XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
KHÁNG SINH CHLORAMPHENICOL
TRONG THỊT GÀ BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
GVHD:
Sinh viên thực hiện:

Nội dung chính
I.
II.

III.

IV.
V.

Đặt vấn đề.
Đối tượng và phương pháp thực hiện.
1. Đối tượng.
2. Phương pháp thực hiện.
2.1. Dấu hiệu nhận biết Chloramphenicol.
2.2. Dụng cụ thiết bị và hóa chất.
2.3. Điều kiện qui trình và quá trình thực hiện.
2.3.1. Điều kiện qui trình.
2.3.2. Quá trình thực hiện.
2.4. Q trình phân tích trên máy.
Tính tốn kết quả.
1. Lập đường chuẩn.
2. Độ chính xác.
3. Hiệu xuất thu hồi của phương pháp.
Kết luận

Tài liệu tham khảo


I.

II.

Đặt vấn đề.

Sự phát triển nhanh chóng và ổn định của ngành chăn nuôi nước ta đã và
đang chịu sự ảnh hưởng rất lớn của kháng sinh. Kháng sinh được dùng khơng
chỉ để phịng bệnh, trị bệnh mà cịn nhằm mục đích kích thích sinh trưởng nếu
được dùng ở liều thấp (nghiên cứu của McEvoy, 2002; Phạm Kim Đăng và cs,
2012). Tuy nhiên, việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp (đối với các chất cấm
dùng trong chăn nuôi) hoặc sai nguyên tắc sử dụng đối với các hợp chất kháng
sinh trong chăn nuôi gà công nghiệp đã gây ra hiện tượng tồn dư kháng sinh.
Tồn dư kháng sinh tác động trực tiếp đến các lồi vật ni (giảm đề kháng, lờn
thuốc..), gây ô nhiễm môi trường và hơn nữa ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của
cộng đồng, những người đang trực tiếp sử dụng các sản phẩm kháng sinh. Do có
phổ kháng khuẩn rộng và khả năng phân bố tốt vào các mô trên cơ thể nên
Chloramphenicol (CAP) được dùng rất phổ biến trong thú y trước đây. Tuy
nhiên, từ khi phát hiện những độc tính của CAP lên cơ quan tạo máu (thi ếu máu
cấp, suy tủy, tử vong), vào năm 2009 Bộ Nông Nghiệp và Phát tri ển nông thôn đã
ra thông tư cấm sử dụng Chloramphenicol trong chăn nuôi thú y và nuôi trồng
thủy hải sản. Nhưng trong một số nghiên cứu (đề tài khảo sát tình hình sử dụng
kháng sinh trong chăn ni và dư lượng kháng sinh trong thịt ở các quầy thịt gà
tại Tp. Hồ Chí Minh của PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải và Khoa CNTY, trường ĐH.
Nông Lâm) chỉ ra rằng: Chloramphenicol vẫn đang được dùng trái phép trong
chăn nuôi gà công nghiệp. Phương Pháp sắc kí lỏng khối phổ được nghiên cứu
và áp dụng với kháng sinh chloramphenicol, với nhiệm vụ phát hi ện lượng

kháng sinh Chloramphenicol (hoặc các chất cấm dùng trong chăn nuôi và nông
nghiệp khác) trong các nền mẫu sinh học ở mức độ vết hoặc siêu vết. Phương
pháp này đang là phương pháp thẩm định cuối cùng đối với các chất khó phát
hiện với độ chính xác và độ tin cậy rất cao.

Đối tượng và phương pháp thực hiện.

1. Đối tượng.
Các mẫu thịt gà bán trên quầy thịt ở địa bàn Quận Thủ Đức. Các đối
tượng này sẽ được phân tích những thành phần chính để lựa chọn ra nền
mẫu đại diện để chạy sắc ký.
2. Phương pháp thực hiện.
2.1. Dấu hiệu nhận biết Chloramphenicol
a. Lý hóa tính của CAP
CAP có dạng tinh thể khơng màu, lấp lánh, vị rất đắng, pH =
2-9, tan nhiều trong lipid và dung mơi hưu cơ như alcohol, tan ít
trong nước. CAP rất bền, không bị phá hủy bởi nhiệt độ của
nước sôi miễn là pH < 9.
b. Ảnh hưởng của CAP đối với con người


CAP ảnh hưởng trực tiếp lên tủy xương với triệu chứng đặc
trưng là suy tủy không hồi phục (thiếu máu bất sản). Tỉ lệ tử
vong trên người là 1/25 000 – 1/60 000 trường hợp. Do đó CAP
khơng được tồn dư trong thực phẩm (MRL = 0)
2.2. Dụng cụ thiết bị hóa chất.
 Nguyên vật liệu và hóa chất.
' Kháng sinh chuẩn CAP pha trong methanol ở nồng độ 1µg/ml
và bảo quản ở tủ lạnh ở 0 - 4°C.
' Hóa chất: Etylacetat; aminoacetat; n- hexan; acid acetid,

aceton và acetonitril.
' Nước cất.
 Thiết bị.
' Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS
' 2 loại cột chiết pha rắn dùng cho khảo sát gồm C18 và
Floresil
' Máy lắc vortex, máy cô quay và bình cơ quay.
' Các loại ống đong, ống nghiệm, pipet và các micropipet.
2.3. Điều kiện qui trình và quá trình thực hiện.
2.3.1. Điều kiện qui trình.
Bảng 1. Điều kiện chạy nguồn hóa ESI
Thế phun điện tử 4,0 kV
Nhiệt độ đầu phun (IS) 130°C
Khí màn (CUR) 30
Khí va chạm (CAD) 7
Nguồn khí ion 1 (GS1) 20
Nguồn khí ion 2 (GS2) 10
Thế phân nhóm (DP) -100
Thế đầu vào (Entrance Potential)
(EP) – 10


Thông số khảo sát

Khoảng khảo sát

Bước quét (step)

Số mảnh quét với mỗi
chất

Thế phân nhóm (DP)
Năng lượng va chạm (CE)
Năng lượng CXP

5 mảnh cho tín hiệu cao
nhất
Từ -150 đến -1 (V)
Từ 130 đến -5 (V)
Từ -55 đến 0 (V)

5 (V)
2 (V)
2 (V)

Bảng 2. Điều kiện bắn phá và phân mảnh các ion con
Chất phân
tích

CAP (323,13)

Mảnh khẳng
định

257,192

Mảnh định
lượng

152,221


Bảng 3. Các thơng số tối ưu cho chạy khối phổ đối với Chloramphenicol
Chú thích: DP: Thế phân nhóm (Declustering Potential), CE: Năng l ượng va ch ạm
(Collision Energy) và CXP: Năng lượng CXP (Collision Cell Exit
Potential).
2.3.2. Q trình thực hiện.
a. Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu.
Đầu tiên đối tượng nghiên cứu sẽ được phân tích những
thành phần chính để lựa chọn ra nền mẫu cho phương
pháp khảo sát. Sau khi chọn được nền mẫu thích hợp tiến
hành tách chiết, làm giàu và tinh sạch mẫu.
Sau khi đã lựa chọn được dung môi khảo sát và mẫu đã
được đồng nhất, tiến hành cân 10g mẫu cho vào ống ly
tâm 50ml, thêm chất chuẩn, sau đó thêm 20ml dung mơi,
lắc trên vortex trong khoảng 5 phút. Tiếp theo đem ly tâm
ở 6 000 v/phút trong 5 phút, gạn thu dịch chiết sang một
ống ly tâm khác. Chiết lặp lại một lần nữa với 10ml dung
mơi. Gộp dịch chiết 2 lần cho vào bình cơ quay 100ml. Cơ
quay tới cạn ở 40oC. Sau đó hịa tan lại bằng dung dịch
CH3COONH4 4%.
Do dịch chiết từ nên mẫu sinh học thường chứa nhiều
tạp chất như lipid, các acid béo, amin, rượu… nên thường
các nghiên cứu thường chọn chiết pha rắn để loại bỏ tạp
chất này cũng như để làm tinh sạch dịch chiết. Tuy nhiên,
do các đối tượng mẫu khảo sát thường có hàm lượng lipid
sau bước làm giàu sơ bộ khá cao nên trước khi nạp mẫu


qua cột chiết pha rắn, 10ml n- hexan đã được dùng để
loại bỏ chất béo chiết, lặp lại việc này 2 lần vớidung dịch
thu được ở trên.


Sơ đồ quá trình xử lý mẫu
b. Tối ưu hóa điều kiện phân tích CAP trên máy LC – MS/MS
Kháng sinh nhóm phenicol có khối lượng phân tử và độ
phân cực trung bình. Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ,
dùng pipet 500µl bơm chuẩn CAP 10ng/ml vào detector
để khảo sát. Tối ưu hóa từng ion mẹ và chỉnh tối ưu điều
kiện chạy ESI như bảng 2.


2.4.

Phổ khối của CAP trên hệ LC/MS nghiên cứu
c. Tối ưu hóa các điều kiện sắc ký

Lựa chọn cột phân tách.
CAP có độ phân cực trung bình, nên lựa chọn an toàn
cho hệ pha động của máy khối phổ là các dung môi phân
cực vừa như methanol, acetonitril, nước, acid formic (<
1%), amoniacetat (< 1%). Lựa chọn dung môi thường
tuân theo tính kinh tế và tính phù hợp với phịng thí
nghiệm.

Hệ pha động và phương pháp gradient
Trong phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, pha động của
chương trình khơng chỉ ảnh hưởng tới q trình tách các
chất mà nó cịn ảnh hưởng tới q trình ion hóa và tín
hiệu các chất phân tích. Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử
bắn phá ở chế độ ion âm, quá trình ion hóa sẽ tốt hơn khi
có thêm các chất như acid acetic, acid formic…Trong

nghiên cứu này đã dùng dung dịch chuẩn CAP ở nồng độ
2ng/ml.
d.
Thẩm định phương pháp phân tích thơng qua việc
phân tích mẫu thêm chuẩn và thử nghiệm phân tích
mẫu thực tế.
o Phân tích mẫu trắng.
Mẫu trắng: gà được nuôi bằng thức ăn tự nhiên
và không sử dụng kháng sinh trong thời gian
ni).
Tiến hành phân tích lặp lại 3 lần và thu được độ
thu hồi đều cao hơn 80% ở 3 mức nồng độ 0,5; 1
và 5 ng/g.
o Thử nghiệm phân tích mẫu thực tế.
Mẫu thực tế: lấy ở các quầy thịt gà tại các chợ
tại địa bàn quận Thủ Đức.
Q trình phân tích trên máy.

Nạp mẫu
Hóa khí mẫu

Bơm hút

Ion hóa

Phân tích ion
theo số khối


Detector


Xửả.lý số liệu
Tính tốn kết qu

1. Lập đường chuẩn.
Phương pháp LC-MS/MS có khoảng tuyến tính rõ rệt (tất cả hệ số hồi qui
Sơ đồ q trình phân tích trên máy
tuyến tính đều dao động trong khoảng từ 0,99 đến dưới 1). Cụ th ể CAP có
khoảng tuyến tính từ 0,5 đến 3 ng/g với hệ số hồi qui tuyến tính là
0,9994.
Khoảng
tuyến tính
khảo sát
0,5 – 3

Phương trình đường
chuẩn

R²

LOD (ng/g)

LOQ (ng/g)

Y = 6x10¯⁵x – 0,0256

0,9994

0,009


0,03

đường chuẩn của CAP
3
2.5

2.5

2

y (ng/g)

III.

1.5
1
0.5
0
0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


x (cm²)
2. Độ chính xác.
Giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD) đối với CAP = 0,009ng/g. Chỉ
số LOD cho phép phát hiện CAP ở độ nhạy rất cao, khoảng 0,009 ppb.
Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) đối với CAP = 0,03ng/g.
Kết quả phân tích cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao để phân tích
dư lượng kháng sinh CAP trong thịt gà.

0.45


IV.

3. Hiệu xuất thu hồi của phương pháp.
Để đánh giá hiệu quả của phương pháp, nghiên cứu đã xác định độ thu
hồi của phương pháp với các mẫu trắng và các mẫu trắng thêm chuẩn ở
ba mức nồng độ quan tâm (xung quanh nồng độ thấp nhất của khoảng
tuyến tính). Kết quả cho thấy, phương pháp đáp ứng tốt với CAP nghiên
cứu, độ thu hồi đạt trên 83%.

Kết luận

Kết quả nghiên cứu bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ để phát hiện chất
cấm CAP trong thịt gà:
' Độ thu hồi đạt được của mẫu tương đối cao (>80%).
' Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các lần đo đều tương đối nhỏ
(<4,18%).
' Nghiên cứu có thể mở rộng ra cho các đối tượng mẫu khác, cho các
kháng sinh khác thuộc nhóm phenicol hoặc ngồi nhóm phenicol
(nhóm beta – lactam, nhóm tetracycline).


V.

Tài liệu tham khảo.

 Phạm Kim Đăng, Vũ Thị Ngân, Phạm Hồng Ngân (2014), “Xác định
đồng thời dư lượng kháng sinh Chloramphenicol (CAP), Florphenicol
(FF), Thiamphenicol (TAP) trong một số sản phẩm động v ật b ằng
phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)”.
 Nguyễn Minh Đức (2006). Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng
dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp
chất tự nhiên, NXB Y học, Tp. Hồ Chí Minh.
 Võ Thị Trà An, giáo trình dược lý thú y, nhà xuất bản Nơng nghiệp
Tp. Hồ Chí Minh, 2014.
 Dr. Nguyễn Ngọc Vinh, bài giảng “Các phương pháp phân tích sắc
ký.