.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

THÂN TRỌNG QUÂN

NGHIÊN CỨU IN VITRO HIỆU QUẢ DIỆT KHUẨN
ENTEROCOCCUS FAECALIS CỦA LASER DIODE 810 NM
TRONG NỘI NHA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SĨ
CHUYÊN NGÀNH: RĂNG HÀM MẶT
MÃ SỐ: 8720501

TP HỒ CHÍ MINH – 2018

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH

-----------------

THÂN TRỌNG QUÂN

NGHIÊN CỨU IN VITRO HIỆU QUẢ DIỆT KHUẨN
ENTEROCOCCUS FAECALIS CỦA LASER DIODE 810 NM
TRONG NỘI NHA

LUẬN VĂN THẠC SĨ RĂNG HÀM MẶT
MÃ SỐ: 8720501

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THU THỦY

TP HỒ CHÍ MINH – 2018
.


.

LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai cơng bố trong bất kì cơng
trình nào khác.
Kí tên

Thân Trọng Quân

.



.

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày

tháng

năm 2018

GIẤY CAM KẾT
TUÂN THỦ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Y HỌC
Tơi tên là:
Học viên của lớp:

Niên khóa:

Chun ngành:

Mã số:

Tên đề tài luận văn:
Tơi cam kết tồn bộ q trình nghiên cứu của đề tài đúng với đề cƣơng
nghiên cứu đã đƣợc cấp thẩm quyền phê duyệt; kết quả nghiên cứu là trung thực và
chính xác của riêng tơi; và tn thủ đúng các quy định về đạo đức nghiên cứu y học
của hƣớng dẫn quốc gia về đạo đức trong nghiên cứu Y học của Bộ Y tế và quyết
định số 111/QĐ-BYT ngày 11/1/2013 về việc ban hành quy chế tổ chức hoạt động
của hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học cấp cơ sở.
Tôi xin cam kết sẽ chịu hồn tồn trách nhiệm nếu khơng thực hiện đúng

các quy định pháp lý hiện hành về việc thực hiện đạo đức trong nghiên cứu y học.
Ngƣời hƣớng dẫn

Ngƣời cam kết
(ký và ghi rõ họ tên)

.


.

MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... i
DANH MỤC BIỂU ĐỒ .......................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................. iv
ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 4
1.1.VI KHUẨN TRONG NỘI NHA .................................................................... 4
1.1.1.Hệ vi khuẩn miệng ................................................................................... 4
1.1.2.Hệ vi khuẩn trong bệnh lý nội nha ........................................................... 5
1.2.PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG VI KHUẨN ............................................. 8
1.2.1.Nuôi cấy đếm khuẩn lạc ........................................................................... 8
1.2.2.PCR .......................................................................................................... 9
1.2.3.Real – time PCR ....................................................................................... 10
1.3.LASER TRONG NỘI NHA ........................................................................... 15
1.3.1.Sơ lƣợc về tia laser ................................................................................... 15
1.3.2.Tƣơng tác giữa laser với mô sống và các hiệu ứng xảy ra ....................... 17
1.3.3.Về laser phổ hồng ngoại gần .................................................................... 20
1.3.4.Ứng dụng laser trong nội nha và khử khuẩn nội nha ............................... 22

1.3.5.Các nghiên cứu về khả năng diệt vi khuẩn Enterococcus faecalis của laser
diode 810 nm trên thế giới................................................................................. 26
1.3.6.Các nghiên cứu về khả năng diệt khuẩn của laser diode ở Việt Nam ...... 28
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 30
2.1.ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 30
2.1.1.Mẫu nghiên cứu ........................................................................................ 30
2.1.2.Phƣơng pháp chọn mẫu ............................................................................ 30
2.1.3.Tiêu chí chọn mẫu .................................................................................... 30
2.2.PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 31
2.2.1.Thiết kế nghiên cứu .................................................................................. 31

.


.

2.2.2.Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 31
2.3.PHƢƠNG TIỆN VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ......................................... 31
2.3.1.Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 31
2.3.2.Vật liệu ..................................................................................................... 32
2.3.3.Giới thiệu về laser diode PICASSO và phƣơng thức tác động ................ 33
2.4.PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN...................................................................... 35
2.4.1.Chuẩn bị mẫu răng ................................................................................... 35
2.4.2.Hoạt hóa và chuẩn bị huyền trọc vi khuẩn Enterococcus faecalis ACTT
29212 ................................................................................................................. 38
2.4.3.Quy trình thực hiện................................................................................... 38
2.5.MÔ TẢ BIẾN SỐ ........................................................................................... 42
2.5.1.Biến độc lập .............................................................................................. 42
2.5.2.Biến phụ thuộc.......................................................................................... 42
2.6.PHƢƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ KẾT QUẢ THỐNG KÊ ........... 42

2.6.1.Thu thập số liệu ........................................................................................ 42
2.6.2.Xử lí kết quả thống kê .............................................................................. 43
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ ........................................................................................ 46
3.1.SỰ HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC DƢỚI KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ
QUÉT (S.E.M) ...................................................................................................... 46
3.2.ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU........................... 49
3.3.SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN TRONG CÁC NHĨM THỬ NGHIỆM
THEO PHƢƠNG PHÁP NI CẤY .................................................................. 50
3.4.SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN TRONG CÁC NHÓM THỬ NGHIỆM
THEO PHƢƠNG PHÁP qPCR ............................................................................ 51
3.5.SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN TRONG CÁC NHĨM THEO PHƢƠNG
PHÁP NI CẤY VÀ THEO PHƢƠNG PHÁP qPCR ..................................... 53
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ..................................................................................... 53
4.1.MẪU NGHIÊN CỨU – MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM .................................. 54
4.1.1.Mẫu nghiên cứu ........................................................................................ 54
4.1.2.Mơ hình thực nghiệm ............................................................................... 56
4.2.BÀN LUẬN VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................. 58

.


.

4.2.1.Số lƣợng vi khuẩn trong các nhóm thử nghiệm theo phƣơng pháp nuôi cấy
........................................................................................................................... 58
4.2.2.Số lƣợng vi khuẩn trong các nhóm thử nghiệm theo qPCR ..................... 59
4.2.3.So sánh kết quả nuôi cấy và qPCR ........................................................... 60
4.3.HẠN CHẾ CỦA NGHIÊN CỨU ................................................................... 62
4.4.Ý NGHĨA VÀ ỨNG DỤNG LÂM SÀNG .................................................... 62
KẾT LUẬN ............................................................................................................. 64

KIẾN NGHỊ VÀ HƢỚNG ĐỀ XUẤT NGHIÊN CỨU ...................................... 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

.


.

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hệ vi khuẩn nƣớc bọt............................................................................... 4
Bảng 1.2. Vi khuẩn trong bệnh lý nội nha ............................................................... 5
Bảng 1.3. Phân loại tia laser theo bƣớc sóng trên dãy quang phổ ........................... 17
Bảng 1.4. Các nghiên cứu về khả năng diệt vi khuẩn E. faecalis của laser diode
810nm ....................................................................................................................... 29
Bảng 3.5. Đặc điểm chung của đối tƣợng nghiên cứu ............................................. 47
Bảng 3.6. Số lƣợng vi khuẩn của mỗi nhóm theo phƣơng pháp nuôi cấy ............... 47
Bảng 3.7. Số lƣợng vi khuẩn của mỗi nhóm theo phƣơng pháp qPCR ................... 49
Bảng 3.8. Sự khác biệt về số lƣợng vi khuẩn của các nhóm theo phƣơng pháp qPCR
và ni cấy ............................................................................................................... 50
Bảng 4.9. So sánh số lƣợng mẫu – nhóm của các nghiên cứu ................................. 51

.


.

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Số lƣợng vi khuẩn trung bình của 3 nhóm theo phƣơng pháp ni cấy
.................................................................................................................................. 48

Biểu đồ 3.2. Số lƣợng vi khuẩn trung bình của 3 nhóm theo phƣơng pháp qPCR .. 49
Biểu đồ 3.3. Sự khác biệt về số lƣợng vi khuẩn giữa phƣơng pháp nuôi cấy và
qPCR ........................................................................................................................ 50

.


.

i

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Vi khuẩn Enterococcus faecalis dƣới kính hiển vi điện tử quét SEM ..... 6
Hình 1.2. Đầu dị gắn huỳnh quang sử dụng trong qPCR ........................................ 12
Hình 1.3. Đƣờng biểu diễn khuếch đại ghi nhận cƣờng độ huỳnh quang phát ra ở
ống phản ứng ............................................................................................................ 13
Hình 1.4. Biểu đồ khuếch đại vẽ các đƣờng biểu diễn khuếch đại của mẫu thử và
mẫu chuẩn ................................................................................................................ 14
Hình 1.5. Biểu đồ chuẩn vẽ nên đƣờng biểu diễn chuẩn về mối quan hệ giữa lƣợng
DNA đích có trong các mẫu chuẩn và chu kì ngƣỡng tƣơng ứng............................ 15
Hình 1.6. Hấp thụ tƣơng đối của Melanin, Hemoglobin, HbO2 với tia laser phổ
hồng ngoại gần ......................................................................................................... 21
Hình 2.7. Phân loại ống tủy theo Vertucci ............................................................... 31
Hình 2.8. Thiết bị Laser diode PICASSO (AMD Laser, Indianapolis, USA) ......... 33
Hình 2.9. Đầu tip chuyên dùng cho nội nha (AMD Laser, Indianapolis, USA) ...... 34
Hình 2.10. Động tác chiếu laser đƣợc Gutknecht đề xuất ....................................... 35
Hình 2.11. Chụp S.E.M ở các vị trí đƣợc đánh dấu A, B, C .................................... 39
Hình 2.12. Chuỗi pha lỗng mẫu ............................................................................. 41
Hình 2.13. Phần mềm đếm khúm vi khuẩn Promega Colony Counter .................... 43
Hình 3.14. Hình chụp dƣới kính hiển vi điện tử quét (S.E.M) ................................ 46


.


.

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
VIẾT TẮT

VIẾT ĐẦY ĐỦ

BHI

Brain – Heart Infusion

CFU

Colony – forming unit

Ct

Cycle threshold

DU

Detected unit – đơn vị phát hiện

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid


E. faecalis

Enterococcus faecalis

PAD

Photoactivated disinfection

PCR

Polymerase chain reaction

PDT

Photoactivated disinfection therapy

qPCR

Quantitative Polymerase chain reaction,
Real time polymerase chain reaction.

SF

Streptococcus Faecalis Medium

SH

Sodium Hypochlorite


VBNC

Viable but non culturable

.


.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Điều trị nội nha là một trong những điều trị thƣờng gặp nhất của hành nghề
nha khoa, với mục đích giữ lại răng thật cho bệnh nhân, thơng qua việc điều trị bệnh
lý của tủy và hệ thống ống tủy chân răng (có hay khơng có bệnh lý quanh chóp kèm
theo) [16]. Việc điều trị bao gồm: loại bỏ vi khuẩn, các sản phẩm của vi khuẩn, mô
hoại tử, làm sạch và tạo hình tối ƣu cho việc trám bít kín hệ thống ống tủy trong
khơng gian 3 chiều, trong đó loại bỏ vi khuẩn chính là yếu tố then chốt quyết định
thành công lâu dài của điều trị [13]. Hiện nay cơ chế diệt khuẩn thƣờng dùng là kết
hợp sửa soạn cơ học và bơm rửa hóa chất kháng khuẩn. Dù đã có nhiều cải tiến, thì
việc tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn trong hệ thống ống tủy vẫn là điều gần nhƣ không
thể [61].
Vi khuẩn nội nha đƣợc chú ý nhất là Enterococcus faecalis (E. faecalis),
bởi vi khuẩn này đã đƣợc tìm thấy trong hầu hết các trƣờng hợp bệnh lý nội nha
nguyên phát và cả thứ phát [56], đƣợc xác định là loại vi khuẩn có vai trị quan
trọng nhất trong các trƣờng hợp nội nha thất bại [52]. Cầu khuẩn Gram dƣơng này
có khả năng sống sót dai dẳng nhờ khả năng xâm nhập sâu trong ống ngà, đề kháng
với các chất kháng khuẩn thông thƣờng, tạo màng biofilm, và đi vào trạng thái cịn
sống nhƣng khơng ni cấy đƣợc (viable but non culturable – VBNC) [15], khi điều
kiện thuận lợi sẽ tái phát gây bệnh [55].
Nguyên nhân quan trọng giúp vi khuẩn tồn tại dai dẳng là sự phức tạp của
hệ thống ống tủy [64], theo đó, một số vùng của ống tủy sẽ khơng thể tiếp cận đƣợc

trong q trình sửa soạn, bơm rửa và trám bít [42]. Một nguyên nhân khác là các
dung dịch bơm rửa chỉ có thể ảnh hƣởng đến độ sâu khoảng 300 µm, trong khi vi
khuẩn có thể tồn tại sâu hơn trong ống ngà và không bị ảnh hƣởng [68].

Chính

vì những hạn chế của phƣơng pháp kết hợp cơ – hóa học thơng thƣờng trong việc
tiêu diệt vi khuẩn, các nhà nghiên cứu ln tìm kiếm một giải pháp diệt khuẩn hiệu
quả hơn. Laser với những ƣu điểm vƣợt trội đã đƣợc chứng minh, ngày càng đƣợc
ứng dụng nhiều trong y học nói chung và nha khoa nói riêng, đặc biệt trong lĩnh vực
diệt khuẩn, bởi khả năng diệt vi khuẩn kể cả những loại vi khuẩn kháng thuốc [19].

.


.

Trong nội nha, những nghiên cứu đầu tiên ứng dụng laser khơng thu đƣợc thành
cơng, nhƣng những thơng tin tích cực thu đƣợc cũng đã góp phần thúc đẩy cho
những nghiên cứu sau này [66].
Với sự ra đời của đầu dẫn quang nhỏ, mềm dẻo, thuận lợi cho việc dùng
trong ống tủy, nghiên cứu hiện nay hƣớng đến việc sử dụng laser nhƣ một phƣơng
pháp thay thế hoặc bổ sung cho phƣơng pháp diệt khuẩn truyền thống. Nhiều tác giả
đƣa ra tỉ lệ diệt khuẩn đầy hứa hẹn của nhiều loại laser với bƣớc sóng khác nhau
[9], [26]. Một ƣu thế khác của laser, đặc biệt là bƣớc sóng thuộc phổ hồng ngoại
gần, là khả năng xâm nhập tốt vào cấu trúc mơ men ngà làm tia laser có khả năng
tiếp cận tới những vùng mà bình thƣờng khơng thể tiếp cận trong hệ thống ống tủy
[63]. Trong xu thế hiện nay, thiết bị laser diode phát ra bƣớc sóng thuộc phổ hồng
ngoại gần (từ 810 đến 1024 nm) với sự đơn giản, nhỏ gọn, tiện dụng đi kèm đầu dẫn
quang nhỏ, mềm dẻo đang ngày càng đƣợc chú ý và nghiên cứu áp dụng trong nội

nha [17]. Trong một nghiên cứu về khả năng diệt khuẩn của các thiết bị laser diode,
Beer (2012) đã mô tả laser diode là “một thiết bị của nha khoa hiện đại” [9].
Các nghiên cứu về diệt khuẩn nội nha hiện nay vẫn sử dụng phƣơng pháp
nuôi cấy, dù là chuẩn vàng để định lƣợng vi sinh vật, phƣơng pháp này có nhiều
nhƣợc điểm: tốn thời gian, phụ thuộc nhiều vào kĩ thuật viên và cơ sở labo… Các
kỹ thuật mới dựa trên sinh học phân tử nhƣ phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase
chain reaction – PCR), đặc biệt là phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian thực (Realtime PCR) cho phép xác định vi sinh vật và định lƣợng nhanh chóng, với độ nhạy
và độ đặc hiệu cao hơn, hứa hẹn sẽ là phƣơng pháp định lƣợng thay thế cho phƣơng
pháp nuôi cấy [67].
Ở nƣớc ta, laser diode đã đƣợc nghiên cứu ứng dụng trong ngoại khoa nói
chung [1], [3] và nha khoa nói riêng [2] nhƣng chƣa có nghiên cứu nào về khả năng
diệt khuẩn của laser diode trong nội nha, do vậy chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu in vitro hiệu quả diệt khuẩn Enterococcus faecalis của laser diode
810 nm trong nội nha”

.


.

Câu hỏi nghiên cứu:
1.

Có hay khơng khả năng diệt khuẩn E. faecalis của laser diode 810 nm?

2.

Có hay khơng sự khác biệt khả năng diệt khuẩn E. faecalis của laser diode

810 nm và dung dịch Sodium hypochlorite 3%?

Mục tiêu cụ thể:
1.

So sánh sự thay đổi mức độ vi khuẩn trong ống tủy thực nghiệm ngay sau

bơm rửa giữa nhóm chứng và các nhóm thử nghiệm với laser diode 810 nm và dung
dịch Sodium hypochlorite 3% bằng phƣơng pháp nuôi cấy.
2.

So sánh sự thay đổi mức độ vi khuẩn trong ống tủy thực nghiệm ngay sau

bơm rửa giữa nhóm chứng và các nhóm thử nghiệm với laser diode 810 nm và dung
dịch Sodium hypochlorite 3% bằng phƣơng pháp real-time PCR.
3.

So sánh mức độ vi khuẩn trong nhóm chứng và các nhóm thử nghiệm đánh

giá bằng phƣơng pháp nuôi cấy và phƣơng pháp real-time PCR.

.


.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

VI KHUẨN TRONG NỘI NHA

1.1.1.


Hệ vi khuẩn miệng

Hốc miệng là một trong những nơi tập trung nhiều vi sinh vật nhất cơ thể
ngƣời, khoảng 6 tỉ vi khuẩn, hơn 700 lồi đƣợc đã đƣợc tìm thấy, tuy nhiên chỉ có
100 – 200 lồi là thƣờng gặp [51]. Sau đây là một số loài đƣợc phân lập từ nƣớc bọt
ngƣời:
Bảng 1.1. Hệ vi khuẩn nước bọt
Ngành

Loài

Firmicutes

Streptococcus
Ruminococcus
Granulicatella
Lactobacillus
Lactococcus
Oribacterium

Bacteroidetes

Bacteroides
Prevotella

Fusobacteria

Fusobacterium
Leptotrichia


Proteobacteria

Neisseria
Burkholderia
Haemophilus/Aggregatibacter
Cardiobacterium

Actinobacteria

Actinomyces

Spirochaetes

Treponema
Nguồn: Anna Edlund (2015) [21]

.


.

Một số loài nhƣ Streptococcus spp. và Veillonella spp., hiện diện ở hầu hết
mọi ngƣời và định cƣ nhiều vị trí trong miệng, phần lớn các lồi có một vị trí đặc
biệt nhƣ trong túi nha chu, phần lƣng lƣỡi, hoặc vịm miệng cứng [51]. Trong đó,
một số lồi đƣợc cho là liên quan với các bệnh hệ thống nhƣ viêm nội tâm mạc, sinh
non, và bệnh mạch vành. Các bệnh lý tại chỗ có Streptococcus mutans và
Lactobacillus liên quan đến sâu răng. Fusobacterium nucleatum, Prevotella
intermedia, Streptococcus constellatus, Porphyromonas gingivalis, Actinomyces
israelii, actinobacillus actinomicetecomitans liên quan đến bệnh lý nha chu [23].

1.1.2.

Hệ vi khuẩn trong bệnh lý nội nha

Vai trò của vi khuẩn trong bệnh lý tủy đã đƣợc chứng minh từ lâu,
Kakehashi và cộng sự (1965) cho biết tủy lộ vơ khuẩn thì khơng hoại tử [31]. Vi
khuẩn gây ra bệnh lý tủy và quanh chóp chính là những vi khuẩn thƣờng trú trong
hốc miệng [23]. Những vi khuẩn này bình thƣờng sống chung với nhau và vơ hại,
nhƣng khi xâm nhiễm vào trong tủy răng, thành phần hệ vi khuẩn sẽ thay đổi và gây
bệnh lý tủy và quanh chóp. Trong một báo cáo năm 2008, Peciuliene và cộng sự
cho rằng có khoảng hơn 12 lồi vi khuẩn trong ống tủy nhiễm trùng [52].
Bảng 1.2. Vi khuẩn trong bệnh lý nội nha
Gram âm

Gram dƣơng

Prevotella nigrescens

Streptococci

Porphyromonas endodontalis

Lactobacilli

Porphyromonas gingivalis

Enterococcus faecalis

Fusobacterium nucleatum


Staphyloccoci

Veillonella parvula

Eubacterium alactolyticus
Propionibacterium propionicum
Actinomyces
Olsenella uli
Parvimonas micra
Nguồn: Peciuliene (2008) [52]

.


.

Trong số vi khuẩn này, Enterococcus faecalis đã đƣợc chứng minh là có
liên quan mật thiết đến bệnh lý nội nha. Đặc biệt là trong những trƣờng hợp nội nha
lại, điều trị thất bại hay những nhiễm trùng nội nha dai dẳng [52].
1.1.2.1.

Đặc điểm của vi khuẩn Enterococcus faecalis

Enterococcus faecalis là liên cầu khuẩn Gram dƣơng, đƣờng kính khoảng
0,6 – 0,8 µm, xếp liên tiếp nhau thành chuỗi dài ngắn khơng đều, cũng có thể đứng
thành đơi hay thành đám. Vi khuẩn này không di động và không sinh nha bào. Bình
thƣờng, cầu khuẩn này thƣờng trú trong hệ tiêu hóa của ngƣời, một số trƣờng hợp
có thể gây bệnh: nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, nhiễm trùng đƣờng niệu, đặc
biệt nhiễm trùng bệnh viện trên cơ thể suy giảm miễn dịch gây nguy hiểm tính
mạng [30].


Hình 1.1. Vi khuẩn Enterococcus faecalis dƣới kính hiển vi điện tử quét SEM,
độ phóng đại x30000 lần.

.


.

Cầu khuẩn này chỉ chiếm tỉ lệ ít trong hệ vi khuẩn các ống tủy chƣa điều trị,
nhƣng chiếm tỉ lệ cao trong ống tủy các răng kháng điều trị, răng phải điều trị lại,
tổn thƣơng quanh chóp tồn tại hay tiến triển sau điều trị. Khi vi khuẩn này cịn số
lƣợng ít, có thể loại bỏ dễ dàng, nhƣng khi ở số lƣợng lớn, rất khó để tiêu diệt. E.
faecalis có nhiều đặc điểm riêng biệt làm cho nó có thể chịu đƣợc điều kiện mơi
trƣờng khắc nghiệt:
-

Cầu khuẩn này có vỏ polysaccharide, với những yếu tố đề kháng kháng thể.

-

Sherman (1937) báo cáo khả năng tăng trƣởng và phát triển trong khoảng
nhiệt độ từ 10 đến 45°C, chịu đƣợc pH lên đến 9,6, hay dung dịch độ muối
cao lên đến 6,5% NaCl, và tồn tại ở 60°C trong 30 phút [30].

-

Distel (2002) báo cáo về khả năng đề kháng với NaOCl [20].

-


Vi khuẩn chịu đƣợc pH cao đến 11,5 của Ca(OH)2 băng thuốc ống tủy, cơ
chế có liên quan đến sự hoạt động của các bơm proton trên màng tế bào của
vi khuẩn. Các bơm này liên tục bơm proton vào để acid hóa bào tƣơng [65].

-

Ngồi ra, E. faecalis cịn có khả năng gắn kết với thành phần collagen trong
ngà, bám dính vào thành ống tủy, xâm nhập sâu vào các ống ngà và tạo thành
màng sinh học. Màng sinh học làm vi khuẩn này và các loại vi khuẩn khác
liên kết với nhau và càng khó tiêu diệt hơn bởi nó đề kháng với các tác động
cơ học và hóa học trong q trình điều trị tủy [55]. Những đặc tính trên đã có
thể giải thích sự tồn tại của vi khuẩn trong các trƣờng hợp nhiễm trùng dai
dẳng sau điều trị, nơi mà chất dinh dƣỡng rất ít và có mặt các chất kháng
khuẩn.

-

Mơi trƣờng thạch SF (Streptococcus faecalis) trong nuôi cấy là môi trƣờng
chọn lọc, dùng để nhận diện và phân biệt các chủng Enterococci nhóm D. Vi
khuẩn E. faecalis sẽ sản xuất men dextrose ức chế sodium azid làm thay đổi
màu tím của chất chỉ thị Bromcresol purple, hình thành các nhóm khuẩn lạc
trịn, lồi, vàng, bóng khơ.

1.1.2.2.

Vi khuẩn E. faecalis và điều trị nội nha

.



.

E. faecalis đã đƣợc chứng minh có liên quan đến cả bệnh lý nhiễm trùng nội
nha nguyên phát và thứ phát, với các dạng sang thƣơng quanh chóp. Theo đó, tỉ lệ
phát hiện vi khuẩn này trong trƣờng hợp bệnh lý nguyên phát và thứ phát lần lƣợt là
2 – 13% và 8 – 71%, theo phƣơng pháp nuôi cấy. Theo phƣơng pháp real-time PCR
thì những tỉ lệ này lần lƣợt là 5 – 82% và 10 – 76% [71]. Tồn tại sự khác biệt lớn
nhƣ vậy giữa các nghiên cứu, có thể do sự khác biệt về cỡ mẫu, về cách thức điều
trị nội nha, vật liệu trám bít, và đặc biệt là cách thức định lƣợng vi khuẩn.
1.2.

CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG VI KHUẨN

1.2.1.

Nuôi cấy, đếm khuẩn lạc

Nuôi cấy là phƣơng pháp đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu về
vi khuẩn, trong chuyên ngành nội nha, là nghiên cứu về thành phần hệ vi khuẩn và
hiệu quả các phƣơng pháp diệt khuẩn trong nội nha. Ƣu điểm lớn nhất của phƣơng
pháp nuôi cấy là phổ kết quả rộng, giúp xác định đƣợc nhiều loài vi sinh vật trong 1
mẫu, bao gồm cả những loài mà nhà nghiên cứu khơng định tìm kiếm. Ngồi ra,
ni cấy cịn có thể dùng để xác định tính nhạy cảm kháng sinh của 1 loài vi sinh
vật đã phân lập, để nghiên cứu sinh lý và khả năng gây bệnh của chúng [60].
Có nhiều phƣơng pháp để định lƣợng vi sinh vật: đếm trực tiếp, đo độ đục,
đếm gián tiếp bằng cấy và đếm khuẩn lạc hay còn gọi là khúm vi khuẩn (Colony
forming unit – CFU). Trong đó cấy trải rồi đếm khuẩn lạc là phƣơng pháp đƣợc
dùng nhiều nhất. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là cho phép xác định lƣợng tế bào
sống, dễ chọn lọc vi sinh vật đích. Thơng thƣờng, để tính tốn tổng số khuẩn lạc,

nhân tổng số khuẩn lạc (hoặc số khuẩn lạc trung bình của những đĩa ở cùng một
nồng độ pha loãng) với độ pha lỗng tƣơng ứng. Đơn vị tính thƣờng là CFU/ml.
Mặc dù từ lâu đã đƣợc xem là chuẩn vàng trong định danh và định lƣợng tác
nhân gây bệnh là vi sinh vật, phƣơng pháp ni cấy có một số nhƣợc điểm nhƣ: độ
nhạy thấp, tốn nhiều thời gian, công sức, kết quả lại phụ thuộc nhiều vào thao tác kĩ
thuật của kĩ thuật viên và điều kiện cơ sở vật chất của labo, phụ thuộc vào việc duy
trì điều kiện môi trƣờng ổn định trong nhiều công đoạn: lấy mẫu, nuôi cấy, vận
chuyển… Hơn nữa, nuôi cấy không thể phát hiện đƣợc các loại vi khuẩn không thể

.


.

cấy, và trạng thái cịn sống nhƣng khơng thể ni cấy của vi khuẩn (viable but non
culturable – VBNC), điều này có thể sẽ làm kết quả ni cấy khơng phản ánh đúng
tình trạng vi khuẩn [71].
1.2.2.

PCR

Các kỹ thuật mới dựa trên sinh học phân tử nhƣ là PCR, đã khắc phục những
hạn chế của kỹ thuật nuôi cấy, cho phép xác định nhanh chóng vi sinh vật kể cả
ni cấy đƣợc hay không nuôi cấy đƣợc, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn [67].
Tuy vậy, kĩ thuật PCR thông thƣờng chỉ phát hiện đƣợc sự hiện diện chứ khơng xác
định đƣợc số lƣợng vi sinh vật. Ngồi ra, kĩ thuật này cũng có một số nhƣợc điểm.
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng
hợp chuỗi. PCR đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ
nhiều mục đích khác nhau, nhƣ phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đốn
những bệnh nhiễm trùng, tách dịng gene, và xác định huyết thống [4].

PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo
ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần các sinh vật sống, chỉ cần dựa vào
các chu kỳ nhiệt và thực hiện trong ống nghiệm. Thử nghiệm đƣợc thực hiện trong
một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịch phản ứng (gọi là PCR mix) có thể tích vào
khoảng từ 10µl đến 50µl với các thành phần chủ yếu là:
(1) enzyme polymerase chịu nhiệt, thƣờng đƣợc gọi là Taq polymerase, có hoạt tính
tối đa ở 72O C và bền đƣợc với nhiệt độ;
(2) 4 loại desoxyribonucleotide (dNTP) là Adenine, Thymine, Guanine, và Cytosine
(dATP, dTTP, dGTP, và dCTP);
(3) DNA chứa các đoạn DNA đích sẽ đƣợc nhân bản trong ống phản ứng;
(4) các đoạn mồi (primer) xuôi và ngƣợc là các đoạn oligonucleotide có chiều
dài khoảng 20 – 30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của
2 đầu đoạn DNA sẽ đƣợc nhân bản;
(5) ion Mg ++ trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp,
(6) dung dịch đệm Tris-KCl để làm dung mơi thích hợp cho phản ứng.

.


0.

Khi ống nghiệm phản ứng này đƣợc cho vào buồng ủ chu kỳ nhiệt của máy
luân nhiệt (thermal cycler), mà chúng ta thƣờng gọi là máy PCR, chƣơng trình nhiệt
độ trong máy sẽ làm cho nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt của máy thay đổi theo chu kỳ,
nhờ vậy mà phản ứng nhân bản DNA sẽ xảy ra [4].
1.2.3.

Real – time PCR

Trong kỹ thuật PCR, sau khi hoàn tất khuếch đại đoạn DNA đích,

ngƣời làm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số bƣớc thí nghiệm để đọc kết quả xác
định có sản phẩm khuếch đại mong muốn trong ống phản ứng hay không, và giai
đoạn này gọi là giai đoạn thí nghiệm sau PCR. Trong giai đoạn này, ngƣời làm thí
nghiệm có thể thực hiện điện di sản phẩm PCR trên gel agarose để xem có vạch sản
phẩm khuếch đại đúng kích thƣớc mong muốn hay khơng, cũng có thể thực hiện thí
nghiệm lai với các đoạn dị đặc hiệu (trên màng, trên giếng hay phiến nhựa...) để
xem sản phẩm khuếch đại có trình tự mong muốn hay khơng. Kỹ thuật PCR mà cần
phải có giai đoạn thí nghiệm để đọc và phân tích sau khi hồn tất phản ứng khuếch
đại, ngày nay đƣợc gọi là PCR cổ điển (classical PCR).
Real – time quantitative PCR (qPCR) là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại
DNA đích hiển thị đƣợc ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên
đƣợc gọi là real – time (thời gian thực) [4].
1.2.3.1.

Hóa chất và thuốc thử trong qPCR

Chìa khóa kỹ thuật của hóa chất và thuốc thử trong qPCR chính là chất
huỳnh quang đƣợc thêm vào trong ống PCR mix. Chất huỳnh quang này sẽ phát
huỳnh quang khi có sản phẩm khuếch đại DNA đích, và khơng phát huỳnh quang
nếu trong ống khơng có DNA khuếch đại. Hiện nay có 3 chất huỳnh quang chính là:
huỳnh quang chèn SYBR – Green, TaqMan, và Beacons.
Thuốc nhuộm huỳnh quang chèn SYBR – Green là phƣơng pháp đơn giản và
chi phí thấp nhất, bao gồm một loại nhuộm huỳnh quang không đặc hiệu liên kết
với DNA sợi kép. Khi cịn tự do, khơng gắn vào DNA đích, huỳnh quang phát ra
yếu. Đến giai đoạn kéo dài, thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết DNA sợi đôi mới

.


1.


hình thành mà có số lƣợng tăng dần qua từng chu kì, giải phóng huỳnh quang.
Huỳnh quang đƣợc đo cuối giai đoạn kéo dài của mỗi chu kỳ PCR để theo dõi số
lƣợng ngày càng tăng của DNA. Xét nghiệm SYBR – Green độ nhạy cao nhƣng có
độ đặc hiệu thấp, vì thuốc nhuộm liên kết với tất cả DNA sợi kép, và các chất mồi
có thể dẫn đến sai số.
Đầu dò DNA chứa huỳnh quang: đầu dò TaqMan, đặc hiệu hơn xét nghiệm
SYBR – Green nhờ việc sử dụng đầu dò oligonucleotide. Đầu dò oligonucleotide là
một chuỗi oligonucleotide dài 24 đến 30 base, ở đầu 5´ là một chất phát tín hiệu
huỳnh quang (reporter) và ở đầu 3´ là một chất thu nhận tín hiệu (quencher). Khi
chƣa gắn DNA đích, tín hiệu huỳnh quang phát ra ở đầu 5’ bị đầu 3’ hấp phụ. Ở giai
đoạn kéo dài, đầu dị gắn đặc hiệu vào sợi khn, khi đó enzyme Taq polymerase sẽ
cắt phần đầu phát, làm cho đầu phát huỳnh quang và đầu thu khơng cịn ở gần nhau.
Kết quả là đầu phát phát ra tín hiệu huỳnh quang và hệ thống máy qPCR sẽ thu
nhận tín hiệu này. Tín hiệu huỳnh quang thu đƣợc tỷ lệ thuận với nồng độ các probe
bị phá hủy và lƣợng DNA khuếch đại (Hình 1.2).
Một đầu dị huỳnh quang khác đƣợc sử dụng, gọi là đầu dò Beacon
molecular. Là 1 phân tử acid nucleic sợi đơn có cấu trúc thân và vịng. Phần vịng
có thể bắt cặp với 1 chuỗi trong DNA đích, phần thân là sự bắt cặp của 2 cánh tay ở
2 đầu vịng. Một đầu có gắn chất phát tín hiệu, một đầu gắn chất thu nhận tín hiệu.
Khi ở trạng thái tự do trong dung dịch, phân tử ở dạng chiếc kẹp, phần thân bắt cặp,
giữ 2 cánh tay gần nhau, khơng có tín hiệu huỳnh quang. Khi đầu dị bắt cặp với
DNA đích, nó thay đổi hình dạng, 2 nhánh tay tách nhau ra, giải phóng tín hiệu
huỳnh quang (Hình 1.2).
Bằng cách theo dõi sự phát huỳnh quang với mỗi chu kỳ PCR, tiến trình của
phản ứng đƣợc ghi lại trong thời gian thực và lƣợng DNA trong mẫu đƣợc định
lƣợng. Số lƣợng DNA mục tiêu ban đầu trong phản ứng có thể liên quan đến
ngƣỡng chu kỳ (CT) – định nghĩa là số chu kỳ mà tại đó có sự gia tăng đáng kể về
mặt thống kê lƣợng huỳnh quang. DNA mục tiêu sau đó có thể đƣợc định lƣợng


.


2.

bằng cách xây dựng một đƣờng chuẩn hiệu chỉnh liên quan đến ngƣỡng chu kỳ với
số lƣợng mẫu DNA đã biết [60].

Hình 1.2. Đầu dị gắn huỳnh quang sử dụng trong qPCR. (A) Đầu dò TaqMan
và (B) Đầu dò Beacons.
Nguồn: Siqueira (2005) [60]
1.2.3.2.

Các vấn đề kĩ thuật cơ bản của qPCR
 Biểu đồ khuếch đại của qPCR

Biểu đồ khuếch đại giúp kỹ thuật viên có thể quan sát đƣợc quá trình nhân
bản DNA đang xảy ra trong ống phản ứng. Biểu đồ có trục tung (Y) là cƣờng độ
huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng, cịn trục hồnh (X) là các chu kì nhiệt. Trên
biểu đồ khuếch đại (hình 1.3), có thể thấy cƣờng độ huỳnh quang trong ống phản
ứng ở những chu kì đầu là rất thấp và hầu nhƣ không thay đổi, hiển thị bằng 1
đƣờng thẳng nằm ngang, gọi là “giai đoạn ủ” hay “giai đoạn tiềm phục”, vì trong
giai đoạn này DNA đích đã có sự nhân bản nhƣng số lƣợng không đủ để chất huỳnh
quang đủ để máy ghi nhận. Một khi số lƣợng bản sao DNA đạt một ngƣỡng nhất
định, huỳnh quang phát ra có thể đƣợc ghi nhận, lúc này đƣờng biểu diễn khuếch
đại bắt đầu đi lên. Cƣờng độ huỳnh quang lúc này sẽ tăng gấp đơi sau mỗi chu kì
nhiệt, nên giai đoạn này đƣợc gọi là “giai đoạn lũy thừa” về cƣờng độ huỳnh quang.

.



3.

Tăng trƣởng đến 1 mức nào đó thì chậm dần và đạt bình nguyên vì số lƣợng dNTP
trong ống cạn dần và enzyme Taq khơng cịn hoạt động hiệu quả nữa, giai đoạn này
là “giai đoạn bình ngun”.
Một thơng số quan trọng luôn đi kèm đƣờng biểu diễn khuếch đại, đó là “chu
kì ngƣỡng” (Ct – threshold cycle). Chu kì ngƣỡng là chu kì nhiệt mà tại thời điểm
này máy ghi nhận tín hiệu huỳnh quang trong ống phản ứng bắt đầu vƣợt qua cƣờng
độ huỳnh quang nền. Để xác định cƣờng độ huỳnh quang nền, máy thƣờng ghi nhận
cƣờng độ huỳnh quang trong các chu kì đầu, và lấy trung bình cộng các chu kì này
làm cƣờng độ huỳnh quang nền. Đƣờng cắt ngang đi qua cƣờng độ huỳnh quang
nền gọi là đƣờng nền (base line). Chu kì ngƣỡng là trị số đƣợc xác định bằng số chu
kì mà tại đó đƣờng nền cắt đƣờng biểu diễn khuếch đại, thƣờng là 1 số lẻ.

Hình 1.3. Đƣờng biểu diễn khuếch đại ghi nhận cƣờng độ huỳnh quang phát ra
ở ống phản ứng
Nguồn: Phạm Hùng Vân (2009) [4]
Có ống phản ứng sẽ đạt chu kì ngƣỡng Ct sớm và có ống có Ct muộn hơn, là
do số lƣợng DNA đích ban đầu trong ống phản ứng. Nếu ban đầu có lƣợng DNA

.


4.

đích nhiều thì sẽ cần ít chu kì nhiệt hơn để đạt đến cƣờng độ huỳnh quang mà máy
ghi nhận đƣợc, và ngƣợc lại.
 Biểu đồ chuẩn của qPCR
Để xác định chính xác số lƣợng DNA ban đầu trong mẫu thử, cần làm thử

nghiệm cùng lúc với các mẫu chuẩn chứa DNA đích đã biết rõ số lƣợng. Sau khi
hồn tất PCR, trên biểu đồ khuếch đại (hình 1.4), các mẫu chuẩn và mẫu thử sẽ có
đƣờng biểu diễn khuếch đại và chu kì ngƣỡng tƣơng ứng với nó [4].
MẪU THỬ

MẪU CHUẨN
1,2,3
CHỨNG ÂM

Hình 1.4. Biểu đồ khuếch đại vẽ các đƣờng biểu diễn khuếch đại của mẫu thử
và mẫu chuẩn
Đƣờng biểu diễn vẽ lên mối quan hệ giữa chu kì ngƣỡng với số lƣợng DNA
đích ban đầu đƣợc gọi là đƣờng biểu diễn chuẩn. Đây là 1 đƣờng thẳng tuyến tính đi
qua các điểm tọa độ xác định bởi số lƣợng DNA đích ban đầu của từng mẫu chuẩn
(trên trục tung) và chu kì ngƣỡng của ống tƣơng ứng (trên trục hồnh) (hình 1.5) [4].

.