.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----------------

NGUYỄN NGỌC QUÍ

ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ NHUỘM GRAM, ZIEHL - NEELSEN
CỦA MỘT SỐ PHÒNG XÉT NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----------------

NGUYỄN NGỌC QUÍ

ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ NHUỘM GRAM, ZIEHL - NEELSEN
CỦA MỘT SỐ PHÒNG XÉT NGHIỆM
Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm Y học
Mã số: 8720601

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUÂT Y HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS. MAI VĂN ĐIỂN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018

.


.

i

LỜI CAM ĐOAN
Chúng tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của riêng chúng tơi.
Các tài liệu trích dẫn, các số liệu trong đề tài là hoàn toàn trung thực và tuân
theo đúng yêu cầu của một đề tài nghiên cứu. Đề tài này là duy nhất và chưa
từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Tác giả luận văn

NGUYỄN NGỌC QUÍ

.



.

ii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................... i
MỤC LỤC ...................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... iv
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH .......................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................ 1
C U HỎI NGHI N CỨU ............................................................................ 3
MỤC TI U NGHI N CỨU ......................................................................... 3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................... 4
1.1. Đặc điểm vi sinh vật gây bệnh và kỹ thuật chẩn đoán .............................. 4
1.2. Kỹ thuật nhuộm soi vi sinh vật ................................................................. 7
1.3. Quy trình xét nghiệm và các sai số thường gặp...................................... 14
1.4. Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm ................................................... 17
1.5. Phương pháp đánh giá kết quả chương trình định tính........................... 23
1.6. Các nghiên cứu về chất lượng xét nghiệm ............................................. 25
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU....... 28
2.1. Thiết kế nghiên cứu ................................................................................ 28
2.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 28
2.3. Thời gian nghiên cứu .............................................................................. 28
2.4. Dân số mục tiêu ...................................................................................... 28
2.5. Dân số nghiên cứu .................................................................................. 28
2.6. Cỡ mẫu nghiên cứu ................................................................................. 28
2.7. Tiêu chuẩn chọn mẫu .............................................................................. 28

2.8. Kỹ thuật chọn mẫu .................................................................................. 29
2.9. Thu thập số liệu....................................................................................... 29
2.10. Xử lý và phân tích số liệu ..................................................................... 33

.


.

iii

2.11. Kiểm soát sai lệch ................................................................................. 33
2.12. Biến số và định nghĩa biến số ............................................................... 33
2.13.Vấn đề y đức .......................................................................................... 34
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ ............................................................................. 35
3.1. Độ ổn định và đồng nhất của các mẫu được sản xuất ............................ 35
3.2. Đánh giá kết quả ngoại kiểm mẫu nhuộm Gram .................................... 37
3.3. Đánh giá kết quả ngoại kiểm mẫu nhuộm Ziehl – Neelsen .................... 45
3.4. So sánh kết quả của PXN được can thiệp ............................................... 52
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN .......................................................................... 56
4.1. Đánh giá kết quả ngoại kiểm mẫu nhuộm Gram .................................... 56
4.2. Đánh giá kết quả ngoại kiểm mẫu nhuộm Ziehl – Neelsen. ................... 61
4.3. So sánh kết quả PXN được can thiệp ...................................................... 63
KẾT LUẬN .................................................................................................. 66
KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4


.


.

iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tiếng Việt
ATSH : An toàn sinh học
CLXN : Chất lượng xét nghiệm
KQXN : Kết quả xét nghiệm
KTCL : Kiểm tra chất lượng
PXN

: Phòng xét nghiệm

NCV

: Nghiên cứu viên

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam
TP

: Thành phố

Tiếng Anh
AFB


: Acid Fast Bacillus – Trực khuẩn kháng acid

EQC

: External Quality Control - Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm

ISO

: International Organization for Standardization – Tổ chức tiêu chuẩn
hóa quốc tế

WHO

: World Health Organization – Tổ chức Y tế thế giới

.


.

v

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH
Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn Gram dương sau khi nhuộm ............................. 10
Hình 1.2: Hình ảnh vi khuẩn Gram âm sau khi nhuộm ................................. 10
Hình 1.3: Hình ảnh vi khuẩn AFB sau khi nhuộm ........................................ 12
Hình 2.1: Sơ đồ phương pháp thực hiện nghiên cứu ...................................... 32
Biểu đồ 3.1: Đánh giá kết quả nhuộm Gram năm 2016.................................. 37
Biểu đồ 3.2: Đánh giá kết quả nhuộm Gram năm 2017.................................. 38
Biểu đồ 3.3: So sánh z-score nhuộm Gram giữa năm 2016 và 2017 .............. 41

Biểu đồ 3.4: Đánh giá kết quả nhuộm Gram theo nhóm vi khuẩn ................. 42
Biểu đồ 3.5: Đánh giá kết quả nhuộm Ziehl – Neelsen năm 2016 ................. 46
Biểu đồ 3.6: Đánh giá kết quả nhuộm Ziehl – Neelsen năm 2017 ................. 47
Biểu đồ 3.7: So sánh z-score nhuộm Ziehl - Neelsen giữa năm 2016 và 2017
......................................................................................................................... 50
Biểu đồ 3.8: Đánh giá kết quả nhuộm Ziehl – Neelsen theo phân loại vi khuẩn
......................................................................................................................... 51

.


.

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại kết quả nhuộm Ziehl – Neelsen ..................................... 12
Bảng 2.1: Thang điểm tương ứng với yêu cầu đặt ra ...................................... 31
Bảng 3.1: Độ ổn định và đồng nhất của mẫu ngoại kiểm nhuộm Gram......... 35
Bảng 3.2: Độ ổn định và đồng nhất của mẫu ngoại kiểm nhuộm Ziehl –
Neelsen ............................................................................................................ 36
Bảng 3.3: Kết quả đánh giá nhuộm Gram qua các năm.................................. 39
Bảng 3.4: Kết quả z-score của 30 PXN tham gia liên tục hai năm 2016 và
2017 ................................................................................................................. 40
Bảng 3.5: Kết quả của PXN trong nhóm trực khuẩn Gram (-) ....................... 42
Bảng 3.6: Kết quả của PXN trong nhóm âm tính ........................................... 43
Bảng 3.7: Kết quả của PXN trong nhóm cầu khuẩn Gram (+), xếp chùm ..... 43
Bảng 3.8: Kết quả của PXN trong nhóm cầu khuẩn Gram (+), xếp chuỗi ..... 44
Bảng 3.9: Kết quả của PXN trong nhóm cầu trực khuẩn Gram (-) ................ 44
Bảng 3.10:Kết quả của PXN trong nhóm hỗn hợp vi khuẩn ......................... 45

Bảng 3.11: Kết quả nhuộm Zeihl – Neelsen qua các năm .............................. 48
Bảng 3.12: Kết quả z-score của 30 PXN tham gia liên tục hai năm 2016 và
2017 ................................................................................................................. 49
Bảng 3.13: Kết quả nhuộm Ziehl – Neelsen của PXN ................................... 51
Bảng 3.14: Các PXN có z-score cần cải thiện sau 3 đợt năm 2017 ................ 52
Bảng 3.15: Các PXN có z-score cần cải thiện sau 4 đợt năm 2017 ................ 53
Bảng 3.16: Kết quả nhuộm Gram của PXN trước và sau khi can thiệp ......... 54
Bảng 3.17: Các yếu tố can thiệp ..................................................................... 54

.


.

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Xét nghiệm là một trong những yêu cầu cận lậm sàng thường quy tại các
bệnh viện, trong đó các xét nghiệm vi sinh đóng vai trị rất quan trọng trong
chẩn đoán, quyết định điều trị cũng như theo dõi hiệu quả điều trị các bệnh lý
nhiễm trùng. Một kết quả vi sinh chính xác góp phần rất quan trọng vào việc
chẩn đoán và sử dụng thuốc kịp thời, giúp bệnh nhân thốt khỏi tình trạng
bệnh lý, rút ngắn thời gian nằm viện, hạn chế chi phí điều trị [42]. Từ thực tế
trên đòi hỏi các phòng xét nghiệm (PXN) cần thường xuyên tăng cường nâng
cao chất lượng của kết quả xét nghiệm vi sinh nhằm đáp ứng yêu cầu phục vụ
lâm sàng.
Để giúp các PXN thực hiện tốt công tác đảm bảo chất lượng xét nghiệm
(CLXN), Bộ Y tế đã ban hành những quy định bắt buộc các PXN phải kiểm
sốt chất lượng thơng qua hoạt động nội kiểm tra và ngoại kiểm tra [7],[13];
trong đó hoạt động ngoại kiểm được triển khai từ PXN khách quan bên ngoài

nhằm đánh giá CLXN, phát hiện các sai số (sai sót) từ đó xác định nguyên
nhân, khắc phục sai sót, nâng cao CLXN [17],[36].
Bên cạnh đó, ngoại kiểm tra CLXN là một yêu cầu bắt buộc đối với các
PXN muốn đạt ISO 15189:2007, ngoại kiểm tra mang lại nhiều lợi ích cho
PXN, bác sĩ lâm sàng, bệnh nhân cũng như các cơ quan quản lý [13], … Nó
giúp PXN so sánh kết quả với các PXN khác trong cùng khu vực [17],[37].
Thơng qua kết quả ngoại kiểm tra, PXN có thể biết được năng lực hiện tại của
mình tốt hơn hay kém hơn so với thời điểm trước đó, có thể đánh giá thực
trạng tại PXN so với các PXN khác, từ đó có cơ sở tìm được ngun nhân gây
sai sót và đề xuất hành động khắc phục đối với kết quả xét nghiệm không đạt
yêu cầu [37]. Ngoại kiểm tra còn cung cấp bằng chứng khách quan về năng
lực của PXN, là cơ sở khoa học cho việc công nhận PXN đạt chất lượng theo
quy định và chuẩn hóa [8],[13]; từng bước hướng đến việc liên thơng và công

.


.

2

nhận kết quả xét nghiệm, từ đó giúp bệnh nhân giảm được thời gian và chi phí
khám chữa bệnh.
Một trong những công cụ để đánh giá độ tin cậy của xét nghiệm nói
chung và xét nghiệm vi sinh lâm sàng nói riêng là ngoại kiểm tra chất lượng
từ trung tâm tin cậy [7]. Cùng với sự ra đời và phát triển của ba Trung tâm
kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học, CLXN ngày càng được nâng cao
[3]. Hiện tại, có rất nhiều các PXN từ tuyến Trung ương, tuyến tỉnh, tuyến
huyện và cả các PXN tư nhân tham gia chương trình ngoại kiểm [10],[11]. Số
lượng PXN tham gia ngoại kiểm ngày càng tăng đòi hỏi trung tâm kiểm

chuẩn phải kiểm soát tốt và đánh giá thường xuyên để đảm bảo CLXN, đồng
thời phát hiện những khó khăn, sai sót của PXN để hỗ trợ khắc phục kịp thời.
Sau nhiều năm triển khai chương trình ngoại kiểm nói chung và ngoại kiểm vi
sinh nói riêng tại Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm Đại học Y
Dược Thành phố (TP) Hồ Chí Minh đã đạt được những kết quả đáng kể
[11],[20]. Để tổng hợp, đánh giá kết quả ngoại kiểm Vi sinh trên các mẫu
nhuộm soi của các PXN tham gia tại Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng xét
nghiệm Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh; bên cạnh đó, tìm ra những nhóm
vi khuẩn mà các PXN thường nhầm lẫn khi trả kết quả, phát hiện những
nguyên nhân sai sót để hỗ trợ các PXN khắc phục sự khơng phù hợp (nếu có),
từ đó rút ra kết luận, kiến nghị thực tiễn nhằm góp phần nâng cao CLXN vi
sinh trước tiên là trên các mẫu nhuộm soi của các PXN, chúng tôi quyết định
thực hiện đề tài “ Đánh giá kết quả nhuộm Gram, Ziehl – Neelsen của một
số phòng xét nghiệm”.

.


.

3

C U HỎI NGHI N CỨU
Các phòng xét nghiệm tham gia chương trình ngoại kiểm vi sinh mẫu
nhuộm soi tại Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm Đại học Y Dược
TP Hồ Chí Minh đạt kết quả như thế nào?

MỤC TI U NGHI N CỨU
1. Khảo sát tỉ lệ không phù hợp của mẫu nhuộm soi Gram một số phịng
xét nghiệm vi sinh.

2. Khảo sát tỉ lệ khơng phù hợp của mẫu nhuộm soi Ziehl - Neelsen một
số phòng xét nghiệm vi sinh.
3. So sánh kết quả ngoại kiểm vi sinh mẫu nhuộm soi Gram trước và sau
khi can thiệp của các PXN được can thiệp.

.


.

4

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm vi sinh vật gây bệnh và kỹ thuật chẩn đoán
1.1.1. Đặc điểm vi sinh vật gây bệnh
Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào khơng có màng nhân
(procaryote), được cấu tạo bởi lớp ngoài cùng là vách (chức năng bảo vệ
trước các tác động lên vi khuẩn), gồm thành phần chính là lớp peptidoglycan
và dịch màng chọn lọc [43]. Các vi khuẩn gram dương có lớp peptidoglycan
dày sẽ giữ được thuốc nhuộm nên có màu tím sau nhuộm gram (ví dụ cầu
khuẩn Staphylococcus aureus). Trái lại, các vi khuẩn gram âm có 2 lớp màng
bào tương kẹp một lớp peptidoglycan nên thuốc nhuộm sẽ trôi khi rửa bằng
cồn cho màu hồng sau nhuộm gram (ví dụ trực khuẩn Escherichia coli,
Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae) [50].
1.1.2. Vi sinh vật trên cơ thể ngƣời
1.1.2.1. Vi sinh vật trên da và niêm mạc
Da ở những nơi có nhiều khe kẽ, nếp nhăn, có độ ẩm thích hợp, những
nơi da hở sẽ có nhiều vi sinh vật hơn những nơi khác. Trên da có chủ yếu là
cầu khuẩn gram (+) như tụ cầu khơng gây bệnh. Ngồi ra, cịn có các trực

khuẩn gram (+). Một số vi khuẩn khác có trên da khơng thường xun hoặc
chỉ có ở những vùng nhất định như tụ cầu gây bệnh [48].
1.1.2.2. Vi sinh vật ở đƣờng tiêu hoá
₋ Vi sinh vật ở miệng: miệng là nơi có các điều kiện thuận lợi cho nhiều vi
sinh vật phát triển như thức ăn, độ ẩm, nhiệt độ thích hợp [33]. Phần lớn
các vi sinh vật chung sống với nhau, một số có khả năng gây bệnh tại chỗ
hoặc toàn thân như liên cầu, tụ cầu, trực khuẩn, xoắn khuẩn.
₋ Vi sinh vật trong dạ dày: vi sinh vật có trong dạ dày là do từ miệng xuống
hoặc theo thức ăn vào. Tuy nhiên, độ pH ở dạ dày thấp (pH = 2) nên rất ít

.


.

5

vi sinh vật sống được ở đó trừ những loại chịu được môi trường acid như
trực khuẩn lao, xoắn khuẩn Helicobacter polyri là căn nguyên gây viêm
loét dạ dày tá tràng [33].
₋ Vi sinh vật ở ruột: trẻ em sau khi đẻ vài giờ đã có vi sinh vật trong ruột,
thường trực khuẩn E.coli có sớm sau khi trẻ được sinh ra [33]. Ở ruột non
do có nhiều enzym ly giải vi sinh vật nên số lượng vi sinh vật ít. Đại tràng
có nhiều loại vi sinh vật, chủ yếu là vi khuẩn kỵ khí. Trong số các loại vi
khuẩn hiếu khí thì nhiều nhất là trực khuẩn E.coli, đến Proteus, cầu khuẩn
đường ruột, Klebsiella…[48]
1.1.2.3. Vi sinh vật ở đƣờng hô hấp
₋ Vi sinh vật ở mũi, họng mũi: ở mũi có nhiều trực khuẩn gram (+) và tụ cầu
gây bệnh, có khoảng 20-30% người lành mang tụ cầu vàng. Ở họng mũi
có nhiều chủng loại và số lượng vi sinh vật do từ miệng lan truyền lên như

phế cầu, liên cầu, cầu khuẩn màng não, Hemophilus influenzae. [34]
₋ Vi sinh vật ở khí quản, phế quản: ở đường hơ hấp dưới thường rất ít hoặc
khơng có vi sinh vật do chức năng sinh lý và các dịch niêm mạc. [48]
1.1.2.4. Vi sinh vật ở bộ phận sinh dục, tiết niệu
Ở nam, lỗ niệu đạo thường có tụ cầu, trực khuẩn gram (-). Ở nữ, niệu
đạo thường có tụ cầu, trực khuẩn gram (+), vi khuẩn đường ruột như cầu
khuẩn, trực khuẩn gram (-). Khi trưởng thành, trong âm đạo phụ nữ có một số
vi sinh vật đơi khi gây bệnh như tụ cầu, liên cầu, trực khuẩn gram (-) [38].
1.1.2.5. Vi sinh vật ở niêm mạc mắt
Ở niêm mạc mắt thường có các trực khuẩn hoặc tụ cầu khơng gây bệnh do
niêm mạc mắt thường tiếp xúc với không khí [52].
1.1.2.6. Vi sinh vật trong máu và các phủ tạng
Bình thường trong máu và các cơ quan nội tạng khơng có vi sinh vật túc
trực [24].

.


.

6

1.1.3. Các kỹ thuật cơ bản dùng trong chẩn đoán vi sinh y học

1.1.3.1. Kỹ thuật khảo sát trực tiếp
Phần lớn vi khuẩn nhuộm bằng phương pháp Gram, một số nhuộm bằng
phương pháp đặc biệt như Ziehl – Neelsen, Fotana – Tribondeau… [52]
Nhuộm Gram thường để quan sát hình thể, kích thước, cách sắp xếp và tính
chất bắt màu của vi khuẩn; cũng như đánh giá các loại tế bào và mối quan hệ
giữa vi khuẩn và tế bào như vi khuẩn nằm trong hay ngoài tế bào hay vi

khuẩn nằm trên tế bào. Vì vậy, nhuộm soi trực tiếp từ bệnh phẩm chỉ mang
tính chất gợi ý cho chẩn đốn. Tuy nhiên, trong một số trường hợp rất có ý
nghĩa trong chẩn đốn và có thể xem như chẩn đoán xác định:
₋ Nhuộm Gram: trong một số bệnh như lậu sinh dục, viêm màng não do
não mô cầu, phế cầu... qua nhuộm Gram có thể chẩn đốn sớm căn
ngun của các bệnh nhiễm trùng này [50].
₋ Nhuộm Ziehl – Neelsen: rất có ý nghĩa trong chẩn đốn các vi khuẩn
thuộc chủng Mycobacterium, đặc biệt là trực khuẩn lao, phong...[27]
₋ Nhuộm Fotana – Tribondeau: rất có ý nghĩa trong chẩn đốn các xoắn
khuẩn như: giang mai, Leptospira...[32]
Ngồi ra, phương pháp soi tươi cũng rất có ý nghĩa trong chẩn đốn vi
khuẩn trong bệnh phẩm như: phẩy khuẩn tả, xoắn khuẩn giang mai...
1.1.3.2. Nuôi cấy phân lập và xác định
Nuôi cấy vi khuẩn trên các mơi trường thích hợp nhằm tăng sinh vi
khuẩn về số lượng và tách được những khuẩn lạc riêng để nhận dạng khuẩn
lạc [42]. Sau khi phân lập được vi khuẩn riêng rẽ, sẽ tiến hành xác định các
tính chất sinh vật hóa học đặc trưng của nó. Trên thực tế, để ni cấy bệnh
phẩm, người ta sử dụng các môi trường nuôi cấy khác nhau. Phần lớn dùng
môi trường phân lập để nuôi cấy những bệnh phẩm bội nhiễm và với mục
đích chọn lọc vi khuẩn (ví dụ: ni cấy phân tìm phẩy khuẩn tả trên môi

.


.

7

trường thạch kiềm hoặc TCBS: Thiosulfite Citrate Bile salt Sucrose) [52].
Tuy nhiên, một số bệnh có thể do nhiều loại vi khuẩn gây ra thì sử dụng mơi

trường có phổ ni cấy rộng như thạch máu, chocolate (ví dụ: dịch não tủy,
dịch tỵ hầu luôn phải nuôi cấy vào một đĩa mơi trường thạch máu và một đĩa
chocolate). Sau đó, xác định các tính chất sinh vật hóa học: thực hiện các
phản ứng sinh vật hóa học để chẩn đốn xác định vi khuẩn phân lập được.
1.1.3.3. Chẩn đốn tìm kháng nguyên
₋ Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp phát hiện vi khuẩn tả trong
bệnh phẩm phân.
₋ Phản ứng ngưng kết hạt latex dùng trong chẩn đốn tìm kháng nguyên của
vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Neisseria meningitidis và Hemophilus
influenzae trong dịch não tủy bệnh nhân viêm màng não mủ.
₋ Phản ứng khuếch đại gen PCR để xác định ADN hoặc mARN đặc hiệu
của vi khuẩn trong bệnh phẩm để chẩn đoán bệnh nhiễm trùng.[52]
1.1.3.4. Chẩn đoán gián tiếp (chẩn đoán huyết thanh)
Chẩn đoán gián tiếp các bệnh nhiễm khuẩn là dựa vào kháng nguyên
mẫu (được điều chế từ vi khuẩn gây bệnh) đã biết trước để phát hiện kháng
thể đặc hiệu tương ứng bằng các phản ứng kết hợp kháng ngun và kháng
thể. Phản ứng dương tính khi có xuất hiện phức hợp kháng nguyên – kháng
thể (tức là có mặt của kháng thể kháng lại vi khuẩn gây bệnh trong huyết
thanh bệnh nhân). [42]
1.2. Kỹ thuật nhuộm soi vi sinh vật
1.2.1. Kỹ thuật nhuộm Gram
1.2.1.1. Mục đích
Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Gram để phân loại vi khuẩn
dựa vào hình thể, cách sắp xếp, tính chất bắt màu của vi sinh vật [45].

.


.


8

1.2.1.2. Nguyên tắc
₋ Vi khuẩn bắt màu Gram âm hay Gram dương do sự khác nhau về thành
phần, cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn.
₋ Vi khuẩn Gram dương: có lớp peptidoglycan dày, nhiều acid teichoic,
chúng khơng bị ảnh hưởng bởi sự tẩy màu bằng cồn, vẫn giữ nguyên được
màu tím ban đầu nếu vách tế bào khơng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như
tuổi, tác dụng của kháng sinh...[50]
₋ Vi khuẩn Gram âm: có một lớp peptidoglycan gắn với lớp phospholipid
kép, xen kẽ các protein ở màng ngoài, lớp màng này dễ bị phá hủy bởi cồn
khi tẩy màu, do đó phức hợp tinh thể tím gentian - iod không bền, bị tẩy
màu và màu được thay bởi các thuốc nhuộm khác[45], .
1.2.1.3. Tiến hành
Làm tiêu bản
Cố định tiêu bản
Phủ thuốc nhuộm
₋ Phương pháp Hucker cải tiến:
+ Nhỏ dung dịch tím Gentian, phủ kín nơi dàn đồ phiến, trong 1 phút.
Đổ dung dịch tím gentian, rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ.
+ Nhỏ dung dịch lugol, trong 30 giây. Đổ dung dịch lugol, rửa tiêu bản
+ Tẩy màu: nhỏ cồn 90 lên tiêu bản, nghiêng đi nghiêng lại để cho
cồn chảy từ cạnh nọ sang cạnh kia, khi màu tím trên lam kính vừa
phai hết thì rửa nước ngay, loại bỏ hết cồn dưới vòi nước chảy nhẹ.
+ Nhỏ dung dịch đỏ fuchsin hoặc safranin hoặc carbon fuchsin lên tiêu
bản, duy trì trong khoảng 30 giây đến 1 phút. Đổ dung dịch, rửa dưới
vòi nước chảy nhẹ [45].
₋ Phương pháp Kopeloff cải tiến:
+ Nhỏ dung dịch tím Gentian phủ kín nơi dàn đồ phiến, sau đó thêm


.


.

9

khoảng 5 giọt Na2CO3, nghiêng đi nghiêng lại tiêu bản để trộn dung
dịch, duy trì 15 - 20 giây, có thể để đến 2 phút.
+ Nhỏ dung dịch I-ốt Kopeloff duy trì trong ít nhất 2 phút.
+ Nghiêng tiêu bản, tẩy màu tiêu bản bằng các hóa chất tẩy màu, rửa
tiêu bản ngay lập tức dưới vòi nước chảy.
+ Làm khơ tiêu bản trước khi soi kính [45],[46].
1.2.1.4. Diễn giải kết quả và báo cáo
Quan sát tiêu bản ở vật kính x10 và x40
₋ Đánh giá tiêu bản đã được tẩy màu đúng chưa.
₋ Tùy theo mẫu bệnh phẩm mà màu nền của tiêu bản hoặc khơng màu
hoặc có màu Gram âm [50].
Chuyển sang vật kính dầu quan sát hình ảnh vi khuẩn và tế bào
₋ Lam nhuộm trực tiếp từ bệnh phẩm quan sát ít nhất 10 vi trường với

bệnh phẩm nước tiểu, 20 - 40 vi trường với bệnh phẩm khác [50].
₋ Quan sát hình thể vi khuẩn ở vật kính dầu (x100).

+ Hình thể: cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn, cầu trực khuẩn,...
+ Kích thước: to/nhỏ, đồng đều/đa hình thái,…
+ Tính chất bắt màu: Gram âm (màu đỏ), Gram dương (màu tím).
+ Cách sắp xếp: đứng đơn lẻ, xếp thành từng cặp, xếp thành
chuỗi, xếp thành từng đám,…
+ Đếm số lượng và mô tả các loại tế bào vi khuẩn sau:

o Gram dương: cầu khuẩn xếp đôi (và chuỗi), cầu khuẩn xếp đám,
trực khuẩn lớn/nhỏ, trực khuẩn chia nhánh, trực khẩn
Coryneform.
o Gram âm: song cầu, trực khuẩn, trực khuẩn chia nhánh (hoặc đa
hình thái), trực khẩn Coryneform.
o Hình thể trung gian: Cầu trực khuẩn, phẩy khuẩn [2],[9].

.


.

10

Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn Gram dƣơng sau khi nhuộm [47]

Hình 1.2: Hình ảnh vi khuẩn Gram âm sau khi nhuộm [47]
1.2.2. Kỹ thuật nhuộm Ziehl – Neelsen
1.2.2.1. Mục đích
Phát hiện các trực khuẩn bền vững với acid (AFB - acid fast bacillus)
thuộc chủng Mycobacterium [5].
1.2.2.2. Nguyên lý
Vách tế bào các Mycobacteria có một lượng lớn acid mycolic nên khi sử
dụng phương pháp nhuộm Gram truyền thống các vi khuẩn này rất khó bắt
màu. Do đó, phải sử dụng phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen để quan sát các
vi khuẩn này [31].
Phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen sử dụng 2 hoá chất nhuộm màu là
carbol fuchsin và xanh methylen kết hợp với chất tẩy màu (hỗn hợp acidalcohol) để phát hiện các trực khuẩn kháng cồn kháng acid [29].
1.2.2.3. Các bƣớc tiến hành


.


.

11

Làm tiêu bản
Cố định tiêu bản
0

₋ Để tiêu bản khô tự nhiên trong tủ ATSH hoặc làm khô ở 60 C.
₋ Cố định tiêu bản.
₋ Đặt tiêu bản lên mâm kính và để tiêu bản khơ tự nhiên hồn tồn ở

nhiệt độ phịng (18-250C).
₋ Lưu ý: khơng làm khơ tiêu bản bằng đèn cồn hoặc ánh nắng mặt trời. [9]

Phủ thuốc nhuộm
₋ Đặt tiêu bản lên giá nhuộm.
₋ Nhuộm màu:
+ Phủ đầy dung dịch carbol fuchsin lên mặt tiêu bản đã được cố định.
+ Hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi bốc hơi (không được để sôi) 1 lần.
Để làm tan vỏ bọc vủa vi khuẩn kháng cồn acid.
+ Để nguội tự nhiên trong 5 phút.
+ Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.
₋ Tẩy màu:
+ Phủ đầy dung dịch Acid-alcohol 3%
+ Duy trì tiêu bản trong 2 phút.
+ Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.

₋ Nhuộm nền:
+ Phủ dung dịch xanh Methylen trong 1-2 phút.
+ Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ
₋ Làm khơ tiêu bản trước khi soi kính [5],[9].
1.2.2.4. Diễn giải kết quả và báo cáo
₋ Quan sát AFB bằng vật kính dầu (x100) trên kính hiển vi quang học.
₋ Âm tính: khơng quan sát thấy hình ảnh của AFB.
₋ Dương tính: AFB bị các trực khuẩn mảnh, bắt màu đỏ đứng riêng lẻ hay

.


.

12

xếp đôi hoặc từng đám trên nền xanh. Đếm số lượng AFB và ghi kết quả
như bảng sau:
Bảng 1.1: Phân loại kết quả nhuộm Ziehl – Neelsen [9],[50]
Số lƣợng AFB

Kết quả

Khơng AFB/100 vi trường

Phân loại
Âm tính
Ghi số lượng AFB cụ thể

Có từ 1-9 AFB/ 100 vi trường


Dương tính

Có từ 10-99 AFB/ 100 vi trường

Dương tính

AFB 1 (+)

Dương tính

AFB 2 (+)

Dương tính

AFB 3 (+)

Có từ 1-10 AFB/ 1 vi trường
(soi ít nhất 50 vi trường)
Có > 10 AFB/ 1 vi trường
(soi ít nhất 20 vi trường)

/100 vi trường

Lưu ý: 1 dòng tương đương 100 vi trường. Soi ít nhất 1 dịng (tiêu bản
dương). Soi ít nhất 3 dịng (tiêu bản âm) [5].

Hình 1.3: Hình ảnh vi khuẩn AFB sau khi nhuộm [47]
1.2.3. Các sai lầm ảnh hƣởng đến kỹ thuật nhuộm soi
1.2.3.1. Kỹ thuật nhuộm Gram

Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn
Gram (+) nhuộm thành màu hồng của vi khuẩn Gram (-) như:

.


.

13

+ Phết vi khuẩn ở lứa cấy quá già trên 24 giờ, lúc đó cấu trúc vách vi
khuẩn khơng cịn bền chặt như cấu trúc vách vi khuẩn Gram (+) lứa cấy
trẻ, do vậy mất khả năng ngăn cản sự tẩy màu của alcohol [47].
+ Dung dịch lugol khơng cịn tốt nữa do đã pha lâu và đã mất đi iod, có
thể nhận biết trường hợp này khi dung dịch lugol khơng cịn sậm màu.
+ Tẩy màu bằng cồn 95% quá lâu đã làm cho vi khuẩn Gram (+) cuối
cùng cũng bị tẩy màu hay dung nhầm chai tẩy màu cồn acid của
phương pháp nhuộm kháng acid. [26]
Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn
Gram (-) nhuộm thành màu tím của vi khuẩn Gram (+):
+ Phết vi khuẩn quá dày làm cho alcohol không thể tẩy màu toàn bộ vi
khuẩn trong phết nhuộm.
+ Tẩy cồn 95% trong thời gian quá ngắn hay dung dịch cồn bị pha q
lỗng làm cho màu Gram khơng được tẩy khỏi tế bào vi khuẩn.
+ Ngồi ra, cịn một sai lầm kỹ thuật nữa thường gặp, đó là sau khi phủ
Gram không rửa sạch màu thừa trên lam do vậy khi phủ lugol trên phết
nhuộm thì màu Gram thừa sẽ bị tủa lại bám trên bề mặt phết nhuộm.
Kết quả khi nhìn qua kính hiển vi sẽ thấy rất nhiều tinh thể màu Gram
bám trên phết nhuộm làm lầm tưởng hình ảnh vi nấm.[9],[5]
1.2.3.2. Kỹ thuật nhuộm Ziehl – Neelsen

₋ Phết nhuộm quá dày sẽ làm cồn acid không thể tẩy hết màu fuchsin, vì
vậy những trực khuẩn khơng kháng cồn acid vẫn ăn màu đỏ [26]. Tuy
nhiên, có thể phân biệt được đây không phải là vi khuẩn kháng acid khi
quan sát màu vùng nhầy hay tế bào biểu mơ hay bạch cầu chung quanh
vẫn cịn màu đỏ chứng tỏ màu khơng bị tẩy hết.
₋ Ngồi ra, trực khuẩn khơng có hình dạng tiêu biểu của trực khuẩn kháng
acid: mập, không mảnh khảnh như trực khuẩn kháng acid thực sự. Màu

.


.

14

fuchsin bị cặn, sẽ bám lên phết nhuộm làm alcohol acid không thể tẩy hết
màu, do vậy vi khuẩn thường vẫn nhuộm màu đỏ như trên. Để tránh tình
trạng này phải thường xuyên lọc màu qua giấy lọc mỗi khi kiểm tra nhỏ
màu fuchsin trên một lam trống thấy có cặn sau khi đổ bỏ fuchsin ra khỏi
lam. [27]
₋ Thời gian phủ màu fushsin quá ngắn không đủ 5 phút hay dùng fuchsin
pha cho phương pháp nhuộm nóng để nhuộm lạnh, do vậy trực khuẩn
kháng acid không bắt được màu fuchsin. [27]
₋ Tiêu bản nhìn khơng rõ vi trường có thể do để ngược tiêu bản, điều chỉnh
kính hiển vi chưa đúng...
₋ Nếu AFB tối màu có thể do nhuộm nền quá lâu.
₋ Tiêu bản có nhiều muội đen bám phía sau có thể do que đốt hết cồn.
₋ Để tránh các sai lầm trên nên nhuộm kiểm tra chất lượng trước mỗi lơ
thuốc nhuộm mới pha và định kì mỗi tháng một lần đối với lô thuốc
nhuộm đang sử dụng. [9],[5]

1.3. Quy trình xét nghiệm và các sai số thƣờng gặp
Kiểm tra chất lượng (KTCL) xét nghiệm nhằm mục đích phát hiện các
sai sót trong q trình làm xét nghiệm và hạn chế đến mức tối thiểu các sai số
[38]. Những xét nghiệm có sai số quá giới hạn cho phép sẽ dẫn đến kết quả
xét nghiệm (KQXN) không có giá trị, thậm chí có hại cho việc chẩn đoán và
điều trị bệnh nhân [30]. Bởi vậy, trước hết cần phải biết các nguyên nhân có
thể gây sai số trong quá trình tiến hành một kỹ thuật xét nghiệm nhất định.
Đây cũng là chìa khóa của việc KTCL.
Mặt khác nếu như xét nghiệm được thực hiện tốt, cho kết quả "tin cậy"
mà người sử dụng KQXN (thường là bác sĩ lâm sàng) không am hiểu đầy đủ
về sự biện luận kết quả các xét nghiệm, điều này cũng sẽ hạn chế hiệu quả của
công tác xét nghiệm, làm giảm chất lượng phòng bệnh, điều trị bệnh tật và

.


.

15

chăm sóc sức khỏe cộng đồng [42]. Một q trình từ khi bắt đầu lấy bệnh
phẩm để làm xét nghiệm, tiến hành làm xét nghiệm tới khi sử dụng KQXN
gồm ba giai đoạn:
1.3.1. Giai đoạn trƣớc xét nghiệm
Giai đoạn này bao gồm những công tác chuẩn bị cho việc làm xét
nghiệm, chuẩn bị bệnh nhân, lấy mẫu bệnh phẩm; chuẩn bị hóa chất, chuẩn
hố thiết bị xét nghiệm. [5]
Bệnh phẩm xét nghiệm thường là:
- Dịch cơ thể: máu, dịch não tuỷ.
- Dịch bài tiết: nước tiểu, phân, nước bọt, đờm ...[1]

Những bệnh phẩm này bao gồm nhiều thành phần, mỗi thành phần đều
phải định lượng riêng lẻ [1]. Vì vậy quá trình lấy bệnh phẩm, bảo quản và vận
chuyển bệnh phẩm cần được qui định và hướng dẫn chặt chẽ tránh sai sót.
Cần làm tốt cơng tác chuẩn bị bệnh nhân trước khi lấy mẫu làm xét
nghiệm như: dụng cụ, chuẩn bị của người bệnh và thời gian tiến hành làm xét
nghiệm [56]. Tiến hành lấy mẫu xét nghiệm theo đúng tiêu chuẩn quy định
tuỳ từng loại xét nghiệm và vị trí lấy mẫu, từng xét nghiệm cụ thể để đảm bảo
KQXN khơng bị ảnh hưởng [6].
Muốn có bệnh phẩm đạt tiêu chuẩn, yêu cầu:
- Xử lý bệnh phẩm phải nhanh.
- Bệnh phẩm bảo quản phải ghi đầy đủ thông tin. Muốn bảo quản bệnh
phẩm càng lâu thì nhiệt độ bảo quản càng phải thấp, chất bảo quản
thích hợp và khi sử dụng phải làm nóng lại bệnh phẩm tới nhiệt độ làm
phản ứng.
- Đối với bệnh phẩm máu muốn vận chuyển bệnh phẩm đi xa, không
được vận chuyển máu toàn phần, phải tách thành huyết thanh hoặc
huyết tương [25].

.


.

16

1.3.2. Giai đoạn xét nghiệm
Giai đoạn này gồm tất cả những bước tiến hành xét nghiệm [1].
Ở mỗi bước trong q trình làm xét nghiệm đều có thể có những sai số
không thể tránh khỏi mặc dù người làm xét nghiệm thao tác rất thận trọng.
Mục tiêu chính của việc KTCL là phát hiện những sai số xảy ra trong quá

trình làm xét nghiệm và hạn chế đến mức thấp nhất những sai số vì vậy cơng
tác KTCL xét nghiệm dựa vào lý thuyết của những sai số xảy ra trong quá
trình làm xét nghiệm.[4]
Những sai số kỹ thuật đƣợc phân loại thành:
* Sai số bất ngờ: xảy ra một cách ngẫu nhiên, thường không thể tránh khỏi.
Sai số bất ngờ có thể do nhiều nguyên nhân:
₋ Thuốc thử hỏng.
₋ Dụng cụ thủy tinh không chuẩn xác.
₋ Thao tác của người làm xét nghiệm chưa thuần thục
₋ Thiết bị làm xét nghiệm không ổn định. [16]
* Sai số hệ thống: sai số loại này thường do:
₋ Chất lượng thuốc thử xấu.
₋ Chuẩn hóa chất hoặc dung dịch sai, khơng chính xác.
₋ Kỹ thuật xét nghiệm không đặc hiệu.
Loại sai số này chỉ có thể tránh được khi phát hiện được nguyên
nhân. Nó dẫn đến sự chuyển dịch của tất cả các KQXN theo cùng một
hướng [16].
* Sai số bất thường: cịn gọi là sai số "thơ bạo", xảy ra do:
- Không thực hiện đúng thủ tục xét nghiệm.
- Nhầm lẫn thuốc thử
- Đọc sai kết quả. [16]

.


.

17

Sai số bất thường có thể tránh được, tần số của loại sai số này phụ

thuộc chủ yếu vào người làm xét nghiệm, q trình đào tạo, vì vậy có thể
tránh được những sai số bất thường bằng việc tổ chức tốt PXN. Một số
yếu tố ngoại cảnh như sự vệ sinh, trật tự, ngăn nắp của nơi làm việc, ánh
sáng, sự thơng gió, sự giảm tiếng ồn trong PXN tác động một phần tới
chất lượng KQXN. Khối lượng công việc quá nhiều so với khả năng cũng
ảnh hưởng tới KQXN. [15]
1.3.3. Giai đoạn sau xét nghiệm
Đó là giai đoạn sử dụng KQXN của bác sĩ để biện luận lâm sàng, bao
gồm kiểm tra hệ thống, ghi nhận hoặc giải thích KQXN, quyết định cơng bố
KQXN, lưu trữ kết quả và mẫu đã được phân tích [3]. Trong giai đoạn này,
người cán bộ xét nghiệm cũng như bác sĩ lâm sàng cần chú ý tới những điều
kiện của bệnh nhân (giới tính, tuổi, chế độ ăn, điều kiện sinh học của bệnh
nhân v.v...) có thể ảnh hưởng tới KQXN [1].
1.4. Ngoại kiểm tra chất lƣợng xét nghiệm
1.4.1. Định nghĩa về ngoại kiểm tra chất lƣợng
Ngoại kiểm tra CLXN là một công cụ quan trọng của kiểm tra chất lượng
được sử dụng để giám sát CLXN của các PXN thông qua so sánh liên phòng
các PXN. [30]
1.4.2. Một số khái niệm về quản lý chất lƣợng
Để hiểu được vai trò của ngoại kiểm đối với đảm bảo CLXN như thế nào
chúng ta cần hiểu được các khái niệm về đảm bảo chất lượng và kiểm tra
CLXN.
Chất lượng (Quality): là tập hợp các đặc tính vốn có đáp ứng các u cầu
Hệ thống quản lý chất lượng (Quality Management System – QMS): là
một tập hợp các chính sách, quy trình và thủ tục cần thiết cho việc lập kế

.