BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
------------------------

ĐẶNG THỊ LAN ANH

ĐỘC TÍNH CỦA XI MĂNG NHỰA TỰ DÁN
TRÊN NGUYÊN BÀO SỢI 3T3
Nghiên cứu In Vitro

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2017


MỤC LỤC
NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 5
1.1.

Khả năng gây độc tế bào của vật liệu nha khoa............................................5

1.2.

Một số thử nghiệm In Vitro đánh giá khả năng gây độc tế bào ....................5

1.2.1.

Các thử nghiệm quan sát hình thái ........................................................6

1.2.2.

Các thử nghiệm đánh giá sự chuyển hóa hoặc chức năng tế bào ...........6

1.2.3.

Các thử nghiệm khác về chức năng tế bào ............................................7

1.3.

Sự tiếp xúc giữa vật liệu và tế bào trong thử nghiệm độc tính .....................8

1.4.

Tương hợp sinh học của xi măng gắn ..........................................................9

1.4.1.

Xi măng GIC .........................................................................................9

1.4.2.

Xi măng GIC lai ..................................................................................10

1.4.3.


Xi măng resin ......................................................................................11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 16
2.1.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..................................................................16

2.1.1.

Nguồn tế bào ......................................................................................16

2.1.2.

Vật liệu ................................................................................................16

2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................17

2.2.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................17

2.2.2.

Thiết kế nghiên cứu .............................................................................17

2.2.3.


Chuẩn bị trước khi nghiên cứu ............................................................17

2.3.

THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU ....................................................................20

2.3.1.

Chuẩn bị tế bào....................................................................................20

2.3.2

Chuẩn bị dịch chiết ..............................................................................23

2.4.

TÓM TẮT QUI TRÌNH THỰC HIỆN ......................................................33


2.5.

BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU ..........................................................................33

2.5.1.

Biến số độc lập ....................................................................................33

2.5.2.

Biến số phụ thuộc: biến số định lượng ................................................33


2.6.

PHÂN TÍCH THỐNG KÊ .........................................................................33

2.7.

CÁC BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC SAI SỐ .................................................34

Chương 3: KẾT QUẢ ........................................................................................ 36
4.1.

ĐỘC TÍNH CỦA DỊCH CHIẾT TRỰC TIẾP ...........................................37

4.2.

ĐỘC TÍNH CỦA DỊCH CHIẾT GIÁN TIẾP ............................................41

4.3.

SO SÁNH DỊCH CHIẾT TRỰC TIẾP VÀ DỊCH CHIẾT GIÁN TIẾP ....45

Chương 4: BÀN LUẬN...................................................................................... 48
4.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP VÀ DÒNG TẾ BÀO NGHIÊN CỨU ......................... 48
4.1.1

Về phương pháp nghiên cứu................................................................48

4.1.2


Về dòng tế bào nghiên cứu ..................................................................50

4.2 VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................... 51
4.3 Ý NGHĨA VÀ ỨNG DỤNG CỦA ĐỀ TÀI .................................................. 58
4.4 HẠN CHẾ CỦA NGHIÊN CỨU .................................................................. 58
KẾT LUẬN ........................................................................................................ 59
KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO


i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
4-META

4-methacryloyloxyethy trimellitate anhydride

Bis-GMA

Bisphenol A-glycidyl Methacrylate

CS

Calf Serum

DMEM

Dulbecco’s Modified Eagle Medium

GIC


Glass ionomer cement

RMGIC

Resin Modified Glass ionomer cement

RC

Resin cement

HEMA

Hydroxyethyl Methacrylate

OD

Optical Density

TEGDMA

Triethylene Glycol Dimethacrylate

UDMA

Urethane Dimethacrylate


ii


DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT-ANH

Độc tính tế bào
Tăng sinh
Thử nghiệm dịch chiết
Nồng độ
Tế bào còn sống
Tương hợp sinh học
Môi trường nuôi cấy
Chứng dương
Chứng âm
Xi măng nhựa tự dán

Cytotoxicity
Proliferation
Test on extract
Concentration
Cell viability
Biocompatibility
Culture medium
Positive control
Negative control
Self-adhesive resin cement


iii

DANH MỤC BẢNG
STT


Tên bảng

Trang

1.1

Tóm tắt một số nghiên cứu về độc tính của vật liệu

13

2.2

Thơng tin các loại xi măng sử dụng trong nghiên cứu

16

3.3

Phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết trực tiếp đối

36

với từng loại vật liệu
3.4

So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết trực

37

tiếp giữa các vật liệu

3.5

So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết trực

38

tiếp giữa Fuji I và Fuji Plus
3.6

So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết trực

39

tiếp giữa Fuji I và G Cem
3.7

So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết trực

39

tiếp giữa Fuji Plus và G Cem
3.8

Phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết gián tiếp đối

40

với từng loại vật liệu
3.9


So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết gián

41

tiếp giữa các vật liệu
3.10 So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết gián

42

tiếp giữa Fuji I và Fuji Plus
3.11 So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết gián

43

tiếp giữa Fuji I và G Cem
3.12 So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết gián

43

tiếp giữa Fuji Plus và G Cem
3.13 So sánh phần trăm tế bào sống của Fuji I giữa dịch chiết trực tiếp
và dịch chiết gián tiếp

44


iv

3.14 So sánh phần trăm tế bào sống của Fuji Plus giữa dịch chiết trực


45

tiếp và dịch chiết gián tiếp
3.15 So sánh phần trăm tế bào sống của G Cem giữa dịch chiết trực tiếp

46

và dịch chiết gián tiếp

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Tên biểu đồ

Trang

Phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết trực tiếp giữa

55

STT
4.1

các loại vật liệu
4.2

Phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết gián tiếp
giữa các loại vật liệu

56



v

DANH MỤC HÌNH

STT

Tên hình

Trang

1.1

Ngun tắc của thử nghiệm MTS

7

2.2

Các loại xi măng sử dụng trong nghiên cứu

17

2.3

Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

19

2.4


Tế bào nguyên bào sợi 3T3 thế hệ thứ 8 ở vật kính 10X

21

2.5

Buồng đếm tế bào

22

2.6

Dịch chiết trực tiếp nồng độ 100% thu được sau 24 giờ

25

2.7

Đo pH dịch chiết trực tiếp của các loại vật liệu

25

2.8

Nồng độ dịch chiết trực tiếp các vật liệu sau khi pha lỗng

26

2.9


Mơ hình các bước tạo hệ thống thân răng trong nghiên cứu

26

2.10 Hệ thống thân răng trong nghiên cứu

27

2.11 Sử dụng sáp inlay che kín bề mặt xoang phía thân răng

28

2.12 Ngâm các khối vật liệu và nhóm chứng vơ mơi trường DMEM

29

2.13 Dịch chiết gián tiếp nồng độ 100% thu được sau 24 giờ

30

2.14 Nồng độ dịch chiết gián tiếp các vật liệu sau khi pha loãng

30

2.15 Cấy tế bào ra đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/ml

31

3.16 Hình ảnh tế bào 3T3 tiếp xúc với dịch chiết xi măng sau 24 giờ


35


1

MỞ ĐẦU
Sự thành cơng lâm sàng của phục hình cố định phụ thuộc nhiều yếu tố, bao
gồm cả việc lựa chọn xi măng gắn phù hợp. Từ thực tế gắn những phục hình cố định
trên răng tủy sống, sẽ có sự tiếp xúc trực tiếp giữa xi măng gắn với phức hợp ngà tủy,
được cho là một trong những nguyên nhân gây nhạy cảm và ê buốt sau can thiệp. Do
đó, ngồi các đặc điểm hóa học, cơ học, vật lý đảm bảo cho khả năng gắn dính, tương
hợp sinh học của xi măng gắn trên tế bào tủy răng là một yêu cầu quan trọng và cần
thiết.
Việc gia tăng mối quan tâm của nha sĩ và bệnh nhân về phục hình thẩm mỹ
giống màu răng đã làm gia tăng mức độ phổ biến của phục hình tồn sứ, từ đó cũng
thúc đẩy sự sáng tạo và cải tiến hệ thống xi măng gắn cho phục hình thẩm mỹ. So
sánh với các xi măng gắn truyền thống, xi măng nhựa có những ưu điểm về thẩm mỹ,
cải thiện độ lưu giữ, ít vi kẽ, độ hịa tan thấp. Tuy nhiên, xi măng nhựa chứa các
monomer nhựa như: HEMA, Bis-GMA, TEGDMA, UDMA...có khả năng gây độc
cao. Hơn nữa, việc xử lí ngà răng bằng acid để loại bỏ lớp mùn ngà trước khi sử dụng
xi măng nhựa sẽ làm tăng tính thấm ngà từ đó cũng làm tăng khả năng gây độc của
xi măng nhựa.
Xi măng nhựa tự dán ra đời năm 2002, hầu hết thuộc loại lưỡng trùng hợp,
kết hợp các thành phần tự trùng hợp và quang trùng hợp, có thể bắt đầu một phản ứng
trùng hợp mà khơng cần chiếu đèn. Cơ chế lưỡng trùng hợp đảm bảo chất lượng
polymer hóa của xi măng, bù đắp cho sự giảm ánh sáng trong quang trùng hợp do độ
dày và độ mờ đục của phục hình. Từ đó làm giảm tỉ lệ các monomer tự do khơng
được trùng hợp hồn tồn có khả năng gây độc. Xi măng kết hợp tác nhân dán và xi
măng trong một sản phẩm, rút gọn qui trình gắn chỉ gồm một bước đơn giản, dễ thao
tác, giảm thời gian trên lâm sàng. Do không cần các bước xử lí bề mặt răng trước khi

gắn, lớp mùn ngà không bị loại bỏ, nên được cho là không gây nhạy cảm sau gắn. Sự


2

dán dính vào các cấu trúc mơ răng khơng có sự hình thành của các đi nhựa trong
ống ngà [4], từ đó có thể ngăn chặn làm giảm tác động gây hại cho tủy [15], [36].
Với tính thuận tiện và đa năng, xi măng nhựa tự dán hiện được nhiều nhà
lâm sàng lựa chọn. Tuy nhiên, các nghiên cứu đánh giá độc tính tế bào của xi măng
này vẫn chưa được thực hiện nhiều và kết quả không thống nhất.
Năm 2015, Rita Trumpaite- Vanagiene [30] nghiên cứu trên nguyên bào sợi
nướu răng đã kết luận xi măng nhựa tự dán và xi măng GIC lai đều gây độc tế bào.
Trong khi đó, năm 2016, Fonseca [8] nghiên cứu trên tế bào nguyên bào ngà MDPC23 và tế bào tủy răng người kết luận xi măng nhựa tự dán và xi măng GIC lai không
gây độc cho tế bào. Từ các kết luận khác nhau như vậy, cho thấy đây cũng là vấn đề
cần được nghiên cứu thêm.
Nhiều nghiên cứu độc tính tế bào in vitro dựa trên đánh giá mức độ sống
của tế bào khi tiếp xúc với dịch chiết trực tiếp của vật liệu. Tuy nhiên, trên thực tế,
khả năng gây độc của vật liệu nha khoa, phụ thuộc vào khả năng của vật liệu khuếch
tán qua ngà răng và tích lũy trong tủy ở nồng độ đủ cao để gây ra các vấn đề trên tủy.
Vì vậy, mơ hình sử dụng rào cản ngà răng là phương pháp tốt để đánh giá các độc
tính trên tủy của vật liệu nha khoa.
Vì vậy, nghiên cứu in vitro này được thực hiện nhằm đánh giá độc tính trên
tế bào nguyên bào sợi 3T3 của xi măng nhựa tự dán lưỡng trùng hợp (G-Cem) theo
phương pháp trực tiếp và gián tiếp qua rào cản ngà răng, so sánh với hai loại xi măng
thông dụng là xi măng Glass Ionomer tăng cường nhựa ( Fuji Plus) và xi măng Glass
Ionomer (Fuji I).


3


Câu hỏi nghiên cứu
Có hay khơng sự khác biệt độc tính trên tế bào nguyên bào sợi 3T3 của xi
măng nhựa tự dán (G-CEM) so với xi măng Glass Ionomer tăng cường nhựa (Fuji
Plus) và xi măng Glass Ionomer (Fuji I)?
Giả thuyết nghiên cứu
Có sự khác biệt độc tính trên tế bào nguyên bào sợi 3T3 của xi măng nhựa
tự dán (G-CEM) so với xi măng Glass Ionomer tăng cường nhựa (Fuji Plus) và xi
măng Glass Ionomer (Fuji I).


4

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu tổng quát
Đánh giá độc tính trên tế bào nguyên bào sợi 3T3 của xi măng nhựa tự dán
lưỡng trùng hợp (G-CEM) theo phương pháp trực tiếp và gián tiếp qua rào cản ngà
răng, so sánh với xi măng Glass Ionomer tăng cường nhựa (Fuji Plus) và xi măng
Glass Ionomer (Fuji I).
Mục tiêu chuyên biệt
1.

Xác định và so sánh tác động gây độc tế bào giữa ba loại xi măng gắn.

2.

Xác định và so sánh tác động gây độc tế bào giữa hai phương pháp nghiên
cứu: phương pháp trực tiếp và gián tiếp qua rào cản ngà răng.

3.


Xác định và so sánh tác động gây độc tế bào giữa các nồng độ dịch chiết
khác nhau.


5

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Khả năng gây độc tế bào của vật liệu nha khoa
Tương hợp sinh học trong nha khoa được định nghĩa là khả năng của một

vật liệu thực hiện chức năng của nó trong ứng dụng điều trị với một phản ứng thích
hợp của cơ thể người nhận (ISO 1942). Đặc tính tương hợp sinh học được nghiên cứu
sâu rộng, để đảm bảo điều trị an toàn cho bệnh nhân và sức khỏe của nhà lâm sàng.
Do hầu hết các vật liệu sinh học được sử dụng trong nha khoa có ảnh hưởng trực tiếp
hoặc gián tiếp vào các tế bào lân cận hoặc các mô, do đó cần phải đảm bảo đặc tính
tương hợp sinh học trước khi ứng dụng vật liệu trên lâm sàng.
Đánh giá khả năng gây độc tế bào của vật liệu nha khoa là rất quan trọng từ
hai quan điểm. Đầu tiên, kiểm tra khả năng gây độc tế bào đã trở thành một phương
tiện được chấp nhận để sàng lọc vật liệu nha khoa về tính tương hợp sinh học (ADA,
1979; ANSI / ADA, 1982). Việc cải tiến thử nghiệm này sẽ cung cấp một phương
tiện chính xác hơn để sàng lọc vật liệu mới, giúp giảm yêu cầu thử nghiệm trên động
vật hoặc trên con người. Thứ hai, sự tương tác của vật liệu và các thành phần của vật
liệu với các tế bào ở cấp độ phân tử có thể chịu trách nhiệm cho các phản ứng ở cấp
độ mô như viêm, hoại tử, gây đáp ứng miễn dịch và sinh ung thư. Hiểu được tương
tác giữa vật liệu và tế bào là cần thiết để hiểu được cách các vật liệu gây ra các đáp
ứng trong cơ thể.
1.2.


Một số thử nghiệm In Vitro đánh giá khả năng gây độc tế bào
Các thử nghiệm in vitro có một số ưu điểm như: dễ dàng kiểm soát các điều

kiện thí nghiệm, được chuẩn hóa, có thể lặp lại, thực hiện nhanh, chi phí tương đối
thấp, thích hợp cho việc đánh giá các đặc tính sinh học cơ bản của vật liệu. Nhược


6

điểm của thử nghiệm in vitro là mức độ phù hợp tương đối giữa điều kiện mơ phỏng
trong phịng thí nghiệm và thực tế trên cơ thể người để áp dụng các kết quả thử nghiệm
1.2.1. Các thử nghiệm quan sát hình thái
Đánh giá sự chết tế bào gây ra bởi vật liệu bằng cách đánh giá số lượng tế
bào hoặc sự tăng trưởng tế bào trước và sau khi tiếp xúc với vật liệu. Thử nghiệm
tính thấm qua màng tế bào được sử dụng để đánh giá khả năng gây độc bởi sự thấm
của một loại thuốc nhuộm qua màng tế bào, vì tế bào có màng thấm được thuốc
nhuộm là tương đương hoặc gần như tương đương với tế bào chết
1.2.2. Các thử nghiệm đánh giá sự chuyển hóa hoặc chức năng tế bào
Một số thử nghiệm sử dụng hoạt động sinh tổng hợp hoặc hoạt động enzym
của tế bào nhằm đánh giá phản ứng gây độc tế bào.
−

Thử nghiệm đo lường sự tổng hợp protein hoặc DNA (deoxyribonucleic
acid).

−

Thử nghiệm enzym:



Thử nghiệm xanh Alamar định lượng sự tăng sinh tế bào bằng cách sử
dụng chất chỉ thị phát huỳnh quang cho phép theo dõi tế bào liên tục theo
thời gian.



Thử nghiệm sắc ký dựa trên những loại muối tetrazolium: thử nghiệm
MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide],
MTS

[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-

sulfophenyl) - 2H - tetrazolium], thử nghiệm NBT (nitroblue tetrazolium),
thử nghiệm XTT [muối 2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) - 2H –
tetrazolium-5 - carboxanilide.
 Thử nghiệm MTS
Phương pháp khử muối tetrazolium là phương pháp đáng tin cậy, thường
được sử dụng để khảo sát độc tính tế bào của các loại vật liệu.


7

MTS (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) – 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) – 2 (4-sulfophenyl) - 2H - tetrazolium) khi có mặt PMS (phenazine methosulfate) sẽ được
tế bào chuyển hóa, tạo ra một sản phẩm formazan tan trong môi trường nuôi cấy tế
bào, hấp thụ ánh sáng tối đa ở bước sóng 490-500 nm trong PBS ( phosphate-buffered
saline). Sự chuyển đổi này được cho là do enzyme dehydrogenase phụ thuộc NADH
trong các tế bào sống.

Hình 1.1: Nguyên tắc của thử nghiệm MTS
Lượng formazan tạo ra sẽ được định lượng bằng lượng ánh sáng ở bước

sóng 492nm bị hấp thụ và tỷ lệ thuận với lượng tế bào sống trong mơi trường ni
cấy đó. Số lượng tế bào càng lớn tạo ra một lượng Formazan càng lớn, do đó làm tăng
mật độ quang. Đánh giá sự thay đổi mật độ quang giúp đánh giá được sự thay đổi tỉ
lệ tế bào còn sống ở thời điểm khảo sát. Từ đó, xác định khả năng gây độc của những
các loại thuốc và vật liệu. Phương pháp MTS thường được coi là phương pháp MTT
1 bước, có tính tiện lợi cao do chỉ cần thêm thuốc thử trực tiếp vào môi trường nuôi
cấy tế bào mà không cần bước hòa tan tinh thể như trong thử nghiệm MTT.
1.2.3. Các thử nghiệm khác về chức năng tế bào
Những thử nghiệm in vitro đo lường chức năng miễn dịch hoặc các phản
ứng mô khác cũng đã được sử dụng. Những thử nghiệm này đo lường sự sản xuất
cytokine từ các lympho bào và các đại thực bào, sự tăng sinh lympho bào, hoá hướng


8

động… Một số thử nghiệm khác lại đo lường khả năng của vật liệu làm thay đổi chu
trình tế bào hoặc kích hoạt bổ thể. Tầm quan trọng in vivo của những thử nghiệm này
vẫn chưa được xác định chắc chắn, nhưng phần lớn cho thấy đầy hứa hẹn có thể làm
giảm số lượng thử nghiệm cần thiết trên động vật để đánh giá tính tương hợp sinh
học của vật liệu.
Sự tiếp xúc giữa vật liệu và tế bào trong thử nghiệm độc tính

1.3.

Các thử nghiệm in vitro, thực hiện bên ngồi cơ thể sống, trong đó, vật liệu
hoặc thành phần của vật liệu tiếp xúc với tế bào. Sự tiếp xúc có thể được chia thành
ba loại
 Vật liệu được đặt tiếp xúc trực tiếp với tế bào: được sử dụng trong những
trường hợp vật liệu có tỷ trọng thấp. Một phần vật liệu được đặt trực tiếp vô
trong mơi trường ni cấy có những tế bào đang tăng trưởng. Độc tính của

vật liệu sẽ được đánh giá thơng qua sự hiện diện những tế bào bị biến dạng,
thoái hóa, ly giải xung quanh vùng tiếp xúc với vật liệu.
 Dịch chiết của vật liệu tiếp xúc với tế bào: vật liệu được ngâm trong môi
trường nuôi cấy với tỉ lệ phù hợp. Sau khoảng thời gian ủ, các thành phần
của vật liệu khuếch tán vô môi trường nuôi cấy. Dịch chiết thu được sau đó
được sử dụng để nuôi cấy tế bào và đánh giá những thay đổi trên những tế
bào được nuôi cấy.
 Vật liệu được đặt tiếp xúc gián tiếp với tế bào qua một rào cản: Bởi vì sự
tiếp xúc trực tiếp thường khơng xảy ra giữa tế bào và vật liệu khi sử dụng
trên cơ thể sống, nên một số thử nghiệm in vitro có rào cản (thử nghiệm
gián tiếp) đã được phát triển nhằm mơ phỏng tình trạng trong cơ thể sống.
Các rào cản thường được sử dụng là: thạch, màng lọc vi lỗ, ngà răng.


Phương pháp khuyếch tán qua thạch: Trong phương pháp này, một lớp
mỏng thạch giàu dinh dưỡng cho tế bào được đặt bên trên lớp tế bào nuôi
cấy. Vật liệu (hoặc dịch chiết của vật liệu dạng khô trên giấy lọc) được


9

đặt bên trên lớp thạch. Độc tính của vật liệu sẽ khuếch tán quá lớp thạch
và gây ảnh hưởng lên tế bào nuôi cấy bên dưới.


Phương pháp sử dụng màng lọc vi lỗ: lớp đơn tế bào tăng trưởng trên
màng lọc rồi lật màng lọc lại để vật liệu thử nghiệm đặt trên màng lọc và
những thành phần của vật liệu khuếch tán qua lỗ lọc có thể tương tác với
tế bào.




Phương pháp sử dụng rào cản ngà: Trong cơ thể sống, ngà răng đóng
vai trị là một rào cản, thơng qua đó các vật liệu độc hại phải khuếch tán
qua được lớp ngà để tiếp xúc tủy răng. Như vậy, sự hiện diện và độ dày
của ngà răng trực tiếp liên quan đến sự bảo vệ tủy. Phương pháp này mơ
phỏng điều kiện trên lâm sàng, trong đó vật liệu sẽ tiếp xúc với một mặt
của lớp ngà, dung dịch môi trường nuôi cấy tế bào sẽ tiếp xúc với mặt
cịn lại. Các thành phần của vật liệu có thể khuyếch tán qua lớp ngà, và
dịch chiết gián tiếp thu được sau đó sẽ dùng để ni cấy tế bào và đánh
giá ảnh hưởng của vật liệu lên chuyển hóa tế bào. Ngồi ra, tế bào cũng
có thể được nuôi cấy cùng lúc trong môi trường nuôi cấy tiếp xúc gián
tiếp với vật liệu qua lớp ngà. Phương pháp sử dụng rào cản ngà thường
được ưu tiên sử dụng khi đánh giá độc tính của vật liệu trên tế bào tủy
răng.

1.4.

Tương hợp sinh học của xi măng gắn
Mặc dù vật liệu dùng trong nha khoa phục hồi và các loại xi măng nha khoa

đã có nhiều cải tiến về tính chất hóa lý, mức độ gây độc của vật liệu, tuy nhiên mức
độ gây độc trong các thử nghiệm in vitro vẫn cịn khá cao. Vì vậy, việc đánh giá lại
các tính chất hóa, lý và khả năng sinh học của vật liệu là cần thiết.
1.4.1. Xi măng Glass Ionomer (GIC)
Vào năm 1969, xi măng Glass Ionomer được tìm ra bởi Wilson và Kent
dựa trên phản ứng axit – bazơ giữa bột aluminosilicate glass và dung dịch polymers,
copolymers của axit acrylic, bao gồm axit itaconic, axit maleic và axit tricarboxylic.



10

GIC được định nghĩa bởi McLean, Nicholson và Wilson “xi măng bao gồm bột thủy
tinh và dung dịch polymer của axit, mà q trình đơng là phản ứng axit – bazơ giữa
các thành phần. GIC có nhiều ưu điểm như: gắn hóa học vào răng, độ giãn nở vì nhiệt
giống mô răng, độ đàn hồi tương tự ngà răng, chống lại sự hịa tan của axit, có độ ép
mỏng cao, giữ độ nhớt ổn định một thời gian ngắn sau trộn tạo sự thuận lợi để gắn
phục hình. GIC được coi như một vật liệu tương hợp sinh học, với khả năng gắn hóa
học vào cấu trúc răng, khả năng phóng thích fluor, và khả năng tái khống hóa thương
tổn sâu răng. Một vài bất lợi của GIC như có thể gây nhạy cảm, dễ bị mòn trong vùng
chịu lực nhai lớn.
GIC phóng thích lượng flour cao nhất trong 24h đầu sau khi đơng và lượng
flour phóng thích có khả năng gây độc tủy răng. Một số nghiên cứu in vitro như của
Chang YC, Chou MY (2001) [5], Theiszova M và cs (2008) [35] đã cho thấy flour
gây độc lên tế bào tủy răng ở người bằng việc ngăn cản sự tăng trưởng của tế bào, sự
tăng sinh, hoạt động nội bào, tổng hợp protein và gây ra sự chết tế bào theo chương
trình.
Trong nghiên cứu của Tatjana Kanjevac và cs (2012) [19] đã cho thấy lượng
fluor phóng thích tương quan trực tiếp với hoạt động gây độc trên tế bào gốc tủy răng
của các xi măng GIC. Những loại vật liệu phóng thích ít flour như Fuji I, Fuji Triage,
Composit thì khả năng gây độc tế bào ít hơn so với những loại GIC phóng thích flour
cao như Fuji Plus, Fuji VIII, Vitrebond.
1.4.2. Xi măng Glass Ionomer tăng cường nhựa (RMGIC)
Sự phát triển của GIC dẫn đến sự ra đời của vật liệu lai được biết đến với
tên gọi xi măng Glass Ionomer tăng cường nhựa (resin modified glass ionomer
cement - RMGIC). Nó là sự kết hợp của GIC với các monomer như 2-hydroxyethyl
methacrylate (HEMA), triethylene glycol dimethacrylate (TEGDMA)... So sánh với
GIC thông thường, RMGIC tăng cường độ bền uốn, độ bền kéo, mơ đun đàn hồi và
kháng mịn. Bất lợi chính của RMGIC là độc tính cao hơn so với GIC truyền thống
[25]



11

GIC lai phóng thích flour gây độc tế bào [19] và ngoài ra, hầu hết các tác
giả đều cho rằng các monomer tự do không được trùng hợp như HEMA, TEGDMA,
UDMA... chịu trách nhiệm gây độc tế bào. Thành phần này có tính ái nước và trọng
lượng phân tử nhẹ, do đó dễ dàng xuyên qua các ống ngà, và đến tế bào tủy răng, ở
đây, kết hợp với màng lipid của tế bào gây ra hiện tượng loạn năng màng tế bào và
dẫn đến chết tế bào [3]. Mặc dù có nhiều cải tiến xi măng GIC lai, lượng monome tự
do không trùng hợp trong xi măng đã giảm, tuy nhiên vẫn khơng có sự chuyển đổi
hồn tồn trong q trình trùng hợp. Mặc dù số lượng monome cịn lại là ít hơn 1,55%, nhưng đủ để góp phần gây ra các tác động gây độc tế bào trong các thử nghiệm
in vitro [15]
Các nghiên cứu thử nghiệm độc tính của GIC và RMGIC trên các loại tế
bào khác nhau như tế bào dạng nguyên bào ngà (MDPC-23) của Costa C (2003) [3],
tế bào tủy răng người của Wan-Hong Lan và cs. (2003) [39] đã kết luận RMGIC gây
độc tế bào nhiều hơn GIC thông thường. Oliva và cs. (1996) [28] trong nghiên cứu in
vitro kết luận HEMA là thành phần gây độc tế bào chính của RMGIC.
Trong một nghiên cứu in vitro của Rita Trumpaite- Vanagiene [30] về độc
tính của các loại xi măng gắn thường được sử dụng, Hoffmann’s Zinc Phosphate
(Hoffmann’s ZP), GC Fuji Plus (RMGIC) and 3M ESPE RelyX Unicem Resin
Cement (RelyX Unicem RC) trên nguyên bào sợi nướu răng người. Nhà nghiên cứu
đã kết luận, Hoffmann’s ZP ít gây độc nhất, trong khi RMGIC và RelyX Unicem RC
thì độc tế bào nhiều hơn (ANOVA, p<0,001).
1.4.3. Xi măng nhựa (RC)
Vật liệu nhựa được sử dụng đã lâu trong nha khoa với vai trò là xi măng
gắn phục hình và vật liệu phục hồi. Trong các thử nghiệm in vitro, các loại nhựa hóa
trùng hợp và quang trùng hợp thường gây độc tế bào từ 24-72 giờ trong môi trường
nuôi cấy, mặc dù một vài hệ thống mới hơn dường như giảm thiểu khả năng gây độc.
Khả năng gây độc tế bào giảm một cách có ý nghĩa từ 24-48 giờ sau khi đông. Một

vài nghiên cứu đã cho thấy một số loại nhựa vẫn còn khả năng gây độc tế bào in vitro


12

đến 4 tuần. Trong các trường hợp, vật liệu gây độc tế bào là do một số monomer nhựa
được phóng thích như: Triethylene Glycol Dimetharylate. Bisphenol-A-glycidyl
Methacrylate,

Urethane

Dimethacrylate,

Ethyleneglycol

Dimethacrylate,

Diethyleneglycol Dimethacrylate…Các nghiên cứu chỉ ra rằng nhựa quang trùng hợp
thì ít độc tế bào hơn so với nhựa hóa trùng hợp, nhưng kết luận này phụ thuộc vào
hiệu quả gây trùng hợp của ánh sáng và hệ thống nhựa.
Goldberg (2008) [15] khẳng định sau 3 ngày trám với composite quang
trùng hợp và hóa trùng hợp với ngà có độ dày cịn lại 0,5mm, đáp ứng tủy viêm ở
mức độ từ nhẹ đến trung bình. Tuy nhiên khơng cịn phản ứng nào sau 5-8 tuần. Thêm
vào đó là q trình hình thành ngà sửa chữa.
Trong một nghiên cứu [17] nuôi cấy tế bào tủy răng với dịch chiết trực tiếp
lấy ngày thứ 2 và ngày thứ 5 của 5 loại vật liệu gốc nhựa khác nhau, bao gồm 2
RMGIC (Fuji II LC and Fuji IX), 1 compomer (Dyract), and 2 composite resin (Tetric
and Superfil), tác giả Fu-Mei Huang và Yu-Chao Chang kết luận tất cả các vật liệu
đều gây độc tế bào. Composite có gây độc tế bào cao nhất trong các loại vật liệu với
thứ tự Superfil > Tetric > Fuji IX > Fuji II LC = Dyract.

Trong nghiên cứu của Fonseca năm 2016 [8] về khả năng gây độc của các
loại xi măng gắn (RMGIC - RelyX Luting, xi măng nhựa tự dán- RelyX U200 và xi
măng nhựa thông thường- RelyX ARC) đối với tế bào tủy răng qua rào cản ngà, kết
luận cả ba loại xi măng gắn có chứa nhựa khơng gây độc cho tế bào tủy răng.


13

Bảng 1.1: Tóm tắt một số nghiên cứu về độc tính của vật liệu
STT

Tác giả

Tế bào/Vật liệu

Phương pháp

Kết quả

nghiên cứu
1

Huang FM

-Tế bào tủy răng -Dịch chiết

-Tất cả vật liệu đều gây độc

và Chang


người.

tế bào. Composite độc

YC (2002)

-RMGIC (Fuji II -Đánh giá độc

nhất. Thứ tự gây độc

LC, Fuji IX),

tính sau 2

Superfil > Tetric > Fuji IX

compomer

ngày, 5 ngày

> Fuji II LC = Dyract

(Dyract),

với thử

composite

nghiệm MTT


trực tiếp.

(Tetric, Superfil)
2

Costa C và

-Nguyên bào

-Dịch chiết

-RMGIC (Vitremer,

cs (2003)

ngà MDPC-23.

trực tiếp.

Vitrebond) gây độc tế bào

-Vitremer,

-Đánh giá độc

cao hơn GIC (Fuji IX GP,

Vitrebond, Fuji

tính sau 72


Ketac-Molar)

II LC,

giờ bằng thử

Fuji IX GP,

nghiệm MTT.

Ketac-Molar
3

Kanjevac T

-Tế bào gốc tủy

-Dịch chiết

-Những loại vật liệu phóng

và cs

răng người.

trực tiếp.

thích ít flour như Fuji I,


(2012)

- Fuji I and Fuji

-Đánh giá độc

Fuji Triage, Composite có

Triage,

tính sau 72

khả năng gây độc tế bào ít

Composite, Fuji

giờ với thử

hơn so với những loại GIC

Plus, Fuji VIII,

nghiệm MTT

phóng thích flour cao hơn

Vitrebond

như Fuji Plus, Fuji VIII,
Vitrebond



14

4

5

6

Malkoc

-Tế bào nguyên

-Dịch chiết

-Cả ba loại xi măng nhựa

MA và cs

bào sợi L929.

trực tiếp.

đều gây độc với tế bào.

(2014)

-Super-Bond


-Đánh giá độc

C&B, RelyX

tính sau 24h

ARC, Clearfil

bằng thử

Esthetic

nghiệm MTT

Rita

-Nguyên bào sợi -Dịch chiết

-Cả ba loại xi măng đều

Trumpaite-

nướu răng

trực tiếp.

gây độc với tế bào.

Vanagiene


người.

-Đánh giá độc

(2015)

-Hoffmann’s

tính sau 1, 6,

ZP, Fuji Plus,

12h bằng thử

RelyX Unicem

nghiệm MTT

Ulker HE

-Tế bào nhú

-Tế bào tiếp

-Trừ MaxCem, các loại xi

và Sengun

răng bò


xúc gián tiếp

măng nhựa còn lại gây độc

A (2009)

-RelyX Unicem,

với vật liệu

tế bào.

MaxCem,

qua rào cản

Panavia F 2.0,

ngà 0,5mm.

BisCem, Bistite

-Đánh giá độc

II DC.

tính sau 24h
bằng thử
nghiệm MTT.


7

Fonseca

-Tế bào nguyên

-Dịch chiết

-Các loại xi măng không

Roberti

bào ngà MDPC-

gián tiếp qua

gây độc tế bào theo chuẩn

Garcia

23 và tế bào tủy

rào cản ngà

ISO 10993-5:1999

răng người.

0,4mm.



15

L, Pontes

-RelyX Luting,

-Đánh giá độc

EC (2016)

RelyX U200,

tính sau 24h

RelyX ARC.

bằng thử
nghiệm MTT


16

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Nguồn tế bào

Dòng tế bào nguyên bào sợi chuột 3T3 được cung cấp từ phịng thí nghiệm
bộ mơn sinh học phân tử trường Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh.
2.1.2. Vật liệu
Bảng 2.2: Thơng tin các loại xi măng sử dụng trong nghiên cứu
Vật
liệu
Fuji
I
Fuji
Plus

G
cem

Cơ
chế
đơng
GIC
1607111 Hóa
học
RMGIC 1605261 Hóa
học
Loại

Xi
măng
nhựa tự
dán

Số lô


1511261 Lưỡng
trùng
hợp

Thành phần

Bột: fluoroaluminosilicate glass
Lỏng: polyacrylic acid, nước,
Bột: fluoroaluminosilicate glass;
Lỏng: copolymer of acrylic and maleic
acids, HEMA, UDMA, tartaric acid, nước,
chất khơi mào hóa trùng hợp
Bột: fluoro-aluminio-silicate glass
Lỏng: thành phần nhựa có tính axit, nước,
UDMA, Dimethacrylates, 4-META,
phosphoric ester monomer,
camphorquinone


17

Hình 2.2: Các loại xi măng sử dụng trong nghiên cứu
2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
 Thời gian nghiên cứu:
Tháng 10/2016 đến tháng 4/2017

 Địa điểm nghiên cứu:
Nghiên cứu được tiến hành tại phịng thí nghiệm bộ môn sinh học phân tử
trường Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh.
2.2.2. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu in vitro có nhóm chứng.
2.2.3. Chuẩn bị trước khi nghiên cứu
a) Huấn luyện định chuẩn
Việc nghiên cứu được chuấn luyện định chuẩn tại phịng thí nghiệm bộ mơn
sinh học phân tử trường Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh.
Cán bộ huấn luyện: giảng viên bộ mơn.
Nội dung: các tiêu chuẩn và cách thức nuôi cấy tế bào, thử nghiệm MTS.