TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y


BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ

ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID
TRONG LÁ VÀ NỤ VỐI

GVHD:
Sinh viên thực hiện:

1


I.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo Đơng y, lá vối có tác dụng kiện tỳ, giúp ăn ngon, tiêu hóa tốt. Nước lá và nụ vối có
hoạt chất ức chế sự phát triển của một số vi trùng Gram âm và Gram dương nên có thể
dùng lâu dài để điều trị bệnh viêm đại tràng cũng như các bệnh tiêu hóa khác.
Trong dự thảo Dược Điển Việt Nam V (dự kiến xuất bản năm 2013-2014) đã có chuyên
luận về lá và nụ vối. Tuy nhiên, trong các chuyên luận này chưa có tiêu chí về định lượng
flavonoid trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành phần chính và có nhiều tác dụng
quan sinh học quan trọng.

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLAVONOID
TRONG LÁ VÀ NỤ VỐI

II.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Đối tượng:
• Flavonoid:
Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Hơn một nửa rau quả
thường dùng có chứa flavonoid. Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong dược liệu
nguồn gốc thực vật. Cho đến nay có khoảng 4.000 chất đã được xác định cấu trúc. Chỉ
riêng 2 nhóm flavon và flavonol và với nhóm thế là OH và/hoặc OCH3 thì theo lý thuyết
có thể gặp 38.627 chất. Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng (Flavonoid do từ flavus
có nghĩa là màu vàng). Tuy nhiên một số có màu xanh, tím đỏ, một số khác lại khơng có
màu cũng thuộc nhóm flavonoid. Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác
khơng thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon, cần
chú ý để khỏi nhầm lẫn

• Cây vối (lá và nụ):

2


Cây vối có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry, thuộc họ Sim
(Myrtaceae), là loại cây mọc nhiều ở nhiệt đới.
Lá Vối chứa rất ít tanin, vết alcaloid (nhóm indolic) và tinh dầu, tinh dầu lá gồm nhiều
thành phần trong đó thành phần chính là (Z)-β-ocimen, myrcen, (E)-β-ocimen. Trong lá
vối có chứa flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường tự do và sterol.
Nụ vối chứa nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần đã xác định cấu trúc hóa
học.
Nụ và lá vối được phơi và sấy ở 50oC cho đến khô.
2. Phương pháp:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp hóa lý dựa vào ái lực khác nhau

của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha
động và một pha tĩnh. Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: hấp thụ, phân bố, trao đổi
ion hoặc rây phân tử.
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra
khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic trên sắc ký đồ.
Dấu hiệu nhận biết Flavonoid
• Tính chất lý hóa:
Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi khơng màu (trường hợp các nhóm OH
đã methyl hố), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm đến đỏ cam.
Các chất thuôc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol, leuco-anthocyanidin,
flavan-3-ol do khơng có nối đơi liên hiệp giữa vịng B với nhóm carbonyl nên khơng
màu.
Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tuỳ theo pH của môi trường. Tuy nhiên khi
các flavonoid ở trong các bộ phận của cây thì cịn phụ thuộc vào hỗn hợp với các sắc tố
khác.
Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycosid và flavonoid sulfat là những hợp
chất phân cực nên khơng tan hoặc ít tan trong dung mơi hữu cơ, tan được trong nước tốt
nhất là cồn nườc. Các aglycon flavonoid thì tan được trong dung mơi hữu cơ, không tan
3


trong nước. Các dẫn chất flavonoid có nhóm 7-hydroxy thường dễ tan trong dung dịch
kiềm loãng.
Flavonoid tạo được phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác
của nhiều phản ứng oxy hóa.
•

Tác động đối với con người:

Các dẫn chất flavonoid có khả năng dập tắt các gốc tự do như HO., ROO.. Các gốc này

sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì sẽ gây ra những
ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hoá,
tăng thị lực vào ban đêm., chống độc, kích thích tiết mật, chống co thắt những tổ chức cơ
nhẵn (túi mật, ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác), thông tiểu, chống viêm
loét, ngừa các nguy cơ như xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá , tổn thương do
bức xạ, thoái hoá gan…
b. Dụng cụ và thiết bị hóa chất
• Cân kỹ thuật Precisa XT 620M
• Cân phân tích Precisa XT 220A
• Máy cất quay Buchi B481
• Tủ sấy Binder – FD 115
• Đèn tử ngoại
• Hệ thống HPLC _LC10A, hãng Shimadzu (Nhật Bản)
• Dung mơi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen..
• Bản sắc ký mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 (Merck)
• Silica gel sắc ký cột pha thng, c ht 40-63àm (Merck).
ã Cỏc húa cht làm các phản ứng định tính và định lượng.

c. Điều kiện quy trình và quá trình thực hiện
Quá trình thực hiện:
1) Chiết xuất và phân lập một Flavonoid chính từ nụ vối:
Cân 8 kg dược liệu (nụ vối) làm khô, chiết bằng ethanol 96% bằng phương pháp ngâm
lạnh, cho ethanol ngập hết dược liệu, thời gian ngâm là 1 tuần/lần rút dung dịch chiết,
4


ngâm 3 lần (dịch đã nhạt màu). Dung dịch chiết thu được, đem cất thu hồi dung môi
ethanol và cô cách thủy, thu được cao toàn phần (1192 g). Lấy 1000g cao đem hịa tan
một lượng vừa đủ 0,5 lít ethanol 96%, và tiếp tục bổ sung thêm 1,5 lít nước cất để hòa
tan.

Cân khoảng 300g cao phân đoạn EtOAc. Tiến hành chạy cột với hệ dung môi n-hexan:
ethyl acetat với độ phân cực tăng dần (tỉ lệ dung môi từ 49:1 đến 1:1). Dùng bình nón có
thể tích 250 ml để hứng dung dịch ra khỏi cột, thu được 32 bình (200 ml). Tất cả các bình
hứng đều được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Bằng cách này, ta thấy từ bình 04 đến
bình 09 cho sắc đồ giống nhau có 1 vết màu vàng, gộp các bình này lại, cất thu hồi dung
môi và cô cách thủy đến khơ thu được chất rắn có màu da cam, gọi là chất rắn CO-1
(4,329 g).

Chất rắn CO-1 là tinh thể có màu vàng da cam, có điểm nóng chảy 125-127 0C. Kiểm tra
độ tinh khiết bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho biết chất CO-1 phân lập
được có độ tinh khiết 98,21% tính theo diện tích pic.

5


Kết hợp số liệu các phổ UV, IR, 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy chất CO-1 là 2',4'dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon, có CTPT là C18H18O4 và KLPT 298 amu.
Phổ khối MS cho pic ion phân tử ở [M+H]+, có m/z = 299; ở [M-H]+ có m/z = 297, tương
ứng với khối lượng phân tử của chất rắn CO-1 là M = 298 amu.

6


Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC, đo nhiệt độ nóng chảy của CO-1 nhiều lần đều cho
kết quả ổn định ở 125-127oC. Như vậy, có thể sử dụng mẫu chất CO-1 phân lập được làm
chất đối chiếu trong việc định lượng flavonoid trong các mẫu nụ và lá vối.
2) Xây dựng phương pháp định lượng
• Khảo sát tính thích hợp của hệ thống:
Pha một mẫu đối chiếu có nồng độ 0,053 mg/ml, tiến hành sắc ký 6 lần với điều kiện sắc
ký đã lựa chọn.
• Khoảng tuyến tính của phương pháp:

Chuẩn bị một dãy gồm 5 dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ chính xác khoảng
0,0055 mg/ml đến 0,11 mg/ml rồi tiến hành chạy sắc ký
• Độ lặp lại của phương pháp:
Tiến hành 6 thí nghiệm riêng biệt cho mẫu chứa chất đối chiếu CO-1 có nồng độ 0,042
mg/ml với mẫu thực nụ vối Hưng Yên.
• Độ đúng và giới hạn của phương pháp:
Thêm vào mẫu thử (nụ vối Hưng Yên) đã được xác định hàm lượng một lượng chính xác
chất chuẩn sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.
Phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ 44 μg/ml, sau đó pha lỗng dần đến khi dung dịch chuẩn
khơng cịn xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Tiến hành phân tích theo các điều kiện
đã lựa chọn, ở nồn độ 0,031μg/ml được coi là giới hạn phát hiện (LOD)
củachứa
phương
1: Bình
phapháp
động.
thể hiện qua việc tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N) đạt trong khoảng 2-3.
2: Bộ phận khử khí
Xác định giới hạn LOL: Xác định bằng cách nới rộng điểm trên của đường chuẩn cho
3: Bơm
đến khi tương quan giữa nồng độ và diện tích pic khơng cịn tuyến tính
nữa. cao áp
4: Bộ phận tiêm mẫu
5: Cộ sắc ký (pha tĩnh)
d. Tiến hành phân tích trên máy

6: Đầu dị
7: Hệ thống máy tính có
phần mềm ghi nhận tín
hiệu, xử lý dữ liệu7 và

điều khiển hệ thống.
8: In dữ liệu.


III.
III.
III.
III.
III.
III.
III.
TÍNH TỐN KẾT QUẢ

• Khảo sát tính thích hợp của hệ thống:

Lần tiêm

Thời gian lưu

Diện tích pic

1

9,12766

2190950

2

9,7053


2186244

3
4
5
6

9,18479
9,47704
9,53417
9,41771

2205546
2245278
2214240
2213154

Các thơng số thống kê

SD = 21052
RSD = 0,95 (%)

Kết quả trên cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC là phù hợp và
đảm bảo sự ổn định của phép phân tích định lượng CO-1.

8


• Khoảng tuyến tính của phương pháp:


Δa = t(0,95, 4).Sa = 2,131841*46041,883 = 98153,9739
Δb = t(0,95, 4).Sb = 2,131841*890693,073 = 1898815,935
9


Phương trình hồi quy đầy đủ của đường chuẩn có dạng y = a + b.x có dạng như sau:
y = a + b.x = (a ± Δa) + (b ± Δb).x
yi = (54599,803 ± 98153,9739) + (4,16056x107 ± 1898815,935). CC.01 (1)
• Độ lặp lại của phương pháp:

• Độ đúng và giới hạn của phương pháp:
Hiệu suất thu hồi được tính theo cơng thức sau :

H(%) = 100%.(Ccó thêm chuẩn - Cnền)/Cchuẩn được thêm vào

10


Qua bảng trên cho thấy, phương pháp phân tích định lượng HPLC có khả năng thu hồi lại
cao hơn 90% có thể chấp nhận được. Như vậy phương pháp này có độ đúng cao.
Ta có S/N = = = 3
Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL
Nồng độ
(mg/ml)
Diện tích
Pic

0,11


0,1375

0,22

0,275

0,367

0,55

4575033

7119423

12105281

14809513

16490167

20791750

Từ kết quả trên cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 0,275 mg/ml, tại nồng độ này trở đi
trên đồ thị cho thấy diện tích pic và nồng độ khơng cịn tuyến tính. Như vậy, khoảng nồng
độ tuyến tính CO-1 để định lượng cho kết quả tốt nhất được xác định nằm trong khoảng
0,1-0,275 mg/ml.

IV.

KẾT LUẬN

11


 Đã phân lập được một flavonoid chính (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'dimethylchalcone) trong nụ vối làm chất đối chiếu trong định lượng flavonoid.
 Xác định được độ tinh khiết của flavonoid chính bằng HPLC (98,21%)
 Đưa ra được điều kiện, dung môi phù hợp chạy sắc ký trong việc định lượng
flavonoid chính trong nụ và lá vối.
 Xác định được khoảng tuyến tính (0,1 – 0,275 mg/ml) và lập đường chuẩn của
flavonoid.
 Xác định được giới hạn phát hiện (LOD = 0,031 μg/ml) và giới hạn định lượng
của phép đo (LOQ = 0,1023 mg/ml) .
 Đánh giá được sai số và độ lặp lại của phép đo.

V.





TÀI LIỆU THAM KHẢO

/> /> /> />%C6%B0%C6%A1ng_ph%C3%A1p_%C4%91%E1%BB%8Bnh_t%C3%ADnh_
%C4%91%E1%BB%8Bnh_l%C6%B0%E1%BB%A3ng_flavonoid_trong_l

%C3%A1_v%C3%A0_n%E1%BB%A5_v%E1%BB%91i
 /> />
Contents

12