết tối thiểu. Chia động vật thí nghiệm

thμnh 3 nhãm:

− Nhóm 1: dùng kháng sinh điều trị ngay sau khi gây nhiễm động vật
bằng vi khuẩn gây bệnh.

− Nhóm 2: dùng kháng sinh điều trị sau khi gây nhiễm động vật ít
nhất 5 giờ. Trong cả 2 tr−ờng hợp trên đ−ợc phép dùng kháng sinh
với liều tối đa để cứu sống động vật thí nghiệm.

− Nhóm 3: lμ nhóm đối chứng.

Dựa vμo số l−ợng động vật sống sót mμ kết luận về tác dụng điều trị của
kháng sinh. L−ợng kháng sinh tối thiểu cứu đ−ợc động vật thoát chết lμ liều
điều trị tối thiểu. Mỗi kháng sinh dùng trong điều trị đều có độc tính nhất
định. Nếu liều điều trị thấp hơn độ độc cho phép thì kháng sinh đó đ−ợc sử
dụng trong điều trị. Trong tất cả các tr−ờng hợp liều điều trị bằng hoặc gần
với liều độc thì khơng cho phép sử dụng kháng sinh đó trong y học.

10. Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh

Kháng sinh lμ những hoá trị liệu, nhiều kháng sinh đ−ợc phát hiện
(> 8.000 chất) nh−ng chỉ có khoảng 150 chất đ−ợc ứng dụng trong y học. Trong
số đó cũng chỉ có khoảng 30 chất đ−ợc ứng dụng rộng rãi. Những kháng sinh
còn lại khơng đ−ợc sử dụng phần vì chúng độc hại với cơ thể hoặc bị giảm tác
dụng khi tiếp xúc với dịch cơ thể. Những yêu cầu của y học đối với một kháng
sinh lμ:

− Kháng sinh phải khơng độc hoặc rất ít độc đối với cơ thể.

− Hoạt tính kháng khuẩn phải nhanh vμ mạnh đối với vi sinh vật gây
bệnh.

− DÔ hoμ tan trong nớc v bền vững khi bảo quản lâu dμi.

− Hoạt tính kháng khuẩn khơng bị giảm khi tiếp xúc với dịch cơ thể.

Trên thực tế, ngoμi penicillin ra khơng có một kháng sinh nμo thoả mãn
cả 4 yêu cầu trên. Vì vậy ng−ời thầy thuốc điều trị phải hiểu biết đầy đủ về cơ
chế tác dụng vμ các phản ứng phụ của kháng sinh để kê đơn chính xác, nên
phối hợp các kháng sinh với nhau hoặc kháng sinh với các chế phẩm khác để
tăng c−ờng tác dụng điều trị, giảm các phản ứng phụ vμ độc tính.

11. Các ph−ơng pháp nh lng khỏng sinh

</div>
(91)<div class='page_container' data-page=91>

11.1. Phơng pháp vi sinh vËt

Định l−ợng kháng sinh bằng vi sinh vật dựa trên nguyên tắc kháng sinh
tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật kiểm định; so sánh tác dụng
với kháng sinh chuẩn đã biết sẽ tính tốn đ−ợc hμm l−ợng của kháng sinh cần
phân tích. Tuy nhiên ph−ơng pháp vi sinh vật cũng có một số nh−ợc điểm, phụ
thuộc vμo nhiều yếu tố bên ngoμi nên độ chính xác cho phép 5%.

11.1.1. Phơng pháp pha loÃng liên tục

Dựng để định l−ợng kháng sinh trong dịch nuôi cấy hay trong dịch chiết.
Nguyên tắc: pha loãng kháng sinh trong môi tr−ờng canh thang (trong suốt)
trong các ống nghiệm đã tiệt trùng thμnh các nồng độ khác nhau:

1 : 10 ; 1 : 20 ; 1 : 40 ; 1 : 80 ; 1 : 160…
hay 1 : 100 ; 1 : 200 ; 1 : 300 ; 1 : 400 1 : 800…
hay 1 : 2 ; 1 : 4 ; 1 : 8 ; 1 : 16 ; 1 : 32...
Tại mỗi nồng độ kháng sinh trong các ống nghiệm đó, cho vμo một l−ợng
xác định vi sinh vật kiểm định. Đặt các ống nghiệm vμo tủ ấm 37°C/20 - 24 giờ
đem ra đọc kết quả. Nếu ống nμo trong suốt tức lμ tại nồng độ pha lỗng đó
kháng sinh đã giết chết vi sinh vật kiểm định.

Ví dụ: định l−ợng Streptomycin trong môi tr−ờng nuôi cấy Str. griseus. 
Dung dịch streptomycin chuẩn 10mcg/ml.

TiÕn hμnh theo b¶ng sau:

Sè èng nghiƯm 
Kh¸ng sinh

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

§é pha lo·ng 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:28 1:256 1:512 1:1024 1:2048 1:4096
Streptomycin

chuÈn 10 μg/ml

- - - - - + + + + + + +

Streptomycin thö - - - + + +

Chó thÝch: dÊu (-) vi khuÈn bÞ giÕt chÕt

dÊu (+) vi khn ph¸t triĨn

ở ống nghiệm số 5 (độ pha loãng 1:32) của kháng sinh chuẩn vi khuẩn
kiểm định không phát triển đ−ợc.

</div>
(92)<div class='page_container' data-page=92>

o

X

Dc

Dt

X

=

×

trong đó:

Dc: độ pha loãng của kháng sinh chuẩn
Dt: độ pha loãng của kháng sinh thử
X: nồng độ kháng sinh cần định l−ợng
Xo: nồng độ ban đầu của kháng sinh chuẩn

trong thÝ nghiÖm trên ta có:

ml
mcg
X 10 320 /

1024ì =

kết quả đ−ợc chính xác khi định l−ợng kháng sinh bằng ph−ơng
pháp pha loãng cần chú ý những điểm sau:

(1) Dùng mơi tr−ờng để pha lỗng có thμnh phần ổn định
(2) Thao tác phải tuyệt đối vô trùng

(3) L−ợng vi khuẩn kiểm định cho vμo các ống nghiệm phải bằng nhau.

(4) Thời gian ủ để cho vi sinh vật kiểm định phát triển phải hằng định.
Có thể pha lỗng kháng sinh cần thử vμo mơi tr−ờng thạch - canh
thang sau đó đổ ra hộp petri đợi thạch đông ta cấy các vi sinh vật kiểm định
vμo, để tủ ấm cho vi sinh vật phát triển sau 20 - 24 giờ mang ra đọc kết quả.
Ưu điểm của ph−ơng pháp nμy lμ trên 1 hộp Petri ta có thể thử nhiều vi sinh
vt kim nh.

11.1.2. Phơng pháp khuếch tán trên thạch

Nguyên tắc: kháng sinh khuếch tán vμo môi tr−ờng thạch có chứa vi sinh
vật kiểm định tạo ra các vòng ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định.
Đo độ lớn của vòng ức chế kháng sinh chuẩn vμ kháng sinh thử rồi tính tốn
hay tra bảng tính sẵn nồng độ sẽ cho kết quả cần phân tích.

</div>
(93)<div class='page_container' data-page=93>

a b

Hình 7.2. Các ph−ơng pháp định l−ợng kháng sinh
a. Định l−ợng kháng sinh dùng ph−ơng

ph¸p khoanh giÊy läc

b. Định l−ợng kháng sinh dùng ph−ơng
phỏp c l thch

11.2. Phơng pháp hoá học v ho¸ lý

Trong thực tế một số kháng sinh đ−ợc định l−ợng bằng ph−ơng pháp hoá
học vμ hoá lý. Ưu điểm của ph−ơng pháp nμy lμ thực hiện nhanh, cho kết quả
ngay. Để định l−ợng penicillin bằng ph−ơng pháp hoá học tiến hμnh nh− sau:
phá huỷ penicillin bằng kiềm, trung hoμ rồi oxy hoá các sản phẩm phân huỷ

bằng iod. Định l−ợng iod thừa bằng Natri thiosulfat sẽ tính đ−ợc iod đã tiêu
thụ cho phản ứng oxy hố vμ từ đó tính ra hμm lng penicillin.

Nguyên tắc của phơng pháp hoá lý dựa trên phản ứng tạo mu của
kháng sinh hoặc sản phẩm phân huỷ của chúng rồi đo bằng quang phổ tử
ngoại hoặc máy so mu rồi tính kết quả.

Ví dụ: để định l−ợng các kháng sinh nhóm tetracyclin cho tạo phức với
FeCl3; đo phổ tử ngoại xác định sự biến mất các đỉnh hấp thụ cực đại của
kháng sinh sau khi phân huỷ bằng kiềm.

Ph−ơng pháp so mμu định l−ợng erythomycin dựa trên phản ứng tạo
mμu của kháng sinh với acid sulfuric (27N). Định l−ợng kháng sinh bằng
ph−ơng pháp nμo lμ chính xác vμ thuận tiện đã đ−ợc qui định rõ trong các
d−ợc điển của mỗi n−ớc. Chỉ các kháng sinh đã đ−ợc kiểm nghiệm theo các qui
định ở trong d−ợc điển mới có giá trị về pháp lý.

12. øng dơng kh¸ng sinh ngoμi lÜnh vùc y häc

</div>
(94)<div class='page_container' data-page=94>

12.1. Kháng sinh dùng trong chăn nuôi

Gia sỳc, gia cầm cũng bị vi sinh vật gây bệnh tấn công gây chết hμng
loạt. Bác sĩ thú y đã sử dụng kháng sinh lμm vũ khí hữu hiệu để điều trị các
bệnh cho động vật. Kháng sinh griseoviridin dùng điều trị bệnh viêm phổi cấp,
viêm vú của trâu, bò, metimyxin hoặc chloramphenicol dùng điều trị các bệnh
do Brucella gây ra; fumagillin điều trị bệnh ỉa chảy do Protozoa gây ra ở ong
lμm chết cả đμn ong.

Kháng sinh còn đợc sử dụng nh chất kích thích tăng trọng đn gia súc,
gia cầm. Giảm chi phí thức ăn; kích thích tăng sản lợng trứng ở g, vịt. ở

Mỹ, các nớc Tây Âu v Nhật dùng bacitraxin, flavomycin, avoparxin,
monenzin lm chất kích thích tăng trọng. Một số nớc khác còn dùng kháng
sinh nhóm tetracyclin. C¸c chÕ phÈm Biovit (biomycin vμ vitamin B12),
Terravit (teramycin + Vitamin B12) l chất kích thích tăng trọng lợn, gμ, vÞt.
Th−êng bỉ sung Biovit hay Terravit cã hμm lợng 15 - 20 g kháng sinh v 8 -
12 mg vitamin B12 vo 1 tấn thức ăn cho lợn, g vừa phòng đợc bệnh ỉa chảy,

va kích thích tăng trọng đến 20 - 25% so với lô chứng. Về cơ chế kích thích
tăng trọng của vật ni bằng kháng sinh ở nồng độ thấp có nhiều cơng trình
nghiên cứu nh−ng vẫn ch−a rõ. Ng−ời ta giải thích có thể do hai ngun nhân
sau đây:

12.1.1. T¸c dơng của kháng sinh lên hệ vi khuẩn chí ở ruột

Kháng sinh lμm tăng số l−ợng vi sinh vật có ích trong ruột, tăng c−ờng
tổng hợp vitamin, tăng c−ờng tái hấp thu các thức ăn. Lμm giảm đi các vi sinh
vật có hại th−ờng tiết ra các chất độc, hoặc sử dụng mất các vitamin, kháng
sinh lμm giảm pH ở ruột, giảm sức căng bề mặt của tế bμo vμ lμm tăng c−ờng
sự sinh tr−ởng... Tất cả các nguyên nhân đó đã giúp cho động vật tăng c−ờng
trao đổi chất vμ lớn nhanh hơn.

12.1.2. Tác dụng gián tiếp của kháng sinh lên cơ thể động vật

Kháng sinh lμm thay đổi hệ vi sinh vật ở ruột dẫn tới các tác dụng sau:
− Tăng c−ờng tốc độ hấp thu chất dinh d−ỡng, kích thích sử dụng các

chất chuyển hố đồng thời lμm giảm tiêu hao năng l−ợng để phân
giải thức ăn.

− Tăng c−ờng quá trình điều tiết các hormon, đặc biệt lμ hormon sinh
tr−ởng giúp cơ thể lớn nhanh hơn.

</div>
(95)<div class='page_container' data-page=95>

12.2. Kh¸ng sinh dïng trong trồng trọt

Các nấm, vi khuẩn, virus gây ra nhiều loại bệnh cho cây trồng lm mùa
mng thất thu lín.

Mầm bệnh có thể nhiễm từ hạt giống, từ các phế thải còn lại của mùa
mμng, từ phân chuồng, từ đất hoặc trong bụi khơng khí. Việc chọn kháng sinh
để tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng không chỉ chú ý đến tác dụng
kháng sinh mμ còn phải quan tâm đến hiệu quả kinh tế.

Nghiên cứu q trình phát triển nơng nghiệp trên thế giới dễ nhận thấy
một hiện t−ợng có tính qui luật: sản xuất ngμy cμng đi sâu vμo thâm canh thì
mức độ phát triển vμ tác hại của sâu bệnh cμng nghiêm trọng. Theo số liệu của
Tổ chức FAO, hμng năm tổng số thiệt hại mùa mμng do sâu bệnh vμ cỏ chiếm
tới 34%, trong đó thiệt hại do bệnh cây chiếm 11,6%.

Trong số các bệnh của cây đ−ợc mô tả, bệnh nấm chiếm 83%. Thuốc hoá
học dùng trong bảo vệ thực vật đ−a lại hiệu quả phòng trị rõ rệt, song cũng
tồn tại một số nh−ợc điểm: đó lμ tính độc khơng chọn lọc, đặc tính khó phân
huỷ trong đất, sự tích luỹ các chất độc trong mơi tr−ờng không những lμm
thay đổi đáng kể các mối quan hệ phong phú giữa các loμi sinh vật trong các
hệ sinh thái, ảnh h−ởng tiêu cực đến năng suất mμ cịn nhiễm độc mơi tr−ờng
sống của con ng−ời, nhiều tr−ờng hợp dẫn đến tử vong. Những thμnh tựu to
lớn trong trị liệu bệnh nhiễm trùng ở ng−ời bằng thuốc kháng sinh vμo những
năm 50 của thế kỷ XX đã gợi mở xu h−ớng sử dụng kháng sinh trong lĩnh vực
bảo vệ thực vật.

Kháng sinh dùng để đấu tranh với bệnh thực vật phải thoả mãn các u
cầu sau:

− Có hoạt tính kháng sinh mạnh đối với mầm gây bệnh.
− Dễ thấm vμo các tế bμo của cây.

− Liều điều trị khơng có hại đến cây.

− Kháng sinh phải bền vững trong một thời gian dù ở bề mặt hay đã
thấm sâu vμo trong cây.

Thông dụng nhất lμ xử lý hạt bằng kháng sinh tr−ớc khi đem gieo trồng,
xử lý đất trồng bằng kháng sinh hoặc các vi sinh vật đối kháng trong đất.

Hiện nay có khoảng 30 chất kháng sinh đã đ−ợc sử dụng để đấu tranh
với các bệnh của cây trồng do nhiễm khuẩn vμ nấm gây ra. Trong điều kiện
thiên nhiên kháng sinh bị phân huỷ nhanh, vì vậy phải tìm kiếm các chất
kháng sinh có độ bền vững cao, tiêu diệt mầm bệnh nhanh, không nên dùng
các chất kháng sinh ứng dụng trong y học để điều trị bnh ca cõy trng.

</div>
(96)<div class='page_container' data-page=96>

Những kháng sinh th−êng dïng trong trång trät lμ:

− Griseofulvin: dïng chèng lại các bệnh do Botrytis gây ra (bệnh rỉ sắt
ở lúa mỳ).

Trichotexin: tác dụng với nhiều loại nÊm g©y bƯnh nh− Botrylis 
cenerea, Helmintosporium g©y bƯnh cho b«ng.

− Blastixidin S (kháng sinh chiết từ Str. griseochromogenes). Có thể
tiêu diệt nhiều vi sinh vật gây bệnh cho cây ở nồng độ 50 - 100

mcg/ml. ở Nhật dùng đấu tranh với bệnh vμng lụi gây ra bởi
Piricularia oryzae.

− Kasugamyxin do Str. kasugaensis tạo ra (Umezawa, 1965) nồng độ
1 mcg/ml đủ để tiêu diệt Piricularia oryzae (hoạt tính mạnh hơn
blastixindin 50 - 100 lần). Hiện nay dùng kasugamyxin thay thế cho
blastixidin để chống bệnh vμng lụi vì khơng độc đối vi ngi.

Polyoxin: đợc tạo ra bởi Str. cacaoi cã ho¹t tÝnh chèng nÊm m¹nh:
Alternaria, Cocholiobalus, Pircularia (Misato, 1975).

− Validamyxin: do Str. hygroscopicus var. limoneus lμ kháng sinh đ−ợc
sản xuất ở Nhật Bản, Trung Quốc dùng để diệt nấm Rhizoctonia 
solani gây bệnh khô vằn hại lúa rất hữu hiệu. Thời gian bán phân
huỷ của validamyxin trong đất lμ 4 giờ.

− Herbicidin A vμ B: l kháng sinh diệt cỏ do Str. saganonensis tạo ra
(Mamoru, Tatsuo 1976). Herbicidin kìm hÃm sự phát triển của
Xanthomonas oryzae gây bệnh cho lúa.

12.3. Kháng sinh dïng trong c«ng nghiƯp thùc phÈm

Bảo quản thực phẩm t−ơi vμ các thực phẩm đóng hộp lμ vấn đề rất quan
trọng đ−ợc nhiều nhμ khoa học quan tâm. Thực phẩm đóng hộp để giữ đ−ợc
lâu th−ờng dùng ph−ơng pháp khử trùng bằng nhiệt, để trong lạnh. Tuy nhiên
khi khử trùng bằng nhiệt sẽ lμm thay đổi giá trị của thực phẩm, đặc biệt lμ
h−ơng vị, một số vitamin bị phân huỷ. Nguyên nhân lμm hỏng thực phẩm lμ
do vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc). Sau khi phân huỷ thực phẩm vi
khuẩn còn tiết ra các độc tố, ăn phải thực phẩm đó s b ng c nguy him.

Để tiêu diệt vi sinh vËt cã trong thùc phÈm th−êng dïng c¸c t¸c nhân vật
lý v hoá học.

Tác nhân vật lý: khư trïng b»ng nhiƯt, tia X, UV.

− Tác nhân hoá học: acid benzoic, nipazin, SO2... Một vμi kháng sinh lμ
những chất bảo quản lý t−ởng thực phẩm t−ơi vμ đóng hộp. Chỉ cần
nồng độ kháng sinh rất thấp đã có thể giữ cho thực phẩm bảo quản
đ−ợc lâu dμi.

</div>
(97)<div class='page_container' data-page=97>

xuống lμm cho chất l−ợng sản phẩm tốt hơn các vitamin không bị phá huỷ,
h−ơng vị ít bị biến đổi. Đặc biệt bμo tử các vi khuẩn −u nhiệt nh−Clostridium
chết nhanh hơn khi khử trùng nhiệt độ thấp có kháng sinh dùng bảo quản.

Kháng sinh nisin khơng dùng trong y học. Nó đ−ợc coi nh− một "hoá
chất" lý t−ởng để bảo quản thực phẩm đóng hộp nh−: cμ chua, đậu xanh, bắp
cải vμ các loại rau khác vμ đặc biệt lμ phomát. Trong bảo quản thực phẩm
cũng th−ờng sử dụng ph−ơng pháp lên men lactic (muối d−a, cμ, lμm mắm,
lμm nem chua…) Nguyên tắc của ph−ơng pháp nμy lμ khi acid lactic do vi
khuẩn lactic tạo ra trong môi tr−ờng đạt đến nồng độ nhất định lμm cho pH
giảm xuống 3 - 3,5. Các thực phẩm nμy bảo quản đ−ợc rất lâu vμ vẫn giữ đ−ợc
dinh d−ỡng.

Sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, trồng trọt vμ công nghiệp thực
phẩm cần phải l−u ý đến khả năng xuất hiện những vi sinh vật kháng kháng
sinh sẽ rất nguy hại cho việc điều trị các bệnh nhiễm trùng ở ng−ời. Thực
phẩm đặc biệt lμ các sản phẩm thịt, cá, tôm hoặc sữa. Nếu xuất khẩu tiêu
chuẩn kiểm nghiệm đầu tiên cần xác định lμ có chứa kháng sinh hay khơng?
Nếu có vết kháng sinh phía nhập khẩu sẽ trả lại.

Tự lợng giá

1. K tờn mt s i diện của kháng sinh tự nhiên đ−ợc sinh tổng hợp từ
nấm mốc, từ xạ khuẩn, từ vi khuẩn.

2. Chứng minh ý nghĩa tích cực của cơng tác đột biến trong chọn giống để
sản xuất kháng sinh.

</div>
(98)<div class='page_container' data-page=98>

Ch

ơng 8

sản xuất Các kháng sinh nhóm

-lactam

Mục tiêu

Sau khi học xong chơng ny, sinh viên phải trình by đợc:

1. Tên các chủng vi sinh vật đợc dùng trong sản xuất các kháng sinh 
nhóm beta-lactam.

2. Quy trình lên men v chiết xuÊt penicillin G vμ V.

3. Các ph−ơng pháp sản xuất nguyên liệu để điều chế các beta-lactam 
bán tổng hp.

4. Quy trình lên men v chiết xuất acid clavulanic.

1. Đại cơng về các -lactam

Bảng 8.1. Các nhân cơ bản của kháng sinh -lactam

Tờn nhúm Cấu trúc hoá học chung Kháng sinh đại diện

Nhân Penam

N
O

Các penicillin tự nhiên và bán tổng hợp

N
O

Các penicillin kháng -lactamase (acid
clavulanic)

Nhân Clavam

N
S

O
O

Các penicillin kháng -lactamase

(sulbactam, tazobactam)

Nhân Cephem

N
O

Các cephalosporin và cephamycin

Nhân

Carbapenem N

Các carbapenem bán tổng hợp từ
thienamycin (imipenem, meropenem)
Nh©n

Monobactam hay

β-lactam

N
O

</div>
(99)<div class='page_container' data-page=99>

Kh¸ng sinh nhãm β-lactam bao gåm c¸c chÊt cã chứa vòng -lactam
(vòng amid 4 cạnh) v có cấu trúc nhân cơ bản nh trong bảng 8.1.

Theo cÊu tróc ho¸ häc c¸c kh¸ng sinh nhãm β-lactam cã thể chia thnh
những nhóm sau:

Các Penicillin
Các Cephalosporin
Các Carbapenem
Các Monobactam

Đặc tÝnh chung cđa c¸c kh¸ng sinh β-lactam lμ t¸c dơng lên thnh tế bo
vi khuẩn bằng cách ức chế sù tỉng hỵp peptidoglycan cđa thμnh tÕ bμo vi
khn. 2 nhãm kh¸ng sinh quan träng nhÊt cđa hä β-lactam l các penicillin
v các cephalosporin. Trong khuôn khổ của giáo trình ny chỉ giới thiệu về quy
trình sinh tổng hợp v nguyên tắc bán tổng hợp một số kháng sinh tiêu biểu
của họ -lactam.

2. Sinh tổng hợp các Penicillin 
2.1. Đại cơng

Cỏc penicillin l i diện tiêu biểu cho các kháng sinh có nguồn gốc từ
nấm mốc. Ngoμi ra còn một vμi kháng sinh khác nh− griseofulvin, trichotexin,
fumagillin… cũng đ−ợc sinh ra từ các chủng nấm mốc khác nhau.

Các penicillin có cấu trúc hố học chung gồm vịng β-lactam nối với vịng
thiazolidin. Penicillin G lμ chất kháng sinh tiêu biểu đ−ợc Alexander
Flemming tìm ra đầu tiên vμo năm 1928 trong khi nghiên cứu về tụ cầu
khuẩn. Ông nhận thấy trên hộp petri ni cấy tụ cầu có nhiễm nấm mốc
Penicillium notatum vμ tạo thμnh vịng vơ khuẩn. Fleming gọi chất ức chế tạo
vịng vơ khuẩn nμy lμ penicillin. Đến năm 1941, các nhμ bác học Anh là
Howara Walter Florey vμ Ernst Boris Chain mới tinh chế đ−ợc penicillin d−ới

dạng tinh khiết vμ nghiên cứu ph−ơng pháp lên men. Năm 1943, penicillin đã
đ−ợc sản xuất ở quy mô công nghiệp ở Mỹ để phục vụ điều trị các bệnh nhiễm
trùng cho th−ơng binh trong chiến tranh thế giới thứ hai. Penicillin cũng lμ
kháng sinh đầu tiên đ−ợc sản xuất lên men chìm ở quy mô công nghiệp (1947).
Việc phát minh ra penicillin tạo ra một b−ớc ngoặt quan trọng trong lĩnh vực y
học thế giới vμ đ−ợc đánh giá lμ một trong các phát minh quan trọng bậc nhất
của thế kỷ XX. Do các đóng góp to lớn đó Flemming, Florey vμ Chain đã đ−ợc
tặng giải Noben về y học (hình 8.1).

</div>
(100)<div class='page_container' data-page=100>

Alexander Flemming
(1881 – 1955)

Ernst Boris Chain
(1906 – 1979)

Howara Walter Florey
(1898 1968)

Hình 8.1. Các nhà bác học nhận giải Nobel y học năm 1945 về công trình penicillin

Penicillin đ−ợc coi lμ kháng sinh có nhiều −u điểm nhất trong các kháng
sinh sử dụng: hiệu quả điều trị cao, ít độc vμ giá rẻ nhất. Tuy nhiên penicillin
cũng có một số nh−ợc điểm:

− KÐm bỊn vững khi gặp ẩm;

Gây dị ứng, sốc phản vệ vì vậy bắt buộc phải thử test dị ứng trớc khi
tiêm;

ít tác dụng lên các vi khuẩn Gram (-);

Nhanh chóng bị kháng thuốc do các loại vi khuẩn có thể tiết
penicillinase v - lactamase ph¸ hủ chÊt kh¸ng sinh.

Tuy có một số nh−ợc điểm nhất định nh−ng hiện nay penicillin vẫn lμ
kháng sinh đ−ợc sản xuất với số l−ợng lớn nhất trong tất cả các kháng sinh
hiện có (sản l−ợng toμn thế giới hơn 45.000 tấn/năm - trong đó Hμ Lan chiếm
15.000 tấn/năm, Trung Quốc 10.000 tấn/năm, sau đó lμấn Độ, Mỹ, Anh, Đức,
Pháp…). L−ợng penicillin lớn nμy chủ yếu đ−ợc dùng lμm nguyên liệu để bán
tổng hợp tạo ra các kháng sinh mới thuộc nhóm β-lactam, còn trong y học vμ
thú y chỉ dùng một l−ợng nh.

1.2. Cấu trúc hoá học, phân loại v tính chất

Các penicillin đợc cấu tạo bằng 2 vòng: -lactam vμ thiazolidin vμ chØ
kh¸c nhau ë gèc R cđa mạch ngang. Tuy nhiên có ý nghĩa lớn nhất trong điều
trị cũng nh trong thơng mại l penicillin G v V (bảng 8.2).

N
S

COOH
O

</div>
(101)<div class='page_container' data-page=101>

Bảng 8.2. Phân nhóm các penicillin

TT Tên nhóm Tên kháng sinh Nguồn gốc

1 Các penicillin tự nhiên Penicillin G, V, N, K, F… Sinh tæng hợp

2 Các penicillin bán tổng hợp Bán tổng hợp

- Các aminopenicillin

Ampicillin 
Amoxycillin

Bacampicillin

- Các chất kháng lại penicillinase

Cloxacillin 
Dicloxacillin 
Flucloxacillin

Oxacillin

Nafcillin 
Methicillin 
- C¸c penicillin phỉ réng

(Carboxypenicillin)

Carbenicillin 
Ticarcillin

Temocillin

- C¸c penicillin phỉ réng 
(Ureidopenicillin)

Mezlocillin 
Azlocillin 
Piperacillin

- C¸c chÊt kh¸ng β-lactamase

Clavulanic acid 
Sulbactam

Tazobactam

Sinh tổng hợp
Tổng hợp hoá học

2.3. Quy trình sinh tổng hợp

TT Gốc R Tªn gäi gèc Tªn penicillin

1 CH3(CH2)5 - CH2 - Heptylpenicillin Penicillin K (IV)

2 CH3 - CH2CH = CH - CH2 2-pentenylpenicillin Penicillin F (I)

3 CH3 - (CH2)3 - CH2 - Amylpenicillin Dihydropenicillin F

4 C6H5 - CH2 - Benzylpenicillin Penicillin G

5 C6H5 - O - CH2 - Paraoxybenzylpenicillin Penicillin X (III)

6 HO – C6H5 - CH2 - Phenoxymethylpenicillin Penicillin V

7 NH2

HOOC-CH(CH2)2-CH2-

</div>
(102)<div class='page_container' data-page=102>

Trong môi tr−ờng lên men P. chrysogenum nếu khơng có chất tiền thể sẽ
xuất hiện một hỗn hợp gồm 4 - 6 penicillin khác nhau (bảng 8.3). Trong số nμy
có penicillin G vμ V lμ 2 chất có nhiều −u điểm nên đ−ợc sản xuất để dùng
trong y học. Dạng acid tự do của penicillin G khơng bền vững, vì vậy th−ờng
dùng dạng muối Na, K dễ tan trong n−ớc. Penicillin G dạng bột khô rất bền
vững, khi gặp ẩm rất dễ bị phân huỷ vì vậy lọ bột khô khi hoμ tan vμo n−ớc
phải tiêm ngay.

− 1 đơn vị penicillin G Na = 0,60 mcg hay 1 mg chứa 1.667 UI;
− 1 đơn vị penicillin G K = 0,64 mcg hay 1 mg chứa 1.530 UI;

Penicillin G không bền trong môi tr−ờng acid: khi bị tác dụng của dung
dịch acid loãng (ở 30°C) vịng β-lactam bị mở, do đó ít hấp thu qua đ−ờng uống
(15 – 30%), chỉ dùng tiêm (tốt nhất lμ tiêm tĩnh mạch). Ngoμi ra penicillin G
cũng dễ bị kiềm hoặc penicillinase phân huỷ. Penicillin V đ−ợc dùng đ−ờng
uống (hấp thu khoảng 60%).

2.3.1. Chñng gièng

Cho đến nay ph−ơng pháp duy nhất để sản xuất penicillin G vμ V lμ sinh
tổng hợp từ nấm mốc P. chrysogenum.

</div>
(103)<div class='page_container' data-page=103>

Vμo những năm 1940 – 1950, việc nghiên cứu sản xuất penicillin th−ờng

sử dụng các chủng P. notatum vμ P. baculatum. Từ khi tr−ờng Đại học
Wisconsin (Mỹ) phân lập đ−ợc chủng P. chrysogenum có hoạt tính cao hơn thì
chủng nμy đã dần thay thế vμ từ khoảng sau những năm 50 của thế kỷ XX, tất
cả các công ty sản xuất penicillin trên thế giới đều sử dụng các biến chủng
P. chrysogenum công nghiệp. Biến chủng P. chrysogenum Wis Q-176 (đ−ợc
tuyển chọn từ chủng P. chrysogenum URRL 1951) đ−ợc xem lμ chủng gốc của
hầu hết các chủng công nghiệp đang sử dụng hiện nay trên toμn thế giới.
Năng suất năm 1947 chỉ đạt từ 60 - 80 UI/ml nh−ng nhờ có các kỹ thuật của
cơng nghệ di truyền học nh− khuếch đại gen các chủng sản xuất hiện nay đã
đạt tới 85.000UI/ml (1993).

Chủng nấm mốc P. chrysogenum thuộc họ nấm cúc (Aspergillaceae), chi
mốc xanh (Penicillium) th−ờng gặp trên các chất hữu cơ mục nát, thể sợi trắng
roi xám xanh. Giống công nghiệp đ−ợc bảo quản lâu dμi ở dạng đông khô, bảo
quản siêu lạnh ở – 70OC hoặc bảo quản trong nit lng.

2.3.2. Thnh phần môi trờng dinh dỡng

Nhìn vμo cơng thức cấu tạo của phân tử penicillin cho thấy đây lμ một
tripeptid vòng gồm 3 acid amin lμ: acid aminoadipic, cystein vμ valin. Theo quan
điểm phổ biến hiện nay 3 acid amin nμy lμ tiền chất để tổng hợp ra nhân cơ bản
của penicillin lμ 6-APA. Có thể biểu diễn cấu tạo của tripeptid đó nh− sau:

HOOC CHNH2 CH2 CH2 CH2 C

O

NH CH
CO

CH2

NH CH

CH (CH3)2
COOH
SH

Acid aminoadipic Cystein Valin

</div>
(104)<div class='page_container' data-page=104>

S CH3

CH3

O COOH

CONH
R

COOH
(CH2)3

CH
H2N

HOOC CH CH2 SH

H2N

HOOC CH

H2N

HOOC CH
CH3

CH3

N
O
CON
(CH2)3

CH
H2N

HOOC

H
H
SH
CH3
COOH
CH3
N

S CH3

CH3

O COOH

CONH
(CH2)3

CH
H2N

HOOC

S CH3

CH3

O COOH

H2N

Acid phenylacetic
Acid L-α-aminoadipic

(D)
(L) (L)
(L)
Isopenicillin N
(h−íng I)

Penicillin N
(H−íng II)

Acid 6-aminopenicilanic Benzylpenicillin (penicillin G)

δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cystein

δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cystein-D-valin

L-valin
L-cystein

Acid L--aminoadipic

Hình 8.3. Quá trình sinh tổng hợp penicillin từ các acid amin

Thμnh phần môi tr−ờng dinh d−ỡng bao gồm những nguồn chính sau:
Nguồn carbon: Glucose hay lactose lμ nguồn năng l−ợng chính để nấm
phát triển. Nguồn hydrat carbon thích hợp nhất lμ glucose nên trong pha phát
triển để tăng sinh khối (48 giờ đầu) của quá trình, nấm đồng hố hầu nh−
toμn bộ glucose. Vì vậy khi chuyển sang pha thứ 2 - pha tổng hợp ra phân tử
penicillin thì nguồn năng l−ợng bị cạn kiệt dẫn đến giảm hiệu suất sinh tổng
hợp. Để khắc phục, môi tr−ờng lên men tạo penicillin cần bổ sung lactose
(th−ờng tỷ lệ glucose vμ lactose lμ 1:1). Trong tr−ờng hợp khơng có lactose thì
có thể thay hoμn toμn bằng glucose. Song phải định l−ợng vμ bổ sung glucose
trong suốt quá trình lên men. Ngoμi ra nấm cịn có khả năng đồng hố tinh
bột, dextrin, saccharose, cácacid hữu cơ nh− acid lactic, acid acetic…

</div>
(105)<div class='page_container' data-page=105>

xây dựng nên phân tử penicillin, do đó trong mơi tr−ờng sản xuất ln có mặt
cao ngơ. Có thể thay thế một phần cao ngơ bằng bột đậu t−ơng, bột lạc hoặc

bột hạt bông. P. chysogenum có khả năng tiết ra proteinase khá mạnh nên các
hợp chất protein trong cao ngô hay bột lạc rất dễ đ−ợc nấm sử dụng. Tuy
nhiên l−ợng N phải vừa đủ vì nếu thiếu sẽ xảy ra hiện t−ợng tự phân của sợi,
cịn nếu thừa thì sợi phát triển nhanh quá cũng lμm giảm hiệu suất sinh
penicillin.

Nguồn l−u huỳnh: Có ý nghĩa đặc biệt trong quá trình sinh tổng hợp
penicillin vì nó tham gia vμo cấu trúc phân tử để tạo nên vòng thiazolidin.
Nguồn l−u huỳnh th−ờng dùng lμ các muối sulfat của kali, natri vμ amoni. Các
chất nμy tham gia vμo tổng hợp methionin, cystin, biotin, thiamin… Hay sử
dụng nhất lμ Natri thiosulfat (Na2S2O3).

Nguồn kim loại vi lợng: Một sè kim lo¹i nh− Mg, Mn, Fe, Zn, Na, Cu
thờng đợc bổ sung dới dạng muối sunfat hoặc có sẵn trong nớc máy hoặc
nguồn nguyên liệu tạo m«i tr−êng.

Chất tiền thể: P. chrysogenum trong quá trình phát triển tạo ra 4 - 6
penicillin có gốc R ở mạch bên khác nhau có hoạt tính kháng khuẩn khác
nhau. Trong cơng nghệ lên men penicillin ng−ời ta phải điều khiển để tạo ra
penicillin G (benzyl penicillin) vμ penicillin V (phenoxymethyl penicillin) lμ
hai chất có tác dụng mạnh khi đ−a vμo cơ thể. Thêm acid phenylacetic vμo môi
tr−ờng lên men nhận thấy hiệu suất penicillin G tăng thêm 30 - 50%. Trong
cao ngơ có chất phenyl etylamin (C6H5CH2NH2) nên cũng lμm tăng hiệu suất

sinh tổng hợp penicillin. Ng−ời ta cho rằng phenyl ethyllamin cũng lμ một
chất tiền thể (cung cấp gốc R) để sinh tổng hợp phân tử penicillin G. Để tạo ra
phân tử penicillin V chất tiền thể dùng lμ acid phenoxyacetic. Theo lý thuyết,
nhu cầu về phenylacetat lμ 0,47 g/g penicillin G (hoặc 0,47g phenoxylacetat/g
penicillin V). Trên thực tế cả 2 cấu tử nμy đều gây độc cho nấm nên ng−ời ta
th−ờng lựa chọn giải pháp bổ sung liên tục vμ khống chế chặt chẽ nồng độ theo

yêu cầu để không lμm giảm năng lực lên men của chủng sản xuất.

M«i trờng nhân giống có thnh phần gồm:

Cao ngô 20 g

− Glucose 40 g

− KH2PO4 0,5 g

− NaNO3 3,0 g

− MgSO4.7H2O 0,125 g

− CaCO3 5,0 g

</div>
(106)<div class='page_container' data-page=106>

M«i trờng lên men tạo penicillin có thnh phần (%):

Cao ng« 0,5

− Glucose 0,5

− Lactose 0,3

− NH4NO3 0,125
− MnSO4.5H2O 0,1
− Na2SO3.10H2O 0,05
− MgSO4.7H2O 0,002

− ZnSO4 0,002

− KH2PO4, 0,2

− CaCO3 0,3

− Acid phenylacetic 0,1

Dầu phá bọt theo nhu cầu
2.3.3. Điều kiện lên men

Nhit : Thng tin hμnh nhân giống ở 30OC, lên men ở 23 - 25OC.

pH: pH thích hợp trong khoảng 6,0 - 6,5. Trong q trình lên men pH
mơi tr−ờng thay đổi tuỳ thuộc vμo tốc độ sử dụng các chất carbon vμ nitơ. Để
ổn định pH ng−ời ta cho CaCO3 vμo mơi tr−ờng lên men.

Thơng khí: P. chrysogenum lμ chủng rất hiếu khí nên q trình ni cấy
cần thổi khí (đối với lên men bề mặt), lắc hoặc khuấy trộn kèm theo sục khí
(đối với lên men chìm). Nhu cầu cấp khí khi có khuấy trộn liên tục lμ 1,2 - 1,5
VVM.

Thêi gian: Trong 6 - 7 ngy.
2.3.4. Quy trình lên men

Trong những năm 40 của thế kỷ XX việc sản xuất penicillin đợc thực
hiện bằng phơng pháp lên men, bề mặt có thể l cơ chất rắn hoặc lỏng. Cơ
chất rắn l các loại hạt hoặc cám. Để lên men ở cơ chất lỏng ngời ta nuôi nấm
trong các chai thuỷ tinh bẹt (chai Roux) có chứa môi trờng dinh dỡng. Váng
mốc sau khi lên men có thể dùng cho lên men lần thứ 2 bằng cách cho môi
trờng dinh dỡng mới vo dới lớp váng ny. Quá trình tiến hnh ở 24OC

</div>
(107)<div class='page_container' data-page=107>

Giáo s− Đặng Văn Ngữ, các nhμ khoa học của n−ớc ta cũng đã sản xuất đ−ợc
dịch lọc Penicillin phục vụ điều trị vết th−ơng. Tuy nhiên ph−ơng pháp nμy có
hiệu suất lên men thấp, chỉ đạt < 200 UI/ml môi tr−ờng nuôi cấy nên hiện nay
không đ−ợc áp dụng.

Hiện nay ng−ời ta chỉ sử dụng ph−ơng pháp lên men chìm để sản xuất
các penicillin. Penicillin G lμ kháng sinh đầu tiên đ−ợc sản xuất bằng cơng
nghệ lên men chìm vμo năm 1947. Q trình lên men tạo penicillin G có 2
pha: pha sinh tr−ởng vμ pha sinh kháng sinh. ở pha lên men thứ nhất nấm
phát triển hệ sợi mạnh, sinh khối tăng nhanh, chất dinh d−ỡng đ−ợc đồng hố
nhiều, c−ờng độ hơ hấp tăng dần đến cực đại, pH tăng dần vμ penicillin G đ−ợc
tạo thμnh ít. ở pha lên men thứ hai hệ sợi phát triển chậm, lactose đ−ợc đồng
hoá, pH tăng đến khoảng 7 – 7,5 vμ Penicillin G đ−ợc tạo thμnh chủ yếu trong
pha nμy. Hiệu suất sinh tổng hợp phụ thuộc nhiều vμo l−ợng sinh khối trong
môi tr−ờng.

Tr−ớc đây do hiệu suất chủng thấp, kỹ thuật lên men ch−a phát triển
nên giá thμnh 1 kg penicillin ở Mỹ (1943) lμ 227.270 USD. Đến năm 1953 đã
hạ xuống 169 $/kg, năm 1993 lμ 34 - 36 $/kg vμ tới năm 2000 chỉ còn 10 $/kg
do hiệu suất đã tăng cao nhờ áp dụng các công nghệ mới vμ có thiết bị hiện đại
trong lên men, áp dụng những tiến bộ trong di truyền học phân tử vμo cải tạo
giống (chủng sản xuất đạt tới 85.000 UI/ml).

2.3.5. ChiÕt xuÊt vμ tinh chÕ penicillin

Kháng sinh penicillin đ−ợc tiết ra môi tr−ờng lên men. Kết thúc lên men,
môi tr−ờng đ−ợc bơm vμo các bồn chứa. Vì kháng sinh rất dễ bị phân huỷ nên
phải hạ nhiệt độ dịch lên men đến 4°C. Thêm phụ gia để lọc (th−ờng thêm
0,1% diatomits) rồi lọc bằng lọc chân khơng hình trống quay. Dạng acid tự do

penicillin tan nhiều trong dung môi hữu cơ nên dịch lọc đ−ợc acid hoá bằng
H2SO4 30% đến pH 2,5. Chiết penicillin trên máy ly tâm siêu tốc bằng dung
môi hữu cơ không trộn lẫn với n−ớc (th−ờng dùng butyl acetat). Bốc hơi chân
không đến nồng độ nhất định; thêm than hoạt (1%) vμo để tẩy mμu. Dịch lọc
sau khi loại than đ−ợc loại n−ớc bằng cách hạ nhiệt độ xuống -20°C.

</div>
(108)<div class='page_container' data-page=108>

Hình 8.4. Quá trình chiết xuất và tinh chế penicillin từ môi trờng lên men

3. Sản xuất 6 - APA v các kháng sinh Penicillin bán tổng hợp 
3.1. Đại cơng về các penicillin bán tổng hợp

Năm 1941, penicillin G lμ kháng sinh có hiệu quả cao, chống lại hầu hết
các chủng Staphylococcus aureus. Tuy nhiên đến năm 1947 phần lớn các vi
khuẩn phân lập đ−ợc trong bệnh viện đều có tính kháng penicillin. Để giải
quyết vấn đề nμy ng−ời ta đã nỗ lực tìm các penicillin mới có tác dụng điều trị
tốt hơn.

Về nguyên tắc, để tạo ra một penicillin mới trong lên men sinh tổng hợp có
thể dùng ph−ơng pháp thay đổi mạch nhánh bằng cách sử dụng các tiền chất
khác nhau. Tuy nhiên bằng con đ−ờng lên men trực tiếp hiện nay ng−ời ta mới
chỉ có khả năng tiến hμnh với penicillin G vμ V. Cịn để triển khai trong sản
xuất cơng nghiệp, ng−ời ta sử dụng chính penicillin G hay V để chế tạo ra
6-APA lμ nguyên liệu chủ yếu trong quá trình bán tổng hợp ra các penicillin mới.
Theo cấu trúc hoá học, các penicillin tự nhiên đều lμ những hợp chất dị
vòng của các acid amin có tên gọi lμ acid 6 - aminopenicillanic (6-APA). Việc
tìm ra phân tử 6 - APA đã mở ra một h−ớng mới để sản xuất các penicillin bán
tổng hợp bằng cách gắn kết các mạch nhánh khác nhau vμo phân tử 6-APA
bằng con đ−ờng hoá học hay sinh học. Có hai h−ớng chính lμ acyl hố nhóm
-NH2 ở vị trí số 6 vμ ester hố nhóm -COOH ở vị trí số 3. Tuỳ theo cơ chế tác

</div>
(109)<div class='page_container' data-page=109>

enzym penicillinase vμ một số nhỏ vi khuẩn Gram (-) nh− lậu cầu. Th−ờng
dùng để uống, đại diện của nhóm nμy lμ phenethicillin vμ azidocillin.

Nhóm 2: Phổ hoạt tính hẹp nh−ng có −u điểm kháng lại penicillinase
nên đ−ợc dùng để điều trị các bệnh do các vi khuẩn đã kháng lại penicillin
nhóm 1 gây ra. Th−ờng dùng tiêm, trong đó có một số có hoạt tính khi dùng
uống nh− oxacillin, cloxacillin…

Nhóm 3: Gồm các chất có phổ hoạt tính rộng lên nhiều loại vi khuẩn
Gram (+), Gram (-) vμ vững bền trong đ−ờng tiêu hoá. Đ−ợc dùng để điều trị
các bệnh nhiễm trùng đ−ờng hô hấp, tiết niệu, sinh dục vμ nhiễm khuẩn máu.
Có thể uống hoặc tiêm. Tuy nhiên chúng vẫn có nh−ợc điểm lμ nhanh chóng bị
phá huỷ bởi các vi khuẩn có khả năng sinh penicillinase (hay β - lactamase)
nh− amoxicillin, ampicillin. Nhóm penicillin nμy cũng đ−ợc gọi lμ các
penicillin khơng pseudomonas vμ đ−ợc chia theo cấu trúc thμnh 2 nhóm:
Nhóm carboxypenicillin (ticarcillin vμ carbenicillin) vμ nhóm acylureido
penicillin (piperacillin vμ mezlocillin).

Một số đại diện penicillin bán tổng hợp phổ biến hiện nay lμ: 
− Benzathin benzylpenicillin (Benzathin penicillin G) bán tổng hợp từ

penicillin G có tính hoμ tan thấp, đ−ợc giải phóng chậm từ vị trí tiêm
bắp vμ thuỷ phân thμnh penicillin G có tác dụng đặc trị để phòng vμ
điều trị bệnh thấp tim tr em.

Ampicilin: l penicillin bán tổng hợp phổ rộng trên cả cầu khuẩn
Gram (+) v (-). Có tác dụng ức chế sinh tổng hợp mucopeptid thnh
tế bo. Dạng uống hoặc tiêm bắp hay tĩnh mạch thËt chËm.

− Amoxicillin (amino penicillin) lμ penicillin bán tổng hợp bền trong

acid, phổ tác dụng rộng hơn penicillin G (đặc biệt có tác dụng chống
trực khuẩn Gram (-), tác dụng ức chế sinh tổng hợp mucopeptid
thμnh tế bμo của nhiều vi khuẩn Gram (+) vμ (-) trong giai đoạn nhân
đôi chủ động. Amoxicillin đ−ợc hấp thu gần nh− hoμn toμn qua đ−ờng
tiêu hoá.

− Amoxicillin natri phối hợp với clavulanat kali (với biệt d−ợc
Augmentin): có khả năng bất hoạt nhiều β - lactamase th−ờng gặp ở
những vi khuẩn đề kháng với kháng sinh - lactam.

3.2. Đại cơng về 6-APA

Nh− đã biết, cấu trúc hoá học của các penicillin lμ những hợp chất dị
vòng của acid 6 - aminopenicillanic (6-APA) - đóng vai trị nhân penicillin.

N
S

O

H2N CH3

CH3

</div>
(110)<div class='page_container' data-page=110>

6 APA (6 aminopenicillanic) đợc Kato ở Nhật tìm thấy vo năm 1953
trong môi tr−êng nu«i cÊy P. chrysogenum kh«ng cã chÊt tiỊn thĨ.

Năm 1959 Batchelor vμ cộng sự đã chiết đ−ợc 6 - APA từ môi tr−ờng
nuôi cấy P. chrysogenum (W - 5120) khơng có chất tiền thể sau khi đã chiết
hết penicillin. Ơng cho rằng sự hình thμnh 6 - APA lμ giai đoạn gần kết thúc

của quá trình sinh tổng hợp penicillin vμ đã công bố phát minh sản xuất 6 –
APA. Sau nμy ng−ời ta phát hiện thấy nhiều vi sinh vật (đặc biệt nhóm vi
khuẩn đ−ờng ruột) nh− E. coli, B. megatherium... tiết ra penicillinamidase có
khả năng thuỷ phân penicillin G hoặc penicillin V tạo ra 6 - APA vμ acid
phenyl acetic.

Penicillinamidase

Penicillin G (V) 6-APA + acid phenylacetic
6-APA lμ chất khơng có hoạt tính kháng sinh đối với tụ cầu vμ cũng bị
penicillinase phá huỷ. Tinh thể mμu trắng, khá bền, độ chảy 209 - 210OC. Tan

Ýt trong nớc v các dung môi hữu cơ.
3.3. Các phơng pháp sản xuất 6-APA

3.3.1. Phơng pháp hoá học

N
S

COO
N

O
H3N

+
CH2 C OO R

H 2 O

CH2 C

OR
N

O
-40 o C

P C l 5

N
S

CO O S i ( C H 3 ) 3

CH2CONH

tert. amin
(CH3)3SiC l

Penicillin G

N
O

CH2 C

C l

N ROH

-40C

-Hình 8.5. Sơ đồ phản ứng tổng hợp hố học 6-APA từ penicillin G

Ph−ơng pháp hố học có hiệu suất chuyển hoá cao (đến 90 - 95%) vμ tốc
độ phản ứng nhanh, tuy nhiên lại tiêu hao nhiều năng l−ợng, nhiều dung môi
vμ chứa đựng nguy cơ ô nhiễm môi tr−ờng cao, đòi hỏi các điều kiện phản ứng
rất khó (nhiệt độ -40°C, hố chất đắt tin).

</div>
(111)<div class='page_container' data-page=111>

Bảng 8.3. Công thức một số penicillin bán tổng hợp

R Tên kháng sinh Phỉ kh¸ng khn

O CH
CH3

Phenethicillin

Phỉ kh¸ng khn hĐp, chủ yếu chống
lại các vi khuẩn Gram (+) và bị phân
huỷ bởi betalactamase

CH
N3

Azidocillin

CH3

Methicillin Phổ kháng khuẩn hẹp, chống lại đợc
các vi khuẩn sinh betalactamase

O CH3

C6H5

Oxacillin

ức chế sự phát triển vi khuẩn Gram
(+), đặc biệt trên tụ cầu

Staphylococcus sinh penicillinase

O
C6H5Cl

CH3

Cloxacillin

ức chế sự phát triển vi khuẩn Gram
(+), c bit trờn t cu

Staphylococcus sinh penicillinase

mạnh hơn oxacillin

Nafcillin

CH C
O

NH2

Ampicillin Phỉ réng, chèng l¹i đợc các tụ cầu
kháng penicillin G

CH C
O

N H2

HO Amoxicillin

Bền trong môi trờng acid, phổ rộng
hơn ampicillin, có hoạt tính trên phần
lớn vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

nhng vẫn chịu tác dụng của

betalatamase

CH CO
COOH

Carbenicillin Tác dụng chủ yếu trên vi khuẩn hiÕu
khÝ Gram (-)

S

CH CO

COOH Ticarcillin

T¸c dơng chđ yếu trên vi khuẩn hiếu
khí Gram (-), hoạt tính mạnh gấp 2 4
lần carbenicillin

CH CO
NH

CO N NH
O

</div>
(112)<div class='page_container' data-page=112>

3.3.2. Phơng pháp sinh học

6-APA cú thể đ−ợc sản xuất bằng ph−ơng pháp lên men từ các chủng
Penicillium. Động học quá trình lên men tạo 6-APA t−ơng tự với lên men tạo
penicillin: đồng hoá hydrat carbon nhanh, pH tăng dần vμ trong giai đoạn tạo
6-APA có khi lên đến 7,0 - 7,4. Thời gian lên men kéo dμi từ 108 - 120 giờ. Tuy
nhiên quá trình nμy cho hiệu suất thấp vì 6-APA đ−ợc tạo thμnh đồng thời với
các penicillin tự nhiên khác, mặt khác chi phí cho việc tách chiết cao. Vì vậy

thực tế trong cơng nghiệp ng−ời ta không sử dụng ph−ơng pháp nμy. Hiện nay
ph−ơng pháp enzym vi sinh vật lμ ph−ơng pháp phổ biến để sản xuất 6-APA
trong công nghiệp. Ng−ời ta sử dụng penicillinacylase để cắt mạch nhánh của
penicillin G hay V. Ph−ơng pháp nμy có nhiều −u điểm, điều kiện phản ứng dễ
dμng nên mang lại hiệu quả kinh tế cao. Hiện nay nhiều hãng d−ợc phẩm trên
thế giới đã sản xuất 6-APA với tấn l−ợng lớn theo ph−ơng pháp nμy, điển hình
lμ hãng d−ợc phẩm Snam Progetti (Italia) với sản l−ợng khoảng 40 tấn/năm;

N
S
N H

O COO H

C H 3
C H 3
C O

R Penicillinamidase

N
S
H 2N

O COO H

C H 3

C H 3 + R C O O -

Penicillin G, V 6-APA

Có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh enzym penicillinamidase: xạ
khuẩn, nấm men, nấm mốc có chứa penicillinamidase ngoại bμo. Loại enzym
nμy có khả năng thuỷ phân các penicillin K, F, V nhanh, còn đối với penicillin
G lại thuỷ phân rất chậm (thấp hơn khoảng 100 lần). Penicillinamidase nội
bμo chủ yếu có trong vi khuẩn có tác dụng thuỷ phân nhanh phân tử penicillin
G, cắt đứt dây nối peptid ở mạch bên 6 - APA. Enzym nội bμo vμ ngoại bμo có
pH hoạt động khác nhau: nội bμo hoạt động mạnh ở pH = 7,3 - 8,5; còn enzym
ngoại bμo hoạt động mạnh ở pH = 9,0. Trong cơng nghiệp hay dùng E. coli vμ
B. megatherium vì chúng cho hoạt tính enzym mạnh nhất. Vi khuẩn E. coli
9637 hay B. megatherium đ−ợc nuôi d−ỡng trong môi tr−ờng có thμnh phần
mơi tr−ờng dinh d−ỡng nh− sau:

Cao ng« 2%

Pepton 0,5%

Glucose 2%

Acid phenylacetic 0,15%
Nhiệt độ 30°C
Thời gian 24 giờ

</div>
(113)<div class='page_container' data-page=113>

bμo E.coli hay B. megatherium để sản xuất 6-APA hiệu quả cao nh− dùng
ph−ơng pháp enzym bất động. Ph−ơng pháp nμy có thể sử dụng nhiều lần vμ
dịch penicillin G ch−a bị deacetyl hố có thể sử dụng lại. 6-APA đ−ợc tách ra
vμ tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion, sấy phun s−ơng hoặc kết tủa ở điểm đẳng
điện (pH = 4,3).

Ph−ơng pháp enzym bất động để sản xuất 6-APA cho hiệu suất t−ơng đối
cao (90 – 95%) vμ đã đ−ợc áp dụng rộng rãi ở nhiều n−ớc, mang lại hiệu quả
kinh tế cao. Hơn 50% sản l−ợng 6-APA trên toμn thế giới đ−ợc sản xuất theo
ph−ơng pháp bất động enzym. Hiện nay một số nhμ máy lên men penicillin chỉ
cho xuất x−ởng thμnh phẩm lμ 6-APA.

Để tạo ra các penicillin bán tổng hợp có thể sử dụng cả ph−ơng pháp hoá
học vμ sinh học bằng cách acyl hoá 6-APA. Tuy nhiên ở công đoạn nμy ng−ời ta
sử dụng phổ biến con đ−ờng hoá học nh− đã đề cập ở trên vì enzym acylase
th−ờng thể hiện đồng thời cả 2 hoạt tính synthetase vμ hydrolase, thay đổi tuỳ
theo điều kiện phản ứng nên cho hiệu suất thp.

4. Sản xuất các Cephalosporin 
4.1. Đại cơng

Các cephalosporin lμ nhóm thuốc quan trọng nhất trong các thuốc kháng
sinh hiện nay. Nhóm nμy đứng thứ 7 trong số 10 loại thuốc dùng nhiều nhất
để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn với doanh số 7,2 tỷ đơla năm 1999, sau đó lμ
các penicillin vμ các nhóm kháng sinh khác. Riêng sản l−ợng cephalosporin C
trên toμn thế giới khoảng 3.000 tấn/năm vμ phần lớn đ−ợc dùng để điều chế
7-ACA – một nguyên liệu trung gian để bán tổng hợp ra nhiều cephalosporin thế
hệ mới.

N
O
CONH

CH2

R2

R1

R3

COOH

</div>
(114)<div class='page_container' data-page=114>

Có nhiều cephalosporin tự nhiên đ−ợc sinh tổng hợp từ các chủng nấm
mốc khác nhau (xem bảng 8.4) nh−ng chúng hầu nh− khơng có ý nghĩa trong
trị liệu. Vì vậy ng−ời ta đã tìm cách tạo ra các cephalosporin bán tổng hợp trên
cơ sở cấu trúc vòng β-lactam. Ưu thế của các cephalosporin lμ có tác dụng
kháng khuẩn đối với cả các cầu khuẩn có hoạt tính β-lactamase, nhiều vi
khuẩn Gram (-) vμ độc tính rất thấp. Vì vậy chúng nhanh chóng chiếm vị trí
quan trọng trong trị liệu.

B¶ng 8.4. Một vài cephalosporin và cephamycin tự nhiên

Tên kháng sinh R1 R2 R3

Cephalosporin C

H O O C

CH (CH2)3

H2N - H - OCOCH3

Cephamycin A H O O C

CH (CH2)3

H2N - OCH3

OH
CH

OCOC

OCH3

Cephamycin B H O O C

CH (CH2)3

H2N - OCH3 OCOC CH OH

OCH3

OH

Cephamycin C

H O O C

CH (CH2)3

H2N - OCH3 OCOC CH OS O3H

OCH3

Oganomycin G

H O O C

CH (CH2)3

H2N

- OCH3 N

N
N

N
S

CH3

Oganomycin H

H O O C

CH (CH2)3

H2N

- OCH3

N N

S

</div>
(115)<div class='page_container' data-page=115>

4.2. Cấu trúc hoá học v phân loại

Bảng 8.5. Phân loại các thế hệ cephalosporin

Tên nhóm Tên kh¸ng sinh Phỉ t¸c dơng

- C¸c Cephalosporin 
thÕ hÖ 1

Cephalexin 
Cephalothin 
Cefazolin 
Cephradin

Streptoccoci, Staphylococcus aureus

- C¸c Cephalosporin 
thÕ hƯ 2

Cefuroxim 
Cefaclor 
Cefamandol

Các Cephamycin (đợc

xếp cùng với 
cephalosporin thÕ hÖ 2)

Cefoxitin 
Cefmetazol 
Latamocef

E.coli, Klebsiella, Proteus

H.influenzae, Moraxella catarrhalis không

có tác dụng lên các vi khuẩn Gram (+)

Bacteroides Pragilis và các Bacteroides

khác

- Các Cephalosporin 
thÕ hÖ 3

Cefotaxim 
Ceftriaxon 
Ceftazidim 
Cefoperazon 
Moxalactam

E.coli, Klebsiella, Proteus

H.influenzae, Moraxella catarrhalis, ít tác

dụng lên các vi khuẩn Gram (+) Bacteroides 
pragilis và các Bacteroides kh¸c

- C¸c Cephalosporin 
thÕ hƯ 4

Cefepine 
Cefpirome 
Cefaclidine

Gièng nh− thÕ hƯ 3 nh−ng cã ho¹t tÝnh

mạnh hơn chống lại các vi khuẩn tiết 
betalactamase

Các cephalosporin v cephamycin có cấu trúc gồm vòng -lactam liên kết
với dị vòng dihydrothiazin (nhân cephem). Các cephamycin khác với các
cephalosporin ở nhóm OCH3 tại vị trí C7 (R2).

Những cephalosporin có tác dụng điều trị trong y học đều lμ các
cephalosporin bán tổng hợp. Chúng đ−ợc phân loại thμnh các thế hệ không
chặt chẽ tuỳ theo phổ tác dụng vμ thời gian công bố thuốc. Hiện nay có 4 thế
hệ kháng sinh cephalosporin (bảng 8.5).

</div>
(116)<div class='page_container' data-page=116>

4.3. Quy trình sinh tổng hợp cephalosporin C

Để sản xuất Cephalosporin C ng−ời ta th−ờng sử dụng các chủng giống
Cephalosporium acremonium có hoạt lực cao. Tuy nhiên việc hoμn thiện vμ
triển khai sản xuất công nghiệp cephalosporin C gặp nhiều khó khăn hơn so
với sản xuất penicillin vì hoạt tính sinh kháng sinh của chủng gốc th−ờng rất
thấp vμ việc tuyển chọn, cải tạo hoạt tính của chủng ch−a tạo ra chủng có
năng lực siêu tổng hợp nh− chủng sinh penicillin. Mặt khác các chủng lên men

cephalosporin d−ờng nh− khơng có hoạt tính enzym acyltransferase nên việc
sử dụng tiền chất tạo nhánh nhằm thay đổi hoạt tính của sản phẩm tạo thμnh
trong q trình lên men cephalosporin khơng mang li kt qu ỏng k.

Hình 8.3. Hình thái chủng nấm mốc C. acremonium

Trong lên men công nghiệp ngời ta th−êng sư dơng c¸c chđng gièng
Cephalosporium acremonium ATCC 48272, 11550, 20339 vμ biÕn chđng cđa
chóng. Ho¹t lùc khoảng 2000 mcg/ml môi trờng nuôi cấy.

Trong mụi trng lên men, chủng C. acremonium sinh tổng hợp đồng thời
cephalosporin C, cephalosporin P1 vμ penicillin N. Trong quá trình sinh tổng
hợp cephalosporin các acid amin L-alpha-aminoadipic acid, L-valin vμ
L-cystein cũng đóng vai trị nh− các tiền chất tạo thμnh cấu trúc penicillin N
(xem chuyên luận penicillin) để từ đó hình thμnh nên phân tử cephalosporin C
theo con đ−ờng trình bμy trong hình 8.4.

Mơi tr−ờng ni cấy để sinh tổng hợp Cephalosporin có thμnh phần nh−
sau (w/v):

Saacharose 36,0 g
Glucose 27,0 g
(NH4)2 SO4 7,5 g

</div>
(117)<div class='page_container' data-page=117>

C¸c yÕu tè vi l−ỵng (K, Fe, Mn, Mg, Zn, Cu…)
N−íc máy vđ 1 lít

pH 7,3

Về nguyên lý, quy trình lên men cephalosporin C có nhiều điểm t−ơng

đồng với cơng nghệ lên men sinh tổng hợp penicillin về thμnh phần môi tr−ờng
nuôi cấy, thơng khí… cũng nh− các thơng số khác.

S CH3

CH3

O COOH

CONH
(CH2)3

CH
H2N

HOOC

N
O
CONH
(CH2)3

CH
H2N

HOOC
S
CH3

COOH
N
O
CONH
(CH2)3

CH
H2N

HOOC
S
CH3
COOH
N
O
CONH
(CH2)3

CH
H2N

HOOC

CH2OH

COOH

O
CONH
(CH2)3

CH
H2N

HOOC

CH2OH

COOH

N
O
CONH
(CH2)3

CH
H2N

HOOC
S
CH2
COOH
OCOCH3
Acetyl-CoA
O2

+
- 2 H

Penicillin N

Cephalosporin C

Hình 8.4. Cơ chế sinh tổng hợp cephalosporin C (giai đoạn cuối từ penicillin N)

5. Sản xuất 7ACA; 7ADCA v các kháng sinh bán tổng hợp 
nhóm Cephalosporin

5.1. Đại cơng

</div>
(118)<div class='page_container' data-page=118>

N
O

COOH
H2N

CH2OCCH3
O

N
O

COOH
H2N

CH3

7-ACA 7-ADCA
Nếu loại nhóm acetoxy ở vị trí C3 của 7-ACA thì sẽ nhận đợc 7.amino

deacetoxy cephalosporanic (7-ADCA). Đây cũng lμ một nguyên liệu trung gian
quan trọng để tạo ra các cephalosporin bán tổng hợp.

5.2. Phơng pháp sản xuất 7-ACA v 7-ADCA

Trc õy 7-ACA chủ yếu đ−ợc sản xuất theo ph−ơng pháp hoá học bằng
cách cắt mạch nhánh của cephalosporin C. Tuy nhiên ng−ời ta nhận thấy rằng
trong môi tr−ờng lên men Cephalosporium acremonium tồn tại đồng thời một
hỗn hợp kháng sinh cephalosporin P, cephalosporin C vμ penicillin N. Sự tồn
tại đồng thời của penicillin N vμ cephalosporin C trong môi tr−ờng lên men đã
gợi nên ý t−ởng bán tổng hợp các kháng sinh mới nhóm cephalosporin từ
penicillin.

Bằng ph−ơng pháp hoá học, từ penicillin G ng−ời ta đã tổng hợp đ−ợc
7-ADCA theo sơ đồ phản ứng sau:

CH2CONH

O N

S CH3

CH3

COOH

CH3COOH >

90%

Penicilin G

S CH3

COOH
N

O
CH2CONH

(CH3)3SiN=C OSi(CH3)3

CH3

pyridin HBr

CH2CONH

N
O N
S
COOH
CH3
> 90%
PCl5
ROH
N
H3N+

O N

COO
-CH3

7 - ADCA

</div>
(119)<div class='page_container' data-page=119>

Từ 7-ACA vμ 7-ADCA đã tạo ra các cephalosporin bán tổng hợp đ−ợc
dùng trong y học (bảng 8.6)

B¶ng 8.6. Công thức một số cephalosporin bán tổng hợp từ 7-ACA và 7-ADCA

Gốc Tên KS Công thức

Cephalexin
C
H
CONH
NH2
O
N
S
COOH
CH3
Cefaclor
C
H
CONH
NH2
O
N
S
COOH
Cl
Cephracin
CH
N H2

C ON H
N
O

C H3
C OOH
Tõ
7-ADCA
Cefadroxil
C
H
CONH
NH2
O
H
O
N
S
COOH
CH3
Cephalothin
O
N
S
COOH

CH2 - O - COCH3

S CH2 CONH

Cefazolin

N N CH2 - CONH

O
N

CH2 S

-COOH S

N
N

CH3

Cefuroxim CONH

O
N

S
COOH

CH2 - O - CO - NH2

C
N - OCH3

Tõ
7-ACA

Cefotaxim CONH

O N

COOH

CH2 - O - CO - CH3
S

N
N

H2 C

</div>
(120)<div class='page_container' data-page=120>

6. Sinh tổng hợp Acid clavulanic 
6.1. Đại cơng

Acid clavulanic lμ một chất kháng sinh có cấu trúc vịng β-lactam đ−ợc
Brown vμ cộng sự tìm ra vμo năm 1976 trong môi tr−ờng nuôi cấy
Streptomyces clavuligerus (Napier vμ cs. cũng phát hiện ra acid clavulanic vμo
năm 1981 độc lập với nghiên cứu của Brown).

Acid clavulanic lμ một kháng sinh phổ rộng, tác dụng lên nhiều loμi vi
khuẩn bao gồm cả vi khuẩn Gram (+) vμ vi khuẩn Gram (-) nh−ng hoạt tính
kháng khuẩn của chúng rất yếu. Tuy nhiên −u điểm của acid clavulanic lμ có
hoạt tính kháng betalactamase, đặc biệt nó có tác dụng ức chế mạnh các
betalactamase truyền qua plasmid gây kháng các penicillin vμ các
cephalosporin. Vì vậy acid clavulanic đ−ợc phối hợp với amoxicilin thμnh biệt
d−ợc mang tên Augmentin đ−ợc bμo chế ở nhiều dạng khác nhau nh− bột
uống, viên nén bao phim, tiêm của hãng Glaxo Smithkline. Sự phối hợp với
acid clavulanic giúp cho amoxicilin không bị betalactamase phá huỷ, đồng thời
mở rộng thêm phổ kháng khuẩn của amoxicilin một cách hiệu quả với nhiều vi
khuẩn thông th−ờng đã kháng lại amoxicilin, kháng lại các penicillin vμ
cephalosporin. Khi sử dụng riêng ampicillin thì nồng độ diệt vi khuẩn tối
thiểu MBC (minimum bactericidal concentration) trên Staphylococcus aureus 
lμ 500 mcg/ml, song nếu sử dụng phối hợp với acid clavulanic ở nồng độ
5 mcg/ml thì liều MBC hiệu quả giảm xuống 5000 lần – tức lμ chỉ cần
0,1 mcg/ml. Việc phối hợp amoxicilin với acid clavulanic lμ một ví dụ điển hình
của các nhμ d−ợc học về nghiên cứu bμo chế phối hợp các d−ợc chất để tạo ra
các biệt d−ợc mới tác dụng tốt trong điều trị nhằm ngăn cản sự kháng thuốc
kháng sinh của vi khuẩn.

6.2. CÊu tróc ho¸ häc vμ tÝnh chÊt

Về cấu trúc của acid clavulanic cũng t−ơng tự nh− các kháng sinh nhóm
β-lactam khác. Phân tử acid clavulanic cũng chứa vịng β-lactam (đ−ợc xếp
vμo nhóm β-lactam khơng chứa S). Ng−ời ta đã tìm ra 6 sản phẩm lên men tự
nhiên có cấu trúc t−ơng tự với acid clavulanic vμ xếp chúng vμo nhóm
clavam.

O R1

</div>
(121)<div class='page_container' data-page=121>

Bảng 8.7. Cấu trúc các kháng sinh clavam tù nhiªn

Tªn clavam R1 R2

Acid clavulanic − COOH = CHCH2OH

Acid β–hydroxypropionylclavulanic − COOH = CHCH2COCH2CH2OH

Acid clavam – 2 – cacboxylic − H − COOH

2–hydroxymethylclavam − H − CH2OH

2–formyloxymethylclavam − H − CH2OCHO

2–(3 – alanyl) – clavam − H − CH2CH(NH2)COOH

2–(2 – hydroxyethyl) – clavam − H − CH2CH2OH

Khi phèi hỵp víi amoxicilin ng−êi ta sử dụng dạng muối kali của acid
clavulanic có công thøc ho¸ häc C8H8KNO5,ptl. 237,25.

N
O

CHCH2OH

COOH

N
O

CHCH2OH

COOK

Acid clavulanic Kali clavulanat

Clavulanat dạng muối kali l bột tinh thể trắng, dƠ hót Èm, tan trong
n−íc, tan Ýt trong cån, rÊt Ýt tan trong aceton.

6.3. Lªn men sinh tỉng hỵp acid clavulanic

6.3.1. Chđng gièng

Trong cơng nghiệp ng−ời ta sử dụng chủng Streptomyces clavuligerus
ATCC 27064 hay NRRL 3858 để sản xuất acid clavulanic. Trong môi tr−ờng
nuôi cấy ngoμi acid clavulanic th−ờng tích tụ đồng thời một vμi clavam khác,
một số dẫn xuất cephalosporin vμ penicillin N.

6.3.2. Quy trình lên men

Quy trình sinh tổng hợp của hÃng Beecham Laboratories Ltd. có những
công ®o¹n chÝnh sau:

Bμo tử giống đ−ợc ni cấy trên bình Roux, ni trên mơi tr−ờng đặc ở
26OC trong thời gian 10 ngμy. Nhân giống ở 26OC trong 72 gi, cp khớ 1VVM,

</div>
(122)<div class='page_container' data-page=122>

Thnh phần môi trờng lên men sinh tổng hợp (w/v):

Bột đậu t−¬ng 3,0

Tinh bét 4,7

FeSO4.7H2O 0,01

KH2PO4 0,01

CaCO3 0,3

Dầu phá bọt 0,05

Nớc máy vđ

Môi trờng lên men đợc chØnh pH = 7,0, tiƯt trïng b»ng h¬i ë 121OC

trong thời gian 30 phút, lμm nguội rồi cấy truyền 5 lít dịch giống sang. Q
trình lên men tiến hμnh ở 26OC, tốc độ khuấy 100 – 110 v/ph, cấp khí l−u

l−ợng 0,75VVM. Thời gian ni cấy từ 90 – 100 giờ. Hiệu suất quá trình lên
men th−ờng đạt 500 mcg/ml dịch lên men.

6.3.3. T¸ch chiÕt vμ tinh chÕ acid clavulanic

Acid clavulanic lμ sản phẩm ngoại bμo vμ có thể đ−ợc chiết bằng cách

dùng nhựa trao đổi ion (th−ờng sử dụng anionit nh− Amberlite IR4B hay
Zeolite FFIP…).

Kết thúc quá trình ni cấy hạ nhiệt độ dịch lên men xuống 5OC, lọc hoặc

ly tâm loại sinh khối, acid hoá dịch lọc bằng acid hydrocloric hoặc sulfuric đến
pH = 2–3, đồng thời bổ sung dung môi không tan trong n−ớc nh− n-butanol
hoặc ethylacetat. Acid clavulanic chuyển sang pha dung môi. Chiết acid
clavulanic khỏi pha dung môi bằng các dung dịch có pH trung tính nh− dung
dịch đệm natri bicarbonat hoặc kali hydrophosphat, hỗn dịch CaCO3 hoặc

n−ớc. Dịch chiết đem hấp phụ bằng nhựa trao đổi ion để thu sản phẩm tinh
khiết hoặc thu chế phẩm thô dạng muối bằng cách cô ở nhiệt độ thấp (≤ 40OC)

vμ áp suất giảm hoặc sấy phun thu sn phm.

</div>
(123)<div class='page_container' data-page=123>

amberlit
loại muối

DD NaCl
phản hấp phụ

than hoạt
tảy mu

amberlit

5oC

DD HCl

pH = 2 - 3

m pH 7
dịch lên men

läc sinh khèi

chiÕt lÇn 1 butanol

chiết lần 2

hấp phụ

cô chân không

sấy phun

acid clavulanic

Hỡnh 8.6. S đồ các công đoạn tách chiết và tinh chế acid clavulanic

Các kháng sinh khác có cấu trúc clavam đợc xếp vo nhóm ny l
sulbactam v tazobactam. Đây l 2 kháng sinh đợc sản xuất bằng phơng
pháp tổng hợp hóa học. Sulbactam thờng đợc phối hợp với amoxicillin, còn
tazobactam đợc phối hợp với piperacillin.

</div>
(124)<div class='page_container' data-page=124>

S O

S O
O

CH3

CH2 N

N N
COONa

Sulbactam Tazobactam

Tự lợng giá

1. Kể tên các chủng vi sinh vật đ−ợc sử dụng dùng để sản xuất các
kháng sinh nhóm beta-lactam.

2. Tìm mối liên hệ giữa cấu trúc hoá học với chủng giống v quy trình
sinh tổng hợp của 2 nhóm kháng sinh penicillin v cephalosporin.
3. Nêu phơng pháp điều khiển quá trình sinh tổng hợp từ chủng nÊm

Penicillium chrysogenum để nhận đ−ợc kháng sinh penicillin mong
mun?

4. Trình by phơng pháp sản xuất 6-APA bằng con đờng sinh học.
5. Nêu nguyên tắc sản xuất các kháng sinh bán tổng hợp nhóm

cephalosporin.

</div>
(125)<div class='page_container' data-page=125>

Ch

ơng 9

sản xuất kháng sinh nhóm Tetracyclin

Mục tiêu

Sau khi học xong chơng ny, sinh viên phải trình by đợc:

1. Nguồn gốc các kháng sinh tự nhiên v bán tổng hợp nhóm tetracyclin.
2. Quy trình lên men nhận từng kháng sinh cụ thể.

3. Phơng pháp có hiệu quả nhất trong 3 phơng pháp chiết xuất
kháng sinh từ dịch lên men.

1. Đại c−¬ng

Các tetracyclin đ−ợc phát hiện rất sớm (từ năm 1948), lμ nhóm chất
kháng sinh phổ rộng đầu tiên ức chế hầu hết các vi khuẩn Gram (-), Gram
(+) vμ Rickettsia… nên đ−ợc sử dụng rộng rãi cho đến những năm 80 của thế
kỷ XX, nhất lμ ở các n−ớc đang phát triển. Hiện nay các kháng sinh tự nhiên
của nhóm nμy nh− tetracyclin, clotetracyclin, oxytetracyclin chủ yếu đ−ợc sử
dụng trong chăn nuôi để điều trị bệnh cho gia súc, gia cầm vμ đ−ợc phối hợp

với vitamin B12 để bổ sung vμo thức ăn trong chăn ni có tác dụng kích

thích tăng trọng. Các kháng sinh tetracyclin bán tổng hợp đ−ợc dùng rộng
rãi hơn để điều trị một số bệnh nhiễm trùng nh− mắt hột, mắt đỏ, viêm giác
mạc, viêm phế quản, viêm tiết niệu do lậu cầu … vμ đặc biệt để điều trị bệnh
dch hch.

</div>
(126)<div class='page_container' data-page=126>

2. Công thức cấu tạo vμ tÝnh chÊt

C¸c kh¸ng sinh nhãm tetracyclin cã bé khung chÝnh lμ octahydro
naphtaxenic:

OH O O

N(CH3)2
OH

CONH
R5

R6a

R6

R2
1

7 5

B¶ng 9.1. Công thức cấu tạo một số kháng sinh nhóm tetracyclin

Tªn R2 R5 R6a R6 R7

Clotetracyclin – H – H – OH – CH3 – Cl

Oxytetracyclin – H – OH – OH – CH3 – H

Tetracyclin – H – H – OH – CH3 – H

6-Demethyl
etracyclin

– H – H – H – H – H

Demeclocyclin – H – H – OH – H – Cl

Methacyclin – H – OH = CH2 – H

Doxycyclin – H – OH – H – CH3 – H

Minocyclin – H – H – H – H – N (CH3)2

Rolitetracyclin

N CH2

– H – OH – CH3 – H

Đặc tính chung của các tetracyclin lμ bền với acid nên dùng để uống đ−ợc
nh−ng do nhiều tác dụng phụ - đặc biệt lμ tạo phức calci bền vững lμm răng bị
vμng ố nên cấm dùng cho trẻ em d−ới 10 tuổi. Một số tính chất của nhóm
kháng sinh nμy cần đ−ợc quan tâm trong quá trình chiết xuất lμ:

− TÝnh l−ìng tÝnh: Do trong ph©n tư cđa c¸c kh¸ng sinh nhãm
tetracyclin cã chøa nhãm dimetylamino có khả năng tạo muối với acid
v các nhóm hydroxyl có khả năng tạo muối với kiềm hoặc với các ion
Ca++, Mg++ (tạo tetracyclinat).

</div>
(127)<div class='page_container' data-page=127>

− Dễ bị đồng phân hóa (do cấu trúc hydro naphtaxenic) trong dung dịch
n−ớc ở pH 2,0 – 6,0 tạo ra epitetracyclin khơng có tác dụng kháng
sinh. Hiện t−ợng đồng phân hóa xảy ra nhanh hơn ở tetracyclin vμ
clotetracyclin.

N(CH3)2
OH

CONH2

(CH3)2N H

Tetracyclin Epitetracyclin

− ë môi trờng quá kiềm hay quá acid (pH > 9 hoặc pH < 1) các
tetracyclin bị khử hoạt tính do tạo thnh các dẫn chất anhydro v
isotetracyclin

OH O

N(CH3)2

CONH2

R1 CH3

O
O

OH O

N(CH3)2
OH

CONH2

R1 CH3

OH O

OH O O

N(CH3)2
OH

CONH2

OH
H3C

R1 pH > 9

pH < 1

isotetracyclin

anhydrotetracyclin

3. Sinh tổng hợp các Tetracyclin tự nhiên

Có gần 10 tetracyclin tự nhiên nhng thực tế ngời ta chỉ sản xuất ở quy
mô công nghiệp 4 sản phÈm lμ clotetracyclin, tetracyclin, oxytetracyclin vμ
demeclocyclin.

3.1. Chñng gièng

</div>
(128)<div class='page_container' data-page=128>

Sinh tổng hợp chuỗi oligoketidamit mạch thẳng từ các nguồn
hydratcarbon.

Khép vòng chuỗi oligoketidamit tạo thnh bộ khung pretetramit
(hoặc 6- metylpretetramit).

Chuyển hoá tiếp pretetramit (hoặc 6- metylpretetramit) để tạo các
tetracyclin.

OH OH OH OH
CH3

OH
CONH2

OH OH OH OH
CH3

OH
CONH2

OH OH O O

CH3

OH
CONH2

OH OH O O

CH3

OH
CONH2

HO
NH2

OH OH O O

CH3
OH
CONH2
HO
N
CH3

H3C

OH O O O

CH3
OH
CONH2
HO
N
CH3

H3C

OH O O

CH3
OH
CONH2
HO
N
CH3

H3C

HO
OH
(A) (B)

(D)
(C)
Tetracyclin
(E) (F)

Hình 9.1. Cơ chế sinh tổng hợp tetracyclin tõ pretenamid (A)

OH OH O O

CH3
OH
CONH2
HO
N
CH3

H3C

OH OH O O

CH3
OH
CONH2
HO
N
CH3

H3C

OH O OH O

OH
OH
CONH2
HO
N
CH3

H3C

OH
H3C

(E)

Pretenamid (A)

Oxytetracyclin

</div>
(129)<div class='page_container' data-page=129>

3.2. Đặc điểm quá trình lên men

Cỏc chng x khun sinh kháng sinh nhóm tetracyclin lμ những chủng
vi sinh vật hiếu khí nên q trình ni cấy cần lắc hoặc khuấy trộn kèm theo
sục khí với l−u l−ợng khoảng 1VVM. Việc đảm bảo thơng khí hợp lý vμ liên tục
trong suốt q trình lên men có ảnh h−ởng rất lớn đến hiệu suất sinh kháng
sinh, đặc biệt lμ trong 6 – 12 giờ đầu tiên (quá trình có thể bị huỷ hoμn toμn
nếu ngừng cấp oxy chỉ trong 5 phút). pH tối −u cho sự phát triển lμ 6,6 – 7,2.
Mỗi bμo tử nảy 2-4 chồi tạo thμnh hệ sợi. Kháng sinh nằm trong sinh khối xạ

khuẩn. Nhiệt độ ni cấy thích hợp từ 27 – 28OC. Thời gian lên men th−ờng

kho¶ng 110 – 140 giê.
3.3. Nhu cÇu dinh d−ìng

Ngn hydrat carbon chủ yếu l bột ngô, bột mì, tinh bột khoai tây hoặc
tinh bột ngô. Ngoi ra ngời ta còn bổ sung vo môi trờng nuôi cấy một số
loại đờng nh glucose (thích hợp với S. rimosus) hoặc maltose (thích hợp với
S. aureofaciens). Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin không
có khả năng phân giải saccharose v lactose.

Nguồn nitơ: Môi trờng sản xuất cần có cả nguồn nitơ vô cơ nh
(NH4)2SO4 cũng nh Nitơ hữu cơ (cao ngô, bột đậu tơng, bột lạc...).

Ngun phospho: i vi quỏ trình sinh tổng hợp các tetracyclin hμm l−ợng
phospho vơ cơ hoμ tan trong môi tr−ờng lên men (chủ yếu từ cao ngơ) có ý nghĩa
rất quan trọng đến hiệu suất tạo kháng sinh: thiếu phospho giống phát triển
kém vμ hiệu suất lên men thấp, thừa phospho giống phát triển nhanh nh−ng
hoạt lực kháng sinh giảm đáng kể do sự tích tụ acid acetic vμ acid pyruvic trong
môi tr−ờng. Để tránh thừa phospho ng−ời ta bổ sung CaCO3 để tạo thμnh các

phosphat calci khơng tan. Ngoμi ra nó cịn có tác dụng giảm nồng độ các kháng
sinh hoμ tan để tránh độc tính của kháng sinh đối với giống.

Nguồn kim loại vi l−ợng: Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm
tetracyclin cũng cần một số kim loại nh− Mg, Mn, Fe, Cu… vμ th−ờng đ−ợc bổ
sung d−ới dạng muối sulfat. Nếu mơi tr−ờng có cao ngơ, bột đậu, bột lạc… thì
khơng cần bổ sung vì bản thân các loại nguyên liệu nμy đã sẵn có các muối
kim loại. Cần chú ý đặc biệt đến hμm l−ợng sắt vì nếu sắt thừa sẽ kết hợp với
Tetracyclin tạo ra những phức chất khơng có hoạt tính kháng sinh.

ở pha phát triển thứ nhất trong điều kiện lên men chìm, các chủng xạ
khuẩn nμy sinh tr−ởng mạnh trong khoảng từ 24 – 48 giờ vμ khối l−ợng khuẩn
ty đã đạt tới 70 – 80% mức tối đa, l−ợng chất dinh d−ỡng tiêu thụ từ 60 – 80%.
B−ớc sang pha lên men thứ hai quá trình phát triển chậm lại nên tốc độ tiêu
thụ chất dinh d−ỡng giảm đi rất nhiều, sự tăng sinh khối (l−ợng khuẩn ty)
chậm lại dần đạt tới mức độ cực đại rồi ổn định vμ xạ khuẩn b−ớc sang giai
đoạn tự phân. Trong giai đoạn nμy l−ợng chất dinh d−ỡng trong mơi tr−ờng
cịn lại rất ít vμ hầu nh− khơng đ−ợc sử dụng.

</div>
(130)<div class='page_container' data-page=130>

với Str. aureofaciens) vμ ở 48 - 55 giờ (đối với Str.rimosus lμ chủng phát triển
chậm hơn). L−ợng kháng sinh đạt tối đa ở 120 -144 giờ. Hiệu suất sinh tổng
hợp lên tới 20.000 mcg/ml môi tr−ờng lên men với những chủng siêu tổng hợp.
3.4. Nguyên tắc chiết xuất kháng sinh từ môi tr−ờng lên men

Các kháng sinh nhóm tetracyclin có tính chất l−ỡng tính nên có thể
dùng cả 3 ph−ơng pháp sau để chiết tách sản phẩm ra khỏi dch lờn men:

Chiết bằng dung môi hữu cơ có chất mang
Chiết bằng phơng pháp kết tủa

− Chiết bằng ph−ơng pháp trao đổi ion

Tuỳ theo loại kháng sinh cụ thể, độ tinh khiết cần thiết của sản phẩm
mμ ng−ời ta lựa chọn ph−ơng pháp thích hợp. D−ới đây mơ tả quy trình sinh
tổng hợp vμ chiết xuất một số kháng sinh cụ thể của nhóm tetracyclin.

4. Sinh tỉng hỵp Clotetracyclin 
4.1. Chủng giống

Clotetracyclin còn có tên khác l biomycin, aureomycin v đợc tìm ra
lần đầu vo năm 1948 trong môi trờng nuôi cấy chủng xạ khuẩn Str. 
aureofaciens. Trong sản xuất công nghiệp hiện nay ngời ta sử dơng mét sè
biÕn chđng cho hiƯu st sinh tỉng hỵp cao nh−Str. aureofaciens A377 (NRRL
2009), Str. aureofaciens ATCC 13908-13911.

Muối clohydrat của clotetracyclin lμ dạng bột tinh thể mμu vμng, không
mùi, vị đắng, bền vững trong không khí khơ ở nhiệt độ phịng, nếu để ra ánh
sáng thì dần dần mất hoạt tính. Clotetracyclin bền trong dung dịch acid (pH
0,6 – 2,6), không bền trong dung dch kim.

4.2. Điều kiện lên men

Nhu cu dinh d−ỡng vμ điều kiện lên men sinh tổng hợp của chủng
Str. aureofaciens mang những đặc điểm chung nh− phần tổng quan nêu trên.
Tuy nhiên cần chú ý thêm một số yếu tố riêng nh− sau:

Thnh phần môi trờng lên men (%):

Bột ngô 12,0

Cao ng« 0,5

(NH4)2SO4 1,5

NaCl (hoặc NH4Cl, NH4NO3) 0,6

Muối khoáng … 0,01

</div>
(131)<div class='page_container' data-page=131>

pH sau khử trùng 6,6 - 7,2

Nhiệt độ nuôi cấy 28OC

Thêi gian lªn men 100-120 giê
Cung cÊp khÝ v« trïng 1VVM

Mơi tr−ờng lên men phải cung cấp ion clo để tạo Clotetracyclin. Thích
hợp nhất lμ amoni clorid, natri clorid hoặc amoni nitrat.

Các tiền chất sử dụng trong sinh tổng hợp clotetracyclin lμ các hợp chất
mạch vịng, thích hợp nhất lμ benzylthioxyanid (C6H5CH2-SCN) với hμm l−ợng
1-3 mg/l mơi tr−ờng có thể lμm tăng hiu sut n 30 - 40%.

4.3. Phơng pháp chiết xuÊt

Có thể sử dụng ph−ơng pháp kết tủa để thu clotetracyclin từ dịch lên
men theo sơ đồ hình 9.3a. Các b−ớc tiến hμnh nh− sau:

Dịch lên men đ−ợc hạ nhiệt độ xuống 15OC. Sau đó acid hoá bằng H
2SO4

30% đến pH = 4,5. Lọc loại sinh khối vμ thêm 0,1% CaCl2. Kiềm hoá bằng
NH4OH đến pH 8,5 – 9 kháng sinh sẽ kết tủa dạng phức calci. Lọc thu kết tủa

để tinh chế tiếp qua các công đoạn loại tạp, tẩy mμu…

Clotetracyclin có hoạt tính kháng khuẩn mạnh gấp 4 lần tetracyclin
(Test lμ Staphyloccocus aureus) song độc tính cao hơn Tetracyclin nên hiện
không dùng trong y học. Tr−ớc đây có sử dụng chế phẩm mỡ tra mắt (dạng
clohydrat) vμ viên nén (dạng base). Hiện nay clotetracyclin đ−ợc sản xuất
dạng thô (chế phẩm Biovit) dùng trong chăn nuôi gia sỳc, gia cm.

Qui trình sản xuất Biovit: Có thể áp dụng một trong hai quy trình sau
(hình 9.3b v c):

sấy phun
dịch lên men

acid hóa

lọc

kết tủa

tinh chế

sản phẩm

lọc

sấy

Làm lạnh 15oC

H2SO4 30%

pH = 4 - 5

CaCl2

NH4OH

Loại tạp Ca, Mg
Tảy màu

<60oC
600mmHg

cô

biovit

Còn 40%

sinh khối

(a)

(b)

(c)

Hình 9.3. Quy trình xử lý dịch lên men clotetracyclin
(a): Quy trình thu clotetracyclin tinh khiết

</div>
(132)<div class='page_container' data-page=132>

Dịch lên men đ−ợc cô chân không đến 40% chất đặc, sau đó sấy phun thu
sản phẩm. Hoặc dịch lên men đem lọc lấy sinh khối (Biomaca) vμ sấy chân
không ở nhiệt độ ≤ 60°C vμ p = 600 mmHg. Sau đó xay thμnh bột, xác định
hoạt tính kháng sinh của bột nμy để phân loại sản phẩm. Có các loại Biovit 80,
Biovit 120 hay Biovit 150 (Mỗi kg Biovit có chứa 80, 120 hay 150 g biomyxin
vμ 4 mg vitamin B12).

5. Sinh tổng hợp Tetracyclin 
5.1. Đại cơng

Tetracyclin c phát hiện lần đầu vμo năm 1953 bằng ph−ơng pháp khử
clo của clotetracyclin. Sau nμy ng−ời ta tìm thấy chủng xạ khuẩn Str. 
viridifaciens có khả năng sinh tổng hợp ra tetracycline nh−ng thực tế trong
sản xuất sử dụng chủng Str. aureofaciens trong điều kiện nuôi cấy đặc biệt (có
bổ sung các chất ức chế q trình Clo hoá).

Tetracyclin base lμ bét kÕt tinh vμng sÉm, ít tan trong nớc v dung môi
hữu cơ. Dạng base ny không bền nên thực tế sản xuất tetracyclin clohydrat l
bột vng sáng tan trong nớc vừa bền vững, vừa dễ sử dụng.

5.2. Quy trình lên men

iu kiện vμ đặc điểm của quá trình lên men tạo tetracyclin bởi chủng
Str. aureofaciens gần giống với lên men tạo clotetracyclin. Tuy nhiên điểm
khác biệt quan trọng nhất lμ thμnh phần môi tr−ờng nuôi cấy. Dựa vμo thμnh
phần môi tr−ờng cung cấp cho xạ khuẩn mμ ng−ời ta có thể định h−ớng đ−ợc
sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men.

Str.aureofaciens trong điều kiện ni cấy bình th−ờng tạo ra clotetracyclin;
nh−ng khi ni d−ỡng trong điều kiện đặc biệt có chất ức chế q trình clo hố
xạ khuẩn sẽ tạo ra chủ yếu tetracyclin. Để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp
tetracyclin phải loại những vết Cl– ra khỏi môi tr−ờng. Trong phịng thí

nghiệm để loại ion Cl– có thể dùng muối bạc, tuy nhiên ph−ơng pháp nμy

kh«ng thùc tÕ. HiƯn nay ng−êi ta dïng nh÷ng chÊt øc chÕ quá trình clo hoá

nh brom, iod, thiocyanid... Tuy nhiên nếu tăng hm lợng bromid trong môi
trờng xạ khuẩn sẽ tổng hợp ra cả 7 bromtetracyclin v ức chế sinh tổng hợp
tetracyclin. Vì vậy ngoi NaBr còn cho thêm các chất ức chế quá trình clo
ho¸ kh¸c nh− 2-mercaptobenzothiazol, 2 - thiouracyl, dÉn chÊt cđa acid
dithiocarbamic ... Cơ chế tác dụng của các chất ny cha đợc rõ vì chúng
không có tác dụng cạnh tranh với ion clo, có thể sự có mặt của nhóm
sulfuhydryl (-SH) có tác dụng kích thích phản ứng oxy hoá khử lm loại Cl ra
khỏi phân tử kháng sinh.

Thnh phần môi trờng lên men (%):

</div>
(133)<div class='page_container' data-page=133>

Cao ng« 0,5

NaBr 0,2

Benzylthiocyanid (C6H5CH2-SCN) 0,0001

2-mercaptobenzothiazol 0,001

CaCO3 0,5

DÇu phá bọt theo nhu cầu

pH sau khö trïng 6,8 – 7,2

Nhiệt độ ni cấy 28OC

Thêi gian lªn men 120 giê – 144 giê
Cung cÊp khÝ v« trïng 0,8 – 1 VVM
5.3. Qui tr×nh chiÕt xuÊt tetracyclin

Cịng nh− c¸c kh¸ng sinh kh¸c thc nhãm ny, tetracyclin có thể đợc
chiết bằng cả 3 phơng pháp. ở đây giới thiệu phơng pháp chiết bằng dung
môi hữu cơ:

Dch lờn men xong, bm vo thùng chứa, hạ nhiệt độ xuống 15°C. Thêm
acid oxalic vμ hạ pH = 2,5 – 3,0. Thêm Na2CO3 khuấy pH = 3,5. Thêm

K4Fe(CN)6 khuấy tiếp 15 phút để loại sắt. Lấy mẫu phân tích Ca++ vμ Fe++: yêu

cầu Ca++ 0,4 - 0,6 g/lít. Fe++ không có. Trong thiết bị chiết thêm hỗn hợp

isooctanol có chứa 1,5 - 2,5% acid oleic tỉ lệ dung môi/dung dịch kháng sinh l
1 : 3 - 1 : 4, thêm NH4OH 5% vμo vμ khuÊy pH = 9 - 9,5. Tetracyclin chuyển
sang dung môi, dịch thải chuyển về phân xởng thu hồi dung môi. Dịch chiết
isooctanol bơm vo thiÕt bÞ chøa cïng víi acid oxalic (dung dÞch 5%) thêm vo
với lợng 0,5 - 0,6% theo tỉ lệ dịch kháng sinh. Tại đây sẽ loại đi Ca++ v c¸c

kim loại khác dạng oxalat. Ly tâm loại oxalat. Tẩy mμu bằng than hoạt 0,25 -
0,3%. Sau khi lọc loại than trên lọc hút chân khơng thì kết tinh tetracyclin
base bằng dung dịch NH4OH 10%. Khuấy để kết tinh ở nhiệt độ 15°C vμ pH
3,9 - 4,5. Ly tâm thu sản phẩm vμ sấy khô bằng máy sấy tầng sôi. Hiệu suất
chiết đạt 70 – 75%.

Trên thực tế, tetracyclin không bền vững, ít ho tan trong nớc nên khó
sử dụng. Vì vậy thờng chế tạo dạng muối clohydrat tetracyclin bền vững hơn
(có dạng viên nén). Tại bộ môn Công nghiệp Dợc, Trờng Đại học Dợc H
Nội lm nh sau:

</div>
(134)<div class='page_container' data-page=134>

Hiệu suất chế tạo clohydrat tetracyclin đạt 90%.

läc, ly tâm
pH = 2,5 - 3,0
Hạ xuống 15oC

lọc
acid hóa
dịch lên men

loại tạp
acid oxalic
K4FeCN6

tảy mu, loại tạp

Loại Ca, Mg
Tảy màu = than ho¹t
ChiÕt

isooctanol chøa a.oleic
chØnh pH 9 - 9,5

NH4OH 10%
kÕt tđa

tetracyclin base

butanol
HCl c
40oC

tetracyclin HCl

lọc

sấy tầng sôi

kiểm nghiệm

Hình 9.4. Quy trình chiết tetracyclin bằng dung môi hữu cơ

6. Sinh tổng hợp Oxytetracyclin

Oxytetracyclin đợc phát hiện lần đầu vo năm 1950 trong môi trờng
nuôi cấy Str. rimosus. Giai đoạn đầu kháng sinh ny đợc sử dụng cho ngời ở
dạng dihydrat hay muối clohydrat với các biệt dợc Abbocin, Clinimycin,
Berkmycen, Imperacin, Oxymycin. Hiện nay oxytetracyclin chủ yếu đợc dùng
trong thú y v chăn nuôi với các sản phÈm mang tªn teravit, terramycin,
biostat.

</div>
(135)<div class='page_container' data-page=135>

6.1. Chđng gièng

Trong c«ng nghiƯp sư dơng Str. rimosus. Ngoμi ra các chủng Str.
griseoflavus, Str. armilatus cũng sinh oxytetracyclin.

Môi trờng lên men (%):

Bột ngô 6,0

Cao ng« 0,5

(NH4)2SO4 0,6

CaCO3 0,6

CoCl2.6H2O 0,01

pH sau khö trïng 6,8 – 7,0

Nhiệt độ ni cấy 28OC

Thêi gian lªn men 120 giê – 144 giê

Cung cÊp khÝ v« trïng: 0,8 – 1 thĨ tÝch kh«ng khÝ/1 thĨ tÝch môi trờng/
phút, áp suất nồi lên men: 0,3 0,4 at.

6.2. Điều kiện lên men

Trong iu kiện ni cấy chìm vμ khuấy trộn có cấp khí, giống xạ khuẩn
Str. rimosus phát triển chậm hơn so với Str. aureofacience. Tuy nhiên tốc độ
sử dụng chất béo ở Str. rimosus nhanh hơn ở Str. aureofacience, do đó q
trình lên men tạo oxytetracyclin cần nhiều dầu phá bọt hơn đối với lên men
tạo tetracyclin vμ clotetracyclin. Tiến hμnh lên men ở 28OC, cấp khí với lu

lợng 1VVM. Thời gian lên men từ 120 giờ – 144 giê.

Quá trình lên men oxytetracyclin xảy ra theo 2 pha: trong 60 giờ đầu xạ
khuẩn phát triển rất mạnh. Từ giờ thứ 60 trở đi bắt đầu pha thứ 2. Khuẩn ty
đứt ra lại nảy mầm tạo thμnh hệ khuẩn ty thứ cấp mảnh hơn. Đây lμ pha sinh
tổng hợp ra kháng sinh. Trong q trình nμy cần theo dõi chặt chẽ các thơng

số nh− pH, tốc độ tạo bọt, nồng độ đ−ờng… b sung kp thi.

6.3. Phơng pháp chiết xuÊt kh¸ng sinh

Để chiết xuất oxytetracyclin tốt nhất lμ dùng ph−ơng pháp kết tủa. Tuy
nhiên ở đây giới thiệu quy trình chiết oxytetracyclin bằng ph−ơng pháp trao
đổi ion. Quy trình chiết bao gồm các b−ớc sau:

Tạo dịch lọc chứa kháng sinh:

Dch lờn men đ−ợc hạ nhiệt độ xuống 15OC. Thêm K

4Fe(CN)6 10% (kho¶ng

3 lít/m3) để loại sắt. Thêm acid oxalic (khoảng 5 kg/m3) vμ khuấy đến pH = 1,9 –

2,0 để loại ion Ca++. Thêm dần Na

2CO3 vμ khuấy cho đến khi đạt pH = 3,0 - 3,2

</div>
(136)<div class='page_container' data-page=136>

g/l; Fe++ không có). Dịch đợc đem lọc bằng lọc trèng quay hay Ðp khung b¶n.

Dịch lọc tinh khiết đem hấp phụ trên cột chứa nhựa trao đổi ion.
Hp ph trờn nha:

Dịch chứa kháng sinh đợc lm lạnh xuống 7 8OC. Bơm qua lọc chứa

bụng thuỷ tinh để loại protein vμ các tạp khác. Dịch lọc trong suốt đ−ợc bơm
qua cột trao đổi ion (cột đ−ợc coi lμ bão hoμ kháng sinh khi dịch đi qua lọc còn
chứa ≤ 200 đơn vị/ml. Rửa cột bằng n−ớc cất.

Trong dung dÞch acid xt hiƯn cation tetracyclin cã thĨ thay thÕ c¸c
cation hydro cđa phân tử nhựa.

R SO3-H+ + TC

NH+(CH3)2

OH R SO3

-TC

NH+(CH3)2
OH

+ H+

Phản hÊp phơ:

Dùng dung dịch đệm borat amoni có pH = 9,6 – 10. Th−ờng dùng dung
dịch NH4OH 0,3N rồi thêm acid boric để đạt nồng độ NH4OH 0,25N. Tc

phản hấp phụ khoảng 600 l/giờ. Kháng sinh chuyển vo dung dịch dới dạng
anion

R SO3- + TC

NH+(CH3)2

O
-TC

NH+(CH3)2

+ 2NH4OH RSO3-NH4+ +NH4+ + 2H2O

Để phản hấp phụ oxytetracyclin cần l−ợng amoniac sao cho không chỉ
thay thế các cation kháng sinh trên nhựa mμ còn đủ để hoμ tan oxytetracyclin
đ−ợc đẩy ra. Phân đoạn đầu vμ cuối để riêng để hấp phụ lại; phân đoạn giữa
đem kết tinh.

KÕt tinh Oxytetracyclin base:

Trong nồi phản ứng có máy khuấy, dịch phản hấp phụ đ−ợc acid hoá
bằng HCl đến pH = 5 – 5,5. Để kết tinh 2 giờ ở 10OC. Ly tâm lấy tinh thể.

Tinh chÕ:

Hoμ tan oxytetracyclin base trong HCl 0,1N. Tẩy mμu bằng than hoạt.
Lọc loại than đ−ợc dịch lọc chứa oxytetracyclin từ 30 – 40 g/l. Dùng dung dịch
NH4OH 10N chỉnh dịch lọc đến pH 3,8 – 4 để kết tinh ở 10OC trong 2 giờ. Sau

đó ly tâm lấy tinh thể. Sấy chân khơng ở nhiệt độ ≤ 60OC hoặc sấy tầng sôi.

Thμnh phẩm đạt khoảng 900 UI/mg.
Hoμn nguyên nhựa:

</div>
(137)<div class='page_container' data-page=137>

NH

4

OH

RSO

Na

NaOH

R SO

3-

NH

4+

NaCl

RSO

Na

HCl

R SO

3-

NH

4+

Cho dung dịch NaOH 3N chảy qua cột với tốc độ 300 l/giờ. Rửa cột bằng
n−ớc đã loại ion đến khi dịch chảy ra có pH = 8 – 9,0. Sau đó cho dung dịch
HCl 1N chảy qua cột với tốc độ 400 l/giờ đến khi pH của dịch chảy ra đạt
2 – 2,5 lμ đ−ợc.

tinh chÕ

läc, ly t©m

pH = 2,5 - 3,0
to = 15oC

lọc
acid hóa
dịch lên men

loại tạp

acid oxalic
K4FeCN6

phản hÊp phơ

§Ưm borat amoni
pH = 9,6 -10,0

hÊp phơ

Nhùa sulfocationit
to = 8oC

kÕt tinh

dd HCl
pH = 5,0 - 5,5

s¶n phÈm

</div>
(138)<div class='page_container' data-page=138>

7. Sản xuất một số Tetracyclin bán tổng hỵp

Do các nh−ợc điểm về độc tính của các tetracyclin tự nhiên nh− đã trình
bμy ở trên, ng−ời ta đã tìm cách tạo ra các kháng sinh mới của nhóm nμy. Xu
h−ớng tạo các tetracyclin tự nhiên mới bằng cách thay đổi các tiền chất hoặc
định h−ớng sinh tổng hợp (VD: tạo bromtetracyclin bằng cách cung cấp ion
brom thay cho clo; hoặc tạo các 6-demetyl của tetracyclin, clotetracyclin hay
oxytetracyclin bằng cách thêm vμo mơi tr−ờng các chất ức chế q trình metyl
hố nh− dẫn suất sulfonamit…) ch−a đem lại kết quả khả quan. Hiện nay các
kháng sinh tự nhiên của nhóm Tetracyclin chủ yếu chỉ đ−ợc dùng trong ngμnh
chăn nuôi, một phần trở thμnh nguyên liệu trung gian bán tổng hợp ra các
tetracyclin mới. Có khoảng trên 3.000 chất kháng sinh bán tổng hợp nhóm
tetracyclin đã đ−ợc cơng bố, tuy nhiên chỉ một số ít trong chúng đ−ợc sử dụng
trong điều trị vì tác dụng phụ (nhất lμ đối với trẻ em). Nhóm các tetracyclin
bán tổng hợp đ−ợc chia thμnh 2 loại:

7.1. C¸c kh¸ng sinh lμ dÉn xuÊt amid

Tõ tetracyclin ng−êi ta cho phản ứng với formaldehyd v một amid tơng
ứng thì sẽ tạo nên một kháng sinh mới nh rolitetracyclin (1958), limecyclin
hoặc mepicyclin. Các kháng sinh ny có tính tan trong nớc tốt hơn.

OH O O

CH3

CH3
H3C
HO
OH
NH2
O
N
H

OH O O

CH3

HO
N

CH3
H3C

HO
OH
NH
O
N
Tetracyclin Rolitetracyclin

CH2OH

Phản ứng tạo Rolitetracyclin

7.2. Các kháng sinh đợc thay thế các nhóm chức ở vị trí số 6 v 7 
Đại diện tiêu biểu của nhóm ny l 3 kháng sinh: methacyclin (1960),
Doxycyclin (1962) vμ minocyclin (1967).

Methacyclin đ−ợc bán tổng hợp từ 6-deoxy-oxytetracyclin theo sơ đồ sau:

6-deoxy-oxytetracyclin

OH O O

HO
N

CH3
H3C

CONH2

CH3 OH

6 6

OH O O

HO
N

CH3
H3C

CONH2
OH

CH2

</div>
(139)<div class='page_container' data-page=139>

Doxycyclin đ−ợc bán tổng hợp từ methacyclin theo sơ đồ:

Methacyclin

OH O O

HO
N

CH3
H3C

CONH2
OH

CH2

6 6

OH O O

HO
N

CH3
H3C

CONH2
OH

CH3

Doxycyclin

Minocyclin đợc bán tổng hợp từ 6-demethyl-tetracyclin:

6-demethyl-tetracyclin

OH O O

HO
N

CH3

H3C

OH
OH

CONH2

6 6

OH O O

HO
N

CH3

H3C

CONH2

Minocyclin

N
CH3
H3C

−u điểm của các kháng sinh nμy lμ liều dùng thấp hơn nên ít độc hơn vμ
có tác dụng kéo dμi. Trong số nμy doxycyclin đ−ợc sử dụng phổ biến hơn cả
d−ới dạng monohydrat hay hyclat.

Doxycyclin monohydrat

.

HCl

1/2

OH O OH O

CONH2

H2O

.

7
8
9
10
5
11 12
4
1
6
3
2
CH3
H
OH
H

N(CH3)2

C2H5OH
1/2

OH O OH O

CONH2

H2O

.

7
8
9
10
5
11 12
4
1
6
3
2
CH3
H
OH
H

N(CH3)2

</div>
(140)<div class='page_container' data-page=140>

Tù l−ỵng giá

1. Chủng xạ khuẩn Str. aureofacience trong điều kiện no thì tạo ra sản
phẩm clotetracyclin, điều kiện no thì tạo ra tetracyclin?

2. Tại sao trong chiết xuất kháng sinh nhóm tetracyclin phải loại tạp

Ca++, Mg++, Fe++?

</div>
(141)<div class='page_container' data-page=141>

Ch

ơng 10

sản xuất kháng sinh nhóm aminoglycosid

Mục tiêu

Sau khi học xong chơng ny, sinh viên phải trình by đợc:

1. Nguồn gốc các kháng sinh tự nhiên v bán tổng hợp nhóm 
aminoglycosid.

2. Nguyên tắc chung trong tìm kiếm v sản xuất kháng sinh nhóm 
aminoglycosid.

1. Đại cơng chung về các aminoglycosid 
1.1. Đại cơng, phân loại

Các kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid chiÕm vÞ trÝ quan träng thø 2
sau nhãm beta-lactam trong điều trị các bệnh nhiễm trùng. Đây l các kháng
sinh có tác dụng chủ yếu trên các vi khuÈn hiÕu khÝ, vi khuÈn Gram (-) nh−
Pseudomonas, Enterobacter…

B¶ng 10.1. Một số kháng sinh tiêu biểu nhóm aminoglycosid

Tên KS Năm Chủng xạ khuẩn Thế 
hệ

Đờng dùng

Streptomycin 1944 Str. griseus I Tiêm

Dihydrostrep bán TH từ streptomycin I Tiêm

Neomycin 1949 Str. fradiae I Ngoµi da, uèng

Kanamycin 1957 Str. kanamyceticus I Tiªm, uèng

Paronomycin 1959 Str. rimosus I Tiªm

Gentamicin 1963 M. purpurea II Tiªm, mắt

Sisomicin 1970 Micromonospora inyoensis II Tiêm

Netilmicin 1975 bán tổng hợp từ sisomicin II Tiêm

Tobramycin 1975 Str. tenebrarius II Tiêm, mắt

</div>
(142)<div class='page_container' data-page=142>

Các aminoglycosid phổ biến đ−ợc phân lập từ các chủng xạ khuẩn
Streptomyces hoặc Micromonospora, ngoμi ra có một số chủng Bacillus cũng có
khả năng sinh kháng sinh nhóm nμy. Các aminoglycosid đ−ợc phân lập từ
chủng xạ khuẩn Streptomyces có tên gọi kết thúc bằng -mycin, cịn những
kháng sinh đ−ợc phân lập từ chủng xạ khuẩn Micromonospora có tên gọi kết
thúc bằng -micin. Số l−ợng các aminoglycosid tự nhiên lên tới hơn 150 chất
kháng sinh. Những kháng sinh quan trọng của nhóm nμy phải kể đến:
amikacin, gentamicin, kanamycin, neomycin, streptomycin... Các
aminoglycosid có thể chia thμnh 2 thế hệ dựa trên độc tính vμ phổ kháng
khuẩn (bảng 10.1).

Các kháng sinh thế hệ I của nhóm aminoglycosid ngμy nay ít đ−ợc sử
dụng do độc tính vμ phổ kháng khuẩn kém hơn các kháng sinh thế hệ II bao
gồm các kháng sinh sinh tổng hợp vμ bán tổng hợp nh− gentamicin,
tobramycin, amikacin, netilmicin… trong đó gentamicin đ−ợc sử dụng phổ
biến hơn cả.

1.2. CÊu tróc ho¸ häc c¸c aminoglycosid

Bảng 10.2. Các aminocyclitol của kháng sinh

Aminocyclitol 
Tên nhóm Cấu trúc

Kháng sinh tiêu biểu

Streptidin

HO
HO

NH C NH2

NH
NH
C
NH2
NH
Streptomycin

Dihydrostreptomycin
Bluesin
HO
HO
OH

NH C NH2

</div>
(143)<div class='page_container' data-page=143>

Actinamin

HO
OH

-NHCH3

H3CHN O

-Spectinomycin
Kasugamicin
Validomycin
Hygromycin
Destomycin

Phần lớn các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh nhóm
aminoglycosid trong q trình sinh tổng hợp có khả năng tạo ra đồng thời
nhiều chất có cấu trúc rất gần nhau nh− chủng Str. fradiae sinh tổng hợp

đồng thời neomycin A, B vμ C; chủng Micromonospora purpurea sinh tổng hợp
đồng thời các gentamicin C1, C1a vμ C2…

Về cấu trúc các aminoglycosid lμ một họ gồm rất nhiều chất kháng sinh
khác nhau có cấu trúc phân tử gồm 2 thμnh phần chính lμ các nhóm amin liên
kết với gốc glycosid. Theo đặc điểm cấu trúc hố học có thể phân loại các
aminoglycosid dựa theo nhóm aminocyclitol của chúng:

Nhóm kháng sinh chứa 2-deoxystreptamin cịn đ−ợc chia thμnh 2 phân
nhóm nhỏ với các phân tử đ−ờng đ−ợc gắn ở vị trí số 4 vμ 5 (đại diện lμ
neo-mycin) vμ các phân tử đ−ờng đ−ợc gắn ở vị trí số 4 vμ 6 (đại diện lμ
kanamycin, gentamicin).

Nhóm chứa actinamin cịn có tên gọi lμ nhóm chứa các acid amin khác
nhau: gồm spectinomycin, kasugamicin, validomycin, hygromycin,
desto-mycin. Trong số nμy chỉ có spectinomycin đ−ợc sử dụng trong y học, các kháng
sinh còn lại chủ yếu sử dụng trong nông nghiệp vμ chăn nuôi để trị bệnh cho
cây trồng vμ gia súc.

1.3. Tính chất hoá học chung v cơ chế tác dông

Phần lớn aminoglycosid dễ tan trong n−ớc, phổ kháng khuẩn rộng, bền
với nhiệt vμ pH. Hầu hết kháng sinh nhóm nμy đ−ợc sử dụng chủ yếu ở dạng
tiêm hoặc thuốc dùng tại chỗ, rất hãn hữu có dạng uống. Chỉ riêng neomycin
đ−ợc dùng đ−ờng uống trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn não vμ gan vì độc tính
cao. Hai phản ứng có hại chủ yếu của các kháng sinh aminoglycosid lμ độc cho
cơ quan thính giác vμ thận không hồi phục khi dùng kéo dμi (nhất lμ
streptomycin vμ neomycin), chủ yếu lμ ở ốc tai (neomycin) v tin ỡnh
(streptomycin).

Cơ chế tác dụng của các aminoglycosid l gắn kết vững chắc với một
trong hai vị trí gắn aminoglycosid trên tiểu phân 30S của ribosom, kết quả l
thuốc ức chế tổng hợp protein của vi khuÈn.

</div>
(144)<div class='page_container' data-page=144>

thích hợp với các n−ớc kinh tế còn nghèo. Ngμy nay các kháng sinh nhóm
aminoglycosid đ−ợc coi lμ các chất kháng sinh dự trữ, chỉ đ−ợc sử dụng chủ
yếu khi các kháng sinh khác không mang lại hiệu quả. Một số kháng sinh
nhóm nμy đ−ợc sử dụng trong nơng nghiệp nh− ở Nhật sử dụng kasugamicin
để trị bệnh vμng lụi cho lúa do chủng Piricularia oryzae gây ra; các kháng
sinh khác đ−ợc sử dụng chữa bệnh cho gia súc nh− hygromycin đ−ợc sinh tổng
hợp từ chủng S. hygroscopios, destomycin đ−ợc sinh tổng hợp từ chủng
S. rimofaciens, validomycin đ−ợc sinh tổng hợp từ chủng S. hygroscopicus…
1.4. Cơ chế sinh tổng hợp

HO
NH
C
NH2
NH2
C
NH2
OH
OH
OH
HN
NH
O
H3C

OH
CH2OH

OdTDP

O
OH

OH
CH2OH

NH2
NH
HN
OH
OH OH
NH2
C
NH2
NH2
C
NH
O
O
CH2OH
OH
H3C

OH
CH2OH

NH2
ONuDP
O
NH
HN
OH
OH OH
NH2
C
NH2
NH2
C
NH
O
O
CHO
OH
H3C

O
OH

CH2OH

CH3NH

Demetyldihydro--streptomycin
Streptomycin
(a)
(b)
(c)

Hình 10.1. Cơ chế sinh tổng hợp streptomycin từ streptidin đã đ−ợc phosphoryl hoá (a),
dTDP-L-dihydrostreptose (b) và N-metyl-glucosamin (c)

</div>
(145)<div class='page_container' data-page=145>

Do cấu trúc hết sức đa dạng vμ khác nhau, trong q trình sinh tổng hợp
các nhóm chất aminoglycosid sẽ trải qua các mắt xích trung gian vμ cần các tác
nhân cảm ứng hay kiềm chế khác nhau. ở Str. Griseus,
dihydrostreptomycin-6-phosphat vμ streptomycin đ−ợc hình thμnh ở giai đoạn cuối nhờ phản ứng kết
hợp giữa 3 cấu tử: streptidin đã đ−ợc phosphoryl hoá, dTDP-L-dihydrostreptose
vμ N-metyl-glucozamin (hình 10.1). Từ nguồn cơ chất glucose, bằng cách sử
dụng các biến chủng vμ áp dụng các chế độ công nghệ t−ơng ứng khác nhau
ng−ời ta đã lên men đ−ợc hμng loạt các aminoglycosid khác nhau.

1.5. Quá trình tách chiết sản phẩm

Cỏc khỏng sinh nhóm aminoglycosid đều lμ những chất có tính base yếu,
t−ơng đối bền với nhiệt, với pH, tuy nhiên trong môi tr−ờng lên men th−ờng
tồn tại đồng thời một họ gồm nhiều kháng sinh có cấu trúc gần giống nhau với
hoạt tính kháng sinh khác nhau. Do đó trong công nghiệp ng−ời ta th−ờng lựa
chọn ph−ơng pháp sắc ký bằng nhựa trao đổi ion để tách vμ tinh chế sản

phẩm. Trong các công đoạn tách đầu tiên ng−ời ta th−ờng sử dụng cationit,
sau đó tuỳ thuộc vμo loại aminoglycosid cần tách mμ ng−ời ta chọn các loại
nhựa khác nhau. Các chất mang th−ờng đ−ợc lựa chọn lμ
carboxymethylcellulose (CMC), CM-sepharose, sephadex, phospho-cellulose,
sulfoethylcellulose… Một số cationit bán trên thị tr−ờng hay đ−ợc sử dụng lμ
Amberlit IR-120, Amberlit IRC-50, Diaion SK-1B, Diaion PK-204, Dowex 44,
Dowex 50W X2, Duolite C-3, Duolite ES-26…

2. Sinh tỉng hỵp Streptomycin 
2.1. Đại cơng

Streptomycin c bit cú tỏc dụng trên trực
khuẩn lao (Mycobacterium tubeculosis) vμ đ−ợc phát
hiện lần đầu tiên vμo tháng 4 năm 1944 do Waksman
S. A vμ cộng sự chiết đ−ợc từ môi tr−ờng nuôi cấy
Streptomyces griseus. Đây lμ một mốc quan trọng
trong lịch sử y học vì đó lμ chất kháng sinh đầu tiên
có khả năng khống chế đ−ợc bệnh lao.

Mặc dù có nh−ợc điểm lμ độc tính cao trên cơ
quan thính giác nếu dùng lâu, song streptomycin vẫn
lμ kháng sinh đ−ợc sử dụng để điều trị lao kết hợp
với một số thuốc khác có hiệu quả. Hiện nay ở các
n−ớc phát triển streptomycin đã đ−ợc thay thế bằng

một số kháng sinh bán tổng hợp khác vì một mặt streptomycin gây tổn th−ơng
cho cơ quan thính giác, mặt khác ngμy cμng có nhiều vi khuẩn có khả năng
kháng lại streptomycin. Một số chủng xạ khuẩn đ−ợc sử dụng để sinh tổng
hợp streptomycin lμ: Str. reticuli, Str. bikiniensis, Str. raneus, Str. humidus,

</div>
(146)<div class='page_container' data-page=146>

Str. griseocarneus. Tuy nhiên trong công nghiệp chủ yếu ngời ta sư dơng mét
sè biÕn chđng Str. griseus cã khả năng kháng actinophage cao.

2.2. Cấu trúc hoá häc vμ tÝnh chÊt

Cơng thức hố học của streptomycin đ−ợc xác định từ những năm 1946 –
1948. Phân tử streptomycin bao gồm 3 phần chính đ−ợc liên kết với nhau bằng
dây nối glycosid:

1- Streptidin lµ dÉn chÊt diguanidin cña meso - inosid

2- Streptose là loại đờng L có chứa nhóm aldehyd ở C3

3- Metyl glucosamin là đờng loại L có chứa nhóm metylamin ở C2.

Hai phần sau liên kết với nhau bằng dây nối glycosid tạo ra phân tử gồm hai loại
đờng đợc gọi là streptobiosamin.

Streptomycin ch cú hot tính khi phân tử cịn ngun vẹn. Nếu cắt bỏ
phần nμo trong phân tử đều lμm kháng sinh mất tác dụng. Tuy nhiên nếu khử
nhóm aldehyd (bằng H2/Pd) thμnh nhóm alcol tạo ra dihydrostreptomycin lại
có tác dụng mạnh trên trực khuẩn lao nên dihydrostreptomycin đ−ợc sử dụng
điều trị lao. Tuy nhiên sau nμy ng−ời ta nhận thấy dihydrostreptomycin tuy ít
độc hơn streptomycin nh−ng lại dễ gây điếc hơn nên hiện nay không sử dụng
nữa.

Streptomycin lμ bột trắng, không mùi, vị đắng, hút ẩm mạnh. Dễ tan
trong n−ớc do có nhiều nhóm hydroxyl vμ amin, ít tan trong etanol, khơng tan
trong ete vμ cloroform. Đ−ợc sử dụng nhiều hơn cả lμ dạng muối sulfat. Dạng
muối nμy bền trong khơng khí vμ ánh sáng.

Streptomycin không hấp thu qua đ−ờng ruột nên dùng để tiêm bắp. Có
tác dụng diệt khuẩn bằng cách ngăn cản quá trình tổng hợp protein của vi

(2)

</div>
(147)<div class='page_container' data-page=147>

khn. Phỉ kh¸ng khn cđa streptomycin gåm c¸c vi khuÈn Gram (-) hiÕu
khÝ vμ một số vi khuẩn Gram (+), streptomycin không có tác dụng trên các vi
khuẩn kỵ khí.

2.3. Quy trình lên men sinh tổng hợp

2.3.1. Chủng giống

Trong sản xuất công nghiệp ngời ta sử dụng các biến chñng cña
Streptomyces griseus nh− ATCC11429.

Xạ khuẩn S. griseus lμ vi sinh vật hiếu khí mạnh nên quá trình ni cấy
cần lắc hoặc khuấy trộn kèm theo sục khí. Nhiệt độ ni cấy thích hợp từ
26 – 28OC. pH tối −u cho sự phát triển lμ 6,8 – 7,2. Thời gian lên men khoảng

96 – 120 giê – 144 giê.
2.3.2. §iỊu kiƯn lªn men

Nguồn carbon: Nguồn hydratcarbon Str. griseus đồng hố đ−ợc lμ tinh
bột, dextrin, maltose, fructose… Chủ yếu sử dụng tinh bột vμ glucose vì cả 3
thμnh phần cấu tạo của Streptomycin đều có nguồn gốc từ glucose. Tuy nhiên
ngoμi streptomycin trong mơi tr−ờng lên men cịn tạo thμnh
manosidostreptomycin (hay cịn gọi lμ streptomycin B) có hoạt tính kháng sinh
yếu. Khi mơi tr−ờng chứa q nhiều glucose thì sẽ tạo thμnh một hỗn hợp

khơng mong muốn của cả 2 loại streptomycin. Nguồn carbon vừa giúp cho vi
sinh vật phát triển, cung cấp năng l−ợng cho vi sinh vật, đồng thời tham gia
trực tiếp vμo phân tử kháng sinh streptomycin.

Nguån nit¬: Nguồn nitơ vô cơ thích hợp l các muối amoni v không thích
hợp với các muối nitrat.

Str. griseus cịn có khả năng sinh tr−ởng vμ tạo kháng sinh streptomycin
trên môi tr−ờng chứa protein nh− bột đậu t−ơng, bột cá, men khơ, gluten bột
mì vì loμi xạ khuẩn nμy có hệ protease mạnh nên có khả năng phân huỷ các
protein thμnh các acid amin vμ sử dụng các acid amin nμy trong quá trình
trao đổi chất.

Nguồn phospho: Cần phospho vô cơ hoμ tan có trong KH2PO4 để cho

giống sinh tr−ởng vμ phát triển bình th−ờng. Thiếu phospho hoμ tan thì sinh
tr−ởng của khuẩn ty yếu do sự đồng hoá carbon vμ nitơ bị chậm vμ hoạt lực
kháng sinh thấp. Tuy nhiên thừa phospho sẽ tăng nhanh tốc độ sử dụng
hydratcarbon lμm cho quá trình tạo bμo tử rút ngắn, do đó ức chế sự tổng hợp
streptomycin.

</div>
(148)<div class='page_container' data-page=148>

CaCO3: Trong mơi tr−ờng ni cấy cần có CaCO3 với mục đích lμm ổn

định pH.

Nguồn kim loại vi l−ợng: Chủng xạ khuẩn sinh streptomycin cũng cần
một số kim loại nh− Mg, Mn, Fe, Cu… vμ th−ờng đ−ợc bổ sung d−ới dạng muối
sulfat. Nếu môi tr−ờng có cao ngơ, bột đậu, bột lạc… thì khơng cần bổ sung vì
bản thân các loại nguyên liệu nμy đã sẵn có các muối kim loại.

Q trình lên men kéo dμi khoảng 120 - 144 giờ, nhiệt độ thích hợp 26 -
28OC, pH mơi tr−ờng 6,8 - 7,2. Cấp khí với l−u l−ợng 1 VVM. ở pha phát triển

thứ nhất, chủng xạ khuẩn nμy sinh tr−ởng mạnh sau 6 - 8 giờ. Các bμo tử nảy
chồi, mỗi bμo tử nảy 1 chồi tạo thμnh hệ sợi. Khuẩn ty thẳng vμ phân nhánh
yếu, tế bμo chất −a kiềm. B−ớc sang pha lên men thứ hai q trình phát triển
chậm lại hệ sợi khơng phát triển nữa mμ b−ớc vμo giai đoạn tự phân ở ngμy
thứ 3 (khoảng 72 giờ). Chủng Str. griseus rất nhạy cảm với phage, do đó q
trình lên men cần giữ vô khuẩn rất chặt chẽ vμ cần kiểm tra độ vô trùng
4 giờ/lần.

Trong điều kiện tối −u hiệu suất sinh tổng hợp tạo streptomycin của xạ
khuẩn Str. griseus đạt tới 20.000 – 25.000 đv/ml môi tr−ờng.

Các môi trờng sinh tổng hợp có thnh phần nh sau:
Môi trờng giữ giống (%)

Glucose 2,0

Pepton 0,5

Cao thÞt 0,5

NaCl 0,5

Agar – agar 2,0

pH 6,8 – 7,2

Khö trïng 115OC trong 20 phót.

Nhiệt độ ni cấy 28OC

Thêi gian nu«i cÊy 5 7 ngy.
Môi trờng nhân giống (%)
Glucose 4,0

Bét ®Ëu 3,0
(NH4)2SO4 0,6

NaCl 0,3

CaCO3 0,6

</div>
(149)<div class='page_container' data-page=149>

Dầu phá bọt 0,5
pH 6,8 – 7,2

Khö trïng bằng hơi nóng ở 120OC trong 60 phút. Khi môi tr−êng h¹

nhiệt độ xuống 28 - 30OC thì cấy giống vμo với tỷ lệ 0,5 lít/600 lít mơi tr−ờng.

Giống đ−ợc ni trong vịng 40 – 48 giờ ở nhiệt độ 28OC. Cấp khí vơ trùng với

l−u l−ợng 1 VVM. Máy khuấy với tốc độ 110 vòng/phút. Phá bọt tự động bằng
dầu lạc đã khử trùng.

Gièng đợc truyền sang nồi nhân giống cấp 2 v đợc nuôi dỡng trong
điều kiện nh trên trong thời gian 36 40 giờ.

Môi trờng lên men tạo streptomycin (%)

Glucose 4,0

Bét ®Ëu 3,0
(NH4)2SO4 0,6

NaCl 0,25

CaCO3 0,6

KH2PO4 0,01
Dầu phá bọt 0,2

pH 6,8 – 7,2

Môi tr−ờng đ−ợc chuẩn bị trong nồi pha chế, sau đó bơm qua cột khử
trùng liên tục ở 134OC. Khi môi tr−ờng hạ nhiệt độ xuống 28 – 30OC thì truyền

gièng tõ nåi đ sang b»ng khÝ nÐn v« trïng.

Tiến hμnh lên men kháng sinh trong điều kiện nhiệt độ 28OC trong thời

gian 120 – 144 giờ. Cấp khí vơ trùng với l−u l−ợng 0,5 – 1VVM. Máy khuấy với
tốc độ 110 vòng/phút. Phá bọt tự động bằng dầu lạc đã khử trùng. Cứ 4 giờ lấy
mẫu phân tích 1 lần để kiểm tra độ vơ trùng, có nhiễm phage hay khơng? Có
cần bổ sung thμnh phần gì vμo mơi tr−ờng ni cấy hay khơng? Cần kiểm sốt
chặt chẽ hμm l−ợng glucose trong môi tr−ờng lên men để thu đ−ợc chủ yếu
streptomycin A.

Hiện nay ng−ời ta vẫn ch−a xác định đ−ợc tiền chất trong quá trình sinh
tổng hp streptomycin.

2.4. Quy trình chiết xuất kháng sinh Streptomycin

Streptomycin lμ chất kháng sinh có tính base yếu nên có thể sử dụng
cacboxycationit dạng Na+ để tách chiết sản phẩm. Q trình hấp phụ của

Streptomycin trªn cationit có thể biểu diễn bằng phơng trình:
3R – COO–Na+ + (Str)3+ R

</div>
(150)<div class='page_container' data-page=150>

Dịch lên men đ−ợc xử lý tr−ớc khi tách chiết kháng sinh bằng cách acid
hoá bằng dung dịch H2SO4 30% đến pH 2,5 - 3,0. Khuấy nhẹ để cho quá trình
kết tủa tốt hơn. Lọc trên lọc ép khung bản, hay lọc trống quay loại sinh khối.
Khuẩn ty Str. griseus rất mảnh nên quá trình lọc cần cho chất trợ lọc.

Khả năng hấp phụ của streptomycin phụ thuộc vμo l−ợng tạp chất có
trong dịch lên men, đặc biệt lμ các cation Mg++, Ca++ vì vậy phải loại các ion đó

tr−ớc khi hấp phụ kháng sinh bằng cách thêm oxalat natri vμo dịch lọc. Khuấy
30 phút. Lọc loại tủa. Dịch lọc bơm vμo thiết bị chứa vμ hạ nhiệt độ đến 8°C.
Thêm 1% formalin để bảo quản. Trung tính bằng NaOH đến pH = 7,0 - 7,5.
Dịch đã tinh chế lọc qua bông thuỷ tinh rồi đem hấp phụ trên cột.

Dịch lọc chứa kháng sinh cho hấp phụ trên cột với tốc độ 800 lít/giờ.
Thời gian bão hoμ cột khoảng 24 giờ. Khi nμo dịch chảy qua cịn khoảng 100
đv/ml thì ngừng. Rửa cột bằng n−ớc mềm để loại tạp chất hữu cơ vμ sắc tố.
Hiệu suất giai đoạn hấp phụ đạt 95%. Phản hấp phụ streptomycin bằng
H2SO4 5%, quá trình phản hấp phụ đ−ợc biểu diễn bằng ph−ơng trình:

R3(Strep) + 3H+ 3RCOOH + (Strep)3+

T¶y màu
Loại muối (cationit)
Trung hoà (anionit)
cô chân không

anionit
95.000UI/ml

60.000UI/ml; pH = 2,0

+ Na 2 CO 3
500UI/ml, pH = 2,0

5.000UI/ml

<50UI/ml
H 2 SO 4 5%

cacboxycationit
Lo¹i Ca, Mg
trung hoà
Loại protein
Lọc
Làm lạnh
pH 2,5 - 3
Lọc

streptomycin

P/đoạn 1

P/đoạn 5
P/đoạn 2

P/đoạn 4

tinh chế

P/đoạn 3
phản hấp phụ

hấp phụ

sinh khối

Dịch lọc
dịch lªn men

</div>
(151)<div class='page_container' data-page=151>

Phân loại dịch phản hấp phụ ra các phân đoạn vμ có chế độ xử lý khác
nhau tuỳ theo hμm l−ợng kháng sinh trong các phân đoạn đó:

Phân đoạn 1: Cho chảy vμo ống thoát đến khi khi hoạt tính đạt 50 đv/ml.
Phân đoạn 2: Có hoạt tính thấp, từ 50 - 20.000 đv/ml. Hoạt tính trung
bình 5000đv/ml vμ có pH 3,5. Đem hấp phụ trở li thu hi.

Phân đoạn 3: Có hoạt tính cao từ 20.000 đv/ml trở lên. Trung bình l
95.000 đv/ml vμ pH = 6,5. Tinh chÕ tiÕp b»ng than ho¹t.

Phân đoạn 4: Phần có hoạt tính cao v pH = 2,0. Hoạt tính trung bình
60.000 đv/ml đợc trung tính hoá bằng anionit dạng OH.

Phõn on 5: Hot tính thấp vμo khoảng 500đv/ml vμ pH = 2,0. Trung
hoμ bằng Na2CO3 rồi hấp phụ lại để thu hồi.

Phân đoạn 3, 4 đ−ợc tẩy mμu bằng than hoạt với l−ợng 2,5 - 3% (tính
theo trọng l−ợng kháng sinh). Lọc loại than. Rửa than bằng n−ớc mềm để lấy
hết kháng sinh. Hiệu suất 96% (tính từ dịch đem tẩy mμu). Dịch kháng sinh
đã tẩy mμu cho chảy qua cột trao đổi ion để loại muối. Ph−ơng trình loại muối
nh− sau:

R - SO3H + Na+ R – SO
3Na

+ + H+

Do xuÊt hiÖn ion H+ nên dung dịch kháng sinh có pH acid. Dịch lại đợc

trung tính hoá bằng cột anionit.

2R - NH4OH + SO42- (RNH

3)2SO4 + H
+

Dung dịch streptomycin đã loại muối vμ trung tính hố đ−ợc bốc hơi
trong chân không ở 740 - 750 mmHg đến đậm độ 170.000 - 210.000 đv/ml, sau
đó phun sấy để thu bột streptomycin. Đóng gói trong điều kiện tuyệt đối
vụ trựng.

3. Sinh tổng hợp Gentamicin

3.1. Đại cơng

Gentamicin đ−ợc phát hiện lần đầu vμo năm 1963 trong môi tr−ờng nuôi
cấy chủng xạ khuẩn Micromonospora purpurea. Cùng với tobramycin (1975)
vμ amikacin (1976), gentamicin có thể đ−ợc coi nh− kháng sinh thế hệ 2 của
nhóm aminoglycosid. Gentamicin đ−ợc sử dụng rộng rãi nhất trong số các
aminoglycosid vì có phổ kháng khuẩn rộng vμ đặc biệt có tác dụng trên các vi
khuẩn Gram (-).

3.2. CÊu tróc ho¸ häc vμ tÝnh chÊt

</div>
(152)<div class='page_container' data-page=152>

ngoi ra còn một phần rất nhỏ gentamicin C2a v gentamicin C2b. C¸c chÊt nμy

đều lμ dẫn chất của DOS (2-deoxystreptamin).

Gentamicin có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram (+) vμ Gram (-). Phỉ diƯt
khn chđ u trên các vi khuẩn hiếu khí Gram (-) v các tụ cầu khuẩn, kể cả
các chủng tạo ra penicillinase vμ kh¸ng methicillin.

Gentamicin khơng hấp thu qua đ−ờng tiêu hoá, đ−ợc sử dụng dạng tiêm
tĩnh mạch hoặc tiêm bắp (th−ờng bμo chế dạng dung dịch tiêm chứa 2;
10 mg/ml vμ 40; 80; 160 mg/2 ml). Gentamicin th−ờng đ−ợc dùng phối hợp với
các kháng sinh khác (β-lactam) hoặc cùng với các chất diệt khuẩn khác để mở
rộng phổ tác dụng vμ tăng hiệu lực

B¶ng 10.3. Cấu trúc hoá học của gentamicin theo Dợc điển Anh BP 2003

Tên 
gentamicin

Thành phần 
%

Công thức 
cÊu t¹o

R1 R2 R3

C1 20 - 35 C21H43N5O7 CH3 NH2CH3 H

C1a 10 - 30 C19H39N5O7 H NH2 H

C2 C20H41N5O7 CH3 NH2 H

C2a C20H41N5O7 H NH2 CH3

C2b

40 - 60

C20H41N5O7 CH3 NH2 H

3.3. Quy trình lên men sinh tổng hợp

3.3.1. Chđng gièng

Gentamicin do mét sè chđng x¹ khn thc chi Micromonospora t¹o ra.
Trong thùc tÕ chđng M. purpurea var. nigrecens vμ M. echinospora lμ nh÷ng
chđng quan trọng nhất đợc ứng dụng vo sản xuất công nghiƯp.

</div>
(153)<div class='page_container' data-page=153>

Micromonospora hầu nh− chỉ có khuẩn ty cơ chất phân nhánh, khơng hình
thμnh khuẩn ty khí sinh. Đ−ờng kính khuẩn ty từ 0,4 – 0,8mcm. Khi ch−a tạo
bμo tử bề mặt khuẩn lạc có mμu vμng sáng đến mμu da cam hoặc nâu đỏ tuỳ
thuộc vμo môi tr−ờng vμ điều kiện nuôi cấy.

3.3.2. Quy trình lên men

Môi trờng giữ giống (%):

Pepton 0,6

Cao nÊm men 0,3

Cao thÞt 0,15

Glucose 1,0

(NH4)2SO4 0,35
KH2PO4 0,1
MgSO4.7H2O 0,5

Th¹ch 2%

N−íc máy vđ

pH 6,8 7,0

Nhiệt độ ni cấy 28OC

CaCO3 0,4

CoCl2.6H2O 0,002
Nớc máy vđ

pH 6,8 – 7,0

Nhiệt độ nuôi cấy 28OC

Nhiệt nuụi cy 28OC

Môi trờng lên men (%):
Bét ng« 2,5
Bột đậu tơng 3,0
Saccharose 1,0

CaCO3 0,4

Alpha amylase 0,001
CoCl2.6H2O 0,002
Dầu phá bọt 0,6
Nớc máy vđ

pH 6,5 6,7

Lên men tạo gentamicin đợc thực hiện theo phơng pháp nuôi cấy chìm.
Quá trình ny đợc thực hiện theo các bớc cơ bản:

</div>
(154)<div class='page_container' data-page=154>

Giống thạch nghiêng đợc hoạt hoá trong môi trờng giữ gièng ë 28OC

trong 4 -5 ngμy rồi cấy vμo môi tr−ờng nhân giống cấp 1 vμ lắc 200 – 250 v/ph
trong khoảng 48 giờ, tiếp tục nhân giống cấp 2 với l−ợng giống cấy truyền 2 -
4% (nếu trong bình nón) vμ tiếp tục nhân giống, l−ợng giống cấy vμo nồi lên
men lμ 10 - 15%. Quá trình lên men kéo dμi khoảng 96 – 120 giờ, nhiệt độ
thích hợp 26 – 28OC, pH mơi tr−ờng 6,8 – 7,2. Cấp khí với l−u l−ợng 1 VVM.

Hiệu suất chủng lên men th−ờng không ổn định do sản phẩm lμ một hỗn hợp
nhiều loại gentamicin, có thể đạt tới 1500 mcg/ml hoặc cao hơn.

3.3.3. ChiÕt xuÊt vμ tinh chÕ

Dịch lên men đ−ợc acid hoá bằng acid sulfuric 4N đến pH 2,0 – 2,5 để
giải phóng các kháng sinh bám vμo khuẩn ty, bổ sung chất trợ lọc, khuấy trộn
rồi lọc bằng lọc trống hay lọc ép khung bản lấy dịch lọc. Trung tính hố dịch
lọc bằng dung dịch NaOH 40%, loại ion Ca++ bằngacid oxalic đến pH = 3 – 3,5.

Khuấy trộn rồi trung tính hố lại đến pH = 7,0 – 7,5. Lọc loại tủa. Dịch lọc đã
xử lý đ−ợc chiết tách kháng sinh bằng nhựa trao đổi ion (th−ờng sử dụng
Amberlit IRC50 đã đ−ợc hoạt hoá ở dạng R-COO–Na+). Sau khi cột bão hoμ rửa

cột bằng n−ớc đã khử ion, phản hấp phụ kháng sinh bằng dung dịch acid
sulfuric 4N. Phân đoạn đậm đặc nhất đ−ợc chỉnh về pH = 4,5 bằng
trietylamin, tẩy mμu bằng than hoạt. Lọc loại than rồi dùng methanol tủa lấy
sản phẩm thô với tỷ lệ dung dịch kháng sinh: methanol lμ 1:8,5. Lọc rửa tủa

thô bằng methanol vμ aceton, sấy chân không ở 40OC v 30 70 mmHg. Sn

phẩm thu đợc l gentamicin thô ở dạng muối sulfat.

Quỏ trỡnh tinh chế gentamicin thô đ−ợc tiến hμnh nh− sau: Hoμ
gentamicin sulfat thô vμo n−ớc cất, chỉnh pH = 7,0 -7,5. Tẩy mμu bằng than
hoạt (khoảng 5%). Dịch lọc đ−ợc đem sắc ký trao đổi ion với nhựa cationit
Amberlit CG50 dạng hoạt hoá NH4. Phản hấp phụ bằng dung dịch NH4OH
0,3N. Lấy phân đoạn đậm đặc nhất. Cô chân không. Tảy mμu bằng than hoạt.
Sau khi lọc loại than thì tủa kháng sinh bằng methanol. Rửa tủa bằng aceton.
Tinh thể sấy khô trong chân không ở 40OC vμ 30 – 70 mmHg. Sản phẩm thu

đ−ợc đem i kim nghim v úng gúi.

Tự lợng giá

1. Kể tên các chủng vi sinh vật sinh kháng sinh nhóm aminoglycosid.
2. Tìm mối liên hệ giữa cấu trúc của streptomycin với thnh phần

môi trờng lên men.

3. Nêu quy trình chiết xuất streptomycin từ môi trờng lªn men.
4. Nªu tªn chđng vi sinh vËt sinh gentamicin v trình by quy trình

</div>
(155)<div class='page_container' data-page=155>

Ch

ơng 11

sản xuất Kháng sinh nhóm Macrolid

Mục tiêu

Sau khi học xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc:

1. Tên các chủng vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh nhóm macrolid. 
2. Quy trình lên men v chiết xuất erythromycin.

1. Tổng quan về các Macrolid

Các Macrolid l những kháng sinh có cấu trúc heterosid m phần genin
l một vòng lacton có chứa nhiều nguyên tử (thờng từ 12 17 hoặc nhiều
hơn) v đợc chia thnh 2 nhóm chính: nhóm kháng khuẩn v nhóm kháng
nấm hay còn gọi l c¸c polyen.

Nhãm macrolid kh¸ng khuÈn bao gåm c¸c macrolid cã cÊu tróc vßng
lacton (chøa tõ 12 - 17 cÊu tư – cßn gäi lμ vßng esther) cã chøa 1 hay nhiỊu
®−êng (deoxy sugar), (th−êng lμ cladinose vμ desosamin).

O
O

Vßng lacton 14- cÊu tư
(erythromycin,

oleandomycin,
clarithromycin)

Vßng lacton 15- cÊu
tư (azithromycin)

Vßng lacton 16- cÊu tư
(leucomycin, josamycin,

spiramycin, tylosin)

</div>
(156)<div class='page_container' data-page=156>

A
B

Erythromycin

Oleandomycin

B A

L Leucomycin

Josamycin

B A

L Spiramycin

Hình 11.1. Sơ đồ cấu trúc kháng sinh nhóm macrolid

Vịng L: Vịng lacton; Vòng A: đ−ờng đơn, Vòng B: Đ−ờng chứa gốc amin;
Các liên kết glycosid khơng chỉ ra ở đây

C¸c kh¸ng sinh thc nhãm macrolid thÕ hƯ II gåm mét số kháng sinh
bán tổng hợp từ erythromycin nh azithromycin (chứa vòng lacton 15 cấu tử -
đợc công bố năm 1980 với biệt dợc của hÃng Pfizer 1991 l Zithromaxđ); v
clarithromycin (chứa vòng lacton 14 cấu tử). Nhóm ny có phổ kháng khuẩn
rộng hơn erythromycin.

c xp vo danh sách các kháng sinh nhóm macrolid thế hệ II cịn bao
gồm các chất có cấu trúc vịng lacton 16 cấu tử nh− spiramycin, leucomycin,
josamycin, tylosin hay tylocicin. Trong đó tylosin chủ yếu đ−ợc sử dụng trong
thú y.

</div>
(157)<div class='page_container' data-page=157>

Bảng 11.1. Một số kháng sinh nhóm macrolid

Tên Năm phát hiện Chủng sinh KS

Nhãm kh¸ng khuÈn

Erythromycin 1952 Str. erythreus

Oleandomycin 1954 Str. antibioticus

Azithromycin (Zithromaxđ) 1980 Bán tổng hợp

Clarithromycin (Clacidđ) 197? Bán tổng hợp

Roxithromycin (Rulidđ) 1987 Bán tổng hợp

Spiramycin 1955 Str. ambefaciens

Leucomycin 1953 Str. kitasatoensis

Josamycin 1964 Streptomyces sp.

Tylosin 1961 Str. fradie

Terithromycin 1998 Bán tổng hợp

Nhóm kháng nấm

Nystatin 1955 Str. noursei

Amphotericin B 1957 Str. nodosus

Nhóm macrolid kháng nấm (cấu trúc polyen): Có tμi liệu xếp nystatin vμ
amphotericin B vμo nhóm kháng sinh đại lacton (chứa 26 – 38 carbon) có tác
dụng chống nấm. Trong nhiều năm, amphotericin B lμ kháng sinh chống nấm
toμn thân có hiệu quả cao tuy có độc tính cao. Nystatin th−ờng đ−ợc sử dụng
để điều trị bệnh do Candida albicans ở da, niêm mạc (miệng, đ−ờng tiêu hố,
âm đạo) vμ khơng có tác dụng khi nhiễm nấm toμn thân vì khơng hấp thu qua

đ−ờng tiêu hoá.

</div>
(158)<div class='page_container' data-page=158>

O
O

OH OH OH OH O

COOH
OH

CH3

H3C

O
O

CH3

OH
OH NH2

Nystatin

Cơ chế tác dụng của 2 thuốc nμy lμ gắn vμo sterol (chủ yếu lμ ergosterol)
ở mμng tế bμo nấm lμm biến đổi tính thấm của mμng.

2. Sinh tổng hợp Erythromycin 
2.1. Đại cơng

Erythromycin c nhóm các nhμ nghiên cứu của hãng Lilly tách chiết từ
chủng Streptomyces erythreus (sau nμy có tên lμ Saccharopolyspora erythraea)
vμo năm 1949 vμ đ−a vμo sử dụng trên lâm sμng từ năm 1952. Đây lμ kháng
sinh đ−ợc sử dụng phổ biến nhất trong nhóm macrolid. Erythromycin có phổ
kháng khuẩn rộng, chủ yếu lμ kìm khuẩn đối với các vi khuẩn Gram (+), Gram
(-) vμ các vi khuẩn khác nh− Mycoplasma, Spirochetes, Chlamydia vμ

Rickettsia. Tuy nhiên ở nồng độ cao erythromycin cũng có tác dụng diệt khuẩn
đối với các chủng rất nhạy cảm. Cơ chế tác dụng của erythromycin lμ gắn với
tiểu đơn vị 50S của ribosom vi khuẩn nhạy cảm vμ ức chế tổng hợp protein.
Thuận lợi của erythromycin lμ có thể dùng cho phụ nữ có thai vμ trẻ nhỏ; dùng
trong các tr−ờng hợp bị dị ứng với kháng sinh β-lactam vμ có thể dùng thay thế
penicillin trong dự phịng dμi hạn thấp khớp cấp tính.

Erythromycin dạng base không bền, dễ bị phá huỷ bởi dịch vị nên th−ờng
đ−ợc sử dụng ở các dạng muối để tăng sinh khả dụng. Erythromycin stearat,
ethylsuccinat, estolat th−ờng đ−ợc sử dụng các chế phẩm dạng uống;
Erythromycin gluceptat, lactobionat đ−ợc dùng ngoμi ở dạng mỡ tra mắt 0,5%;
dung dịch 2% điều trị trứng cá.

</div>
(159)<div class='page_container' data-page=159>

Erythromycin R1 R2

A OH OMe

B H OMe

C OH OH

Erythromycin base lμ hỗn hợp của 3 erythromycin A, B vμ C trong đó chủ
yếu lμ erythromycin A. Erythromycin base lμ bột tinh thể trắng hoặc hơi ánh
vμng, dễ hút ẩm, tan ít trong n−ớc (độ tan giảm khi nhiệt độ tăng), tan trong
ethanol, methanol, tan trong acid lỗng.

Chđng gièng: Streptomyces erythreus (sau nμy cã tên l
Saccharopolyspora erythrae.

2.3. Lên men sinh tổng hợp

Saccharopolyspora erythrae lμ chủng vi sinh vật hiếu khí, nhiệt độ ni
cấy thích hợp trong khoảng 30 – 33OC. Quy trỡnh lờn men cng cú nhng c

điểm tơng tự nh lên men tạo các kháng sinh nhóm tetracyclin. Thnh phần
môi trờng lên men nh sau (w/v):

Glucose 5,0 % CaCO3 0,6

Bét ®Ëu 3,0 pH 7,0

(NH4)2SO4 0,3 t0 nu«i cÊy 33OC

NaCl 0,5

Erythromycin có thể đợc chiết khỏi dịch lên men bằng dung môi hữu cơ.
Quy trình chiết xuất tiÕn hμnh nh− sau:

40 oC
Butyl acetat

Dd NaCl hay Na 2SO4

Làm lạnh
pH 2,5 - 3

erythromycin
kết tinh

cô
Chiết

sinh khối
dịch lên men

lọc

</div>
(160)<div class='page_container' data-page=160>

Dịch lên men đ−ợc lọc bằng lọc ép khung bản hay lọc trống. Dịch lọc
đ−ợc bổ sung dung môi hữu cơ nh− butyl acetat. Khuấy trộn để tạo thμnh một
hỗn hợp đồng nhất. Thêm dung dịch muối vô cơ nh− NaCl hay Na2SO4 vμ
khuấy trộn kỹ. Hỗn hợp sẽ phân lớp vμ kháng sinh chuyển sang pha hữu cơ.
Kháng sinh đ−ợc tách khỏi dung môi hữu cơ bằng cách cô chân không vμ kt
tinh 40OC.

Tự lợng giá

</div>
(161)<div class='page_container' data-page=161>

Ch

ơng 12

sản xuất kháng sinh chống ung th

Mục tiêu

Sau khi học xong chơng ny, sinh viên phải trình by đợc:

1. Nêu đợc tên v nguồn gốc các dợc phẩm đợc dùng trong điều trị 
ung th. Phân loại đợc các kháng sinh dùng điều trị bệnh ung th. 
2. Trình by đợc quy trình lên men v chiết xuất daunorubicin.

1. Đại cơng

Cú th nh nghĩa ung th− lμ tên gọi chung cho một nhóm bệnh khoảng
trên hai trăm loại khác nhau mμ nguyên nhân chủ yếu của chúng lμ do sự
phân chia khơng kiểm sốt đ−ợc của tế bμo, rất nhanh vμ không theo quy luật
trật tự. Các tế bμo nμy có khả năng xâm lấn vμ chèn ép vμo các cơ quan vμ tổ
chức xung quanh. Khi các ung th− chèn ép hoặc di căn vμo các cơ quan giữ
chức năng sống của cơ thể nh− não, phổi, gan, thận thì bệnh nhân sẽ tử vong.

Bệnh ung th− không phải do một nguyên nhân gây ra. Mỗi loại ung th−
có những nguyên nhân riêng biệt. Một tác nhân sinh ung th− có thể gây ra
một số ung th− vμ ng−ợc lại một loại ung th− có thể do một số tác nhân. Một
trong những tác nhân chính gây ung th− có thể kể đến lμ khói thuốc lá, các
yếu tố gây ung th− trong thiên nhiên hoặc tạo ra do chế biến thực phẩm, bệnh
nhiễm trùng mạn tính, một số loại virus, vi khuẩn, ký sinh trùng, r−ợu…
2. Các ph−ơng pháp điều trị bệnh ung th−

Ung th− có thể đ−ợc điều trị bằng phẫu thuật, hoá trị liệu, xạ trị liệu hay
miễn dịch trị liệu. Việc chọn lựa ph−ơng pháp trị liệu phụ thuộc vμo vị trí vμ

độ của khối u, giai đoạn của bệnh cũng nh− tình trạng của bệnh nhân.

Điều trị bằng phẫu thuật: Khi khối u cịn nhỏ có khả năng điều trị triệt để.
Điều trị bằng hoá chất (hoá trị liệu):

</div>
(162)<div class='page_container' data-page=162>

th−ờng rất độc). Có thể đ−ợc phân chia thμnh các nhóm chính sau (vừa theo cơ
chế tác dụng, vừa theo nguồn gốc hố chất):

a. Ho¸ chÊt chèng ung th−:

− Dacarbazin; busulphan; c¸c chÊt alkyl ho¸: cyclophosphamid,
melphalan, iphosphamid, lomustin.

− C¸c chÊt chèng chun hãa: methotrexat, mercaptopurin, cytarabin;
fluorouracin (chống ung th kìm hÃm sự phát triĨn cđa tÕ bμo)

− Các alkaloid từ thực vật vμ các sản phẩm tự nhiên khác: vinblastin,
vincristin (dừa cạn); etoposid, teniposid, paclitaxel, các taxoid (từ
thông đỏ).

b. C¸c kh¸ng sinh:

Nhãm c¸c actinomycin: dactinomycin.

C¸c antracyclin v các chất liên quan: doxorubicin (adriamycin);
daunorubicin; idarubicin.

Cỏc kháng sinh độc tế bμo khác: bleomycin.
c. Hoá chất chng ung th khỏc:

Hợp chất platin hữu cơ: cisplatin, carboplatin.
C¸c methylhydrazin: procarbazin.

C¸c chÊt kh¸c: asparaginase; estramustin, tretinoin…

Điều trị nội tiết: Dùng nội tiết tố hoặc kháng nội tiết tố bao gồm:

Hormon v các chất liên quan nh− ethinylestradiol, megestrol,
medroxyprogesteron, buserelin…

Các thuốc đối kháng hormon vμ các chất liên quan: tamoxifen, formestan.
Điều trị miễn dịch: Mục đích kích thích miễn dịch, tăng khả năng đề
kháng của cơ thể để diệt tế bμo ung th−, bao gồm:

− C¸c cytokin vμ c¸c chÊt điều ho miễn dịch.

Các yếu tố kích thích tăng trởng cụm bạch cầu: filgrastim.

Các interferon: tự nhiªn (interferon alpha vμ beta) … interferon
alpha 2a, 2b, n1, interferon beta 1a, 1b.

− C¸c interleukin: aldesleukin, interleukin.

Điều trị bằng tia xạ: Sử dụng tia phóng xạ γ để diệt tế bμo ung th−. Cùng
với phẫu thuật đây lμ ph−ơng pháp điều trị ung th− phổ biến vμ hiệu quả.

</div>
(163)<div class='page_container' data-page=163>

ph−ơng pháp nμy hố trị vμ xạ trị có thể gây tổn th−ơng đến các mô lμnh;
phẫu thuật không thể triệt để khi đã có di căn.

3. C¸c kh¸ng sinh chèng ung th− nguån gèc sinh häc

C¸c kháng sinh có nguồn gốc sinh học đợc sử dụng trong điều trị bệnh
ung th có thể chia thnh phân nhóm chính theo cấu trúc hoá học nh sau:

Nhóm các actinomycin
Nhóm các bleomycin

Nhóm chứa vòng antracyclin

Bảng 12.1. Các kháng sinh chống ung th nguồn gốc sinh học

Kháng sinh Năm phát hiện Chủng vi sinh vËt

Actinomycin F1, C… 1952 Str. chrysomallus

Actinomycin D 1952 Str. antibioticus

Actinomycetin 1941 Str. albus

Bleomycin 1956 Str. verticillus

Daunorubicin 1963 Str. peuceuticus;

Str. coeruleorubidus

Doxorubicin (adriamycin) 1968 Str. peuceutius var. caesius

Carminomycin Actinomadura carmirtana

3.1. Nhãm c¸c Actinomycin

D-e-lle

L-Thr
O
L
Sar
L-Pro

O O

CH3

O
-MeVal

D-e-lle

L-Thr
O
L
Sar

L-Pro -MeVal

</div>
(164)<div class='page_container' data-page=164>

Actinomycin D hay dactinomycin l chất kháng sinh đầu tiên có khả
năng kìm hÃm sự phát triển của tế bo ung th do C. Hackman tìm thấy vo
năm 1952 đợc chiết xuất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces antibioticus. Nhóm
ny còn cã c¸c actinomycin C, C1, K, F… nh−ng chØ cã actinomycin D đợc
dùng phổ biến hơn cả trong trị liƯu.

3.2. Nhãm c¸c bleomycin

Bleomycin đ−ợc Hamao Umezawa (1914 – 1983) tìm ra vμo năm 1956 từ
chủng xạ khuẩn Streptomyces verticillus. Trong môi tr−ờng nuôi cấy chủng xạ
khuẩn nμy sinh tổng hợp ra một hỗn hợp nhiều bleomycin khác nhau. Ng−ời
ta đã tìm ra 9 bleomycin tự nhiên vμ hơn 100 dẫn xuất bleomycin bán tổng
hợp nh−ng chỉ có hỗn hợp chứa bleomycin A2 không chứa ion kim loại chiếm
55 – 70% vμ bleomycin B2 (25 – 30%) lμ dạng đ−ợc sử dụng nhiều để điều trị
các bệnh ung th− vẩy nến, tinh hoμn vμ ung th− bạch cầu.

N
S
S
N
O R
HO
Me
NH2
H
H
H

H Me HO Me

H O

NH
H2N

O
O
O
NH2
NH
N
O
N
O
Me HN
N
N
NH2
H
O
HO O
OH
O
O
OH
OH
O
OH

CONH2
OH

A2: R = -NH[CH2]3SMe2
B2: R = -NH[CH2]4NH C NH2

NH
+
,xH2SO4

Hình 12.2. Cấu trúc hoá học của một vài bleomycin

3.3. Nhóm chứa vòng antracyclin

</div>
(165)<div class='page_container' data-page=165>

R1 R2

COCH3 CH3

CO CH2OH CH3

COCH3 H

Daunorubicin
Adriamycin
Carminomycin

O O

R2

R1

CH3

OH
NH2

Hình 12.3. Cấu trúc hoá học của một vài kháng sinh antracyclin

4. Sinh tổng hợp Daunorubicin 
4.1. Đại cơng

Daunorubicin c tỡm ra ln u tiờn vμo năm 1963 trong môi tr−ờng
nuôi cấy chủng xạ khuẩn S. peuceticus hay chủng S. coeruleorubidus.
Daunorubicin vμ adriamycin lμ 2 kháng sinh có phổ kháng khuẩn vừa phải
trên vi khuẩn Gram d−ơng nh−ng hoạt tính rất yếu trên vi khuẩn Gram âm
vμ rất độc. Tuy nhiên chúng có khả năng kìm hãm sự phát triển của tế bμo
ung th− theo cơ chế tác động trực tiếp lên cấu trúc phân tử xoắn kép lμm biến
đổi cấu trúc sinh học của phân tử ADN, dẫn tới kìm hãm quá trình sao chép
ADN vμ quá trình phiên mã sang mARN. Trong y học, cả 2 kháng sinh nμy
đ−ợc sử dụng d−ới dạng chỉ định độc lập hay phối hợp để điều trị nhiều dạng
ung th− khác nhau, trong đó có hiệu quả nhất lμ bệnh ung th− bạch cầu cấp

tính, ung th− vú vμ ung th− phổi. Tuy nhiên các kháng sinh nμy cũng có nhiều
phản ứng phụ nh−: độc tính cao, kìm hãm sự phát triển của tuỷ x−ơng, nếu
tích tụ nhiều trong cơ thể thì sẽ gây ngộ độc tim.

4.2. CÊu tróc ho¸ häc vμ tÝnh chÊt

Daunorubicin lμ mét glycosid bao gåm 3 thμnh phÇn: tetracyclic aglycon,
daunomycinon vμ mét ®−êng amin lμ daunosamin.

Daunorubicin hydroclorid lμ bột tinh thể mμu đỏ cam, dễ hút ẩm, tan
trong n−ớc vμ methanol, tan ít trong ethanol, khơng tan trong aceton.

Daunomycinon

</div>
(166)<div class='page_container' data-page=166>

Daunorubicin hydroclorid có dạng bột pha tiêm, cịn daunorubicin citrat
có ở dạng vi hạt lipid dùng pha loãng truyền tĩnh mạch. Do rất kích ứng với
các mơ nên daunorubicin chỉ đ−ợc dùng ở dạng tiêm tĩnh mạch. Bảo quản
tránh ánh sáng. Dạng vi hạt lipid phải bảo quản ở 2 - 8OC v trỏnh úng bng.

4.3. Điều kiện lên men

Chủng xạ khuẩn sinh daunorubicin S. coeruleorubidus lμ vi sinh vật hiếu
khí, nhiệt độ ni cấy thích hợp t 26 - 27OC

Môi trờng nhân giống (% w/v)

Pepton 0,6

NÊm men kh« 0,3

Ca(NO3)2.H2O 4,0
N−íc m¸y v®

pH 7,2

Môi trờng lên men (% w/v)

Bột đậu tơng 4,0
Dịch bÃ rợu 0,5

Tinh bột 4,0

Dầu đậu nnh 0,5

NaCl 1,0

N−íc m¸y v®

pH 7,2

Cấp khí với lu lợng 0,5 VVM; thời gian lên men: 60 - 80 giê

Daunorubicin vμ các dẫn suất khác đ−ợc hình thμnh trong quá trình lên
men đều lμ những chất độc mạnh vμ đ−ợc xem nh− tác nhân gây đột biến. Vì
vậy quá trình tách vμ tinh chế yêu cầu độ an toμn nghiêm ngặt (th−ờng tiến
hμnh trong dây chuyền kín)

4.4. Quy tr×nh chiÕt xuÊt

Daunorubicin lμ sản phẩm nội bμo. Kết thúc lên men dịch đ−ợc acid hoá

bằng acid oxalic d− ở 50OC để thuỷ phân các glycosid liên kết với

</div>
(167)<div class='page_container' data-page=167>

bằng hệ 1% NaCl trong methanol - n−ớc (9:1). Dịch phản hấp phụ đ−ợc cơ đặc
cịn 1/5 thể tích; chỉnh về pH = 8,5 rồi chiết bằng cloroform (tỷ lệ bằng khoảng
một nửa so với dung môi). Phân đoạn cloroform trên đ−ợc cô chân không
xuống còn khoảng 1/100 rồi bổ sung vμo 10V hexan để kt tinh thu c
daunorubicin thụ.

Tự lợng giá

1. Kể tên v phân loại các kháng sinh chống ung th đợc sản xuất
bằng con đờng sinh học.

</div>
(168)<div class='page_container' data-page=168>

Ch

ơng 13

sản xuất một số kháng sinh cã ngn gèc

tõ vi khn

Mơc tiªu

Sau khi học xong chơng ny sinh viên phải trình by đợc:

1. Tên các kháng sinh đợc sản xuất từ vi khuẩn trong công nghiệp. 
2. Quy trình lªn men vμ chiÕt xuÊt Polymycin.

Trong danh sách các kháng sinh đã mơ tả có đến 140 chất có nguồn gốc
từ vi khuẩn, nh−ng chỉ có một số rất ít chất có ứng dụng trong y học nh−:
Polymyxin, gramicidin, bacitracin ..., Ngoμi ra cịn có nisin chỉ đ−ợc dùng
trong chăn nuôi vμ công nghiệp thực phẩm. Các chất khác khơng đ−ợc ứng
dụng vì có độc tính cao đối với cơ thể. Về cấu trúc hoá học, các kháng sinh do

vi khuẩn tạo ra lμ các polypeptid. Nghiên cứu con đ−ờng sinh tổng hợp kháng
sinh polypeptid sẽ lμ mơ hình để tổng hợp các peptid nói chung có hoạt tính
sinh học lμ một vấn đề có ý nghĩa lý thuyết rất lớn. Sau đây giới thiệu một vμi
kháng sinh quan trọng do vi khuẩn tạo ra.

1. Sinh tỉng hỵp Polymyxin 
1.1. Đại cơng

Polymyxin l tờn gi ca mt nhóm kháng sinh có cấu trúc polypeptid
do vi khuẩn Bacillus polymyxa vμ Bacillus circulans tạo ra. Năm 1947, ba
nhóm các nhμ khoa học gồm nhóm Ainsworth, nhóm Benedict vμ nhóm
Stansly đã phân lập đ−ợc từ chủng vi khuẩn Bacillus polymyxa một hỗn hợp
gồm 5 polymyxin A, B, C, D vμ E. Các nghiên cứu sau nμy cho thấy polymyxin
B, D vμ E lại chia ra B1 - B2, D1 – D2 vμ E1 - E2. Danh sách các polymyxin đ−ợc
tìm thấy từ các chủng vi khuẩn ngμy cμng nhiều nh− polymyxin M, polymyxin
F1, F2, F3… Do độc tính cao đối với thận nên chỉ 2 trong các chất trên lμ
polymyxin B vμ polymyxin E đ−ợc dùng d−ới dạng muối sulfat để điều trị các
bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Gram (-).

</div>
(169)<div class='page_container' data-page=169>

chất colistin A, B vμ C có hoạt tính kháng khuẩn mạnh gấp 4 lần polymyxin
mμ độc tính lại thấp hơn. Các phân tích về cấu trúc hố học sau nμy cho thấy
colistin A chính lμ polymyxin E1.

1.2. CÊu tróc ho¸ häc vμ tÝnh chÊt

Các polymyxin đã đ−ợc nghiên cứu kỹ, riêng polymyxin B, đã tổng hợp
đ−ợc. Về cấu tạo chúng lμ 1 polypeptit vòng chỉ khác nhau về thμnh phần vμ số
l−ợng acid amin. Phân tử polymyxin M có chứa D-leucin, 3 gốc treonin vμ 6 gốc
acid α, γ diaminobutyric (DAB). Ngoμi ra còn chứa 1 gốc acid -6-metyloctanoic.

γ
Thr DAB
NH2
DAB
Y
X
D
DAB
DAB
Z

γ NH2

Thr
DAB
R
NH2
γ
NH2
γ

Tªn R X Y Z

Polymyxin B1 (+)-6-methyloctanoyl Phe Leu DAB

Polymyxin B2 6-methylheptanoyl Phe Leu DAB

Polymyxin D1 (+)-6-methyloctanoyl Leu Thr D-Ser

Polymyxin D2 6-methylheptanoyl Leu Thr D-Ser

Thr DAB
NH2
DAB
Leu
Leu
D
DAB
DAB
DAB

γ NH2

Thr
DAB
R
NH2
γ
NH2
γ
γ
Tªn R

Polymyxin E1 hay Colistin A (+)-6-methyloctanoyl

Polymyxin E2 6-methylheptanoyl

Polymyxin M

</div>
(170)<div class='page_container' data-page=170>

Các polymyxin có tác dụng diệt khuẩn, thuốc gắn vμo phospholipid lμm

thay đổi tính thấm vμ thay đổi cấu trúc mμng tế bμo của vi khuẩn. Hoạt tính
kháng khuẩn của polymyxin B chỉ giới hạn trên một số chủng vi khuẩn Gram
(-) nh− E. coli, Aerobacter aerogenes, Salmonella, Proteus… vμ đặc biệt trên
trực khuẩn mủ xanh Ps. aeruginosa. Trong y học polymyxin B đ−ợc dùng tại
chỗ, đơn độc hay phối hợp với một số hợp chất khác nh− neomycin sulfat,
oxytetracyclin, hydrocortison… điều trị nhiễm khuẩn mắt, tai mũi họng vμ
một số nhiễm khuẩn khác. Polymyxin E hay colistin đ−ợc dùng trong y học
d−ới dạng muối sulfat để điều trị tại chỗ nhiễm khuẩn đ−ờng tiết niệu hay
đ−ờng tiêu hoá. Dạng muối colistin natri mesilat đ−ợc dùng dạng tiêm để điều
trị nhiễm khuẩn huyết, viêm mμng não, nhiễm khuẩn thận… vμ chỉ sử dụng
khi không dùng đ−ợc những thuốc khác do độc tớnh cao.

1.3. Điều kiện lên men

Để sinh tổng hợp polymyxin ngời ta nuôi cấy B. polymyxa trên môi
trờng thạch có thnh phần (%):

Cao ngô 0,5
Cao nÊm men 0,5
Glucose 2,0

Agar 2,0

pH 6,8 ÷ 7,2

Khư trïng 110°C/20 phót. Nu«i ë 28°C trong thêi gian 24 giê.
M«i tr−êng nhân giống gồm (%):

Cao ngô 1,0
Bột đậu tơng 1,0

Glucose 2,0

Sulfat amoni 0,3
pH 6,8 ÷ 7,2

Khư trïng 115°C/20 phót. CÊy gièng vμo vμ nu«i 18- 20 giê/28°C.
Môi trờng lên men tạo kháng sinh có thnh phần (%):

Cao ngô 1,0
Bột đậu t−¬ng 2,0
Glucose 3,0

vμ mét sè muèi: MgSO4. 7H2O; KH2PO4; NaCl ...

</div>
(171)<div class='page_container' data-page=171>

1.4. ChiÕt xuÊt polymyxin tõ m«i tr−êng lªn men

Trong cơng nghiệp để chiết polymyxin đã sử dụng ph−ơng pháp trao đổi
ion. Bản chất hoá học của kháng sinh lμ polypeptid. Các acid amin trong phân
tử polymyxin có chứa các nhóm amin tự do, có khả năng trao đổi với nhóm
carboxyl của phân tử nhựa loại carboxycationit. Nh− KB-2, KB-HP-2,
Amberlit, IRC-50 ... Quá trình chiết có thể tiến hμnh nh− sau:

Dịch lên men xong đ−ợc acid hoá đến pH 3,5 ữ 4,0 để giải phóng kháng
sinh (có thể sử dụng acid oxalic để loại ion calci). Lọc loại sinh khối. Dịch lọc
trung hoμ bằng NaOH. Có thể chiết polymyxin từ dịch lọc nμy bằng dung môi
hữu cơ n-butanol. Sau đó kết tủa bằng aceton.

Dịch lọc đã trung hoμ đ−ợc lọc qua bông thuỷ tinh đến trong suốt rồi bơm
qua các cột trao đổi ion dạng Na+(R-COO-Na+). Cột đã bão hoμ kháng sinh rửa

bằng n−ớc ct hay nc ó kh khoỏng.

Phản hấp phụ kháng sinh bằng acid hydrocloric hay sulfuric 10%. Dịch
phản hấp phụ tẩy mu bằng than hoạt, lọc loại than. Dịch lọc đem loại các
cation kim loại bằng sulfocationit ví dơ: KU-2-20 hay SBS - 1. Trung hoμ dÞch
b»ng cách cho chảy qua cột anionit dạng OH.

Dch khỏng sinh đã trung hoμ đ−ợc bốc hơi trong chân không ở nhiệt độ
≤ 35°C, áp suất 10 – 15 mmHg. Sau đó phun sấy để thu lấy kháng sinh.

2. Sinh tổng hợp Bacitracin 
2.1. Đại cơng

Bacitracin lμ kháng sinh polypeptid do các chủng vi khuẩn B. 
licheniformis tạo ra (Johnson, Anker et al 1945). Sau đó Newton (1949) vμ

Abraham (1950) đã chiết đ−ợc từ môi tr−ờng nuôi cấy B. subtilis một hỗn hợp
kháng sinh gọi lμ eifaivin. Eifaivin có bản chất polypetid giống với bacitracin.
Thực tế trong công nghiệp để sản xuất bacitracin đã sử dụng B. licheniformis.
2.2. Cấu trúc hoá học

Bằng ph−ơng pháp sắc ký ng−ời ta đã xác định bacitracin lμ 1 hỗn hợp
gồm 10 kháng sinh khác nhau. Đólμ bacitracin A, A1, B, C, D, E, F1, F2, F3, vμ
G trong đó bacitracin A chiếm khoảng 37%. Độc tính của các kháng sinh trên
cũng khác nhau. Bacitracin C độc hơn bacitracin A vμ B, bacitracin F ít độc
nhất.

Newton vμAbraham (l953) đã xác định đ−ợc cấu trúc phân tử bacitracin

</div>
(172)<div class='page_container' data-page=172>

Chế phẩm bacitracin chứa chủ yếu bacitracin A lμ bột trắng xám, vị đắng
gắt, tan trong n−ớc vμ ethanol. Không tan trong ether, chloroform, aceton.
Bền trong dung dịch acid, khơng bền trong dung dịch kiềm. Hoạt tính kháng
sinh thấp dần từ bacitracin A đến bacitracin F.

B¶ng 13.1. Hoạt tính kháng sinh của các bacitracin

Bacitracin Hot lực t−ơng t−ơng đối của bacitracin trên

Corynebacterium xerosis

A 1

B 0,075

C 0,500

D 0,014

E 0,008

F1 0,055

F2 0,028

F3 0,014

G 0,140

Bacitracin có tác dụng kìm khuẩn hay diệt khuẩn nhờ khả năng ức chế
tổng hợp vỏ tế bμo của vi khuẩn. Nó có hoạt tính cao đối với các vi khuẩn
Gram (+) hoạt phổ giống với penicillin, ít tác dụng trên vi khuẩn Gram (-).
Tr−ớc đây bacitracin đ−ợc dùng để tiêm nh−ng do độc tính cao trên thận nên
hiện nay chỉ dùng tại chỗ để điều trị các vết th−ơng ngoμi da, một số bệnh về
mắt. Th−ờng đ−ợc sử dụng d−ới dạng phức hợp bacitracin kẽm hay d−ới dạng
hỗn hợp với neomycin hoc polymyxin B.

</div>
(173)<div class='page_container' data-page=173>

2.3. Điều kiện lên men

2.3.1. Chñng gièng

B. licheniformis

l

μ

những trực khuẩn có
bμo tử, sống hiếu khí, nhiệt độ ni cấy thích
hợp lμ 37OC. Trong cơng nghiệp để sản xuất

bacitracin đã sử dụng các chủng có số hiệu
ATCC 9945, 10716, 11945, 11946 vμ 14580.
2.3.2. Môi tr−ờng dinh d−ỡng

Tỷ lệ giữa hydrat carbon vμ nitơ rất quan
trọng trong thμnh phần môi tr−ờng nuôi cấy
B. licheniformis để sinh tổng bợp bacitracin. Nếu
tỉ lệ nμy thích hợp sẽ tạo ra bacitracin vμ nếu tỉ
lệ trên khơng thích hợp sẽ tạo ra licheniformin có
hoạt tớnh khỏng khun rt thp.

Môi trờng thạch nghiêng giữ gièng (w/v):

Trypton 5,0

D-glucose 1,0

DÞch chiÕt nÊm men 2,5

Agar 15,0

Môi trờng nhân giống (w/v):

Pepton 10,0

Glucose 5,0

Cao thÞt 5,0

NaCl 2,5

MnCl2 0,167

pH 7,0

Môi trờng lên men (w/v):

Citric acid 1,0

Glucose 0,5

KH2PO4 0,5

K2HPO4 0,5

MgSO4. 7H2O 0,2
MnSO4. 4H2O 0,01

H×nh 13.2. Trùc khuÈn

</div>
(174)<div class='page_container' data-page=174>

FeSO4. 7H2O 0,01

Dầu phá bọt theo nhu cÇu

pH 7,0

TiÕn hμnh lªn men ë 37OC. B. licheniformis lμ chđng hiếu khí nên cần

cp khớ mnh vi lu lng 1VVM (nhất lμ trong 6 giờ đầu). Máy khuấy tốc độ
110 vòng/phút. Phá bọt bằng dầu cọ hoặc dầu lạc. Thời gian lên men khoảng
45-50 giờ.

Bacitracin có thể đ−ợc chiết xuất bằng dung môi hữu cơ (n-butanol hay
ethanol) theo quy trình sau: Dịch lên men đ−ợc ly tâm để loại n−ớc, acid hoá
sinh khối để chiết kháng sinh ra khỏi tế bμo vi khuẩn. Lọc loại tế bμo. Dịch lọc
đem chiết kháng sinh bằng ethanol hoặc n-butanol. Cô kết tinh lấy tinh thể
bacitracin.

Dạng muối kẽm của bacitracin bền vững hơn nên ng−ời ta có thể tạo
muối ngay từ khi chiết kháng sinh khỏi môi tr−ờng lên men. Ph−ơng pháp nμy
hay áp dụng để lấy sản phẩm dùng trong chăn nuôi. Kết thúc lên men thêm
dung dịch ZnSO4 0,01% để tạo phức kẽm – bacitracin bền vững. Dịch thu đ−ợc
đ−ợc cô chân không ở nhiệt độ ≤ 40OC đến hμm l−ợng chất đặc lμ 40%, sau đó

phun sấy sẽ thu đ−ợc bột bacitracin thơ dùng trong chăn nuôi. Bảo quản ở chỗ
khô mát, nhiệt độ ≤ 25OC.

bacitracin

pH = 2,5 - 3,0

ly t©m

acid hóa

dịch lên men

Chiết

ethanol

kết tinh
cô
sinh khối

Sản phẩm thô
cho chăn nuôi

sấy phun
cô
tạo phức

(a) (b)

ZnSO4

< 40oC

hm lng cht c cũn 40%

</div>
(175)<div class='page_container' data-page=175>

Tự lợng giá

1. Tìm mối liên hƯ chung vỊ cÊu tróc gi÷a polymycin vμ bacitracin.
2. Nêu tên chủng vi sinh vật sinh tổng hợp polymycin v điều kiện

lên men tạo kháng sinh.

</div>
(176)<div class='page_container' data-page=176>

Ti liệu tham khảo

1. Kiều Hữu ảnh - Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp. NXB Khoa
häc vμ Kü tht. 1999.

2. Bé m«n C«ng nghiƯp Dợc Kỹ thuật sản xuất dợc phẩm, tập 1.
Trờng Đại học Dợc H nội. 2001.

3. Từ Minh Koóng - Cơ sở công nghệ sinh học v sản xuất dợc phẩm.
NXB Y học. 2004.

4. Nguyễn Văn Cách Công nghệ lên men các chất kháng sinh. NXB
Khoa häc vμ Kü thuËt. 2004.

5. Edward Alcamo - Fundamentals of microbiology (Third Edition).
The Benjamin/Cummings Publishing Company Inc., 1991

6. K.P. Gaponov - Process and equipments of microbiology’s 
production. Light and food industry. Moskva. 1981. (b¶n tiÕng
Nga)

7. John E. S. Biotechnology. Third edition. Cambridge University
Press; 1996.

8. Lantini D., Parenti F. - Antibiotics. Springer-Verlag New York
Inc. 1982 (b¶n tiÕng Nga)

9. Thomas D. B., Michael T. M., John M. M., Jack P. – Biology of
Microorganisms. Seventh edition. Prencice Hall, Englewood Cliffs,
New Jersey 07632.

</div>

KY THUAT SX DUOC PHAM

Kü thuËt

s¶n xuÊt dợc phẩm

<b>Tập II </b>

Kỹ thuật sản xuất thuốc bằng ph

ơng pháp sinh tổng hợp

<b>Lời giới thiệu </b>

<b>Lời nói đầu </b>

<b>Mơc lơc </b>

phÇn I. tỉng quan vỊ Công nghệ sinh học

Ch

ơng 1. Giới thiệu về công nghệ sinh học

<b>phần I. tổng quan về Công nghệ sinh học </b>

<b>Ch</b>

<b></b>

<b>ơng 1 </b>

<b> giới thiệu về công nghệ sinh học </b>

<b>Ch</b>

<b></b>

<b>ơng 2 </b>

<b>Nguyên liệu cho công nghệ sinh học </b>

<b>Ch</b>

<b></b>

<b>ơng 3 </b>

<b>Kỹ thuật lên men </b>

<b>Ch</b>

<b></b>

<b>ơng 4 </b>

<b>Kỹ thuật sản xuất enzym</b>

<b>(</b>

<b>)</b>

<b>Ch</b>

<b>−</b>

<b>¬ng 5 </b>

<b>Sản xuất Protein đơn b</b>

<b>μ</b>

<b>o </b>

<b>Ch</b>

<b>−</b>

<b>¬ng 6 </b>

<b>Sản xuất các sản phẩm trao đổi chất </b>

<b>bậc một dùng trong Y học </b>

<b>phần II. Công nghệ sản xuất kháng sinh </b>

<b>Ch</b>

<b></b>

<b>ơng 7</b>

<b>Đại c</b>

<b></b>

<b>ơng về kháng sinh </b>

<i>X</i>

<i>Dc</i>

<i>Dt</i>

<i>X</i>

=

×

<b>Ch</b>

<b></b>

<b>ơng 8 </b>

<b>sản xuất Các kháng sinh nhóm </b>

<b>-lactam </b>

<b>Ch</b>

<b></b>

<b>ơng 9 </b>

<b>sản xuất kháng sinh nhóm Tetracyclin </b>

NH

OH

RSO

Na

NaOH

R SO

NH

NaCl

RSO

Na

HCl

R SO

NH

.

.

.