ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đỗ Thị Hải Anh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HÌNH THÀNH β-AMYLOID
GÂY BỆNH ALZHEIMER BỞI MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ
HOA HÒE (Sophora japonica L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đỗ Thị Hải Anh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HÌNH THÀNH β-AMYLOID
GÂY BỆNH ALZHEIMER BỞI MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ
HOA HÒE (Sophora japonica L.)
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội – 2018

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới người thày đã
luôn tận tâm chỉ bảo, tạo điều kiện cho em được học tập, trau dồi kiến thức trong suốt
thời gian qua – PGS.TS. Nguyễn Quang Huy. Nếu khơng có sự hướng dẫn, giúp đỡ và
động viên liên tục của thày, em sẽ khó có thể hồn thành được luận văn thạc sĩ này.
Tiếp đến, em xin chân thành cảm ơn GS Shunsuke Izumi và PGS.TS. Kazumi
Saikusa, phịng thí nghiệm Khoa Tốn học và Khoa học sự sống, ĐH Khoa học tự
nhiên, ĐH Hiroshima đã hết sức tạo điều kiện, quan tâm và hướng dẫn em làm thí
nghiệm trong thời gian em học tập và trao đổi tại ĐH Hiroshima. Dưới sự hướng dẫn
của thầy cô, em đã học được rất nhiều điều hay và bổ ích, phục vụ rất nhiều cho quá
trình thực hiện đề tài.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cơ bộ mơn Hóa sinh và Sinh học phân
tử, các thày cô giáo tại Khoa Sinh học và chuyên viên phòng Đào tạo Sau Đại học
trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện cho em hồn thành chương trình học
tập của khóa học.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ở bên động
viên, cổ vũ tinh thần cho em mỗi khi em gặp khó khăn trong suốt thời gian em học tập
và thực hiện đề tài.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2018

Học viên cao học

Đỗ Thị Hải Anh


Đỗ Thị Hải Anh

i

Sinh học thực nghiệm K25


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3
1.1.

Tổng quan về bệnh Alzheimer ........................................................................ 3

1.1.1.

Bệnh Alzheimer trên thế giới và Việt Nam ............................................... 3

1.1.2.

Đặc điểm lâm sàng của bệnh Alzheimer................................................... 5

1.1.3.

Chẩn đốn và phịng ngừa bệnh Alzheimer ............................................. 6

1.1.4.

Mối liên hệ giữa stress oxi hóa và bệnh Alzheimer.................................. 9


1.1.5.

Vai trò của β-amyloid trong bệnh Alzheimer ......................................... 10

1.2.

Tổng quan về flavonoids và các nghiên cứu flavonoids từ thực vật ......... 12

1.2.1.

Tổng quan về flavonoids.......................................................................... 12

1.2.2.

Giá trị sinh học của flavonoids ............................................................... 15

1.3.

Tổng quan về Hoa hòe (Sophora japonica L.) ............................................. 19

1.3.1.

Giới thiệu chung ...................................................................................... 19

1.3.2.

Thành phần hóa học của cây hoa hịe .................................................... 20

1.3.3.


Cơng dụng của hoa hịe ........................................................................... 21

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 23
2.1.

Nguyên liệu ..................................................................................................... 23

2.1.1.

Mẫu thực vật ............................................................................................ 23

2.1.2.

Mẫu peptide .............................................................................................. 23

2.2.

Hóa chất .......................................................................................................... 23

2.3.

Thiết bị thí nghiệm ........................................................................................ 23

2.3.1.

Thiết bị tách chiết và xác định hợp chất ................................................. 23

2.3.2. Thiết bị đánh giá khả năng bắt gốc tự do và giảm sự tích tụ peptide βamyloid 24
2.4.


Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 24

Đỗ Thị Hải Anh

ii

Sinh học thực nghiệm K25


2.4.1.

Phương pháp tách chiết........................................................................... 24

2.4.2.

Phương pháp sắc ký bản mỏng ............................................................... 25

2.4.3.

Phương pháp sắc ký cột ........................................................................... 26

2.4.4.

Phương pháp chiết lỏng – lỏng ............................................................... 28

2.4.5.

Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân .................................................. 29

2.4.6.


Phương pháp khối phổ ............................................................................ 31

2.4.7. Phương pháp chuẩn bị mẫu β-amyloid và các dung dịch chất chuẩn,
chất tinh sạch ......................................................................................................... 32
2.4.8.

Phương pháp bắt gốc tự do DPPH ......................................................... 33

2.4.9.

Phương pháp thực nghiệm huỳnh quang Thioflavin T ......................... 35

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 37
3.1.

Phân lập và tinh sạch các hợp chất chính có trong dịch chiết................... 37

3.1.1.

Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký bản mỏng ....................... 37

3.1.2.

Tinh sạch các chất bằng phương pháp sắc ký cột.................................. 38

3.1.3.

Tinh sạch chất bằng phương pháp sắc ký lỏng-lỏng ............................. 40


3.2.

Xác định các hợp chất có trong phân đoạn chính ...................................... 42

3.2.1.

Xác định cấu trúc chất C2 ....................................................................... 42

3.2.2.

Xác định cấu trúc chất C6 ....................................................................... 45

3.3.

Đánh giá khả năng làm giảm sự tích lũy β-amyloid ................................... 52

3.3.1.

Hoạt tính chống oxi hóa .......................................................................... 52

3.3.2.

Hoạt tính làm giảm sự tích tụ peptide β-amyloid ................................... 54

KẾT LUẬN .................................................................................................................. 56
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 57

Đỗ Thị Hải Anh


iii

Sinh học thực nghiệm K25


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả phân tách dịch chiết nụ hoa hòe bằng phương pháp sắc ký cột ...... 38
Bảng 3.2. Kết quả sắc ký bản mỏng các phân đoạn thu được sau khi chạy sắc ký cột 39
Bảng 3.3. Tổng kết các chất tinh sạch và cao khô thu được từ dịch chiết nụ hoa hòe . 41
Bảng 3.4. Bảng so sánh giá trị peak của quercetin chuẩn với chất C2 ......................... 43
Bảng 3.5. Thành phần nguyên tố của hợp chất C6 ....................................................... 47
Bảng 3.6. Bảng so sánh giá trị peak của Neohesperidin chuẩn và chất C6 .................. 50
Bảng 3.7. Giá trị quét gốc tự do DPPH của các chất .................................................... 53

Đỗ Thị Hải Anh

iv

Sinh học thực nghiệm K25


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ minh họa q trình tạo nên đám rối tơ thần kinh [4] ............................ 7
Hình 1.2. Mảng viêm thần kinh do sự tích tụ β-amyloid ở não bệnh nhân Alzheimer
[2] .................................................................................................................................. 11
Hình 1.3. Cấu trúc vịng flavonoid ................................................................................ 13
Hình 1.4. Cây hoa hịe ................................................................................................... 20
Hình 2.1. Sơ đồ minh họa cột sắc ký ............................................................................ 27
Hình 2.2. Sơ đồ minh họa hoạt động của hệ ESI-MS/MS ............................................ 32
Hình 3.1. Kết quả sắc ký bản mỏng dịch chiết nụ hoa hịe ........................................... 37

Hình 3.2. Các phân đoạn khác nhau sau khi chạy sắc ký cột ....................................... 39
Hình 3.3. Kết quả sắc ký bản mỏng các chất C2 và C6 khi so sánh với quercetin và
rutin chuẩn ..................................................................................................................... 40
Hình 3.4. Chất C6.......................................................................................................... 41
Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của quercetin chuẩn ............................................................... 42
Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của C2 .................................................................................... 43
Hình 3.7. Công thức cấu tạo của chất C2 – quercetin ................................................... 45
Hình 3.8. Phổ khối lượng ESI của chất C6 ................................................................... 46
Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của Neohesperidin chuẩn ....................................................... 48
Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của chất C6 .......................................................................... 48
Hình 3.11. Phổ 13C-NMR của Neohesperidin chuẩn ................................................... 49
Hình 3. 12. Phổ 13C-NMR của chất C6 ....................................................................... 49
Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của C6 – neohesperidin ................................................... 51
Hình 3.14. Đồ thị đường chuẩn khả năng chống oxi hóa của vitamin C ...................... 52
Hình 3.15. Biểu đồ thể hiện sự tích lũy β-amyloid trong các điều kiện khác nhau ...... 54

Đỗ Thị Hải Anh

v

Sinh học thực nghiệm K25


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Aβ

Β-amyloid

DPPH


2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

MS

Mass Spectrometry – Phổ khối lượng

NMR

Nuclear Magnetic Resonance – Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

SSTT

Sa sút trí tuệ

Đỗ Thị Hải Anh

vi

Sinh học thực nghiệm K25


MỞ ĐẦU
Nhờ sự tiến bộ của khoa học công nghệ và sự phát triển của kinh tế xã hội, cuộc
sống của con người ngày càng được cải thiện. Tuổi thọ trung bình của lồi người tăng
lên là một thành tựu đối với y tế công cộng và là kết quả của sự phát triển kinh tế, xã
hội. Tuy nhiên cũng gây thách thức về vấn đề chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cho một số
lượng lớn người cao tuổi trong xã hội. Tuổi già làm tăng nguy cơ phát triển các bệnh
mạn tính và thối hóa. Một trong những bệnh mạn tính khơng lây nhiễm và thối hóa
thường gặp ở người cao tuổi là hội chứng sa sút trí tuệ (SSTT), trong đó bệnh
Alzheimer chiếm tới 50-70%.

Hiện nay tỉ lệ mắc SSTT tăng theo tuổi theo hàm số mũ rên toàn thế giới, theo
báo cáo của Hiệp hội Alzheimer thế giới, có khoảng 50 triệu người mắc bệnh
Alzheimer trong năm 2016, và ước tính sẽ lên đến khoảng 150 triệu người vào năm
2050. Sa sút trí tuệ thật sự là một thảm hoạ đối với người cao tuổi. Bệnh gây suy giảm
trí nhớ và nhiều lĩnh vực nhận thức khác, kèm theo với những rối loạn về hành vi, gây
ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả năng hoạt động và chất lượng sống của bệnh nhân.
Người mắc bệnh Alzheimer bị mất dần khả năng tự chăm sóc và ngày càng phụ thuộc
vào người khác trong việc thực hiện các hoạt động thể chất và tinh thần cơ bản nhất.
Chi phí cho điều trị bệnh Alzheimer rất tốn kém, chỉ đứng sau các bệnh tim mạch và
ung thư. Vì vậy việc tìm ra các phương pháp phịng ngừa và chữa trị bệnh Alzheimer là
vô cùng cần thiết đối với xã hội hiện nay.
Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật phong phú
với trữ lượng lớn, có nhiều tiềm năng về cây thuốc. Cây hoa hịe (Sophora japonica L.)
là một loại cây được trồng phổ biến ở Việt Nam. Cây vừa cho bóng mát, vừa cung cấp
các giá trị khác đặc biệt về kinh tế và y học. Hoa hòe là một vị thuốc được sử dụng
rộng rãi trong các bài thuốc y học cổ truyền từ xưa đến nay. Mọi bộ phận của cây, đặc
biệt là quả khơ, hoa và chồi có giá trị rất lớn trong y học như nụ hoa hòe được dùng
làm thuốc cầm máu cho các bệnh đổ máu cam, ho ra máu, ruột chảy máu, tiểu tiện ra

Đỗ Thị Hải Anh

1

Sinh học thực nghiệm K25


máu ở dạng thuốc sắc. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng thành phần flavonoids ở
trong thực vật có khả năng giúp chống oxi hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, và đặc biệt
là khả năng giảm sự tích lũy peptide β-amyloid – một loại peptide gây bệnh Alzheimer.
Vì các lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ức chế hình

thành β-amyloid gây bệnh Alzheimer bởi một số hoạt chất từ hoa hòe (Sophora
japonica L.)” với mục đích:
 Tách chiết và tinh sạch các chất có hoạt tính sinh học từ nụ cây hoa hịe.
 Đánh giá khả năng ngăn chặn sự tích tụ peptide β-amyloid in vitro từ một
số chất tách từ nụ hoa hoè.

Đỗ Thị Hải Anh

2

Sinh học thực nghiệm K25


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer
1.1.1. Bệnh Alzheimer trên thế giới và Việt Nam
Bệnh Alzheimer là một bệnh thối hóa thần kinh, biểu hiện bằng giảm trí nhớ và
những rối loạn nhận thức khác, kèm theo các thay đổi về hành vi, gây ảnh hưởng
nghiêm trọng đến hoạt động nghề nghiệp và xã hội của bệnh nhân. Bệnh tiến triển nặng
dần và không hồi phục.
Bệnh do bác sĩ Alois Alzheimer phát hiện lần đầu năm 1901, ông là người đầu
tiên mô tả lâm sàng và đặc điểm giải phẫu bệnh lý của bệnh bao gồm các búi tơ thần
kinh (neurofibrillary tangles) và các mảng dạng tinh bột (amyloid plaque). Sau này
bệnh được mang tên ông, gọi là bệnh Alzheimer [18].
Trước kia, bệnh Alzheimer thường được dùng chỉ các trường hợp SSTT với
người ở độ tuổi 45-65 với những tổn thương mơ học điển hình nên còn được gọi là
SSTT trước tuổi già (presenile dementia). Còn khái niệm SSTT tuổi già (senile
dementia) được xem là do q trình lão hố bình thường của não, chủ yếu do các mạch
máu trong não bị “xơ cứng” trong quá trình lão hóa. Từ những năm 70 – 80 của thế kỷ
XX, người ta thấy biểu hiện lâm sàng cũng như đặc điểm tổn thương giải phẫu bệnh

tương tự ở người trẻ cũng như ở người già nên danh từ bệnh Alzheimer được dùng để
chỉ các trường hợp có đặc điểm lâm sàng, tiến triển và giải phẫu bệnh điển hình, bất kể
ở lứa tuổi nào [23].
Tuổi càng cao, tỷ lệ mắc SSTT càng nhiều. Cứ sau mỗi năm năm, tỷ lệ mắc
bệnh của sa sút trí tuệ tồn bộ lại tăng gần gấp đôi, từ 1,5% ở độ tuổi 60-69 lên 40% ở
độ tuổi 90. Một nhóm chuyên gia đã ước tính tỷ lệ mắc bệnh tồn bộ của sa sút trí tuệ ở
những người từ 60 tuổi trở lên trên toàn thế giới là 3,9%, Châu Phi là 1,6%, Đông Âu
là 3,9%, Trung Quốc 4,0%, Mỹ La tinh 4,6%, Tây Âu 5,4% và Bắc Mỹ 6,4%. Trong
các nguyên nhân gây sa sút trí tuệ, bệnh Alzheimer hay gặp nhất chiếm từ 50 đến 70%,

Đỗ Thị Hải Anh

3

Sinh học thực nghiệm K25


tiếp đến là sa sút trí tuệ do mạch máu từ 14 đến 25%, còn lại là các nguyên nhân khác
[42].
Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, hiện số người mắc SSTT trên toàn thế
giới vào khoảng 50 triệu người. Con số này ước tính sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030
(65,7 triệu) và tăng gấp hơn ba lần vào năm 2050 (115,4 triệu người) [60]. Với xu
hướng già hoá dân số, cứ sau mỗi khoảng hai mươi năm số người mắc sa sút trí tuệ sẽ
tăng gấp đôi. Mặc dù tỷ lệ mới mắc sa sút trí tuệ ở khu vực các nước phát triển cao
hơn, nhưng đa số người bị sa sút trí tuệ sống ở các nước đang phát triển. Trung Quốc
và các nước khu vực Tây Thái Bình Dương có số người mắc sa sút trí tuệ cao nhất (6
triệu người), tiếp theo là Cộng đồng Châu Âu (5 triệu), Hoa kỳ (2,9 triệu) và Ấn Độ
(1,5 triệu). Tỷ lệ tăng số lượng bệnh nhân sa sút trí tuệ dao động rất nhiều theo vùng, ở
các nước đang phát triển cao hơn các nước phát triển từ ba đến bốn lần. Hậu quả là tỷ
lệ người bị sa sút trí tuệ ở các nước đang phát triển dự đoán sẽ tăng từ 61% (năm 2000)

lên 65% (năm 2020) và 71% (năm 2040). Tình hình mắc bệnh Alzheimer cũng có bức
tranh tương tự [7].
Ở Việt Nam, theo khảo sát của Bệnh viện Tâm thần tiến hành trên 258 người từ
65 tuổi trở lên được chọn ngẫu nhiên từ cộng đồng tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy
tỷ lệ mắc SSTT là 7,8% [3]. Nghiên cứu của Bệnh viện Lão khoa Trung ương về tỷ lệ
mắc và một số yếu tố liên quan đến SSTT ở người cao tuổi tại huyện Ba Vì, Hà Nội
năm 2005 - 2006 cho thấy tỷ lệ người cao tuổi (từ 60 tuổi trở lên) sống tại cộng đồng
có SSTT là 4,63%. Cứ sau mỗi khoảng cách 5 tuổi, tỷ lệ mắc bệnh lại tăng lên 1,78 lần
[2, 5]. Trong một nghiên cứu về một số đặc điểm dịch tễ học sa sút trí tuệ và suy giảm
nhận thức nhẹ ở người cao tuổi Hà Nội (thực hiện trong giai đoạn 2009- 2010) cho
thấy tỷ lệ người cao tuổi có sa sút trí tuệ tại xã Thanh Xn huyện Sóc Sơn, Hà Nội là
5,1% trong tổng số 410 người cao tuổi, ở phường Phương Mai quận Đống Đa, Hà Nội
là 3,2% trong tổng số 556 người cao tuổi [7].

Đỗ Thị Hải Anh

4

Sinh học thực nghiệm K25


Tuy chưa có một điều tra mang tính đại diện cho thực trạng sa sút trí tuệ ở người
cao tuổi tại Việt Nam nhưng qua một số nghiên cứu đã được tiến hành thì tỷ lệ mắc sa
sút trí tuệ và bệnh Alzheimer tại Việt Nam cũng tương tự như ở các nước khác trong
khu vực.
1.1.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Alzheimer
Bệnh Alzheimer biểu hiện bằng giảm trí nhớ và những rối loạn nhận thức khác,
kèm theo các thay đổi về hành vi [4, 5].
 Giảm trí nhớ: là biểu hiện đầu tiên làm cho bệnh nhân và người nhà chú ý. Đây
là triệu chứng đặc trưng nhất của bệnh. Trong giai đoạn đầu chủ yếu giảm trí

nhớ gần (khơng cịn khả năng ghi nhận các thơng tin mới), giảm khả năng hiểu
ngữ nghĩa, nhắc đi nhắc lại một chi tiết. Khi bệnh tiến triển nặng hơn, bệnh nhân
quên cả những thông tin đã tiếp thu được từ trước, thậm chí qn tên người
thân.
 Mất ngơn ngữ (aphasia): Giảm ngôn ngữ là triệu chứng nổi bật trong bệnh cảnh
lâm sàng của bệnh Alzheimer. Bệnh nhân diễn đạt ý nghĩ của mình ngày càng
khó khăn, ngơn ngữ nghèo nàn, khơng lưu lốt, khó tìm từ, nói vịng vo, khơng
hiểu hết lời nói của người đối diện, khơng thể tiếp xúc cùng lúc với nhiều người.
Trong giai đoạn muộn, bệnh nhân khơng nói gì, mất giao tiếp hồn tồn gây khó
khăn lớn cho mối quan hệ giữa bệnh nhân và người chăm sóc.
 Mất sử dụng động tác (apraxia): Gần như tất cả bệnh nhân Alzheimer ở giai
đoạn nặng đều có mất sử dụng động tác (apraxia). Hay gặp nhất là mất sử dụng
động tác ý-vận (ideomotor apraxia), bệnh nhân không có khả năng chuyển một
ý định thành động tác có định hướng khơng gian chính xác, làm cho bệnh nhân
khó thực hiện các hoạt động sinh hoạt hàng ngày.
 Mất nhận biết (agnosia), mất khả năng tổng hợp suy luận và rối loạn chức năng
thực hiện. Bệnh nhân than phiền là khơng nhìn rõ đồ vật và vì vậy khó khăn
trong việc xác định đồ vật đó. Họ khơng thể sao chép hoặc miêu tả đồ vật một

Đỗ Thị Hải Anh

5

Sinh học thực nghiệm K25


cách chính xác, khơng thể phân biệt các đồ vật tương tự nhau, không thể nhận
biết được tất cả các chi tiết của đồ vật, không thể nhận ra được đồ vật dưới các
góc nhìn bất thường hoặc khơng thể phân biệt các hình chồng lên nhau… Bệnh
nhân mất khả năng nhận mặt những người quen, mất khả năng nhận diện lồi

hoa, loại ơ tơ…
 Suy giảm khả năng thực hiện hoạt động: biểu hiện bằng khơng có khả năng
quản lý các nhiệm vụ phức tạp như chi tiêu trong gia đình hoặc chuẩn bị bữa ăn.
 Các triệu chứng về hành vi: là những biểu hiện lâm sàng quan trọng và đơi khi
bệnh nhân đến khám vì những triệu chứng này: không thừa nhận bệnh, thờ ơ, rối
loạn tâm thần (hoang tưởng, ảo giác), rối loạn cảm xúc (trầm cảm, lo âu), kích
động,…
Biểu hiện lâm sàng điển hình của bệnh Alzheimer theo mức độ:
 Nhẹ: Trí nhớ giảm, có thể không rõ với những người thường xuyên tiếp xúc với
bệnh nhân, không thực hiện được các hoạt động phức tạp (ví dụ chuẩn bị bữa
ăn, chi tiêu), vẫn tự chăm sóc được bản thân, tính tình trở nên thụ động, ít hoặc
khơng có các biểu hiện về hành vi.
 Trung bình: Trí nhớ giảm rõ, khơng thực hiện được các hoạt động thông thường
(như sử dụng bếp, gọi điện thoại), khơng tự chăm sóc được bản thân (như tắm
rửa, trang điểm), có rối loạn hành vi (hội chứng hồng hôn, hoang tưởng hệ
thống - paranoia), kỹ năng giao tiếp xã hội thay đổi, cần người giám sát.
 Nặng: Trí nhớ giảm nhiều, chỉ cịn những mảnh vụn, khơng nhận biết được
người thân, không thực hiện được mọi hoạt động phức tạp, giảm vận động, cần
có người chăm sóc thường xun.
1.1.3. Chẩn đốn và phịng ngừa bệnh Alzheimer
 Chẩn đốn
Xác định bệnh Alzheimer chỉ dựa trên giải phẫu bệnh học. Hai tổn thương đặc
trưng nhất của bệnh Alzheimer là mảng lão hóa và đám rối tơ thần kinh. Các tổn

Đỗ Thị Hải Anh

6

Sinh học thực nghiệm K25



thương này thường xuất hiện trong não nhiều năm trước khi bệnh biểu hiện đầy đủ trên
lâm sàng. Ở các tế bào thần kinh bệnh lý xảy ra hiện tượng các vi ống tan rã, tức là các
đơn vị vi quản tách rời nhau, hình thành nên đám rối tơ thần kinh. (hình 1.1).

Hình 1.1. Sơ đồ minh họa quá trình tạo nên đám rối tơ thần kinh [4]

Tuy nhiên, các kỹ thuật chẩn đốn hình ảnh hiện đại cũng được xem là có giá trị
hỗ trợ chẩn đốn các trường hợp có khả năng là bệnh Alzheimer (probable Alzheimer’s
disease). Phương pháp chụp cộng hưởng từ (MRI) sọ não cũng giúp nhận dạng được
tình trạng teo vỏ não thùy trong rãnh mũi và teo hồi hải mã ở bệnh nhân Alzheimer.
Các chụp hình hệ thần kinh như chụp cắt lớp phát điện tử dương (Positron Emission
Tomography/PET) và chụp cắt lớp phát photon đơn (Single Photon Emission
Tomography/SPECT) giúp cho thấy có hình ảnh của giảm chuyển hóa hay giảm tưới
máu tại các vùng thái dương đỉnh phía sau.
 Phịng ngừa: Có rất nhiều cơng trình nghiên cứu trên thế giới đã và đang
cố tìm những biện pháp nhằm giảm, hạn chế các yếu tố nguy cơ:

Đỗ Thị Hải Anh

7

Sinh học thực nghiệm K25


 Liệu pháp hóc mơn thay thế: Nhiều nghiên cứu trên thế giới cùng ghi nhận kết
quả ở phụ nữ khi dùng liệu pháp thay thế hóc mơn đều giảm được triệu chứng sa
sút trí tuệ. DHEA (dehydroepiandrosterone) là hóc mơn dùng chống lão hóa ở
nữ có tác dụng làm giảm nguy cơ bệnh Alzheimer. Ở nam giới thì liệu pháp thay
thế bằng testosteron có hiệu quả tương tự như nữ giới [40].

 Thuốc kháng viêm khơng có thành phần steroid: Nhiều nghiên cứu cho thấy
dùng các thuốc kháng viêm khơng có thành phần steroid sẽ chống lại sự tích tụ
beta Amyloid trong não [24].
 Statin: đây là thuốc làm giảm cholesterol máu. Một vài nghiên cứu cho thấy
những người dùng statin giảm được 70% nguy cơ bị sa sút trí tuệ [20].
 Chế độ ăn uống
 Chất béo: Một nghiên cứu ở Hà Lan cho thấy có mối liên hệ giữa sa sút
trí tuệ và chế độ ăn nhiều chất béo tồn phần, chất béo bão hịa và
cholesterol. Tuy nhiên mỡ dạng omega-3 có tác dụng chống lão hóa cho
tế bào não. Người ta khuyến cáo năng lượng từ chất béo chỉ nên ở mức
dưới dưới 30% tổng nhu cầu hàng ngày [46].
 Rau quả sậm màu: Nghiên cứu cho thấy các loại rau quả có mầu sẫm có
tác dụng bảo vệ não chống lại sự lão hóa.
 Đậu nành: Có chứa hau, để xác định số lượng các chất
có trong các phân đoạn này, chúng tơi sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng với hệ
dung môi khai triển ethyl acetate/ethanol/acetic acid 25 mM = 4/1/1, thu được kết quả
trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả sắc ký bản mỏng các phân đoạn thu được sau khi chạy sắc ký cột
STT

Tên phân đoạn

Số lượng (chất)

Giá trị Rf

1

C1


1

0,95

2

C2

1

0,89

3

C3

1

0,73

4

C4

1

0,68

5


C5

2

0,60 và 0,50

6

C6

1

0,50

Sau khi cô quay thu hồi dung môi từng phân đoạn chất thu được, vì nồng độ
thấp nên các phân đoạn 1,3,4 và 5 không tạo được thành dạng bột. Chỉ có phân đoạn 2
và 6 (tương ứng với chất C2 và C6) lần lượt tạo thành bột có màu vàng xanh và vàng
tươi.

Đỗ Thị Hải Anh

39

Sinh học thực nghiệm K25


Khi so sánh giá trị Rf của các chất thu được với hai chất chuẩn quercetin và
rutin, chúng tôi thu được chất C2 và chất C6 có giá trị Rf lần lượt bằng với giá trị Rf
của querctin chuẩn và rutin chuẩn (hình 3.3).


Hình 3.3. Kết quả sắc ký bản mỏng các chất C2 và C6
khi so sánh với quercetin và rutin chuẩn

3.1.3. Tinh sạch chất bằng phương pháp sắc ký lỏng-lỏng
Dựa vào sự phân bố của các chất trong các dung môi là khác nhau và khả năng
tạo tủa được quan sát trong q trình làm thí nghiệm. Chúng tôi sử dụng phương pháp
chiết lỏng-lỏng để thu được một chất kết tủa có màu vàng tươi (hình 3.4).

Đỗ Thị Hải Anh

40

Sinh học thực nghiệm K25


Hình 3.4. Chất C6

Sau khi so sánh với giá trị Rf của quercetin và rutin chuẩn, nhận thấy chất kết
tủa thu được có giá trị Rf bằng với giá trị Rf của Rutin chuẩn. Kết hợp với phương pháp
sắc ký cột cổ điển, chúng tôi thu được bảng tổng kết về lượng các chất thu được từ dịch
chiết nụ hoa hoè (bảng 3.3).
Bảng 3.3. Tổng kết các chất tinh sạch và cao khô thu được từ dịch chiết nụ hoa hịe
Mẫu hoa hịe

Cao khơ (mg)

C2 (mg)

C6 (mg)


20000

3006

45

287

20000

2195

40

277

20000

2267

35

215

Trung bình

2489

40


260

(mg)

Trung bình khối lượng cao khô sau khi cô quay thu hồi dung môi chiếm khoảng
12,45% khối lượng mẫu ban đầu. Sau khi phân tách cao khô bằng phương pháp sắc ký
cột cổ điển và sắc ký lỏng-lỏng, thu được hai chất C2 và C6 lần lượt chiếm khoảng
0,2% và 1,3% khối lượng mẫu ban đầu. Hai chất C2 và C6 là hai hợp chất chính thu
được từ mẫu hoa hịe khơ, để xác định thành phần hóa học và cấu trúc của hai chất này,

Đỗ Thị Hải Anh

41

Sinh học thực nghiệm K25


chúng tôi sử dụng phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phương pháp đo
phổ khối lượng.
3.2.

Xác định các hợp chất có trong phân đoạn chính

3.2.1. Xác định cấu trúc chất C2
Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp hiện đại và thường được sử
dụng để xác định cấu trúc phức tạp của các hợp chất thiên nhiên. Qua đánh giá kết quả
sắc ký bản mỏng bao gồm: giá trị Rf chất C2 bằng giá trị Rf của quercetin chuẩn, thuốc
nhuộm vanillin và thuốc thử AlCl3 chỉ thị sự có mặt của nhóm chức flavonoids, chúng
tơi định hướng chất C2 là một chất có tính chất tương tự quercetin. Vì vậy, chúng tơi
tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR của quercetin chuẩn và chất

C2, kết quả được thể hiện trong hình 3.5 và hình 3.6.

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của quercetin chuẩn

Phổ này cho thấy ba loại tín hiệu proton: proton nhân thơm, tín hiệu proton
hydroxyl của chất phân tích và tín hiệu proton của dung môi. Cấu trúc khung của
flavonol là một flavon được thay thế ở vị 3 trên benzopyrone với một nhóm hydroxyl,
làm cho nó trở thành một 3-hydroxyflavone. Hai proton thơm tại vị trí màu xanh da
trời và đỏ, xuất hiện dưới dạng cấu trúc kép lần lượt ở mức 6,8 và 6,6 ppm, sự nhân đôi

Đỗ Thị Hải Anh

42

Sinh học thực nghiệm K25


phát sinh từ khớp nối xa trên hệ thống nhân thơm. Các proton tại vị trí màu hồng (5,53
ppm) và xanh lá cây (5,30 ppm) xuất hiện dưới dạng một cặp đơi và là các tín hiệu
riêng vì có sự tách tín hiệu ở các khớp nối. Trong khi proton tại vị trí màu đen, cặp đơi
với proton lân cận ở vị trí màu xanh da trời xuất hiện dưới dạng một tín hiệu đơi tại
trung tâm ở 6,01 ppm. Các proton hydroxyl xuất hiện riêng rẽ với tín hiệu ở bến trái
của phổ tại các giá trị 9,92, 8,72, 8,48 và 8,43,

Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của C2

Phổ 1H-NMR của chất C2 cũng cho thấy sự xuất hiện của proton hydroxyl,
proton nhân thơm và proton từ dung môi. Các giá trị phổ của chất C2 và chất chuẩn
quercetin được so sánh trong bảng kết quả 3.4:
Bảng 3.4. Bảng so sánh giá trị peak của quercetin chuẩn với chất C2

1H NMR

STT

Quercetin_St

C2

1

11,613

12,441

2

9,928

9,911

3

8,729

4

8,482

5


N/A

ppm

Đỗ Thị Hải Anh

43

7,672

Sinh học thực nghiệm K25


6

N/A

7,54

7

N/A

7,536

8

N/A

6,933


9

6,800~6,794

6,899

10

6,676

6,881

11

6,673~6,652

6,863

12

N/A

6,452

13

N/A

6,394


14

N/A

6,39

15

6,019~6,018

6,173

16

6,003~6,000

5,971

17

5,536~5,531

5,529

18

5,316~5,309

5,279


19

N/A

3,828

20

N/A

3,484

21

N/A

2,729

22

2,497

2,49

23

N/A

2,141


24

N/A

1,975

25

1,626

1,62

26

N/A

1,452

27

N/A

1,177

28

N/A

0,889


29

N/A

0,817

Chú thích: N/A là khơng tồn tại

Từ bảng so sánh 3.4 có thể thấy, các tín hiệu proton thu nhận được của chất C2
tương đồng với các tín hiệu đo được của quercetin chuẩn. Các tín hiệu chính thể hiện
sự có mặt của các proton nhân thơm bao gồm tín hiệu 6,800~6,793 ppm đến 5,3165,309 đều quan sát được trong phổ đồ của chất C2. Ngoài ra, trong phổ đồ của chất C2

Đỗ Thị Hải Anh

44

Sinh học thực nghiệm K25


cịn xuất hiện một số tín hiệu nhiễu. Vì q trình tinh sạch chất trải qua nhiều bước, sử
dụng nhiều hệ dung mơi khác nhau, nên các tín hiệu nhiễu trong phổ đồ có thể được
giải thích là do các dung mơi chưa được loại bỏ hồn tồn khỏi chất tinh sạch.
Kết hợp các dữ liệu thu được bao gồm: giá trị Rf tương đồng với quercetin
chuẩn, giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H tương đồng với chất quercetin.
Chúng tôi dự kiến chất C2 là quercetin với cơng thức cấu tạo như sau:

Hình 3.7. Cơng thức cấu tạo của chất C2 – quercetin

Quercetin là một flavonoids phổ biến trong tự nhiên, thuộc nhóm polyphenols,

có nhiều trong các loại rau, củ, quả. Đã có nhiều nghiên cứu về cấu trúc, đặc tính, cơng
dụng và chức năng của quercetin. Thêm vào đó, Dasha cùng cộng sự đã xác định
quercetin là một thành phần được tìm thấy trong cây Sophora japonica, đồng thời các
nghiên cứu khác cũng chỉ ra sự xuất hiện của quercetin trong các họ thực vật khác nhau
[15, 26]. Điều này củng cố thêm rằng chất C2 là quercetin và kết quả chúng tôi thu
được là tương đồng với những nghiên cứu trước đây.
3.2.2. Xác định cấu trúc chất C6
Dựa trên các kết quả đã thu được bao gồm: giá trị Rf bằng với rutin chuẩn và sự
tồn tại của khung flavonoids thông qua sự chỉ thị của thuốc thử vanillin và AlCl3, chúng
tôi định hướng chất C6 có tính chất tương tự như rutin. Rutin là một flavonoids bao
gồm 2 thành phần gốc quercetin flavonol và đường đôi rutinose. Đây là một hợp chất
tự nhiên với cấu trúc tương đối phức tạp. Vì vậy, với mục tiêu xác định thành phần hóa

Đỗ Thị Hải Anh

45

Sinh học thực nghiệm K25


học và khối lượng của chất C6, chúng tôi kết hợp sử dụng 2 phương pháp đo phổ khối
lượng và đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
3.2.2.1.

Xác định phổ khối lượng chất C6

Phổ khối lượng với nguồn ion hóa mẫu bằng phương pháp phun chùm ion (ESIMS) được thực hiện trên thiết bị LTQ-Orbitrap XL. Kết quả phổ được thể hiện trong
hình 3.8.

Hình 3.8. Phổ khối lượng ESI của chất C6

Chú thích: Các số ở trên mỗi đỉnh thể hiện giá trị m/z. Giá trị Z chỉ trạng thái tích điện của
các tín hiệu

Trong phổi khối lượng này, giá trị m/z 610 đã được phát hiện. Ngoài ra, các
đỉnh với giá trị m/z lớn hơn 610 cũng được phát hiện. Những đỉnh này được xác định là
chất có giá trị m/z 610 được thêm một chất khác. Ví dụ, giá trị m/z 633 (lớn hơn m/z
610) là kết quả của sự hợp nhất giữa ion natri với hợp chất có giá trị m/z 610 vì khối
lượng ion natri là 23, Các đỉnh khác dịch chuyển 74 Da so với các đỉnh có giá trị m/z

Đỗ Thị Hải Anh

46

Sinh học thực nghiệm K25


thấp hơn, như m/z 684 được dịch chuyển 74 Da từ m/z 610. 74 Da ở đây là KCl hoặc
polysiloxanes. Từ những kết quả này, có thể khẳng định khối lượng của chất C6 là 610.
Sau đó, sử dụng phần mềm Xcalibur để đưa ra kết quả dự kiến thành phần
nguyên tố mẫu chất C6, chúng tôi thu được bảng 3.5.
Bảng 3.5. Thành phần nguyên tố của hợp chất C6
Số

Thành phần

thứ

khối lượng lý

Delta


bằng

tự

thuyết

(mmu)

RDB

m/z

610,18

Cân
Thành phần

Hợp chất

1

610,19

-0,62

13,5

C22 H28 O12 N9


Không tồn tại

2

610,19

-1,97

13,0

C24 H30 O13 N6

Không tồn tại

3

610,18

2,06

9,0

C19 H30 O15 N8

Không tồn tại

4

610,19


-3,30

18,0

C25 H26 O9 N10

Không tồn tại

5

610,19

-3,31

12,5

C26 H32 O14 N3

Không tồn tại

6

610,19

-4,65

17,5

C27 H28 O10 N7


Không tồn tại

7

610,19

-4,65

12,0

C28 H34 O15

8

610,18

5,24

17,0

C30 H30 O12 N2

Không tồn tại

9

610,18

5,25


22,5

C29 H24 O7 N9

Không tồn tại

10

610,19

-5,99

17,0

C29 H30 O11 N4

Không tồn tại

Hesperidin,
Neohesperidin

Như thể hiện trong bảng trên, 10 hợp chất với các thành phần nguyên tố tương
tự chất C6 có thể trở thành ứng cử viên cho chất C6. Dựa vào ngân hàng dữ liệu có sẵn
về các hợp chất, chỉ có hợp chất C28H34O15 được tìm thấy tương ứng với hợp chất hiện
có, với tên hesperidin và neohesperidin. Như vậy, từ kết quả ESI-MS, chúng tôi định
hướng mẫu chất C6 là hesperidin hoặc neohesperidin.
3.2.2.2.

Xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân chất C6


Từ kết quả đo phổ khối lượng, định hướng chất C6 là hesperidin hoặc
neohesperidin, chúng tôi tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon

Đỗ Thị Hải Anh

47

Sinh học thực nghiệm K25


của hợp chất neohesperidin chuẩn và chất C6, kết quả phổ được thể hiện trong các hình
3.9, 3.10, 3.11 và 3.12.

Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của Neohesperidin chuẩn

Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của chất C6

Đỗ Thị Hải Anh

48

Sinh học thực nghiệm K25