BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VÕ ĐỖ MINH HỒNG

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI
TỪ NỌC BÒ CẠP ĐENHETEROMETRUS LAOTICUS

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 62.44.27.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HỐ HỮU CƠ

TP. Hồ Chí Minh – 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VÕ ĐỖ MINH HỒNG

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI
TỪ NỌC BÒ CẠP ĐENHETEROMETRUS LAOTICUS

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 62.44.27.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HỐ HỮU CƠ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TSKH. Hoàng Ngọc Anh
2. GS. TSKH. Utkin Yuri Nikolaevich

TP. Hồ Chí Minh – 2017


VIỆN HÀM LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ

VÕ ĐỖ MINH HỒNG

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT TOXIN CỦA MỘT SỐ
TOXIN MỚI TỪ NỌC BỌ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số chuyên ngành: 62.44.27.01

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Phản biện độc lập 1:
Phản biện độc lập 2:


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. TSKH. Hoàng Ngọc Anh
2. Giáo sư TSKH Utkin Yuri Nikolaevich

Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2017

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
1) Luận văn này là sản phẩm nghiên cứu của tôi.
2) Số liệu trong luận văn là trung thực.
3) Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

ii


MỤC LỤC
Trang phụ bìa ............................................................................................................. i
Lời cam đoan ............................................................................................................ ii
Mục lục .................................................................................................................... iii
Danh mục các chữ viết tắt ....................................................................................... vi
Danh mục các bảng................................................................................................. vii
Danh mục các hình ................................................................................................ viii
Mở đầu ...................................................................................................................... 1
1. TỔNG QUAN ........................................................................................................2
1.1. Giới thiệu về bọ cạp ...........................................................................................................3
1.1.1. Phân bố và môi trường sống ....................................................................................4

1.1.2. Đặc điểm hình thái cơ bản ........................................................................................5
1.1.3. Nọc độc ..........................................................................................................................6
1.1.4. Bọ cạp ở Việt Nam .....................................................................................................8
1.2. Cấu trúc và ảnh hưởng của toxin nọc bọ cạp ..............................................................9
1.2.1. Cấu trúc của toxin .......................................................................................................9
1.2.2. Tác động và ảnh hưởng của nọc bọ cạp lên kênh vận chuyển ion ...............11
1.3. Một số nghiên cứu về toxin có trong nọc bọ cạp .....................................................17
1.3.1. Các phương pháp cô lập và tinh chế toxin .........................................................17
1.3.2. Một số nghiên cứu nọc độc của chi Heterometrus...........................................19
1.4. Ứng dụng của nọc bọ cạp ...............................................................................................22
1.4.1. Nghiên cứu trên thế giới..........................................................................................22
1.4.2. Nghiên cứu và ứng dụng nọc bọ cạp ở Việt Nam ............................................24
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................26
2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................................27
2.2. Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm .................................................................27
2.2.1. Nuôi bọ cạp trong phịng thí nghiệm ...................................................................27
2.2.2. Xác định pH và hàm lượng protein trong nọc bọ cạp H. laoticus ...............28
2.2.3. Xác định khối lượng phân tử của nọc bọ cạp H. laoticus ..............................29
iii


2.2.4. Cô lập toxin từ nọc bọ cạp ......................................................................................31
2.2.5. Xác định trình tự acid amin trong chuỗi polypeptide ......................................35
2.2.6. Xác định trình tự acid amin của các toxin đối với chuột ................................39
2.2.7. Xác định cấu trúc bậc 1 của phân đoạn 5.21.1 ..................................................40
2.3. Khảo sát độc tính các phân đoạn độc ..........................................................................40
2.3.1. Khảo sát độc tính sơ bộ các phân đoạn độc lên chuột.....................................40
2.3.2. Khảo sát độc tính sơ bộ các phân đoạn độc lên côn trùng .............................41
2.3.3. Xác định độc tính cấp của phân đoạn độc trên chuột ......................................42
2.3.4. Xác định độc tính cấp của phân đoạn độc lên côn trùng ................................43

2.4.Khảo sát sự tương tác của của các phân đoạn độc với kênh vận chuyển K+ .....43
3. NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN........................................................................45
3.1. Định danh bò cạp thu mua tại An Giang ........................................................46
3.2. Ni bọ cạp trong phịng thí nghiệm và thu hoạch nọc .........................................46
3.2.1. Nuôi bọ cạp trong phịng thí nghiệm ...................................................................46
3.2.2. Thu nọc bọ cạp H. laoticus .....................................................................................47
3.3. Khảo sát, đánh giá và phân tích nọc thơ bọ cạp H. laoticus .................................49
3.3.1. Khảo sát độ pH của nọc thơ ......................................................................49
3.3.2. Phân tích hàm lượng protein tổng trong nọc thơ ..............................................49
3.3.3. Phân tích nọc bọ cạp bằng sắc ký lọc gel trên gel Sephadex G50 ...............50
3.3.4. Xác định khối lượng phân tử các phân đoạn nọc .............................................52
3.4. Khảo sát độc tính của nọc bọ cạp H. laoticus đối với chuột .................................54
3.4.1. Đánh giá độc tính của các phân đoạn nọc thu được trên chuột ....................54
3.4.2. Đánh giá độc tính cấp của các phân đoạn độc lên chuột ................................56
3.4.3. Phân tích thành phần phân đoạn 4 ........................................................................58
3.4.4. Khảo sát độc tính của các phân đoạn peptide thứ cấp lên chuột ..................59
3.5. Tinh chế và xác định khối lượng phân tử các phân đoạn thứ cấp có độc tính .62
3.5.1. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.6 ..............................................................62
3.5.2. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.7 ..............................................................64
3.5.3. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.11 ............................................................65
3.5.4. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.15 ............................................................66
iv


3.6. Khảo sát cấu trúc bậc một của các polypeptide phân đoạn 4.6 và tác động lên
kênh vận chuyển K+ .................................................................................................................67
3.6.1. Khảo sát cấu trúc bậc một của các polypeptide phân đoạn 4.6 ....................67
3.6.2. Khảo sát tác động của Hetlaxin lên kênh vận chuyển K+ ..............................70
3.7.Khảo sát độc tính của các phân đoạn của nọc bọ cạp H. laoticus lên dế ...........72
3.7.1. Kết quả khảo sát độc tính các phân đoạn nọc trên dế .....................................72

3.7.2. Xác định độc tính cấp của phân đoạn độc lên côn trùng ................................73
3.7.3. Phân tách phân đoạn 5 .............................................................................................75
3.7.4. Khảo sát độc tính của các phân đoạn thứ cấp trên dế......................................75
3.7.5. Cô lập và xác định khối lượng phân tử protein của các phân đoạn thứ cấp
có độc tính trên dế..................................................................................................................76
4. KẾT LUẬN ..........................................................................................................83
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN .....................................................86
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 123
PHỤ LỤC .............................................................................................................. 131

v


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

COSY

Correlation spectroscopy

DAD

Diode-array detector

DNA

Deoxyribonucleic acid

DQF

Double quantum filtered


EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

HPLC

High performance liquid chromatography

LD

Lethal dose

MALDI

Matrix-assisted laser desorption/ionization

MS

Mass spectroscopy

NOESY

Nuclear Overhauser effect spectroscopy

PAGE

Polyacrylamide gel electrophoresis

PD


Protective dose

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TFA

Trifluoroacetic acid

TOF

Time of flight

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các đại diện của độc tố bọ cạp tác dụng lên kênh vận chuyển natri. ...... 12
Bảng 1.2. Đại diện các nhóm độc tố kênh vận chuyển K+ ...................................... 16
Bảng 2.1. Tóm tắt lập đường chuẩn định lượng protein bằng phương pháp biuret. 29
Bảng 2.2. Thông số sắc ký lỏng hiệu năng cao các phân đoạn độc thứ cấp............. 34
Bảng 2.3. Thơng số q trình sắc ký lỏng hiệu năng cao của phân đoạn 5.............. 35
Bảng 2.4. Dấu hiệu nhận biết sơ bộ độc tính lên chuột của các phân đoạn gây độc.41
Bảng 2.5. Dấu hiệu nhận biết sơ bộ độc tính cơn trùng của các phân đoạn gây
độc. ........................................................................................................................... 42
Bảng 3.1. Kết quả đo mật độ quang của mẫu và chuẩn ........................................... 49
Bảng 3.2. Khối lượng các phân đoạn nọc bọ cạp. .................................................... 51
Bảng 3.3. Kết quả đo UV và nồng độ thực tế của 5 phân đoạn nọc bọ cạp ............. 54

Bảng 3.4. Kết quả thử độc tính trên chuột của các phân đoạn nọc. ......................... 55
Bảng 3.5. Tỷ lệ tử vong của chuột ở các liều khác nhau trong khoảng LD0 và LD100
sau 24 giờ tiêm.......................................................................................................... 56
Bảng 3.6. Bảng tính theo phương pháp Karber – Behrens. ...................................... 56
Bảng 3.7. Kết quả thử độc tính các phân đoạn thứ cấp ............................................ 60
Bảng 3.8. Khối lượng phân tử của các polypeptide tách ra...................................... 68
Bảng 3.9. Kết quả thử độc tính trên dế của các phân đoạn nọc. .............................. 72
Bảng 3.10. Tỷ lệ tử vong của dế ở các liều khác nhau trong khoảng LD0 và LD100
sau 24 giờ tiêm.......................................................................................................... 73
Bảng 3.11. Bảng tính theo phương pháp Karber – Behrens. .................................... 74
Bảng 3.12. Kết quả thử độc tính các phân đoạn thứ cấp trên dế. ............................. 76
Bảng 3.13. Tóm tắt quá trình phân tách phân đoạn 5 bằng HPLC. .......................... 77

vii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Một số lồi bọ cạp đại diện các họ khác nhau ............................................ 4
Hình 1.2. Lồi bọ cạp Heterometrus laoticus Couzijn, 1981 ..................................... 5
Hình 1.3. Cấu trúc toxin ngắn của nọc bọ cạp. ........................................................ 10
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của một số toxin tách ra từ nọc bọ cạp. .................. 10
Hình 1.5. Sắc ký đồ trao đổi ion của nọc bọ cạp loài Tityus serrulatatus. ............... 18
Hình 1.6. Sắc ký đồ sắc ký lọc gel của nọc bọ cạp Scorpio Maurus. ...................... 19
Hình 1.7. Sắc ký đồ sắc ký hiệu năng cao của nọc bọ cạp Scorpio Maurus ............ 19
Hình 2.1. Thau ni bọ cạp trong phịng thí nghiệm. .............................................. 28
Hình 2.2. Thu nọc bọ cạp H. laoticus. ...................................................................... 31
Hình 2.3. Nguyên tắc của phương pháp Edman ....................................................... 36
Hình 2.4. Phản ứng phụ của phương pháp Edman ................................................... 37
Hình 2.5. Xác định trình tự các chuỗi polypeptide ngắn trong chuỗi ban đầu ......... 38
Hình 2.6. Tách hai chuỗi polypeptide liên kết bằng cầu disulfide ........................... 38

Hình 3.1. Trọng lượng bọ cạp trong 6 tháng. ........................................................... 47
Hình 3.2. Mẫu nọc thơ bọ cạp H.laoticus. ................................................................ 48
Hình 3.3. Lượng nọc bọ cạp thu được theo thời gian. .............................................. 48
Hình 3.4. Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng protein. .................................... 50
Hình 3.5. Sắc ký đồ của nọc thô bọ cạp thực hiện bằng sắc ký lọc gel.................... 51
Hình 3.6. Kết quả điện di 5 phân đoạn nọc so với mẫu chuẩn. ................................ 53
Hình 3.7. Đồ thị tỷ lệ % chuột chết theo liều dùng. ................................................. 57
Hình 3.8. Sắc ký đồ khi phân tách phân đoạn 4 bằng HPLC ................................... 59
Hình 3.9. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.6 .............................................................. 63
Hình 3.10. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.6.2. .............................................. 63
Hình 3.11. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.6.3. .............................................. 64
Hình 3.12. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.7.2 ......................................................... 64
Hình 3.13. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.7.2. .............................................. 65
Hình 3.14. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.11.1 ....................................................... 65
Hình 3.15. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.11.1. ............................................ 66
viii


Hình 3.16. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.15. ......................................................... 66
Hình 3.17. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.15.8 bằng MALDI MS. ............... 67
Hình 3.18. Phân tích trình tự acid amin của Hetlaxin bằng khối phổ. ..................... 69
Hình 3.19. Xác định cấu trúc bậc 1 của Hetlaxin bằng khối phổ và phương pháp
Edman. ...................................................................................................................... 69
Hình 3.20. So sánh sự tương đồng của Hetlaxin với các toxin khác........................ 70
Hình 3.21. Sự cạnh tranh của Hetlaxin với R-AgTx trong liên kết với kênh KcsAKv1.1 (A) và KcsA-Kv1.3 (B) ................................................................................. 71
Hình 3.22. Đồ thị tỷ lệ % dế chết theo liều dùng. .................................................... 74
Hình 3.23. Sắc ký đồ của phân đoạn 5. .................................................................... 75
Hình 3.24. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.21 với các bước sóng 226 nm. ............. 78
Hình 3.25. Phổ MS của phân đoạn 5.21.1. ............................................................... 79
Hình 3.26. Phổ MS của phân đoạn 5.21.2. ............................................................... 79

Hình 3.27. Phổ NMR của toxin 5.21.1 ..................................................................... 77
Hình 3.28. Cấu trúc của toxin 5.21.1 (Leu-Trp)....................................................... 78

ix


MỞ ĐẦU
Bọ cạp phân bố ở Việt Nam rộng khắp các vùng miền với số lượng tương đối
lớn. Trong dân gian và y học cổ truyền đã sử dụng bọ cạp làm nguyên liệu trong một
số phương pháp chữa bệnh. Tuy nhiên, việc nghiên cứu một cách có hệ thống và khoa
học về thành phần, tác dụng cũng như ứng dụng của nọc bọ cạp ở Việt Nam hiện nay
còn sơ khai và chưa có nhiều kết quả.
Trên thế giới hiện đã có nhiều nghiên cứu về thành phần, cấu trúc, tác dụng và
ứng dụng của nọc bọ cạp nhưng vẫn còn nhiều vấn đề chưa thể giải quyết triệt để. Nọc
bọ cạp là hỗn hợp các protein có tác động đối với hệ thần kinh, việc xác định cấu trúc
các protein này cũng như cách thức các protein này tác động lên hệ thần kinh con
người vẫn chưa được nghiên cứu triệt để và còn nhiều tiềm năng nghiên cứu cũng như
ứng dụng. Từ việc xác định được cấu trúc và cơ chế tác động của nọc bọ cạp đối với
hệ thần kinh con người, có thể đưa ra những phương án sử dụng nọc bọ cạp vào dược
phẩm nhằm phục vụ các mục đích về y tế.
Trong nọc bọ cạp chứa nhiều các polypeptide có khả năng tác động lên các thụ
thể và các kênh ion của màng tế bào bị kích thích, các loại polypeptide này đã và đang
được các nhà khoa học nghiên cứu nhằm tạo ra các loại dược phẩm mới. Nhằm đóng
góp một nguồn nguyên liệu mới và các nghiên cứu khoa học mới, hướng tới làm thuốc
chữa bệnh và làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, tác giả đã tiến hành các nghiên
cứu về nọc bọ cạpHeterometrus laoticusCouzijn. Hiện nay, chưa phát hiện toxin tách
từ nọc bọ cạp chi Heterometrus có tác dụng mạnh đối với kênh thần kinh Kv1.3. Qua
đề tài “Phân lập và khảo sát tính chất toxin của một số toxin mới từ nọc bọ
cạpHeterometrus laoticus”, hi vọng sẽ mang đến cơ sở cho những nghiên cứu tiếp
theo về việc ứng dụng của nọc bọ cạp dùng làm nguồn nguyên liệu cho dược phẩm.


1


1.TỔNG QUAN

2


1.1. Giới thiệu về bọ cạp
Bọ cạp là một trong những động vật lâu đờinhất trên trái đất với hơn 450 triệu
năm tiến hóa, gồm khoảng 1750 lồi khác nhau.Bọ cạp thuộc lớp Arachnida, bộ
Scorpionida,có họ hàng gần với lồi nhện, ve bét và rệp. Trong đó, họ Buthidae có số
lượng lớn nhất với 89 chi và hơn 940 loài, kế đó là họ Scorpionidae có 17 chi gồm 264
lồi, họ Vaejovidae có 17 chi gồm 173 lồi, họ Chactidae có 12 chi 172 lồi, họ
Bothriuridae có 15 chi 139 lồi, họ Hemiscorpiidae có 12 chi 89 lồi. [9, 27]Bọ cạp là
động vật ăn thịt, thức ăn của bọ cạp rất đa dạng từ các côn trùng như châu chấu, dế,
kiến, rết, nhện… đến các động vật nhỏ như thằn lằn, rắn, chuột mới sinh.Bọ cạp hoạt
động về đêm, ban ngày ẩn nấp trong hang, dưới lá cây khô. Nhiệt độ phát triển bình
thường của bọ cạp là 25-28oC, độ ẩm khoảng 72 – 82 %. Từ khi mới sinh ra đến khi
trưởng thành, bọ cạp trải qua năm lần lột xác. Trong họ Buthidae có khoảng 500 loại
có khả năng gây nguy hiểm đối với con người và các loại này được phân bố nhiều ở
châu Phi, châu Mỹ, châu Á (Hình 1.1).[22, 23, 69]

3


Họ Buthidae

Họ Scorpionidae


Loài Androctonus australis

Loài Heterometrus spinifer

Họ Vaejovidae

Họ Chactidae

Loài Smerinigurus vachoni

Lồi Uroctonus mordax

Họ Bothriuridae

Họ Hemiscorpiidae

Lồi Bothriurus keyserlingi Lồi Hadogenes troglodytes
Hình 1.1. Một số loài bọ cạp đại diện các họ khác nhau.[69]

1.1.1. Phân bố và môi trường sống
Bọ cạp được tìm thấy trên tất cả các châu lục, trừ châu Nam Cực, nhưng phong
phú và đa dạng nhất là ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Môi trường sống của bọ
cạp rất đa dạng từ những khu vực sa mạc, bán sa mạc đến những vùng thảo nguyên,
rừng mưa nhiệt đới, rừng lá kim…Bọ cạp cịn được tìm thấy trên những sườn núi cao
(ở độ cao trên 5,500 m) ở dãy Alps, Andes hay Hymalaya, hoặc trong
4


những hang động sâu (gần 1,000m dưới lịng đất). Mơi trường sống ưa thích của bọ

cạp trong tự nhiên là các hang hốc, khe đá, không gian dưới vỏ cây hay lớp lá rụng.[15]
Bọ cạp độc nguy hiểm với con người thuộc họ Buthidae, có khoảng 500 lồi,
phân bố chủ yếu ở các vùng Nam Mỹ, Đông Á và Ấn Độ. Các chiAndroctonus,
Leiurus, Buthus, ButhotusvàHeterometrus phân bố chủ yếu ở Châu Á, Bắc Phi, Trung
Đông. Giống Centruroides phân bố ở Trung Mỹ, và giống Tityus phân bố ở Nam Mỹ,
phần lớn là ở các nước Brazil, Venezuela, Colombia và Argentina.[59, 89]

1.1.2. Đặc điểm hình thái cơ bản

Hình 1.2. Lồi bọ cạpHeterometrus laoticusCouzijn, 1981.[69]

Cơ thể bọ cạp gồm hai phần chính là phần đầu ngực (prosoma) và phần bụng
(opisthosoma). Phần bụng được chia thành hai phần, phần trước bụng, mesosoma, và
phần đuôi, metasoma.Phần đầu ngực bao phủ bởi một cái mai giống tấm khiên, trên
mai có một cặp mắt chính ở trung tâm, các cặp mắt phụ ở rìa góc phía trước mai. Phía
trước mai là đơi kìm nhỏ gọi là kìm miệng dùng để xé con mồi và ăn. Ở hai bên phần
đầu là đơi kìm to gọi là kìm kẹp có tác dụng chụp giữ con mồi và tự vệ, chung quanh
đơi kìm kẹp được che phủ bởi các lơng cứng xúc giác. Phía dưới bụng có bốn cặp chân
và có một cơ quan giống như tấm lược gọi là pectin, có vai trị như những cảm biến để
cảm nhận bề mặt tiếp xúc và những chấn động trên mặt đất (Hình 1.2).
Phần bụng bọ cạp bao gồm mười hai đốt với bảy đốt ở phần trước bụng và năm
đốt ở phần đuôi và kết thúc là cơ quan telson (một túi tích trữ nọc độc từ tuyến nọc của
5


bọ cạp), tận cùng của cơ quan này là ngòi đốt cong và nhọn dùng để truyền nọc độc.
Phần bụng trước được coi là cơ thể chính và là nơi chứa phổi, cơ quan tiêu hóa và cơ
quan sinh dục của bọ cạp.[53]
Bọ cạp có sự thay đổi bề ngồi rõ rệt qua các giai đoạn phát triển. Những biến
đổi bên ngồi này có thể được quan sát rõ rệt nhất ở các loài bọ cạp thuộc

chiHeterometrus là sự thay đổi về màu sắc. Khi mới sinh, bọ cạp con có màu trắng
như bơng và chuyển màu sẫm dần sau vài ngày nằm trên lưng bọ cạp mẹ (màu nâu đen
với ánh màu xanh). Sau khi lột xác lần thứ nhất,bọ cạp con có màu nâu đen gần giống
màu của bọ cạp mẹ (chưa có ánh màu xanh).Khi mới sinh, bọ cạp con có kích thước
10-15 mm và tăng dần kích thước qua các lần lột xác. Thí dụ, lồi H. spinifer có chiều
dài cơ thể qua các tháng tuổi như sau: tháng 1: 12-15 mm, tháng 2: 32-40 mm, tháng
3: 44-51 mm, tháng 4: 56-62 mm, tháng 5: 69-75 mm và tháng 6: 82-90 mm. Trong
phịng thí nghiệm, ở dạng trưởng thành lồi này có chiều dài từ 95-110 mm, trong tự
nhiên có thể dài tới 125 mm. Nhiều lồi bọ cạp rất khó phân biệt giữa con đực và con
cái. Một số lồi bọ cạp con đực có kích thước nhỏ hơn con cái như lồi H. spinifer, cơ
thể con đực dài 110 mm, con cái dài 125 mm. Ở một số loài thuộc chiIsometrus, sự
khác nhau giữa bọ cạp đực và cái biểu hiện rất rõ, bọ cạp đực có đi và các đốt đi
(phần bụng sau) dài hơn bọ cạp cái.[15]

1.1.3. Nọc độc
Nọc độc, chất tiếtra từ răng nanh hoặc ngòi châm của các sinh vật được sử dụng
như vũ khí săn mồi tự nhiên của các loài động vật ăn thịt này nhờ khả năng gây tê liệt
cơ thể con mồi.Thành phần chính trong nọc độc là các protein và polypeptide có độc
tính, các cấu tử trong nọc độc này có thể có mục tiêu và hiệu ứng khác nhau nhưng
được phối hợp hoạt động để đạt hiệu quả cao nhất trên con mồi. Tùy thuộc lồi mà các
nọc độc có tác dụng khác nhau lên hệ thần kinh. Một số nọc độc làm tê liệt hệ thần
kinh bằng cách ngăn cản tín hiệu truyền đi giữa dây thần kinh và cơ bắp. Một số nọc
độc khác thì phá hủy các tế bào và mơ ở mức độ phân tử. Ngồi ra, nọc độc cịn có thể

6


làm đông máu và dừng sự hoạt động của tim hoặc ngăn cản quá trình đơng máu tự
nhiên và xuất huyết để giết con mồi.[1, 3]
Tất cả các loài bọ cạp đều có nọcđộc sử dụng để giết hoặc làm tê liệt con mồi

trong hoạt động săn mồi. Hầu hết nọc bọ cạpcó chứa nọc độc thần kinh, riêng ở lồi
Hemiscorpius lepturus, trong nọc độc cịn phát hiện nọc độc tế bào.Nọc bọ cạp là hỗn
hợp gồm các thành phần như: enzyme, peptide, nucleotide, lipid, mucoprotein, những
biogenic amin và các thành phần chưa biết.Trong số các thành phần của nọc bọ cạp thì
các polypeptide neurotoxin đóng vai trị đặc biệt quan trọng. Các neurotoxin này có
tác dụng lên các kênh ion của tế bào thần kinh bị kích thích và qua đó tác dụng lên hệ
thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, tim mạch và hô hấp.[18]Tuỳ thuộc vào tác
dụng của các toxin với các kênh ion, các toxin được chia ra làm bốn loại, đó là các
toxin tác dụng trên các kênh vận chuyển ion: kênh Na+, kênh K+, kênh Cl- và kênh
Ca2+.[70, 83] Ngoài các neurotoxin, nọc bọ cạp cịn chứa các serotonin, góp phần gây
đau tại chỗ và các serotonin cũng có thể gây ra sự co thắt tử cung và gây sảy thai ở
phụ nữ trong giai đoạn sớm của thai kì nếu bị bọ cạp chích phải.[23, 59]
Bọ cạp có khả năng điều chỉnh lượng nọc chính, thơng thường trong khoảng
0,1 – 0,6 mg. Gần đây, bọ cạp được phát hiện có khả năng sinh ra hai loại nọc độc tố
khác nhau (nọc kép) trong cùng một lúc. Đầu tiên, nọc nhẹ gọi là tiền độc tố (pretoxin)
được sử dụng để gây tê cứng con mồi, tiếp sau đó là siêu độc tố, một loại dịch đậm
đặc giống như sữa có độc tính cao hơn để giết chết con mồi.[70]

7


1.1.4. Bọ cạp ở Việt Nam
Bọ cạp ở Việt Nam phân bố rộng rãi khắp cả nước bao gồm các họ Buthidae,
Scorpionidae, Chaerilidae và Pseudochactidae.
 Họ Buthidae[3]
Loài Lychas mucronatusFabricius, 1798phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền
Trung và miền Nam, phát triển mạnh về số lượng cá thể ở Đồng Phú (Bình Phước).
LồiIsometrus basilicus Karsch, 1879 phân bố ở các tỉnh Nghệ An, Quảng
Trị, Bình Định, Khánh Hồ (Trường Sa), Bình Phước (Đồng Phú).
LồiIsometrus spKovařík, 1998 phân bố ở Nghệ An (Vinh).

LoiIsometrus deharvengi sp. Lourenỗo, 2010phõn b Hũn Chng, Kiên
Giang.
 Họ Scorpionidae[3]
Loài Heterometrus spinifer Ehrenberg, 1828 phân bố ở Bình Phước (Bù
Đốp, Bù Gia Mập, Đồng Phú).
Lồi Heterometrus petersiiThorell, 1876ở thành phố Hồ Chí Minh, Bình
Thuận, Khánh Hồ, Gia Lai, Lâm Đồng, Quảng Ninh.
LoàiHeterometrus laoticus Couzijn, 1981: phân bố ở Thành phố Hồ Chí
Minh, Tây Ninh, Đồng Nai (Biên Hoà), An Giang.
Loài Heterometrus cyaneusC. L. Koch, 1836: phân bố ở Thừa Thiên Huế,
Quảng Trị.
 Họ Chaerilidae[3]
Lồi Chaerilus petrzelkaiKovařík, 2000: ở miền nam Việt Nam, đảo Cơn
Sơn.
LồiChaerilus variegatus Simon, 1877 phân bố ở miền Nam Việt Nam.
Loài Chaerilus vietnamicus Lourenco v Zhu, 2008 phõn b min Bc.
Loi Chaerilus julietteaeLourenỗo, 2011 phõn b min Nam.
Loi Chaerilus phamiLourenỗo, 2011: tp trung ở đảo Côn Sơn.

8


H Pseudochactidae[3]
LoiVietbocap canhi Lourenỗo& Pham, 2010.
LoiVietbocap thienduongensisLourenỗo& Pham, 2012.
C 2 loài này đều được phát hiện ở động Thiên Đường, Phong Nha – Kẻ
Bàng thuộc tỉnh Quảng Bình.
1.2. Cấu trúc và ảnh hưởng của toxin nọc bọ cạp

1.2.1. Cấu trúc của toxin

Các toxin có khả năng tương tác với các kênh vận chuyển Na+ được cấu tạo từ
60 - 70 gốc acid amin và cấu trúc được ổn định bởi bốn cầu disulfide. [19]Trong khi
đó các toxin có khả năng tương tác với kênh vận chuyển K+ thường cấu tạo từ 31-39
đơn vị acid amin với cấu trúc được ổn định nhờ ba hoăc bốn cầu disulfide.[43, 48] Các
toxin này tác dụng lên kênh vận chuyển K+ sẽ liên kết với các thụ thể kích thích của
kênh và ức chế sự vận chuyển ion K+ qua kênh.[49, 72, 82]
Gần đây, hai peptide khác nhau của nọc bọ cạp thay đổi sự liên kết với
ryanodine đã được xác định có tác dụng trên kênh vận chuyển Ca2+. Một trong số
peptide đó cấu tạo từ 33 acid amin, toxin này tăng sự liên kết với ryanodine, còn toxin
khác là heterodimer peptide cấu tạo từ 104 và 27 gốc acid amin, có tác dụng ức chế sự
liên kết với ryanodine. Chlorotoxin tác dụng với kênh Cl- là peptide cấu tạo từ 36 gốc
acid amin với bốn cầu disulfide. [21, 51, 93, 94]
Các toxin của nọc bọ cạp có cấu trúc khơng gian tương tự nhau trừ cấu trúc của
các toxin tác dụng lên kênh Ca2+ là chưa biết, còn tất cả các peptide toxin bọ cạp đều
có lõi cấu trúc bảo thủ. Các toxin ngắn của nọc bọ cạp thường có cấu trúc bậc hai gồm
một xoắn alpha và hai nhánh đối song song của cấu trúc beta, giữa cấu trúc alpha và
beta được cố định bằng hai cầu disulfide, còn cầu disulfide thứ ba gắn đầu N với đầu
C của chuỗi peptide (Hình 1.3).[80, 96]

9


Hình 1.3. Cấu trúc toxin ngắn của nọc bọ cạp.[80]

Cấu trúc không gian của toxin dài gồm một xoắn alpha và ba nhánh đối song
song của cấu trúc beta, trong cấu trúc này có bốn cầu disulfide. Ngồi ra cịn có một
ngoại lệ với quy luật này là cấu trúc của insectoxin tách từ nọc bọ cạp Hotentotta
jundaicus, toxin này có hai đoạn xoắn alpha thay vì một đoạn như ở toxin tìm thấy ở
các lồi bọ cạp khác (Hình 1.4).[1, 93, 94]


 - toxin

cricket
toxin

 - toxin

insect
crustacean toxin
-like toxin
toxin
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của một số toxin tách ra từ nọc bọ cạp.

10


1.2.2. Tác động và ảnh hưởng của nọc bọ cạp lên kênh vận chuyển ion
1.2.2.1. Tác động của nọc bọ cạp trên kênh vận chuyển Na+
Kênh vận chuyểnNa+ là một tập hợp các protein xuyên màng hình thành nên
kênh vận chuyển ion có chức năng điều tiết sự di chuyển của ion Na+ xuyên qua màng
sinh chất của tế bào. Kênh vận chuyển Na+ được phân loại dựa trên các tác nhân kích
thích làm mở kênh Na+, thí dụ như kênh điện thế (kênh cổng điện thế, nhạy điện thế
với tên viết tắt “VGSCs”), kênh cổng ligand natri. Về cấu tạo, kênh vận chuyển Na+
bao gồm một protein thứ cấp kích thước lớn α có khả năng tương tác với các protein
khác (protein thứ cấp β). Protein thứ cấp α hình thành nên trung tâm của kênh và hoạt
động tự do.Khi protein thứ cấp α bị tác động bởi tế bào, nó có thể hình thành kênh dẫn
điều khiển hướng đi của ion Na+ theo đường cổng điện thế, ngay cả khi protein thứ
cấp β hay các protein khác không được tác động.[17] Khi các protein đính kèm kết
hợp với protein α, hai protein sẽ hình thành phức có khả năng điều chỉnh sự phụ thuộc
điện thế của màng tế bào và vị trí của phức hai protein.[66, 67, 74]

Các toxin có nguồn gốc từ bọ cạp có khả năng tương tác với kênh vận chuyển
Na+ ban đầu được phân thành 2 loại α và β. Dạng α được tìm thấy đầu tiên trong nọc
độc của loài bọ cạp Bắc Phi. Độc tố Androctonus australis australis toxin II của loài
bọ cạp này có khả năng gắn vào vị trí số 3 trên kênhvận chuyểnNa+ tùy thuộc vào điện
thế của màng tế bào (voltage-dependent manner), từ đó làm chậm hoặc ức chế hồn
tồn cơ chế kích hoạt của các kênh này. Độc tố loại β là nhóm độc tố có khả năng gắn
vào vị trí số 4 (site 4) để ức chế hoạt động của kênh vận chuyểnNa+ mà không chịu
ảnh hưởng của điện thế màng tế bào. Mơ hình của độc tố loại β là toxin II trích từ lồi
bọ cạp Centru-roides suffusus.[37, 42] Ngoài hai dạng độc tố trên, nhiều loại độc tố
khác đã được phát hiện và công bố xếp loại riêng do chúng có khả năng phân biệt
kênhvận chuyểnNa+ của tế bào các lồi khơng phải động vật có vú, thí dụ như màng tế
bào kích ứng của cơn trùng và lồi giáp xác. Số lượng các loại độc tố mới đang ngày
càng tăng, cho đến nay đã có 85 dạng đã được biết đến và được phân loại thành 10
nhóm dựa vào sự khác biệt về cấu trúc và chức năng. Bảng 1.1 trình bày các dạng điển

11


hình của từng nhóm, các chuỗi acid amin trong bảng chỉ đại diện cho loại độc tố đặc
trưng của nhóm.[67]
Bảng 1.1. Các đại diện của độc tố bọ cạp tác dụng lên kênh vận chuyển natri.[67]

Tên
thơng

Chuỗi acid amin

Lồi bọ cạp

dụng

1

AaHII

VKDGYIVDDVNCTYFCGRNAYCNEECTKLKGES

A. sustralis

GYCQWASPYGNACYCYKLPDHVRTKGPGRCH

2

CssII

KEGYLVSKSTGCKYECLKLGDNDYCLRECKQQY

C. suffussus S

GKSSGGYCYAFACWCTHLYEQAVVWPLPNKTC

3

Tsgamma KEGYLMDHEGCKLSCFIRPSGYCGRECGIKKGSS

T. serrulatus

GYCAWPACYCYGLPNWVKVWDRATNKC

4
5

6
7

LqhIT2
LqqIV
LqqIII
AaHIT4

DGYIKRRDGCKVACLIGNEGCDKECKAYGGSYG

L. quinquestriatus

YCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSETNTCG

h.

GVRDAYIADDKNCVYTCGSNSYCNTECTKNGAE

L. quinquestriatus

SGYCQWLGKYGNACWCIKLPDKVPIRIPGKCR

q.

VRDAYIAKNYNCVYECFRDSYCNDLCTKNGASS

L. quinquestriatus

GYCQWAGKYGNACWCYALPDNVPIRVPGKCH


q.

EHGYLLNKYTGCKVWCVINNEECGYLCNKRRGG

A. australis

YYGYCYFWKLACYCQGARKSELWNYKTNKCDL

8

CsEv3

KEGYLVKKSDGCKYGCLKLGENEGCDTECKAKN

C. sculpturatus

QGGSYGYCYAFACWCEGLPESTPTYPLPNKSC

9

Cn10

KEGYLVNKSTGCKYNCLILGENKNCDMECKAKN

C.noxius

QGGSYGYCYKLACWCEGLPESTPTYPIPGKTCRT

10


AaHIT1

KKNGYAVDSSGKAPECLLSNYCNNECTKVHYAD
KGYCCLLSCYCFGLNDDKKVLEISDTRKSYCDTTI
IN

12

A. australis


1.2.2.2. Tác dụng của nọc bọ cạp trên kênhvận chuyển K+
Trong nghiên cứu sinh học tế bào, kênh vận chuyển K+ là loại kênh vận chuyển
ion phổ biến và được tìm thấy ở gần như tất cả mọi lồi sinh vật sống. Kênh vận chuyển
K+ hình thành các lỗ rỗng thẩm thấu chọn lọc ion K+ giúp mở rộng màng tế bào. Ngồi
ra, kênh K+ cịn được tìm thấy ở hầu hết các dạng tế bào và điều khiển hoạt động nhiều
chức năng khác nhau của tế bào. Trong các tế bào kích thích như tế bào thần kinh,
kênh K+ định hình điện thế hoạt động và thiết lập điện thế phục hồi của màng tế bào.
Kênh vận chuyển K+ hỗ trợ sự điều chỉnh điện thế hoạt động của cơ tim, do vậy nếu
có sự cố xảy ra với kênh vận chuyển K+ có thể dẫn tới rối loạn nhịp tim gây ảnh hưởng
đến khả năng sống sót. Kênh vận chuyển K+ cũng tham gia vào duy trì ni dưỡng
mạch máu và kiểm sốt các q trình hoạt động tế bào như quá trình bài tiết hormone
(quá trình tạo insulin trong tế bào beta ở tuyến tụy). Do vậy khi xảy ra rối loạn chức
năng ở kênh vận chuyển K+ sẽ gây ra nhiều bệnh tật đối với cơ thể con người.[11, 12,
35, 40, 52, 60, 85]
Kênh vận chuyển K+ được chia làm 4 nhóm chính:


Kênh vận chuyển K+ kích hoạt bằng calcium (Calcium-activated) – Kênh


được mở ra khi có sự hiện diện của ion calcium hoặc các phân tử gây tín hiệu
khác.


Kênh vận chuyển K+ hiệu chỉnh trong (Inwardly rectifying) – Giúp dẫn

truyền dịng điện (tích điện dương) dễ dàng hơn vào bên trong tế bào.


Kênh vận chuyển K+ tandem pore domain – Nhóm kênh này ln mở hoặc

cơ bản ln ở trong tình trạng kích hoạt. Nhóm kênh này (“kênh vận chuyển
Kali hồi phục” hoặc “kênh thải”) có chức năng thiết lập điện thế âm trên màng
bao tế bào thần kinh. Khi mở, kênh cho phép ion Kali đi xuyên qua màng với
vận tốc ngang với tốc độ thẩm thấu phân tử nước.


Kênh vận chuyển K+ cổng hiệu điến thế (voltage-gated) – Dạng kênh này

có thể mở hoặc đóng tương ứng với sự thay đổi điện thế trên màng tế bào.

13


Từ mục đích sử dụng ban đầu như một chất ligand để nghiên cứu bản chất và
sự chọn lọc điện sinh lý học của các kênh ion, việc nghiên cứu nọc độc bọ cạp đã dần
dần phát triển trở thành nền tảng công nghệ sinh học đa năng để thiết kế các que thăm
dò chức năng đa dạng giúp xác định vị trí các kênh ion ở cấp độ phân tử, làm sạch các
kênh ion, xác định trung tâm khối u để hỗ trợ trị bệnh ung thư… Các kênh ion trong
cơ thể điều khiển dòng chảy của các ion giúp phát sinh và lan truyền các xung thần

kinh và điện thế hoạt động. Giải phẫu phân tử các kênh ion bằng peptide nọc độc bọ
cạp đã đưa ra được các bằng chứng cụ thể về các các đột biến, đặc tính hóa sinh lý
dưới sự điều chỉnh lên xuống của các kênh ion liên quan đến các thay đổi, đơi khi gây
nguy hiểm trong suốt q trình lan truyền và dẫn truyền xung điện trong cơ thể. Một
thí dụ cụ thể ở người mắc triệu chứng Long QT, sự biến đổi chức năng liên quan đến
quá trình điều khiển ion và hoạt động của kênh vận chuyển K+ Kv11.1 quy định bởi
gene Ether-a-gogo (hERG) gây đột quỵ ở người bệnh.[77, 88]
Báo cáo đầu tiên về sự tương tác giữa nọc độc bọ cạp và kênh vận chuyển K+
được công bố vào năm 1982 bởi Carbone và các đồng sự. Khi truyền nọc độc của loài
bọ cạp Centruroides noxius vào loài mực khổng lồ Axon, đồng thời theo dõi bằng
phương pháp xác định hiệu điện thế (kẹp điện thế). Hoạt tính duy nhất được ghi nhận
trong suốt q trình theo dõi là của Noxiustoxin (NTX), một peptide 39 AA được tinh
chế từ nọc độc thô và tách bằng máy sắc ký Sephadex G-50 với phương pháp trao đổi
ion. Mặc dù đã cô lập và tinh chế, điện thế đa chiều của độc tố bọ cạp vẫn chưa được
xác định chính xác. Từ thời điểm Carbone công bố báo cáo, rất nhiều báo cáo về các
độc tố bọ cạp khác đã được xác định có hoạt tính đặc trưng đối với kênh vận chuyểnn
K+. Cùng với tiến bộ trong các kỹ thuật sắc ký, kết hợp với khả năng thiết lập ghi nhận
các tín hiệu đơn kênh, khả năng ứng dụng độc tố của bọ cạp đã được phát triển rộng.
Năm 1985, Miller và các cộng sự sử dụng Charybdotoxin (Leiurus quinquestriatus;
ChTx) để định danh và phân tích dược lý của một kênh vận chuyển K+ điều khiển ion
Ca2+ (KCa1.1, MaxiK hoặc BK). Qua nhiều năm nghiên cứu, số lượng các polypeptide
có độc tính được phát hiện tăng dần lên. Việc sử dụng các phương pháp phân tách
bằng sắc ký ở áp suất cao có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp truyền thống

14