BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ HĨA VÀ THỰC PHẨM

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH THỰC
PHẨM

Giảng viên hướng dẫn

:

T.s Trịnh Khánh Sơn

1


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1:
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP
WOHLGEMUTH
-

1. Mục đích bài thí nghiệm
Biết được các thao tác làm bài thí nghiệm,
Trình bày được ngun tắc, trình tự tiến hành, tính toán kết quả và đánh giá

sai số cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
2. Nguyên tắc
Phương pháp dựa vào tìm nồng độ enzyme thấp nhất có thể thủy phân tinh
bột đến dextrin. Đơn vị Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn

toàn 1 mg tinh bột đến dextrin sau 30 phút ở 37oC có Cl- làm chất hoạt hóa.
3. Dụng cụ và hóa chất
• Dụng cụ:
- 11 ống nghiệm,
- Pipet 1 ml (4 cái),
- Bể điều nhiệt.
• Hóa chất và cách pha hóa chất:
- NaCl 0.5%
- Tinh bột 0.5%
- H2SO4 10%
- Iodine 0.3% trong KI 3%.
4. Quy trình thực hiện
B1: Chuẩn bị dịch chiết amylase: Mẫu enzyme được pha loãng 200 lần
B2: Tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme amylase
Lưu ý:
Khi cho hồ tinh bột vào ống nghiệm, phải thực hiện đồng đều, liên tục theo
số giây, để thời gian phản ứng xảy ra trong mỗi ống nghiệm là như nhau, để có kết
quả chính xác nhất.
Lấy ống nghiệm cịn lại (số11) cho vào 3 ml nước cất, 2 giọt thuốc thử Iodine
trong KI, so sánh màu của 10 ống nghiệm trên để xác định ống có nồng độ enzyme
thấp nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột thành dextrin.

2


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH

5. Tính kết quả và nhận xét
a) Mẫu trong 300C


Lần 1

Lần 2

3


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH

Ống so màu
 Kết quả được thể hiện trong bảng có đánh dấu:Vàng (v ), Xanh (x ), Đỏ (đ )
 Bảng kết quả 1:
Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

8


9

10

Độ pha loãng

2

4

8

16

32

64

128

256

512

1024

n/2

n/4


n/8

n/16 n/32 n/64 n/128 n/256

n/512 n/1024

Màu lần 1

v

v

v

v

v

v

đ

x

x

x

Màu lần 2


v

v

v

v

v

đ

đ

x

x

x

Nồng độ enzyme

 So sánh màu chọn ống có nồng độ enzyme thấp nhất thủy phân hoàn toàn
tinh bột thành dextrin
- Lần 1 chọn ống số 6 F1=64
- Lần 2 chọn ống số 5 F2=32
 Tính tốn kết quả:
- Lượng enzyme cho vào ống nghiệm
n= m x = = 0,01 ( mg)
- Một đơn vị Gohlgemuth (W) ứng với 300C

Trong đó : F- Độ pha lỗng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy
phân hồn tồn tinh bột ( ống nghiệm có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)
Dựa vào kết quả thí nghiệm ta chọn F = 64 và F = 32
W1 = = = 3,125 x 10-5
W2 = = = 6.25 x 10-5
- Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzyme
N1w = = = 320
N2w = = = 160
Chạy excel Nw = 240

113,1371 tính trong 1 ml dịch trích enzyme

Vậy số đơn vị Wohlgemuth có trong dịch chiết enzyme pha lỗng 200 lần là
Nw = 48000

22627.42

0

b) Mẫu trong 37 C

4


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH

Lần 1

Lần 2


Ống so màu
 Bảng

kết quả 2:

Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Độ pha loãng

2


4

8

16

32

64

128

256

512

1024

Nồngđộ enzyme

n/2

n/4

n/8

n/16 n/32 n/64 n/128 n/256 n/512 n/1024

Màu lần 1


v

v

V

v

đ

đ

X

x

x

x

Màu lần 2

v

v

V

v


đ

x

X

x

x

x

 So sánh màu chọn ống có nồng độ enzyme thấp nhất thủy phân hoàn toàn
tinh bột thành dextrin
- Lần 1chọn ống số 4 F1=16.
- Lần 2chọn ống số 4 F2=16.
 Tính tốn kết quả:
- Lượng enzyme cho vào ống nghiệm :
n= m x = = 0,01 ( mg)
- Một đơn vị Gohlgemuth (W) ứng với 300C :
W1 = = = 1.25 x 10-4
W2 = = = 1.25 x 10-4
Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzyme :
N1w = = = 80
N2w = = = 80

5



BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
Chạy excel Nw= 80 0 tính trong 1ml dịch trích enzyme
Vậy số đơn vị Wohlgemuth có trong dịch chiết enzyme pha lỗng 200 lần là :
Nw = 16000

0

KẾT QUẢ
Ở 300C thì Nw = 48000

22627.42

Ở 370C thì Nw= 16000

0

 Nguyên nhân gây sai số :
+Pipet, ống nghiệm, dụng cụ thí nghiệm bị nhiễm.
+Cho lượng iodine trong KI không đều vào các ống nghiệm.
+Sai số nhiệt độ trong bể điều nhiệt.
+Thao tác thí nghiệm chưa chuẩn xác.
+ Enzyme rất nhạy với nhiệt độ, có thể bị giảm hay mất hoạt tính khi khơng bảo
quản cản thận trong q trình thí nghiệm.
+ Thời gian thực hành khơng chính xác, kết thúc phản ứng không đúng lúc.
Hướng khắc phục:
-

Rèn luyện thêm kỹ năng thực hiện các thao tác thí nghiệm, phải tuyệt đối

-


chính xác.
Thức hiện nhiều lần thực hành để đưa ra các thơng số chính xác nhất.

+ Tốc độ phản ứng của enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Và tốc độ phản ứng chỉ tăng
ở giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng của enzyme
cũng sẽ giảm và làm enzyme vô hoạt.
6. Bàn luận
Cần phải nhận biết chính xác màu của phức iodine và hồ tinh bột để biết
chính xác độ pha lỗng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân
hồn tồn tinh bột (ống nghiệm có màu trùng với màu của ống nghiệm 11).

6


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
Nồng độ enzyme càng lớn thì lượng tinh bột bị thuỷ phân càng nhiều. Nhưng khi
vượt quá nồng độ tới hạn vận tốc phản ứng sẽ chậm lại.
Quá trình thủy phân tinh bột đến dextrin, thêm NaCl vào nhằm giúp tăng hoạt độ
của enzym giúp q trình thủy phân đạt hiệu quả cao.
Ngồi ra trong q trình thủy phân 30 phút, có thêm H 2SO4 10% vào để ức
chế hoạt động của enzym để quá trình thủy phân dừng lại.
Nồng độ enzyme giảm dần từ ống 1 đến ống 10 do đó, phản ứng thủy phân
tinh bột cũng giảm dần. Tinh bột không bị thủy phân hồn tồn, một phần cịn sót lại
sẽ phản ứng với iodine tạo ra dung dịch có màu xanh của iodine, màu càng đậm khi
nồng độ enzyme càng thấp, hoạt độ enzyme càng yếu. Màu xanh thể hiện rõ nhất ở
ống nghiệm 10 – khi mà nồng độ enzyme rất thấp, có thể khơng cịn enzyme để có
thể thủy phân tinh bột.
Dựa vào màu sắc của từng ống nghiệm sau quá trình thủy phân tinh bột đến
dextrin với sự xúc tác của enzym amylase thì ta thấy:

Ở nhiệt độ 37oC, ống nghiệm số 1,2,3,4 gần như mất màu hoàn toàn chỉ cịn lại
màu của Iodine =>q trình thủy phân gần như hồn tồn.
Ở nhiệt độ phịng, ống nghiệm số 1,2,3,4,5,6 gần như mất màu hồn tồn chỉ
cịn lại màu của Iodine => q trình thủy phân gần như hồn tồn.
Vậy một trong những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân là nhiệt độ.

7


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 2
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ LIPASE
1. Nguyên tắc
Dưới tác dụng của lipase, lipid bị thủy phân và giải phóng các acid béo. Hàm
lượng acid được chuẩn độ bằng kiềm. Hoạt độ của enzyme là lượng kiềm cần để
trung hòa acid mới được hình thành. Cơ chất tốt nhất đối với lipase chính là lipid
của cùng một đối tượng enzyme.
2. Dụng cụ - hóa chất
 Dụng cụ: Cối chày sứ, Erlen 10ml, Pipet 1ml, 10ml, Ống đong, Burret, Cốc
100ml, 250ml, Tủ ấm.
 Hóa chất và cách pha hóa chất:
- Đệm acetat pH=4.7 (trộn CH3COOH 1N và CH3COONa 1N theo tỉ lệ 1:1)
- Cồn 96o
- Toluen
- Ether ethylic
- NaOH 0.1N
- Phenolphthalein 1%: 1.0g phenolphthalein được pha với 50ml ethanol và
50ml nước cất.
- Dầu đậu nành tinh khiết.
3. Cách tiến hành


8


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH

Lặp lại thí nghiệm 3 lần
- Làm bình kiểm chứng tương tự như trên nhưng dịch chiết enzyme phải
được đun cách thủy 10 phút để làm mất hoạt tính nước trước khi cho vào
cơ chất
4. Phương trình phản ứng và cơng thức
H+ + NaOH =>

Na+

+

H2O

(1)

b ml
RCOOH

+

NaOH

=>


RCOONa

+

H 2O

(2)

(a-b) ml
Gọi a là số ml NaOH để chuẩn độ trong bình thí nghiệm
b là số ml NaOH để chuẩn độ trong bình kiểm chứng
 a -b là số ml NaOH để chuẩn độ lượng acid tự do sinh ra do lipase trích ly
 Vậy cơng thức tính hoạt độ của lipase (X):
X = (a-b)x10xk/m
9


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
Với k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N
m: khối lượng hạt sử dụng
5. Kết quả tính tốn
b = 1.1 ml

-

Lần thí nghiệm

1

2


3

a (ml)

5.5

6

6.3

X(1) = (5.5-1.1)x10x1/5 = 8.8
X(2) = (6-1.1)x10x1/5 = 9.8
X(3) = (6.3-1.1)x10x1/5 = 10.4
 X = (8.8+9.8+10.4)/3 = 9.67
6. Nhận xét và giải thích
Số ml NaOH để chuẩn độ trong bình thí nghiệm được lặp lại 3 lần là gần

bằng nhau.
Số ml NaOH để chuẩn độ trong bình thí nghiệm cao hơn số ml NaOH để
chuẩn độ trong bình kiểm chứng vì trong bình kiểm chứng dịch chiết enzyme phải
đun cách thủy làm mất hoạt tính nước trước khi cho cơ chất, cịn ở bình thí nghiệm
thì sau khi nghiền thì đã cho cơ chất vào.
Thêm toluene vào có tác dụng làm diệt khuẩn.
 Lưu ý
- Khi pha đệm acetate phải chính xác, đúng tỉ lệ, pH= 4.7 vì khi pha thấp hơn
trở thành sút, cao hơn thì thành acid.
- NaOH 0.1N phải pha chính xác nồng độ, sau đó dùng H2SO4.1N để xác định
hệ số k. Phải sử dụng ống chuẩn đậy lại để không bị hút ẩm.
- Khi thêm dầu đậu nành, đệm acetate, toluene vào bình erlen chứa đậu nành

nghiền nhỏ xong thì lấy giấy nilon bịt lại để tránh bị hư.
7. Bàn luận mở rộng
- Các yếu tố ảnh hưởng sai số:
o Pha hóa chất khơng chính xác nồng độ, không đúng tỷ lệ.
o Khi chuẩn độ, màu của dịch enzyme đục nên khó quan sát lúc chuyển

-

màu, khơng nhìn thấy rõ nên dẫn đến hao hụt số ml NaOH chuẩn độ.
o Hút khơng chính xác thể tích.
Cách khắc phục sai số:
o Cẩn thận về thao tác, cách thực hiện.
o Có thể lặp lại thao tác chuẩn độ nhiều lần để lấy kết quả chính xác
hơn.
o Có thể sử dụng phương pháp ly tâm tách bã để giảm thiểu sai số.

10


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH

11


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
BÀI BÁO CÁO SỐ 3: KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ INVERTASE
1. Nguyên tắc
Invertase là một enzyme thủy phân saccharose thành glucose và fructose. Dựa
vào tính chất iodine trong dung dịch kiềm có khả năng oxi hóa glucose để xác định
glucose sinh ra bằng cách định phân iodine dư với dung dịch Na2S2O3

2. Dụng cụ- hóa chất
 Dụng cụ: cốc thủy tinh 100- 250ml, bình tam giác 250ml, pipette 2ml- 10ml,
buret 25ml, phễu thủy tinh.
 Saccharose 10%, NaOH 0.1N, iodine 0.1N, H2SO4 1N, hồ tinh bột 1%, dung
dịch Na2S2O3 0.05N.
3. Cách tiến hành
-

Điều chế dung dịch invertase: cân 1g men bánh mì, hịa tan vào 50ml

nước cất, cho vào bình định mức 100ml, lắc đều 5 phút. Để lắng, lọc lấy dịch lọc.
-

Thực hiện 3 ống nghiệm như sau:

Số ống
Dung dịch saccharose 10% (ml)
Nước cất
Dịch enzyme(ml)
Dịch enzyme đã bị đun cách thủy (ml)

Dãy ống
nghiệm



ở nhiệt độ
phòng để
30 phút


1
0
10
10
0

Đun cách
thủy
10phút

2
10
0
10
0
Hút 5ml hỗn
hợp dịch
cho vào
erlen 250ml

3
10
0
0
10
Xác định
glucose

-


Saccharose bị enzyme đăc hiệu thủy phân thành glucose.

-

Đun cách thủy để vô hoạt enzyme dừng phản ứng thủy phân để xác định.

-

Đúng hoạt độ của enzyme invertase.

Qui trình xác định glucose và các phản ứng hóa học diễn ra:

 Cho vào erlen 10ml iodine 0.1N và 15ml NaOH 0.1N.
Lúc này ta có phản ứng xảy ra trong dd như sau:
(1) I2 + 2NaOH

NaIO + NaI + H2O

(2) C5H11O5CHO + NaIO + NaOH =>

C5H11O5COONa + NaI + H2O

Cân bằng (1) và (2) ta được:
12


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
(3) I2 + 3NaOH+ RCHO =>

RCOONa + 2NaI + 2H2O


Và sodium hypoiodite cũng nhanh chóng và dễ dàng phản ứng và tạo ra sodium
iodate :
(4) 3NaIO => NaIO3 + 2 NaI
Kết hợp (1) với (4) ta được:
(5) 3I2 + 6 NaOH => NaIO3 + 5 NaI+ 3 H2O
-

Khi NaIO dư tức I2 dư thì phản ứng (5) sẽ diễn ra.

-

Phản ứng số (3) có sự tham gia của glucose nên cần nhỏ NaOH từ từ để

lượng glucose phản ứng hết, vì ngay khi NaOH dư thì phản ứng (4) có cơ hội xảy
ra làm lượng glucose cần chuẩn độ khơng có NaIO và NaOH để phản ứng. Cùng
với đó, khi phản ứng số (4) xảy ra trước sẽ gây ra sai số vì phản ứng (7) xảy ra tạo
ra I2.
 Sau khi để yên bình trong bóng tối 20 phút cho thêm 2ml H2SO4 1N thì:
(6) NaIO + NaI + H2SO4=>I2 + Na2SO4 + H2O
(7) NaIO3 + 5 Nal + 3H2SO4 => 3I2 + 3Na2SO4 + 3H2O
-

Lượng NaIO dư và NaIO3 do phản ứng (5) tạo ra sẽ tác dụng với acid tạo

ra lại I2.
 Định phân lượng iodine vừa được tạo ra tương đương với lượng iodine thừa
bằng Na2S2O3 0.05N với chỉ thị hồ tinh bột 1%.
(8) I2 + 2Na2S2O3 => 2 NaI + Na2S4O3
- Khi bỏ chỉ thị hồ tinh bột vào erlen thì do có iodine nên tạo phức màu, khi chuẩn

độ phản ứng (8) xảy ra, khi I2 được chuẩn độ hết hỗn hợp mất màu phức ta dừng
chuẩn độ. Nghi số liệu và tính kết quả.

13


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
 Mẫu trước khi định phân:

 Mẫu sau khi định phân:

- Cơng thức:
(V1-V2)*A*B/(1000*20*2*a*b*t*m)
Trong đó:
-

V1: số ml cần để định phân dung dịch ở ống nghiệm 1

-

V2: số ml cần để định phân dung dịch ở ống nghiệm 2

-

A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống nghiệm
14


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
-


B: tổng thể tích trích ly enzyme có được từ m (g)

-

a: thể tích dung dịch đem xác định đường glucose

-

b: thể tích trích ly enzyme vào mỗi ống nghiệm

-

t: thời gian thủy phân

4. Tính kết quả.
Ống nghiệm

1

2

3

VNa2S2O3 0.05N chuẩn lần 1 (ml)
VNa2S2O3 0.05N chuẩn lần 2 (ml)

18.8
19


9
9.1

13.5
13.5

VNa2S2O3 0.05N chuẩn lần 3(ml)

19

9.05

13.5

VNa2S2O3 0.05N trung bình (ml)

18.9

9.05

13.5

 Bảng số liệu
Hoạt độ invertase: (18.9- 9.05)*20*100/(1000*20*2*5*10*1)=9.85x10-3 (mol/g.phút)
- Đối với ống nghiệm số 3 ta vẫn áp dụng công thức vì có thể khi enzyme
invertase bị bất hoạt glucose vẫn được ra trong điều kiện làm thí nghiệm:
a=(13.5- 9.05)*20*100/(1000*20*2*5*10*1)=4.45x10-3 (mol/g.phút)
 Và a có thể xem là sai số của thí nghiệm.
5. Nhận xét và nguyên nhân sai số.
Do máy móc và dụng cụ đo thiếu chính xác, thiếu tinh vi.

• Do người đo với trình độ tay nghề chưa cao, khả năng các giác quan bị hạn
•

chế.
• Do điều kiện ngoại cảnh bên ngoài tác động tới, như thời tiết thay đổi, mưa
•
•

•
•

gió, nóng lạnh bất thường.
Lấy mẫu khơng chính xác.
Thời gian để enzyme phân hủy của từng ống thí nghiệm khơng giống nhau.
Pha hóa chất khơng đúng nồng độ ảnh hưởng đến kết quả.
 Cách khắc phục:
Thao tác tiến hành thí nhiệm phải chính xác, nhỏ từng giọt chất chuẩn để xác

định đúng điểm dừng thí nghiệm.
• Thực hiện thí nghiệm nhiều lần để xác định kết quả chính xác nhất.
• Phải canh đúng thời gian thủy phân của từng ống nghiệm.
 Ưu điểm: thí nghiệm đơn giản, ít sai số, điểm nhận biết rõ ràng khi 1
giọt dư Na2S2O3 làm dung dịch chuyển từ màu nâu sang trắng.
15


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
 Nhược điểm: thao tác và phương pháp cách chuẩn độ ảnh hưởng lớn

đến kết quả, phải canh đúng thời gian thủy phân của từng ống nghiệm

6. Bàn luận
Nhiệt độ và tốc độ pha loãng có ảnh hưởng rất lớn đến q trình thủy phân
saccharose trong thiết bị phản ứng liên tục. Khi tăng nhiệt độ từ 35 lên 55 oC, hoạt
tính của enzyme trong những giờ thủy phân đầu tiên sẽ tăng; tuy nhiên, hoạt tính
của enzyme sẽ giảm nhanh trong những giờ thủy phân tiếp theo. Cịn khi tăng tốc độ
pha lỗng thì năng suất hoạt động của phản ứng sẽ tăng, tuy nhiên hiệu suất thủy
phân sẽ giảm.

16


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 4: KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ
ENZYME UREASE
1. Nguyên tắc
Urease là một enzyme thủy phân đặc hiệu urea theo phản ứng:
NH2 -CO-NH2

+

H2O

→

NH3

+

CO2


Khi thêm formaldehyde vào môi trường sẽ tạo thành hexamethylene
tetramine và giải phóng acid carbonic.
2(NH4)2CO3

+

6HCHO

→

(CH2)6N4

+

2H2CO3

+

6H2O

2. Cách pha hóa chất
-

Formol trung tính: cho 10ml dung dịch 10% formol vào erlen, bổ sung 2ml

0.5% phenolphtalein. Nhỏ từng giọt NaOH 0.2N vào erlen cho đến khi xuất hiện
màu hồng nhạt của phenolphtalein. Ghi nhận lượng NaOH 0.2N đã sử dụng ( Vml ).
Căn cứ tỉ lệ dung dịch formol 10% và NaOH 0.2N đã sử dụng, tiến hành điều chế
100ml formol 10% trung hịa ( khơng sử dụng phenolphtalein).
- Phenolphtalein 1%: 0.1g phenolphtalein được pha với 50ml ethanol và 50ml

nước cất.
3. Tiến hành
3.1.

-

Điếu chế dung dịch urease

Xay nhiễu đậu nành nguyên hạt thành bột để phá vỡ tế bào giải phóng
enzyme.

-

Lọc và thu dịch lọc để trách sự ngăn cản của enzyme với cơ chất, lấy dịch
enzyme với thể tích chính xác và để q trình chuẩn độ được thuận lợi.
17


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
3.2.

Khảo sát động học

Chuẩn bị 2 dãy ống nghiệm, mỗi dãy 6 ống. Ở từng dãy cho lần lượt các
dung dịch vào theo bảng sau:
Ống nghiệm
Ure 1/3M (ml)
Nước cất (ml)
Dd urease (ml)


-

1
0
5
5

2
1
4
5

3
2
3
5

4
3
2
5

5
4
1
5

6
5
1

5

Cho nước vào ống nghiệm với từng thể tích tăng dần nhầm mục đích pha

loãng enzyme theo từng nồng độ để khảo sát số liệu vẽ đồ thị.
-

Khi thêm formaldehyde vào môi trường sẽ tạo thành hexamethylene

tetramine và giải phóng acid carbonic sau đó chuẩn độ lượng acid sinh ra bằng
NaOH.
3.3.

Xác định hoạt độ

Ống nghiệm
Ure 2% (ml)
Nước cất (ml)
DD Urease (ml)
DD Urease đã đun cách thủy (ml)
Thực hiện dãy ống nghiệm sau:

-

1
0
5
5
0


2
5
0
5
0

3
5
0
0
5

Khi thêm formaldehyde vào mơi trường sẽ tạo thành hexamethylene

tetramine và giải phóng acid carbonic sau đó chuẩn độ lượng acid sinh ra bằng
NaOH.
-

Ống 1 là mẫu thử khơng có cơ chất.

-

Ống 2 là mẫu vữa có cơ chất vừa có dịch enzyme.
18


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
-

Ống 3 là mẫu có cơ chất và dịch enzyme đã được đun cách thủy để vô hoạt


enzyme. Để xác định lượng urea đã bị thủy phân khi khơng có hoạt động của
enzyme.
4. Tính kết quả:
4.1.

Khảo sát động học

 Kết quả thí nghiệm tại 30°C
Ống nghiệm
NaOH dùng để chuẩn độ

1
2
0.5 0.9

1

1

1.1

1.1

lần thứ nhất (ml)
NaOH dùng để chuẩn độ

0.5 0.9

1.2


1.3

1.3

1.4

lần thứ hai (ml)
NaOH trung bình dùng để

0.5 0.9

1.1

1.15

1.2

1.25

2,75x10-5

2,875.10-5

3.10-5

3,125.10-5

chuẩn độ (ml)
Y= số mol ure bị thủy phân( 0


2,25.10-5

3

4

5

6

mol)
[S]=số mol ure ban đầu

0

Vận tốc phản ứng thủy phân 0
v=

.10-3
1,125.10-6

. 10-3

10-3

1,375.10-6 1,438. 10-6

. 101,5. 10-6


. 10-3
1,563. 10-6

d (S) Y
=
dt
20
 Kết quả thí nghiệm tại 40°C

Ống nghiệm
NaOH dùng để chuẩn độ lần

1
2
0.5 1,4

1,5

2

2,2

2,6

thứ nhất (ml)
NaOH dùng để chuẩn độ lần

0.5 1,3

1,5


2,1

2,2

2,6

thứ hai (ml)
NaOH trung bình dùng để

0.5 1,35

1,5

2,05

2,2

2,6

chuẩn độ (ml)
Y= số mol ure bị thủy

0

3,75.10-5

5,125.10-5 5,5.10-5

3,35.10-5


3

4

5

6

6,5.10-5

phân( mol)

19


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
[S]=số mol ure ban đầu

0

Vận tốc phản ứng thủy phân

0

v=

.10

-3


.10

-3

1.10-3

.10-3

1,675.10-6 2,038.10-6 2,563.10-6 2,75.10-6

.10-3
3,25.10-6

d (S) Y
=
dt
20
Đồ thị biểu diễn phương trình động học của Michaelis-Menten tại 30°C

Đồ thị biểu diễn phương trình động học của Michaelis-Menten tại 40°C

20


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH

 Tính tốn kết quả tại 40°C:
Ta có phương trình y= (113,56.x + 274,26).103 Có đồ thị cắt trục 1/V tại 1/Vmax và
trục 1/S tại -1/Km.

Từ đó suy ra -1/Km = -2,41. suy ra Km = 0,415.
1/Vmax= 274,26.103.
Vậy vận tốc thủy phân của enzyme tại 40°C là :

1
= 274,26.103 + 0,451. 274,26.103.3=645333.78
V
Suy ra V= 1,55.10-6.
 Tính tốn kết quả tại 30°C:
Ta có phương trình y= (100,36x + 586,13).103 Có đồ thị cắt trục 1/V tại 1/Vmax và
trục 1/S tại -1/Km.
Từ đó suy ra -1/Km =-5,84 suy ra Km= 0,171.
1/Vmax= 586,13.103.
Vậy vận tốc thủy phân của enzyme tại 40°C là :

1
=586,13.103. + 0,171. 586,13.103.3=886814,69
V
Suy ra V= 1,13.10-6.
Vậy tại nhiệt độ 30oC vận tốc thủy phân của enzyme bé hơn ở nhiệt độ 40o
21


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
 Giải thích cơng thức và cách lập đồ thị biểu diễn phương trình động học
-

của Michealis- Menten:
Trên cùng một hệ trục tọa độ vẽ 2 đường cong biễu diễn đường cơ chất bị


thủy phân theo nồng độ cơ chất ban đầu ở 2 nhiệt độ ( Y1 và Y2 theo [S]).
-

Vẽ đường thẳng biễu diễn sự biến thiên của 1/v theo 1/[S] ở 2 nhiệt độ thủy

phân.
Trong đó: v= d(S)/dt = Y/20 (v là vận tốc phản ứng thủy phân).
Đây là đồ thị biễu diễn phương trình động học của Michaelis-Menten:

 Với:
+ Vmax: vận tốc thủy phân cực đại.
+ [S]: nồng độ cơ chất.
+ Km: hằng số Michaelis-Menten.
Các đường thẳng này sẽ cắt trục hoành và trục tung tại các giá trị nghịch đảo
của Km và Vmax. Hãy tính các trị số này ở từng chế độ nhiệt.
 Chứng minh phương trình
Khảo sát trường hợp đơn giản nhất: chỉ một cơ chất.

Gọi:

v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES.
v-1 là vận tốc của phản ứng tạo phân ly phức chất ES tạo thành E và S.
v2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm).
v1 = k1 [E] [S]
v-1 = k-1[ES]
v2 = k2 [ES]
Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có: k-1[ES]+k2[ES] = k1[E][S]
(k-1+k2)[ES] = k+1[E][S] (2)
Gọi: E0 là nồng độ ban đầu: [E0]=[E]+[ES]=>[E]=[E0]-[ES] (3)
Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có: (k-1+k2)[ES] = k1([E0]-[ES]) [S]

22


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
[ES] =
Nếu đặt Km= k-1+k2/ k1(Km: gọi là hằng số Michalis Menten)
Ta có: [ES] = [E0][S]/ Km+[S]
Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P là: V = k2 [ES]
Thay [ES] bằng giá trị ở trên ta thu được: v =

(4)

Qua đây ta thấy nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng enzyme càng
lớn. Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ chất Vmax= k 2[E0]
Thay vào phương trình (4) ta được: v = Vmax

(5)

Phương trình (5) gọi là phương trình Michelis Menten. Km đặc trưng cho ái
lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất
càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn.

Sự biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất
Khi tăng [S] thì v phản ứng tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì v đạt đến
giá trị Vmax và sẽ khơng tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S].
Khi Km = [S] thì v0 =1/2 Vmax
Năm 1934. Lineweaver và Burk, trên cơ sở của phương trình (5) đã nghịch đảo
để biến thành dạng đường thẳng y = ax+b.
23



BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH

Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver –
Burk
4.2.

Xác định hoạt độ

 Bảng số liệu:

Ống nghiệm
VNaOH 0.05N chuẩn lần 1
VNaOH 0.05N chuẩn lần 2

1
0.10
0.10

2
1.10
1.00

3
0.20
0.20

VNaOH 0.05N chuẩn lần 3

0.15


1.00

0.20

VNaOH 0.05N trung bình

0.117

1.033

0.200

 Tính kết quả:
Hoạt độ urease được biểu diễn bằng số mol ure bị thủy phân bởi lượng enzyme
urease có trong 1g bột đậu nành trong thời gian 1 phút ở 40oC.
(V2 - V1)xAxk/(20x103x2xtxaxm)
= ( 1.033-0.1167)x250x1/(20x103x20x60x5x10) = 1.91x10-6 (mol/phút)
24


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH
Trong đó:
V1, V2: số ml NaOH 0.05N dùng định phân dung dịch trong ống nghiệm 1 và 2
a: thể tích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm
A: tổng thể tích enzyme có được từ m(g) bột đậu nành
t: thời gian thủy phân (phút)
m: khối lượng mẫu cân
k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.05N
 Vậy hoạt độ của enzyme urease:

( 1.033-0.1167)x250x1/(20x103x20x60x5x10) = 1.91x10-6


Vì urea có thể bị thủy phân sẵn hay trong điều kiện diễn ra thí nghiệm

acid được tạo ra khơng mong muốn nên công thức được áp dụng cho mẫu mà
enzyme đã bị vơ hoạt:
a = (V3 - V1)xAxk/(20x103x2xtxaxm)
=(0.2-0.1167)x250x1/(20x103x20x60x5x10)=1.73x10-8(mol/phút)
Vậy ta có thể lấy a làm sai số của hoạt độ enzyme.
Chứng minh công thức
5. Bàn luận mở rộng:
Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme
Việc nghiên cứu động học enzyme có những ý nghĩa quan trọng về :
- Biết được cơ chế phân tử về sự tác động của enzyme.
- Cho phép ta hiểu biết được mối quan hệ về mặt lượng của q trình enzyme.
- Thấy được vai trị quan trọng cả về mặt lý thuyết lẫn thực hành: khi lựa chọn
các đơn vị hoạt động enzyme người ta cần phải biết những điều kiện tốt nhất đối với
hoạt động của enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt
động của chúng.
- Là điều kiện cần thiết để thực hiện tốt các bước tinh chế enzyme.
Ngoài các tác nhân như nồng độ cơ chất, chất hoạt hóa, pH mơi trường,… thì
nhiệt độ cũng là một trong những tác nhân ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme.
Vì thế thực nghiệm khảo sát động học enzyme là một rất hữu ích bổ trợ cho
kiến thức chun mơn.
6. Những nguyên nhân và phương pháp hạn chế sai số :
• Ngun nhân :
Thao tác thí nghiệm :
Canh thời gian khơng chuẩn xác.
Chuẩn độ khơng chính xác .

25