Phương pháp xác định melamine
trong thực phẩm, thức ăn chăn
nuôi và sữa bằng sắc ký lỏng cao
áp HPLC


Tham khảo: Gopalakrishnan Venkatasami, John R. Sowa
Jr. ∗ Department of Chemistry and Biochemistry, Seton Hall
University, 400 South Orange Ave., South Orange, NJ 07079,
USA
NGUYÊN LÝ
Quá trình tách được thực hiện trên một cột C18 (150mm x 3.2mm
ID, kích thước hạt 5 µm). Pha động (0,1% Trifluoroacetic - TFA /
methanol là 90:10) được bơm với tốc độ dòng 0.3 mL/ phút với
bước sóng phát hiện ở 240 nm. Melamine tách ra ở 3,7 phút. Một
đáp ứng tuyến tính (r> 0,999) quan sát thấy đối với các mẫu khác
nhau từ 1,0-80 µgmL-1 Phương pháp này cung cấp khả năng thu
hồi từ 97,2-101,2% trong khoảng nồng độ từ 5-40 µgmL-1 . Các
giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) có giá trị
là 0,1 µgmL-1 và 0,2 µgmL-1
THÍ NGHIỆM
Hóa chất và thuốc thử
Chất chuẩn: Melamine (99,0%)
Dung môi: Methanol
Dung môi rửa giải: Trifluoroacetic và Methanol
Mẫu thử (sữa dạng bột hoặc lỏng, thức ăn chăn nuôi, thực
phẩm,..)


Nước sử dụng cho việc chuẩn bị pha động và pha loãng được lọc
bằng hệ thống Q-pod Millipore.

Hệ thống sắc ký
Đầu dị UV, cột C18 (150mm x 3.2mm ID, kích thước hạt 5 µm)
Thiết lập các thơng số cho HPLC
Dung môi rửa giải HPLC là dung dịch 0,10% (pH 2.4) TFA /
methanol (90:10) được bơm ở tốc độ dòng chảy của 0,3 mLmin 1

với khối lượng tiêm 20 µL. Các bước sóng phát hiện được thiết

lập tại 240 nm. Hiệu quả của TFA tập trung vào thời gian lưu giữ
melamine và hình dạng pick được đánh giá. Tại 0,050% (pH 2,8)
và 0,10% TFA, thời gian lưu giữ (3.7 phút) được hình dạng giống
hệt nhau và cao điểm sắc nét, tuy nhiên, ở nồng độ 1,0% (pH 1,4)
TFA, thời gian lưu giữ lâu hơn (4,6 phút) và pick rất rộng.
Pha dung dịch
Dung mơi
Dung mơi 50% methanol (về thể tích) được chuẩn bị bằng cách
pha thể tích bằng nhau của methanol và nước.
Dung dịch chuẩn Melamine
Cân chính xác 100 mg melamine vào bình định mức 100 mL, hịa
tan với Methanol 50% bằng cách rung trong bể rung siêu âm 30
phút. Lên thể tích 100 mL thu được dung dịch có nồng độ
melamine 1000 µgmL-1.


Pha lỗng 5mL melamine trên (1000 µgmL -1) bằng 50 ml 50%
methanol để được nồng độ melamine 100 µgmL-1.
Pha lỗng tiếp 5mL melamine 100 µgmL-1 bằng 50 ml methanol
50% để được nồng độ melamine 10 µgmL-1.
Chuẩn bị mẫu
Cho 10 ml (mẫu dạng lỏng) hoặc 1,0 g (mẫu khơ) vào bình định

mức 100 ml. Mẫu được pha với 10 ml dung dịch melamine của
1000 µgmL-1, được pha lỗng với 50 ml dung dịch methanol 50%
và rung siêu âm 30 phút. Sau khi làm lạnh về nhiệt độ phịng, lên
thể tích 100 ml bằng dung dịch methanol 50% và thu được dung
dịch hỗn hợp với nồng độ melamine là 100 µgmL-1
Cho dung dịch mẫu thu được vào ống li tâm và ly tâm ( ≥ 3200
rpm) rồi lấy phần dung dịch phía trên ống (5 ml) chuyển sang
bình định mức 50ml, và lên thể tích 50 ml bằng dung dịch
methanol 50%. Mẫu được lọc qua bộ lọc 0.45 µm (Acrodisc,
25mm, màng Nylon). Nghiên cứu về dịch lọc chỉ ra rằng các bộ
lọc hấp thụ melamine tại các mức sau: 22% (cho 1ml ban đầu),
10% (2 mL), <1% (3, 5 và 7ml). Như vậy, 3ml ban đầu của dịch
lọc bị loại bỏ phần lọc còn lại được bổ sung vào một lọ HPLC để
phân tích.


Phương pháp kiểm chứng
Độ tuyến tính
Độ tuyến tính của dung dịch thử nghiệm đã được chuẩn bị từ
dung dịch melamine ở các nồng độ khác nhau từ 1,0-80 µgmL -1.
Một đường cong hiệu chuẩn được thu được bằng cách vẽ đồ thị
tuyến tính giữa diện tích peak với nồng độ. Giá trị % R.S.D (độ
lệch chuẩn tương đối) từ năm lần tiêm mẫu chuẩn được lặp đi lặp
lại ở mỗi nồng độ và % hệ số độ lệch chuẩn đã được tính tốn.

Hình 2. Mối quan hệ tuyến tính của nồng độ melamine với
diện tích của peak
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
LOD và LOQ của phương pháp này được ước tính ở một tỉ số tín
hiệu cực đại trên đọ nhiễu (Signal-to-noise) 03:01 và 10:01, bằng



cách tiêm một loạt các dung dịch pha loãng với nồng độ nhất
định.
Một nghiên cứu chính xác cũng đã được tiến hành ở mức LOQ
bằng việc tiêm sáu lần riêng rẽ chất pha chế và giá trị % RSD của
diện tích peak được tính tốn. Một nghiên cứu về hiệu suất thu
hồi được thực hiện trong ba lần, mức LOD và LOQ cho mẫu bột
và chất lỏng cho thấy hiệu suất trung bình là 75 ± 2% của LOD
và 90 ± 1% của LOQ
Độ chính xác
Độ chính xác của phương pháp này được đánh giá ở nồng độ
bốn mức độ melamine (5, 10, 20 và 40 µgmL -1) với việc sử dụng
1 g khô hoặc10ml mẫu chất lỏng. Hiệu suất thu hồi phản ánh một
trung bình cộng của sáu lần phân tích tại mỗi nồng độ và được
báo cáo trong bảng 1.


Bảng 1: Kết quả phục hồi của melamine trung bình trong 6
lần phân tích ở 4 nồng độ khác nhau của Melamine
Độ chính xác được đo bằng độ ổn định và tính lặp lại của mẫu.
Việc sử dụng một mẫu được xử lý theo mục 2.5.2, độ lặp lại trong
1 hay nhiều ngày của phương pháp đã được chứng minh bằng
cách tiêm (trong ba lần) của mẫu vào ngày đầu tiên và ba ngày
liên tiếp. Thu hồi khoảng 101,1-102,8 (0,8% RSD). Ngoài ra, độ
tái lặp của một mẫu được xử lý (trong ba lần) một cách riêng biệt
vào ngày 0 và ngày 4 có kết quả trong thu hồi 99,5 đến 101,8
(0,8% RSD).
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Sắc ký lỏng pha đảo là một kỹ thuật tách tuyệt vời cho các phân

tử ion hóa. Vì melamine là một chất phân tích cơ bản (pKa = 5.0),
trong điều kiện có tính acid (pH <3), chất phân tích được thêm
đầy các proton trong pha động và các nhóm silanol (SiH 3OH) cịn
lại trên cột hỗ trợ Silica cũng được thêm proton. Phương pháp
này sử dụng một hỗn hợp pha động của axit trifluoroacetic
(0.10%, pH 2,4) và methanol. Phương pháp này là lợi thế hơn vì
nó tránh việc sử dụng của acetonitril đắt tiền trong pha động.


Những sắc phổ (Hình 2) chỉ ra rằng khơng có sự nhiễu và các tín
hiệu melamine được phân biệt rõ ràng ở 3,7 phút. Một đường
cong hiệu chuẩn tuyến tính được thể hiện trong hình.3. Ngồi ra,
các mẫu được pha với 5-40 µgmL-1 Melamine chỉ ra sự thu hồi
melamine khác nhau, từ 97,2-101,2 với các giá trị RSD khác
nhau, từ 0,4% đến 2,9% cho thấy phương pháp này là chính xác
trong khoảng nồng độ này (Bảng 1). Phương pháp này liên quan
đến việc xử lý mẫu tương đối đơn giản bao gồm pha lỗng với
50% Methanol. Sắc ký HPLC hồn thành q trình chạy trong 6
phút.
NHẬN XÉT
Tính chất tuyến tính
Một đường hiệu chỉnh tuyến tính (hình 3) thu được trên dải hiệu
chuẩn từ 1,0 đến 80 µgmL-1với hệ số tương quan (r) 0,999. Giá trị
R.S.D của các lần tiêm mẫu lặp lại < 0,02% đối với mỗi nồng độ
và hệ số lệch chuẩn y < 2%


Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
LOD đã được xác định là 0,1 µgmL-1 và LOQ đã được xác định là
0,2 µgmL-1 . Giá trị % của R.S.D được nghiên cứu chính xác ở

mức độ LOQ là trong khoảng 5%.
Độ chính xác
Hiệu suất thu hồi hồi tỷ lệ melamine trong các mẫu dao động từ
97,2% đến 101,2% (Bảng 1).
Phương pháp này cho thấy độ lặp lại trong 1 ngày và nhiều ngày
cho các mẫu xử lý được chỉ ra thông qua hiệu suất thu hồi từ
101,1-102,8% (0,8% RSD). Ngoài ra, khả năng tái lặp của một
mẫu riêng biệt xử lý (trong ba lần) vào ngày 0 và ngày 4 kết quả
hiệu suất thu hồi từ 99,5-101,8 (0,8% RSD).
KẾT LUẬN


Bài viết này mô tả một phương pháp đơn giản để xác định ô
nhiễm melamine trong các thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng
cách sử dụng sắc ký lỏng pha đảo HPLC. Phương pháp này
thuận lợi bởi vì pha động là acetonitril miễn phí và thời gian phân
tích của ~ 6min mỗi mẫu. Quá trình tách được thực hiện trên cột
C18 (150mm x 3.2mm ID, kích thước hạt 5 µm) ở nhiệt độ phòng
với một pha động của TFA 0,1% / methanol (90:10), tốc độ dòng
chảy của 0.3 mLmin-1 và phát hiện ở bước sóng 240 nm của đầu
dị. Bắt đầu với một nồng độ chất phân tích của 10 µgmL-1, một
phản ứng tuyến tính(r> 0,999) đã được quan sát thấy đối với các
mẫu khác nhau, nồng độ từ 10% đến 400%. Phương pháp này
cho hiệu suất thu hồi 97,2-101,2% trong khoảng nồng độ 5-40
µgmL-1 . Trong ngày và giữa các ngày tính lặp lại là ít hơn 1,0%
R.S.D. LOD và LOQ là 0.1 mLmin-1 và 0,2 mLmin-1, tương ứng.
Phương pháp phân tích này cung cấp độ nhạy cảm tuyệt vời, khả
năng tái lặp, chính xác cao.