TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

MƠN: THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG CÁC CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC

ĐỀ TÀI:
THU NHẬN LYSOZYME TỪ LỊNG TRẮNG TRỨNG VÀ ỨNG
DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ BẢO QUẢN THỰC PHẨM

GVHD: NGƠ ĐẠI NGHIỆP
SINH VIÊN THỰC HIỆN:
VÕ ĐƠNG PHÁT

TP. HỒ CHÍ MINH-2018

05001170074


MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG BIỂU............................................................................................ii
DANH MỤC HÌNH ẢNH.............................................................................................iii
I. TỔNG QUAN.............................................................................................................1
1.1 Lịch sử của Lysozyme...........................................................................................1
1.2 Phân loại Lysozyme..............................................................................................1
1.3 Đặc tính của Lysozyme.........................................................................................3
II. Lysozyme là chất kháng khuẩn..................................................................................3
2.1 Hoạt tính chống Vi sinh vật của Lysozyme..........................................................3
2.2 Cơ chế Lysozyme phá hủy thành tế bào vi sinh vật...............................................4
2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Lysozyme.....................................................8
2.3.1 pH................................................................................................................... 8
2.3.2 Nhiệt độ..........................................................................................................8

2.3.3 Sự có mặt của chất điện ly..............................................................................8
2.3.4 Điều kiện canh trường.....................................................................................8
III. SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH LYSOZYME TỪ
LÒNG TRẮNG TRỨNG...............................................................................................8
3.1 Đặc điểm các kỹ thuật tách Lysozyme từ lòng trắng trứng....................................8
3.2 Sắc ký trao đổi ion để tách Lysozyme...................................................................9
3.2.1 Bản chất của sắc ký trao đổi ion......................................................................9
3.2.2 Nguyên tắc của sắc ký trao đổi ion................................................................10
3.2.3 Cơ sở lý thuyết để tách Lysozyme bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi cation .......11
3.2.4 Ưu điểm của nhựa Amberlite FPC 3500 trong sắc ký ion trao đổi tách
Lysozyme từ lòng trắng trứng................................................................................12
3.2.5 Quy trình tách Lysozyme bằng sắc ký trao đổi ion dương............................13
IV. ỨNG DỤNG LYSOZYME TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM........................15
V. KẾT LUẬN..............................................................................................................19
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................21
i


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.Phân loại Lysozyme...........................................................................................2
Bảng 2. Hàm lượng Lysozyme ở các nguồn khác nhau..................................................2
Bảng 3. Đặc tính hóa học và vật lý của Lysozyme.........................................................3
Bảng 4. Đặc điểm của Protein trong lòng trắng trứng..................................................12
Bảng 5. Ảnh hưởng của Lysozyme đến việc bảo quản các loại thực phẩm.................18

ii


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. Một phần của thành phần polysaccharide của thành tế bào vi sinh vật.............4

Hình 2. Chuỗi amino acid của HEW Lysozyme............................................................5
Hình 3. Mơ hình khơng gian của Lysozyme..................................................................6
Hình 4. Cơ chế xúc tác của Lysozyme...........................................................................7
Hình 5. Bản chất của sắc ký trao đổi ion......................................................................10
Hình 6 Sắc ký trao đổi ion dùng phân tách các Protein................................................11
Hinh 7. Quy trình tách Lysozyme từ lịng trắng trứng bằng sắc ký trao đổi Cation.....14

iii


I. TỔNG QUAN
Lysozyme (ký hiệu E.C.3.2.1.17) được biết như một protein chống vi sinh vật
trong lòng trắng trứng, lòng trắng trứng gà là nguồn cung cấp dồi dào để sản xuất
Lysozyme.
Lysozyme từ trứng gà thuộc Lysozyme type c, nó được nghiên cứu nhiều nhất.
Lysozyme được biết như một enzyme phân cắt liên kết β –1,4 glycoside. Lysozyme có
hoạt tính chống Vi sinh vật rộng đặc biệt là gram dương và có thể tăng phổ tác dụng
đến gram âm. Lysozyme ở dạng tinh khiết cao, được chiết xuất tốt sẽ được dùng để kéo
dài thời gian bảo quản của nhiều loại thực phẩm, như chất bảo quản và được xem như
chất bảo quản an tồn trong thực phẩm.
Ngồi ra, Lysozyme cịn được sử dụng trong ngành dược phẩm như kháng sinh tự
nhiên.
1.1 Lịch sử của Lysozyme
Lysozyme được Alexander Fleming phát hiện năm 1922 một cách tình cờ trong
phịng thí nghiệm của ơng. Ơng vơ tình bị chảy nước mũi vào đĩa petri có canh trường
vi khuẩn và ơng thấy những vi khuẩn này bị phân giải. Hiện tượng này được ông
nghiên cứu cẩn thận và enzyme Lysozyme đã được xác định.
Năm 1965, David Chilton Phillips khám phá ra cấu trúc của Lysozyme bằng cách
phân tích X quang ở độ phân giải 2 Å. Trong nhiều năm, phân tích X quang là phương
pháp phân tích Lysozyme tốt nhất vì những tính chất đặc biệt của loại enzyme này. Thứ

nhất, Lysozyme rất dễ được tinh sạch từ lòng trắng trứng. Thứ hai, Lysozyme rất dễ kết
tinh, không giống như hầu hết các lại protein khác. Người ta dựa vào tính chất này của
Lysozyme để tinh sạch enzyme này. Và cuối cùng, những tinh thể Lysozyme làm nhiễu
xạ tia X với độ phân giải rất cao, hiện nay là loại cấu trúc protein có độ phân giải cao
nhất: 0,94 Å.
1.2 Phân loại Lysozyme
Lysozyme đã được lấy ra từ nhiều nguồn: vi sinh vật, virus, côn trùng, cây, động
vật. Người ta phân loại Lysozyme thành những nhóm nhỏ dựa trên nguồn gốc, thứ tự
các acid amin và chiều dài.
Lòng trắng trứng là nguồn giàu Lysozyme nhất, chứa khoảng 0,3 – 0,4 g
Lysozyme trong một quả trứng. Lysozyme trong lòng trắng trứng là đại diện cho họ các
Lysozyme và được gọi là Lysozyme type-c. Những nghiên cứu đã cho thấy rằng lớp
biểu bì và vỏ trứng chứa ít Lysozyme trong khi màng ngồi và màng trong thì nhiều
Lysozyme. Lysozyme type-g có mặt trong các lồi chim. Lysozyme type-c và
Lysozyme type-g có khối lượng phân tử khác nhau và trạng thái khác nhau.
Lysozyme cũng có mặt trong mô động vật, huyết thanh và các cơ quan. Lá lách
của gia súc chứa một lượng Lysozyme lớn nhất. Lysozyme trong sữa bị có cùng khối
1


lượng phân tử với Lysozyme lòng trắng trứng nhưng hoạt độ thì gấp 2 lần. Lysozyme
type-v (viral) là Lysozyme của virus, được xác định là khác với những Lysozyme khác
ở chỗ đây là loại transglycosidase. Lysozyme từ thực vật là Lysozyme type-h và type-b
tùy thuộc vào nguồn gốc của Lysozyme.
Bảng 1.Phân loại Lysozyme
Loại Lysozyme

Nguồn

Tài liệu tham khảo


Type-c

Lòng trắng trứng gà

Chipman và Sharon, 1969

Type-g

Các loài chim

Prager và Jolles, 1996

Type-h

Thực vật

Beintema và cộng sự,1996

Type-b

Thực vật

Beintema và cộng sự,1996

Type-i

Động vật thân mềm, côn trùng

Jolles và Jolles, 1975


Bảng 2. Hàm lượng Lysozyme ở các nguồn khác nhau
Nguồn Lysozyme

Lượng Lysozyme

Lòng trắng trứng gà

2500-3500 μg/ml

Lòng trắng trứng vịt

1000-1300 μg/ml

Lòng trắng trứng ngỗng

500-700 μg/ml

Nước mắt

3000-5000 μg/ml

Sữa người

55-75 μg/ml

Sữa bò

10-15 μg/ml


Lá lách

50-160 mg/kg

Tuyến tụy

20-35 mg/kg

Nước ép đu đủ

8-9 μg/ml

Nước ép bắp cải

7-8 μg/ml

Nước mắt

2.6 mg/l

2


1.3 Đặc tính của Lysozyme[5]
Lysozyme của lịng trắng trứng gà là polypeptide của 129 amino acid, có khối
lượng phân tử là 14,4 kDa và có điểm đẳng điện là 10.7.
Lysozyme có 4 liên kết disulfide ở các vị trí Cys6-Cys127, Cys30-Cys115,
Cys64-Cys80 và Cys76-Cys94.Lysozyme có độ ổn định rất cao bởi bốn liên kết
disulfide trong chuỗi polypeptide của enzyme làm protein có phân tử lượng nhỏ này trở
nên nhỏ gọn và ổn định cao.Để duy trì hoạt tính của enzyme thì cần ít nhất hai trong

bốn liên kết disulfide được duy trì. Hai trong bốn liên kết disulfide cũng ổn định dưới
nhiệt, hoạt động của nó có thể được giữ lại ngay cả khi ở 100oC trong 1-2 phút.
Bảng 3. Đặc tính hóa học và vật lý của Lysozyme.
Đặc tính

Giá trị

Khối lượng phân tử

14400 Da

Amino acid

129

pI

10.7

Liên kết disulfide

4

II. Lysozyme là chất kháng khuẩn
2.1 Hoạt tính chống Vi sinh vật của Lysozyme.[2]
Hoạt tính kháng khuẩn của Lysozyme hiệu quả với vi khuẩn gram dương. Thành
tế bào của các vi sinh vật này bao gồm chủ yếu là lớp peptidoglycan.Vi khuẩn gram âm
ít nhạy cảm với enzyme này vì chúng có cấu tạo thành tế bào phức tạp hơn. Lớp
peptidoglycan là cơ chất của Lysozyme, được bao phủ thêm bên ngoài lipoprotein,
lipopolysaccharides và peptide kỵ nước. Lớp ngồi đóng vai trị rào cản để ngăn chặn

enzyme tiếp cận đến vị trí hoạt động của nó.Gần như Lysozyme ít hoặc khơng tác dụng
với vi khuẩn gram âm.
Các nghiên cứu chỉ ra rằng để mở rộng phổ tác dụng của Lysozyme có thể thay
đổi hiệu chỉnh Lysozyme hoặc hóa học kết hợp các chất bảo quản khác. Lysozyme kết
hợp với peptide kị nước hoặc acid béo của thành phần lysine, nó làm tăng sự thâm
nhập và phá vỡ màng vi khuẩn, giúp mở rộng phạm vi hoạt động của Lysozyme với vi
khuẩn gram âm, bao gồm Escherichia coli K12 (Ibrahim và cộng sự, 1993, 1994).
Glycosyl hóa cũng có thể mở rộng hoạt tính chống vi sinh vật đến vi khuẩn gram âm
(Nakamura và cộng sự, 1997). Thêm ethylene di - amine tetra acetic acid (EDTA)
(Charter and Lagarde 2004 ), acid hữu cơ, nicin (Losso và cộng sự, 2000) trypsin, hoặc
3


lactoferrin (Baron và Rehault,2007) giúp làm mất ổn định màng ngồi các sinh vật
Gram âm, do đó cho phép Lysozyme xâm nhập qua màng ngồi từ đó mở rộng phổ
hoạt tính Lysozyme. Q trình đồng hóa áp suất cao thúc đẩy sự thay đổi cấu trúc tại
các vị trí hoạt động Lysozyme và làm tăng hoạt tính kháng khuẩn chống lại
Lactobacillus plantarum (Vannini và cộng sự, 2004).
2.2 Cơ chế Lysozyme phá hủy thành tế bào vi sinh vật.[4]
Lysozyme xúc tác quá trình thủy phân các liên kết glycoside, là liên kết axit Nacetylmuramic (NAM) và N-acetylglucosamine (NAG) trong các polysaccharides của
thành tế bào vi khuẩn. Khi làm như vậy, nó làm hư hỏng tính tồn vẹn của thành tế bào
và do đó hoạt động như một tác nhân diệt khuẩn. Mối liên kết NAM-NAG với vị trí
phân chia bởi Lysozyme đã chỉ ra ở Hình 1.

Hình 1. Một phần của thành phần polysaccharide của thành tế bào vi sinh
vật, cho thấy sự luân phiên giữa axit N-acetylmuramic (NAM) và Nacetylglucosamine (NAG). Polysacharide này là cơ chất cho Lysozyme, nó
sẽ phân cắt liên kết glycoside ở vị trí chỉ định.
Lysozyme của lịng trắng trứng gà là chuỗi polypeptide đơn có độ dài là 129
amino acid ( Hình 2 ) với phân tử lượng là 14400 Da. Từ dữ liệu X-Ray, chúng ta có
4



thể thấy có một khe rảnh trong cấu trúc của Lysozyme (Hình 3). Trung tâm hoạt động
nằm ở khe rảnh này.Trình tự các amino acid ở Hình 2 và cấu trúc khơng gian của
Lysozyme Hình 3 , chuỗi amino acid này trong rảnh sẽ được gấp lại trong Protein và
đã được đánh dấu trong hình.

Hình 2. Chuỗi amino acid của HEW Lysozyme,với thành phần amino nền
liên kết với nhau được đánh dấu bằng màu xám. Asp 52 và Glu 35, thành
phần chính trong trung tâm hoạt động, được đánh dầu bằng đỏ và vàng
tương ứng.

5


Hình 3. Mơ hình khơng gian của Lysozyme, trong đó thành phần chính
được đánh dấu. Asp với màu đỏ, Glu màu vàng và một số chất nền liên kết
với màu xám.
Trung tâm hoạt động của Lysozyme là một rảnh dài có chứa 6 đường của
polysaccharide tại một thời điểm.Khi liên kết với polysaccharide, enzyme thủy phân
một liên kết glucoside. Nếu 6 đường trong đoạn polysaccharide được đánh dấu từ A-F
thì vị trí phân cắt sẽ giữa D và E như được chỉ ra trong Hình 1. Hai mảnh
polysaccharide được giải phóng. Hình 4 sẽ mơ tả các giai đoạn của phản ứng này.Và sẽ
được mô tả chi tiết bên dưới.

6


Hình 4. Cơ chế xúc tác của Lysozyme. Lưu ý chỉ amino acid chính liên
quan đến xúc tác (Glu 35 và Asp 52 ) được đề cập.Các giai đoạn này sẽ

đươc mô tả chi tiết (dựa trên Phillips, 1966).
1) Khi liên kết với enzyme, cơ chất cần phải thay đổi cấu tạo hình dạng. Ở đây vị
trí D sẽ bị thay đổi cấu tạo (không được thể hiện trong sơ đồ) để chứa một
nhóm -CH2OH nếu khơng sẽ gây ra tiếp xúc không thuận lợi với enzyme. Bằng
cách này enzyme buộc cơ chất chấp nhận một cấu hình gần đúng với trạng thái
thay đổi.
2) Amino acid ở vị trí 35 là Glutamic acid (Glu 35) với 1 proton mà nó dễ dàng
chuyển tới cực của nguyên tử oxy của liên kết glycoside, bằng cách này liên kết
của C-O trong chất nền bị cắt. (Hình 4a và b)
3) Ở vị trí D trong chuỗi polysaccharide lúc này sẽ có điện tích dương. Phản ứng
trung gian này được gọi axonium ion (Hình 4b). Enzyme ổn định chất trung
gian này theo 2 cách. Thứ nhất, nhóm cacboxylat của Asp 52 gần đó nằm gần đó
có điện tích âm, tương tác với điên tích dương của oxonium ion. (sự chia sẻ điện
tích của nguyên tử C và O này được gọi là sự cộng hưởng cũng giống như chia
sẻ các electron giữa các nguyên tử của nhóm peptide).Như vậy oxonium trung
gian là trạng thái chuyển tiếp. Thông thường, một trung gian như vậy sẽ rất
không ổn định và phản ứng.Asp 52 giúp ổn định oxonium ion nhưng sẽ khơng
phản ứng với nó.Điều này là do, ở khoảng cách 3 Å, các nhóm phản ứng quá xa
nhau.
7


4) Enzyme bây giờ tách vị trí E với polysaccharide đính kèm của nó, sản sinh ra
một chất Glycosyl-Enzyme trung gian. Oxonium phản ứng với một phân tử
nước từ môi trường,tạo ra một nhóm hydroxyl và tái proton hóa Glu 35.(Hình
4c và d)
5) Enzyme giải phóng vị trí D với polysaccharide đính kèm của nó và phản ứng
hồn thành.
2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Lysozyme
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của Lysozyme, ví dụ như: pH, nhiệt

độ, các ion, khả năng tiếp cận với liên kết để phá hủy trong thành tế bào vi khuẩn…
2.3.1 pH
Đối với Lysozyme lòng trắng trứng, khi các thí nghiệm được tiến hành ở dung dịch
trung tính và dung dịch acid, hoạt động của Lysozyme trong dung dịch acid luôn luôn
mạnh hơn so với trong môi trường trung tính. Sự ức chế hoạt động của Lysozyme bắt
đầu tại pH 5,7, pH tối ưu của Lysozyme khoảng 6,2 và khả năng dung giải tốt nhất ở
pH 6,0-7,0 (Boasson, 1938; Smolelis và Hartsell, 1949).
2.3.2 Nhiệt độ
Sự dung giải tế bào vi khuẩn của Lysozyme lòng trắng trứng tăng khi tăng nhiệt độ
đến 60oC (Smolelis và Hartsell, 1949).
2.3.3 Sự có mặt của chất điện ly
Hoạt động dung giải của Lysozyme lòng trắng trứng tốt nhất khi có sự có mặt của
muối Ka với lực ion khoảng 0,1 (Salton, 1957) . Lysozyme dung giải ít hơn trong dung
dịch muối Mg hay Ca so với dung dịch muối K và Na (Smolelis và Hartsell, 1949).
2.3.4 Điều kiện canh trường
Sự dung giải tế bào vi khuẩn bao gồm sự phá vỡ cấu trúc bề mặt của tế bào. Vì thế,
yếu tố ảnh hưởng đến sự bền của cấu trúc bề mặt tế bào hay bất cứ chất nào ngăn cản
sự tiếp xúc giữa Lysozyme và cơ chất của nó đều ảnh hưởng đến hoạt động dung giải
của Lysozyme (Salton, 1957).
III. SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH LYSOZYME
TỪ LÒNG TRẮNG TRỨNG.
3.1 Đặc điểm các kỹ thuật tách Lysozyme từ lòng trắng trứng.[5]
Có nhiều phương pháp tách Lysozyme từ lịng trắng trứng đã được phát triển.Hầu
hết chúng được tiến hành trong phòng thí nghiệm để có enzyme có hoạt tính cao nhưng
chỉ một số trong đó có tính khả thi trên quy mơ thương mại như quy trình kết tủa và kết
tinh lọc màng , sắc ký gel, sắc ký ái lực, siêu lọc .

8



Phương pháp kết tủa là phương pháp cổ điển trong phịng thí nghiệm và quy trình
thương mại để tách Lysozyme từ lòng trắng trứng dựa trên sự kết tủa trực tiếp của
enzyme với muối NaCl 5%. Cần phải thực hiện một vài q trình hịa tan và tái kết tinh
để thu được enzyme có độ tinh khiết cao. Để giảm nồng độ muối trong phần lòng trắng
trứng sau khi tách Lysozyme bằng siêu lọc.
Nói về đặc tính hóa lý của Lysozyme, khối lượng phân tử thấp là đặc điểm để kỹ
thuật lọc màng có tính khả thi, đặc biệt là kỹ thuật siêu lọc để tách Lysozyme. Tuy
nhiên, khả năng Lysozyme tĩnh điện và liên kết với ovomucin và các protein tĩnh điện
khác trong lòng trắng trứng là giảm khả năng khuyếch tán qua màng.
Cơ chế nhận biết cơ chất là cơ sở của phương pháp sắc ký ái lực. Chất hấp phụ
đầu tiên được sử dụng là chitin, sau đó những vật liệu mới được cải tiến như
glucochitin hoặc chitosan cũng được sử dụng để phục hồi Lysozyme. Kỹ thuật sắc ký
ái lực không được chập nhận để sản xuất quy mơ lớn vì chi phí cao, chọn lọc ligands,
dịng chảy của lịng trắng trứng khơng pha lỗng kém, quy trình rửa giải tốn kém, mất
nhiều thời gian và khơng đặc hiệu với các protein khác trong lịng trắng trứng.
Điểm đẳng điện rất cao của Lysozyme giúp tách enzyme khỏi các protein trong
lòng trắng trứng khác bằng sắc ký trao đổi ion. Việc ứng dụng nhựa trao đổi ion là một
bước tiến hiệu quả của việc tách enzyme. Các loại hạt nhựa như carboxymethyl
cellulose (CMC), carboxymethyl-sephadex,… đều có mặt trên thị trường với mức giá
vừa phải, có thể sử dụng cho việc trao đổi trong một thời gian dài.
Sấy thăng hoa và sấy phun được sử dụng để làm mất nước các chế phẩm
Lysozyme dạng lỏng.Cả hai kỹ thuật đều khơng giảm hoạt tính của enzyme.
3.2 Sắc ký trao đổi ion để tách Lysozyme
3.2.1 Bản chất của sắc ký trao đổi ion
Sắc ký trao đổi ion dựa trên hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion linh
động của pha tĩnh rắn với các ion trong dung dịch phân tích khi cho dung dịch đi qua
cột được nạp đầy pha tĩnh.Pha tĩnh trong trường hợp này gọi là các chất trao đổi ion
(ionit).Bản chất quá trình tách này là do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch
với các nhóm chứa ion của ionit.


9


Hình 5. Bản chất của sắc ký trao đổi ion.
3.2.2 Nguyên tắc của sắc ký trao đổi ion
 Trước tiên protein sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tương tác ion
giữa các nhóm mang điện tích trái dấu.
 Sau đó protein được chiết rút riêng biệt nhờ việc tăng dần lực ion làm cho tương
tác ion bị bẻ gãy thông thường dùng gradient muối NaCl hay gradient pH.
Bởi vì các nhóm có chứa điện tích của các phân tử đều có thể điều chỉnh được, do
đó điện tích bề mặt phụ thuộc nhiều vào pH của dung dịch. Trong trường hợp các
protein được cấu tạo từ nhiều acid amin khác nhau, nên điện tích bề mặt của nó sẽ thay
đổi nếu ta thay đổi pH bề mặt của mơi trường.
Một protein khơng chứa điện tích tại điểm pH bằng pI. Tuy nhiên ,Ở môi trường
pH > Pi phân tử P thể hiện tính axit cho ion H+, do đó số điện tích âm lớn hơn số điện
tích dương , đa anion , tích điện âm. Nếu pHnhiều hơn điện tích âm.[1]
Dựa vào tính chất đó mà ta có thể tiến hành phân tách hay tinh sạch protein theo
phương pháp sắc ký trao đổi ion.

10


Hình 6 Sắc ký trao đổi ion dùng phân tách các Protein.
3.2.3 Cơ sở lý thuyết để tách Lysozyme bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi cation .
Thành phần và tính chất của protein trong lịng trắng trứng để thể hiện qua Bảng
4.

11

Bảng 4. Đặc điểm của Protein trong lòng trắng trứng (Powrie và Nakai,1985)
Protein

Thành phần (%)

Điểm đẳng điện

Trọng lượng phân
tử (Da)

Ovalbumin

54

4.5

44500

Conalbumin

12

6.1

77700

Ovomucoid

11

4.1

28000

Ovomucin

3.5

4.5-5

5.5-8.3x106

Lysozyme

3.4

10.7

14300

Gobulin

4

5.5

49000

Avidin

0.05

10

68300

Qua Bảng 4 ta thấy Lysozyme có điểm đẳng điện pI cao là 10.7 phù hợp với việc
tách Lysozyme khỏi các Protein khác bằng kỹ thuật sắc ký ion dương với dung dịch
đệm pH từ 7-10. Vì Lysozyme mang điện tích dương sẽ được giữ lại trong cột. Các
protein khác có điện tích càng âm sẽ được rửa giải ra trước.
3.2.4 Ưu điểm của nhựa Amberlite FPC 3500 trong sắc ký ion trao đổi tách
Lysozyme từ lòng trắng trứng[6]
Carboxymethyl cellulose (CMC) đã được sử dụng trong quá khứ để giữ
Lysozyme (Strang, 1984). Tuy nhiên, do kích thước hạt mịn của nó, xử lý khó khăn và
dịng chảy tốc độ rất chậm đối với cột sắc ký. Magnetic cation trao đổi cation (Safarik
và cộng sự, 2007), siêu lọc (Wan và cộng sự, 2006) là một số các phương pháp khác
được sử dụng để tách protein. Tuy nhiên, tất cả các phương pháp này có vấn đề trong
việc sản xuất quy mơ thương mại và β-mercaptoethanol không thể được sử dụng trong
ngành công nghiệp thực phẩm. Lysozyme được tách ra bằng sắc ký trao đổi cation.
Amberlite FPC 3500 (styrene-divinylbenzene, khả năng trao đổi ion >2.6 mEq/g), được
sử dụng làm nhựa trao đổi cation.
Ưu điểm:
Việc sử dụng nhựa Amberlite FPC 3500 dễ dàng hơn, đơn giản hơn và hiệu quả
hơn. Amberlite FPC 3500 hoạt động tốt hơn hơn CMC. Một vấn đề của nhựa CMC là
các hạt mịn của CMC nổi trên bề mặt của chất lỏng và dẫn đến sự mất mát của nhựa
trong suốt bước cân bằng và rửa giải để nghiên cứu quy mô công nghiệp. Nhựa
12

Amberlite FPC 3500 có hạt lớn hơn (0,3-1,18 mm so với đường kính 25-60 μm), giúp
dễ dàng xử lý, có khả năng trao đổi ion cao hơn (> 2,6 so với 1,0 mEq / mL), và giá
thành thấp hơn nhựa cellulose CM. Nhựa trao đổi cation CM-Toyopearl 650M cũng có
kích thước hạt nhỏ và có khả năng trao đổi ion thấp hơn nhưng giá thành cao hơn nhựa
Amberlite FPC 3500 (0.24 so với 2.6 mEq / mL). Do đó, Amberlite FPC 3500 là loại
nhựa trao đổi cation tốt cho Lysozyme tách lịng trắng trứng so với nhựa khác.Vì
khơng có hóa chất nào được thêm vào trứng, các protein trong dung dịch trắng trứng
Lysozyme khơng có sự thay đổi về vật lý hoặc hóa học. Như vậy, tách Lysozyme sử
dụng nhựa FPC 3500 được chọn làm bước đầu tiên cho sự tách ly tuần tự của nhiều
protein trong lòng trắng trứng. Sau khi loại bỏ Lysozyme, nhựa có thể dễ dàng tái tạo
bằng cách rửa nhựa 2 đến 3 lần với 5 thể tích 3% HCl, rửa 2 đến 3 lần với 10 thể tích
nước cất, sau đó cân bằng với 0,1 M glycine-NaOH đệm, pH 9,0 đến 9,3, trước khi sử
dụng lại.
3.2.5 Quy trình tách Lysozyme bằng sắc ký trao đổi ion dương.[6]
Trứng gà trắng đã được pha loãng với một lượng nước cất tương ứng, bổ sung
nhựa Amberlite FPC 3500 (0,5 g / 10 ml lịng trắng trứng lỗng), và sau đó hỗn hợp
được khuấy trong 12 giờ ở phòng lạnh (4°C) bằng cách sử dụng trên máy khuấy với tốc
độ thấp nhất (RW20 digital, IKA Works Inc., Wilmington, NC). Dung dịch được lọc
qua giấy lọc (cho quy mô phịng thí nghiệm) hoặc ly tâm cho 3.400 g trong 20 phút ở
4°C (để nghiên cứu cho quy mô lớn) và nhựa được thu lại và rửa nhiều lần với nước
cất, và sau đó một lần với 0,1 M glycine-NaOH đệm, pH 9,3. Lysozyme bị giữ lại nhựa
đã được rửa bằng dung dịch 0,1 M Glycine-NaOH, pH 9,3, chứa 0.5 M NaCl. Dung
dịch rửa giải được khử muối bằng cách sử dụng một bộ phận siêu lọc được trang bị
một hộp bằng sợi rỗng (kích cỡ 10 kDa) . Sau đó đem đi sấy thăng hoa hoặc sấy phun
để bảo quản.
Hoạt tính của Lysozyme được kiểm tra bằng phương pháp ELISA của Vidal và
cộng sự (2005)
Phương pháp này cho hiệu suất tốt lên đến 88% và độ tinh khiết trên 95%.

13

Lòng trắng trứng đã đồng nhất

Bổ sung nhựa Amberlite FPC 3500 (0,5 g / 10 ml) sau
đó lắc trong 12 giờ ở 4oC

Tái tạo nhựa, nhựa được rửa với nước, đệm glycineNaOH pH=9.3,Rửa giải với với 0,1 M glycine-NaOH
đệm, pH 9,3, chứa 0,5M NaCl

Khử muối và tiến hành sấy thăng hoa hoặc sấy phun

Lysozyme , Kiểm tra hoạt tính với phương pháp ELISA

Hinh 7. Quy trình tách Lysozyme từ lịng trắng trứng bằng sắc ký trao đổi
Cation.

14


IV. ỨNG DỤNG LYSOZYME TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM[3]
Lysozyme có một số tính chất thích hợp để ứng dụng trong thực phẩm, nó là một
protein bền nhiệt hoạt động trong khoảng (1-100oC) có khả năng hoạt động sau 1 đến 2
phút ở nhiệt độ sơi. Do đó nó ổn định trong suốt q trình sấy phun và sấy thăng
hoa.Nó khơng bị bất hoạt bởi dung môi và không mất hoạt tính khi hịa tan trong nước.
Nó có được chứng minh hoạt động trong khoảng pH 4-10 (Chung and Hancock, 2000).
Cheese: đây là ứng dụng được biết nhiều nhất của Lysozyme trong cơng nghiệp
thực phẩm, để kiểm sốt sự phát triển của vi sinh vật gây hư hỏng (Bevilacqua và cộng
sự, 2010; Doosh và Sawsan, 2014).Việc sử dụng Lysozyme trong việc sản xuất hard
cheese và semi-hard cheese được nghiên cứu vào đầu những năm 1980 với việc Pháp

là nước đầu tiên cho phép ứng dụng công nghiệp Lysozyme trong sản xuất phô mai.
Cộng đồng Châu Âu năm 1995 cho phép sử dụng nó như một chất bảo quản phơ mai
(E1105) mà khơng có bất kỳ giới hạn liều nào, điều đó có nghĩa việc thêm Lysozyme là
cần thiết để ngăn ngừa hư hỏng.Từ đó trở đi, nó dùng để thay thế Nitrate (Schneider và
cộng sự, 2011) và được công nhận là sản phẩm tự nhiên hiệu quả nhất chống
Clostridium tyrobutyricum, một loại vi khuẩn gây hương vị không mong muốn và hiện
tượng nở hoa muộn (late blowing) trong cheese (Pellegrino và Tirelli, 2000). Trong q
trình ủ chín cheese, hiện tượng nở hoa muộn xảy ra khi Clostridium tyrobutyricum tiến
hành lên men butyric.Sự chuyển hóa của acid lactic dẫn đến sản sinh các axit hữu cơ
khác cũng như khí H2 và CO2. Sự tích tụ khí dẫn đến tạo thành các lỗ khí hoặc vết nứt
cho cheese. Các thơng số cơng nghệ, như pH, hoạt tính nước, hàm lượng muối, và
nhiệt độ chín, có thể ảnh hưởng đến hoạt động của Lysozyme đối với Clostridium spp.
Ví dụ, Nồng độ ion cao (muối 0.2 M) sẽ ức chế ảnh hưởng hiệu quả của Lysozyme
(Chung và Hancock, 2000). Liều Lysozyme 25g / l sữa ngăn ngừa hiện tượng nở hoa
muộn trong thời gian 60 ngày ở 15 ° C (59 ° F). Lượng Lysozyme trong phô mai
thường dao động từ 50 đến 350 mg / kg phơ mai (Avila và cộng sự, 2014).
Lysozyme có tính đặc hiệu cao để ngăn ngừa vi khuẩn gây ơ nhiễm mà khơng ức
chế q trình ủ chín, nó cịn góp phần làm tăng tốc độ ủ chín cheese. Cụ thể, sự phân
giải các vi khuẩn gây hư hỏng sẽ bắt đầu giải phóng các enzyme, nó đóng vai trị then
chốt trong q trình phân giải Protein trong suốt q trình ủ chín. (Abdou và cộng sự,
2013).
Rượu vang: Ngồi ứng dụng trong bơ sữa, việc sử dụng Lysozyme còn được sử
dụng cho rượu vang. Vào năm 1999, sau khi phê duyệt lần đầu tiên năm 1997 bởi Tổ
chức Vine and Wine Quốc tế, Lysozyme đã được chính thức cho phép như là một chất
thay thế tự nhiên hoặc bổ sung sulfur dioxide, một hợp chất có độc tính cho người. Lưu
huỳnh dioxide không phải luôn luôn được thay thế bởi Lysozyme bởi vì Lysozyme
khơng thể hồn tồn tự nó ngăn ngừa sự hư hỏng do vi sinh vật, mặc dù Lysozyme có
hiệu quả trong việc kiểm sốt, ít nhất là một phần, chất nhiễm bẩn của nấm men và vi
15

khuẩn axetic gây ra axit dễ bay hơi trong rượu vang (Liburdi và cộng sự, 2014).
Lysozyme cũng được sử dụng trong quá trình sản xuất rượu để ngăn ngừa sự hư hỏng
do vi khuẩn Gram dương và để trì hỗn quá trình lên men gây malolactic. Cụ thể,
Lysozyme được sử dụng trong quá trình lên men rượu để hạn chế sự gia tăng các vi
khuẩn lactic không mong muốn, chủ yếu là Pediococcus spp, Lactobacillus spp, and
Leuconostoc mesenteroides, hoặc để kiểm sốt q trình lên men malolactic. Q trình
lên men malolactic là quá trình phụ thường xảy ra cuối quá trình lên men,trong đó vi
khuẩn Lactic sẽ tách cacboxyl của L-malic acid, trong tự nhiên được tìm thấy trong quả
nho, từ đó dẫn đến ít L-malic acid và giải phóng CO 2 trong quá trình. Malolactic lên
men làm giảm axit rượu và ổn định hoạt tính của vi sinh vật (Carrillo và cộng sự, 2014;
Liburdi và cộng sự, 2014).
Quy định của Ủy ban EC số 643/2006 quy định bổ sung tối đa tỷ lệ Lysozyme
500 mg / lít rượu (Commission Regulation, 2006). Lysozyme có thể được sử dụng ở
các giai đoạn khác nhau của sản xuất rượu vang và ở các liều khác nhau, dao động từ
100 đến 500 mg / L tùy thuộc vào mục tiêu (Carrillo và cộng sự, 2014).Hoạt tính
Lysozyme khơng bị ảnh hưởng đáng kể bởi các quy trình cơng nghệ thơng thường
được sử dụng trong sản xuất rượu vang. Hơn nữa, enzyme không ảnh hưởng đến chất
lượng cảm quan của rượu vang, và nó khơng làm thay đổi màu của rượu trắng trong
suốt quá trình bảo quản của chúng (Carrillo và cộng sự, 2014). Cuối cùng, nó khơng
gây bất lợi ảnh hưởng đến sự phát triển của men Saccharomyces hoặc các giai đoạn của
quá trình lên men (Roldán và cộng sự, 2012). Tuy nhiên, Lysozyme ổn định hơn ở các
loại rượu vang trắng so với rượu đỏ, và hoạt tính kháng khuẩn của Lysozyme đối với vi
khuẩn lactic khác với rượu vang trắng và đỏ. Trong rượu vang đỏ, Lysozyme bị tổn hại
do sự giải phóng các polyphenol khỏi bã nho. Lysozyme liên kết với tanin và các
phenol khác trong rượu vang đỏ dẫn đến sự bất ổn định màu sắc và sự hình thành chất
kết tủa. (Tirelli và De Noni, 2007, Liburdi và cộng sự, 2014). Khi Lysozyme có mặt
trong sản phẩm cuối cùng,việc đưa chất gây dị ứng của trứng phải được ghi nhãn trong
ghi nhãn rượu vang theo Quy định của Ủy ban châu Âu số 579/2012 (Commission
Regulation, 2012c).

Bia: Việc sử dụng Lysozyme làm chất bảo quản trong bia đã được phê duyệt
(Commission Regulation, 2012b). Lysozyme có hiệu quả trong việc kiểm soát sự phát
triển của vi khuẩn làm hỏng bia, đặc biệt là vi khuẩn axit lactic. Một số lượng hạn chế
vi khuẩn axit lactic thích ứng với hoa bia và có khả năng làm hỏng bia. Lactobacillus
brevis and Pediococcus damnosus là nguyên nhân chính gây ra acid lactic và diacetyl
dẫn đến các loại hương vị không mong muốn và độ đục cao trong sản phẩm cuối cùng.
Khi các vấn đề ô nhiễm vi sinh vật trong sản xuất và tiêu dùng, enzyme có thể được
dùng ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình sản xuất bia để tránh nhiễm và kéo dài
thời gian sử dụng (Vaughan và cộng sự, 2005). Lysozyme, khi bổ sung vào bia ở nồng
độ 100 ppm, có tác dụng ức chế mạnh mẽ đối với bất kỳ vi khuẩn lactic nào có thể có
và rất ổn định trong suốt thời hạn sử dụng mà không ảnh hưởng bất lợi đến hương vị
16


bia hoặc độ bền của bọt (Silvetti và cộng sự, 2010). Lysozyme hoạt động tốt đối với vi
sinh vật gram dương ở nồng độ 100 mg / L bia, nhưng nó khơng có tác dụng chống lại
một số loại vi sinh vật gây hư hỏng khác (men và Acetobacter aceti), do đó Lysozyme
cần thêm một sự kết hợp của các phương pháp bảo quản khác, để đảm bảo sự ổn định
của bia trong suốt quá trình bảo quản (Franchi và đồng sự, 2012).
Các ứng dụng khác: Lysozyme được sử dụng như là một chất chống vi sinh vật
hiệu quả trong việc kéo dài thời hạn sử dụng của một số thực phẩm bao gồm rau tươi,
cá, sản phẩm cá chế biến, thịt, thịt chế biến, trái cây và hải sản. Các tính chất kháng vi
sinh vật của Lysozyme và việc sử dụng chúng để kiểm sốt tốt q trình lên men và vi
sinh vật hư hỏng trong chế biến thực phẩm khác nhau được trình bày trong Bảng 5.
Đặc biệt Lysozyme có hiệu quả chống lại các vi khuẩn gây bệnh cho gia súc và gia
cầm, và nó cũng kiểm sốt sự hình thành độc tố Clostridium botulinum ở cá, gia cầm
và nhiều loại rau củ (Hughey và cộng sự, 1989, Natress và cộng sự, 2001, Sung và
cộng sự, 2011, Juneja và cộng sự, 2012). Hiện tượng giảm trọng lượng cũng như hơ
hấp và hư hỏng, có thể giảm bằng cách phủ Lysozyme bề mặt (Han và cộng sự, 2008).
Bao bì hoạt tính sinh học: Lysozyme là một đại diện cho chất bảo quản sinh học

được nghiên cứu nhiều nhất. Khơng giống như các hệ thống bao bì thơng thường, chỉ
kéo dài thời hạn sử dụng, bao bì chống vi sinh vật được biết đến như là bao bì hiệu quả
bởi vì nó có khả năng giết hoặc ức chế các vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm. Hệ
thống này cho phép kiểm sốt sự giải phóng Enzyme với tỷ lệ phù hợp từ màng trên bề
mặt của thực phẩm, nơi mà phản ứng gây hư hỏng diễn ra mạnh mẽ nhất. Sự giải
phóng bền vững này cho phép duy trì nồng độ cần thiết để ức chế sự phát triển của vi
sinh vật trong quá trình bảo quản thực phẩm. Lysozyme được kết hợp vào các vật liệu
đóng gói thực phẩm có khả năng kéo dài thời hạn sử dụng của thực phẩm không đông
lạnh, ướp lạnh hoặc chế biến tối thiểu bằng cách ngăn ngừa sự nhiễm bẩn hoặc sự phát
triển của các vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm và sinh vật gây bệnh (Leśnierowski và
Cegielska-Radziejewska, 2012; Alhazmi và cộng sự, 2014). Việc bổ sung Lysozyme
trong một polymeric matrix hỗ trợ bởi cố định, hấp thụ được áp dụng thành công. Một
vài vật liệu như chitosan, alginate, gelatin, carrageenan, whey protein, sodium
caseinate, soy protein, cũng như các vật liệu nhựa, như polyvinyl alcohol and cellulose
acetate, đã được sử dụng làm chất mang Lysozyme (Bayarri và cộng sự, 2014). Các
màng hoạt tính có chứa Lysozyme đã được phát triển. Ví dụ các phân tử Lysozyme kết
hợp với chuỗi methoxyl pectin hình thành nên nhiều phức hợp phân tán đồng nhất
trong màng. Lysozyme trong màng nhắm tới các vi sinh vật nhạy cảm với Lysozyme
như một số chủng Bacillus spp. Và Clostridium spp. Có thể sản xuất pectinolytic
enzyme trong các sản phẩm có chứa trái cây và rau quả (Bayarri và cộng sự, 2014).

17


Bảng 5. Ảnh hưởng của Lysozyme đến việc bảo quản các loại thực phẩm.
Sản phẩm

Ảnh hưởng

Liều dùng

Ức chế Listeria monocytogenes

1000 μg/mL

Sản phẩm từ sữa:

Sữa

Ức chế Bacillus anthracis

2 mg/mL

Hard cheeses

Ức chế C. tyrobutyricum

50–350 mg/kg

Italian
mozzarella

Ức chế Hafnia alvei và kéo dài thời hạn sử
dụng khi kết hợp với disodium
ethylenediaminetetraacetic acid

0.0078 g/L

cheese

Thịt và sản phẩm từ thịt:
Thịt heo

Ức chế Brochothrix thermosphacta và
Carnobacterium spp. Sử dụng độc lập hoặc
kết hợp với nisin.

130–195 μg/cm2

Ức gà

Kéo dài thời gian sử dụng.

1 mg/mL

Xúc xích và

Ức chế B. thermosphacta, L. mesenteroides,
và Lactobacillus sakei

25.5 g/L of
Lysozyme–nisin

bologna

Ức chế L. monocytogenes sử dụng kết hợp với
nisin and ethylenediaminetetraacetic acid

Thịt bò xay

Ức chế B. anthracis

2 mg/g

Fillet cá da trơn

Ức chế L. monocytogenes

3 mg/mL of water

Các sản phẩm
từ cá hồi

Ức chế L. monocytogenes

3 mg/mL of water

(1:3)

Cá và sản phẩm từ cá:

Trái cây và rau quả:

18


Rau tươi

Ức chế L. monocytogenes

100 mg/kg

Kiểm sốt và phịng ngừa lên men malolactic .

100–150 mg/L

Ổn định rượu vang sau quá trình lên men
malolactic, bảo vệ rượu vang trong suốt quá
trình lên men rượu chưa đạt yêu cầu.

250–300 mg/L

Ức chế hoàn toàn lên men malolactic .

500 mg/L

Ức chế vi khuẩn sinh lactic.

100 mg/kg

Đồ uống có cồn:

Rượu vang

Bia
V. KẾT LUẬN

 Lysozyme là một enzyme có đặc tính chống vi sinh vật được tìm thấy rộng khắp
từ mơ động vật và thực vật đến VSV.
 Hiện nay, Lysozyme từ lòng trắng trứng gà là Lysozyme duy nhất được ứng

dụng công nghiệp trong công nghiệp thực phẩm.
 Lysozyme phân cắt liên kết β-1,4-glycoside giữa axit N-acetylmuramic và Nacetylglucosamine của peptidoglycan, thành phần cấu tạo của thành tế bào vi
khuẩn.
 Lysozyme có hiệu quả chủ yếu chống lại vi khuẩn Gram dương, nhưng phổ của
nó có thể được mở rộng theo hướng Gram âm, thơng qua hiệu chỉnh, hóa học,
hoặc kết hợp với chất bảo quản khác.
 Sắc ký trao đổi ion có nhiều ưu điểm so với các phương pháp khác và là kỹ
thuật hiệu quả hiện nay để tách Lysozyme khỏi các Protein khác trong lịng
trắng trứng với chi phí vừa phải phù hợp và cho hiệu quả đạt hơn 88% với độ
tinh khiết cao trên 95% phù hợp cho quy mô thương mại.
 Sự an tồn và ổn định cơng nghệ của Lysozyme làm nó trở thành chất bảo quản
lý tưởng cho cơng nghiệp thực phẩm, mặc dù có thể gây dị ứng và Hội Đồng
Châu Âu yêu cầu phải ghi nhãn.
 Trong quá trình sản xuất phomai, Lysozyme ngăn ngừa sự phát Clostridium
tyrobutyricum, nó là ngun nhân chính gây ra hiện tượng nở hoa muộn (late
blowing) trong phô mai. Sự nở hoa muộn là sự tạo thành khí trong suốt quá trình
lên mên butyric xảy ra trong q trình ủ chín phô mai tạo nên những kết quả
không mong muốn như: lỗi trong cấu trúc thông qua sự phát triển của những

19


mắt có hình dáng khơng đúng, tạo mùi vị khơng mong muốn và khối phơ mai có
thể bị vỡ ra hồn tồn.
 Lysozyme cũng kiểm sốt sự phát triển của vi sinh vật sinh lactic trong bia và
rượu vang.
 Các loại thực phẩm khác có thể được bảo quản bằng cách phủ Lysozyme ở bề
mặt.

20

TÀI LIỆU THAM KHẢO
[

21