NGHIÊN CỨU VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG
NITRATE CÓ TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU CỦ
QUẢ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO HPLC


Chương 1. Giới thiệu
1.1 Lý do chọn lựa đề tài
1.2 Mục tiêu, đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
Chương 2.Tổng quan lý thuyết
2.1 Tổng quan về nitrat
2.1.1 Giới thiệu về nitrate
2.1.2 Nguồn gốc của nitrate. Vì sao nitrate có nhiều trong đất ?
2.1.3 Ảnh hưởng của nitrat đối với sức khoẻ con người
2.1.4 Quy định hàm lượng nitrate trong một số loại rau củ
2.1.5 Một số phương pháp xác định hàm lượng nitrate
2.2 Tổng quan về HPLC
2.2.1 Giới thiệu HPLC
2.2.2 Khái niệm HPLC
2.2.3 Phân loại sắc ký
2.2.4 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột
2.2.5 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ
2.3 Hệ thống HPLC
2.3.1 Bình đựng dung mơi
2.3.2 Bộ phận khử khí (Degasse)
2.3.3 Hệ thống bơm
2.3.4 Bộ phận tiêm mẫu
2.3.5 Cột sắc ký
2.3.6 Detector
2.3.7 Bộ phận xử lý và ghi tín hiệu
2.4 Chọn điều kiện sắc ký

2.4.1 Lựa chọn pha tĩnh
2.4.2 Lựa chọn pha động


2.4.3 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc
2.4.4 Chuẩn bị dung môi pha động
2.4.5 Chuẩn bị mẫu đo HPLC
2.4.6 Cách sử dụng máy HPLC
Chương 3. Phương pháp nghiên cứu
3.1 Quy trình thử nghiệm
3.1.1 Thuốc thử
3.1.2 Thiết bị - dụng cụ
3.1.3 Cách tiến hành
3.2 Thẩm định quy trình thử nghiệm
3.2.1 Độ đúng
3.2.2 Độ chính xác
3.2.3 Tính đặc hiệu
3.2.4 Giới hạn phát hiện
3.2.5 Giới hạn định lượng
3.2.6 Tính tuyến tính
Chương 4. Kết quả nghiên cứu
4.1 Kết quả thẩm định
4.1.1 Kiểm tra độ sai lệch giữa 2 phương pháp xử lý mẫu
4.1.2 Độ lặp lại
4.1.3 Tính tuyến tính
4.1.4 Độ đúng
4.1.5 Giới hạn phát hiện
4.1.6 Tính đặc hiệu
4.2 Kết quả khảo sát hàm lượng nitrate trên 1 số loại rau củ quả bằng 2 phương
pháp



4.3 Một số hình ảnh về sắc kí đồ của mẫu phân tích
Chương 5. Kết luận và kiến nghị
Chương 1. Giới thiệu
1.1 Lý do chọn đề tài
Hiện nay, an toàn vệ sinh lương thực thực phẩm đang là vấn đề cấp bách được
nhiều người quan tâm. Số người phải cấp cứa vào bệnh viên do ăn phải thức ăn
bị nhiễm độc ngày càng tăng trong những năm gần đây. Do chạy theo năng
suất, một bộ phận nông dân đã sử dụng quá liều lượng các loại phân bón và
thuốc bảo vệ thực vật làm nhiễm độc cho các loại rau quả dẫn đến gây độc thậm
chí nguy hiểm đến tính mạng con người. Rau quả là sản phẩm nông nghiệp cực
kỳ quan trọng đối với việc cung cấp vitamin, khoáng và các chất bổ dưỡng khác
liên quan đến sức khoẻ con người. Nhiều loại rau quả được con người sử dụng
ở dạng tươi sống vì thế các tác nhân hố học sử dụng cho rau quả dễ bị haaos
thụ và chuyển trực tiếp vào cơ thể con người.
Nitrate là một ion đọc có trong rau quả, hàm lượng nó liên quan chặt chẽ đến
liều lượng phân đạm sử dụng. Sự có măt của nitrate với hàm lượng lớn gây hại
tác động xấu đến sức khoẻ.
Do vậy, việc phân tích xác định hàm lượng của các độc tố (trong đó có nitrate)
có trong rau quả trên thị trường đồng thời có thể giúp các cơ quan chức năng
trong việc kiểm tra giám sát chất lượng lương thực, thực phẩm nhằm bảo vệ sức
khoẻ người tiêu dung.
1.2 Mục tiêu đối tượng nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu:
Tìm hiểu tính chất vật lí, hố lí, tác hại của nitrate có trong rau củ quả.
 Đưa ra phương pháp xác định hàm lượng nitrate trong rau củ quả bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
 Khảo sát hàm lượng nitrate có trong một số loại rau củ quả có mặt trên thị
thường

Đối tượng nghiên cứu: một số loại rau củ quả phổ biến trong bữa ăn hang
ngày.
Phạm vi nghiên cứu: rau củ quả được mua từ một số chợ trên đia bàn thành
phố Hồ Chí Minh.
Chương 2. Tổng quan lý thuyết
2.1 Tổng quan về nitrate
2.1.1 Giới thiệu về nitrate
Nitrate là muối của acid nitrite. Trong muối nitrate, ion NO3- có cấu tạo hình
tam giác đều với góc ONO bằng 1200 và độ dài liên kết N-O bằng 1,218 A0 .
Ion NO3- khơng có màu nên các muối nitrate của những cation không màu
đều khơng có màu. Hầu hết các muối nitrate đều dễ tan trong nước. Muối
nitrate của những kim loại hoá trị hai và hoá trị ba thường ở dạng hydrat.


Muối nitrate khan của kim loại kiềm khá bền với nhiệt ( chúng có thể thăng
hoa trong chân khơng ở 3800 – 5000 ). Còn các nitrate của kim loại khác dễ
phân huỷ khi đun nóng. Độ bền nhiệt của muối nitrate phụ thuộc vào bản
chất cation kim loại.
2.1.2 Nguồn gốc của nitrat. Vì sao nitrat có nhiều trong đất?
Nitrat được tạo thành tự nhiên từ nito trong lòng đất. Nito tồn tại trong thiên
chủ yếu dưới dạng phân tử hai nguyên tử N2 và là một nguyên tố khá phổ
biến trong thiên nhiên, chiếm 78,03% thể tích của khơng khí. Một cách gần
đúng có thể coi thể tích của khơng khí gồn có 4 phần N2 và 1 phần 02.
Trong phân tử N2, nito liên kết với nhau bằng ba liên kết hoá trị. Để phá vỡ
liên kết này cần một năng lượng rất lớn khoảng 942kJ/mol. Điều này giải
thích tính trơ của phân tử N2 và giải thích tại sao đa số hợp chất đơn giản của
N2, mặc dù trong đó có liên kết bền, đều là hợp chất thu nhiệt. Cũng chính vì
thế mà phần lớn các sinh vật sống khơng thể sử dụng trực tiếp nó được.
Nito có trong mọi sinh vật dưới dạng hợp chất hữu cơ phức tạp như protein, acid
nucleic, một số sinh tố và kích thích tố, chất màu của máu, clorophin… Nito là một

trong những nguyên tố dinh dưỡng chính đối với thực vật. Bởi vậy trong nông
nghiệp, những lượng lớn hợp chất của nito được thường xuyên cung cấp cho đất
dưới dạng phân tử đạm để nuôi cây trồng.
Nito tồn tại ở nhiều trạng thái ox khác nhau như NO3-, NO2 và NH4. Trong các
dạng tồn tại của nito thì NO3- và NO2- được quan tâm hơn cả vì chúng là những
ion có khả năng gây độc cho con người. Ngồi các trạng thái trên nito cịn tồn tại ở
trạng thái khí như N2, NO, N2O. Trong các dạng tồn tại của nito thì NO3- là dạng
bến nhất và được tìm thấy nhiều trong nước ngầm tại các khu vực đất trồng trọt.
Quá trình hình thành nitrate là một giai đoạn khơng thể thiếu trong vịng tuần hồn
của nito trong tự nhiên.
Chu trình của nito chủ yếu liên quan đến các phản ứng sinh học.Tất cả các phản
ứng trong chuỗi:
N2-----> NH3----- > NO2----- >NO3------> NH4+----- > Protein
 Các hợp chất của nitơ xuất hiện trong nước như NH4+, NO2-, NO3là sản phẩm của quá trình phân huỷ vi sinh yếm khí (NH4+), hiếu khí
(NO2-, NO3-) các chất hữu cơ chứa nitơ từ xác các sinh vật, chất thải
hữu cơ...ở giai đoạn đầu các chất đạm dưới tác dụng cuả vi khuẩn
yếm khí sẽ phân huỷ thành NH3:
(NH2)2CO H2O ---> 2 NH3 CO2


Ion amoni (NH4+) trong nước sau một thời gian tương đối dài sẽ chuyển
dần thành NO3• Các nguồn thải từ một số ngành cơng nghiệp hố chất, cơng nghiệp
thực phẩm chứa acid nitrite ( hoà tan trong nước mưa tạo HNO3) cũng
đưa vào nước một lượng khá lớn NO3
- Thành phần nitơ trong đất chủ yếu ở dạng hữu cơ, do kết quả của quá
trình phân huỷ thực vật và động vật chết, phân, nước tiểu...nó được
chuyển hố thành NH3, NH4+ sau đó bị oxi hố bởi vi khuẩn tạo thành
NO2- rồi NO3- và thực vật sử dụng NO3- làm chất dinh dưỡng. Tuy
nhiên, nồng độ tự nhiên của nitrate trong đất không cao lắm, chưa đủ để
đảm bảo cho cây trồng có năng suất cao. Vì vậy, người nơng dân phải bổ

sung vào đất các loại phân đạm như urê (NH2)2CO , NH4NO3,
(NH4)2SO4....đều đặn để cấp thêm nitơ cho đất, nhất là sau khi thu
hoạch đất bị bạc màu. Khi đó các vi khuẩn sẽ chuyển hố NH4+ thành
NO3- để cho cây hấp thụ. Ngày nay do sử dụng phân đạm trong sản suất
nông nghiệp quá nhiều và chưa đúng quy định là nguyên nhân chủ yếu
gây ô nhiễm NO3- trong nước. Tuy nhiên, nitrate và amoni một phần chủ
yếu được cây cối hấp thụ, một phần giải phóng ra ngồi khí quyển dưới
dạng N2, NH3 và phần cịn lại tích tụ trong đất và tan trong nước ngầm.
Từ đó cho thấy nếu luợng đạm đưa vào đất càng nhiều thì lượng NO3dư thừa càng tăng. Thực phẩm và đồ uống có chứa một hàm lượng nitrate
thấp thì khơng có hại cho sức khỏe. Cây cối hấp thụ nitrate trong đất để
lấy dưỡng chất và có thể sẽ tạo một dư lượng nhỏ trong lá và quả. Do
tính cơ động cao, nitrate dễ dàng thấm vào nguồn nước ngầm. Nếu con
người và súc vật uống phải nước có nhiều nitrate sẽ dễ bị mắc các chứng
bệnh về máu, đặc biệt là đối với trẻ nhỏ. Nitrate hình thành khi vi sinh
vật chuyển hóa phân bón, phân hủy xác động thực vật. Nếu cây cối
không kịp hấp thụ hết lượng nitrate này thì nước mưa và nước tưới sẽ
làm cho nó ngấm vào lịng đất, làm ơ nhiễm nguồn nước ngầm. Rất tiếc
là con người lại chính là thủ phạm tạo ra nguồn ô nhiễm nitrate lớn nhất
thông qua các hoạt động nơng nghiệp:
• Sử dụng phân bón hóa học hoặc hữu cơ
• Chăn ni
• Thải nước và rác khơng qua xử lý
• Hệ thống bể phốt
2.1.3 Ảnh hưởng của nitrate đối với sức khỏe con người


Nitrate là chất dinh dưỡng cho cây cỏ (phân bón) để chúng có thể
sanh trưởng. Khi thiếu ánh nắng, vào buổi sáng tinh mơ, mùa xuân và
mùa thu hoặc trong mùa đông nếu lượng phân nitrate quá cao cây cỏ sẽ
dự trữ lại trong các tế bào. Tự bản thân nitrate khơng có độc tố, nhưng

trong cơ thể con người nitrate sẽ tạo ra nitrite ở những điều kiện nhất
định.
Một người trưởng thành khỏe mạnh có thể chịu được một lượng
nitrate tương đối lớn mà không bị ảnh hưởng đến sức khỏe. Trên thực tế,
phần lớn lượng nitrate xâm nhập cơ thể qua thực phẩm, cụ thể là các loại
rau củ. Tuy nhiên, lượng nitrate này sẽ bị thải theo nước tiểu. Thế nhưng,
nếu liên tục phải hấp thụ nitrate có thể sẽ dẫn đến mắc phải một số bệnh
do sự hình thành của các Nitrosamines (chất gây ung thư) và làm rối loạn
sức khỏe như sự thay đổi hàm lượng vitamin, rối loạn việc tạo ra
thyroxin của tuyến giáp, sự thay đổi trong máu, ảnh hưởng xấu đến việc
tái sản xuất…Hầu hết tất cả thực phẩm đều có chứa nitrate bởi vì nitrate
có mặt trong tự nhiên trong đất, nước và khơng khí. Sự ảnh hưởng xấu
của nitrate đến sức khỏe con người bắt đầu từ những sự chuyển đổi của
chúng thành nitrite bởi một enzyme. Enzyme này có trong tuyến nước
bọt, trong dạ dày hoặc bất cứ ở đâu trong cơ thể người có pH thấp.
Nitrosamine là một hộp chất có cấu trúc hóa-học là R1N (-R2)N=O, trong đó có carcinogenic, đó là tác nhân kích thích sự phát triển
của bệnh ung thư hay bệnh ác tính nào đó.

Hình 2.2: Cơng thức của Nitrosamine
Tại sao có Nitrosamine?
Trong thức ăn, Nitrosamine do hai yếu tố tạo nên nó là nitrites và
amines. Ta thấy sự hợp thành của nó thường xảy ra trong các proteins.
Với điều kiện thích hợp, chẳng hạn như trong các điều kiện quá ư là acid,
như trong bao tử chúng ta, hay tại nơi nào có chiên xào với nhiệt độ cao,
thì Nitrosamine dễ hợp thành. Như ta biết nitrite hợp thành nitrous acid
(HNO2), và khi ta tách chúng ra làm đơi ta có hai phần: nơi cực dương ta


có nitrosonium cation N = O+ cịn nơi cực âm ta có hydroxide anion
OH-. Rồi nơi phía cực dương chính cation nitrosonium tác dụng với

amine cho ta một chất gọi là Nitrosamine.
Ngồi ra, Nitrosamine cịn có do các hố chất dùng hằng ngày trong
kỹ nghệ hấp khô (dry cleaning industry) cũng gây độc chất cho con
người. Thêm nữa, hai nhà khoa học người Anh kể trên là Magee và
Barnes còn nghiên cứu thêm những tính chất khác có được của
Nitrosamine và của cả hợp chất N-Nitroso (N-Nitroso compounds). Trên
300 hợp chất Nitroso được thí nghiệm thì thấy rằng khỏang 90% đều có
thấy chất carcinogenic tạo ra các bướu ác tính trên nhiều loại thú được thí
nghiệm. Tất cả các Nitrosamines là đều là những tác nhân gây đột biến
(mutagens) bên ngoài tác dụng vào các tế bào trong cơ-thể và một số tạo
thành carcinogens, cho từng phần lớn các cơ quan đặc biệt trong cơ thể.
Ví như: chất dimethylNitrosamine thì tạo ung thư gan (liver cancer) cho
các động vật được thí nghiệm, trong khi Nitrosamine từ khói thuốc lá tạo
ung thư phổi (lung cancer).
Nitrosamine có mặt trong :
Hiện diện trong các thức ăn. Ngồi ra Nitrosamine cịn thấy hiện
diện trong nhiều thực phẩm chế biến như: beer, cá, cá chế biến, sản phẩm
của thịt và cheese thường dùng muối nitrite để bảo quản và tạo màu đỏ
thịt. Vì sự nguy hiểm của Nitrosamine, nên chính phủ Mỹ cho một hàm
lượng giới hạn được dùng nitrite trong thịt để giảm thiểu sự gia tăng ung
thư trong cộng đồng Mỹ Quốc. Nitrosamines trong thực phẩm ở trong
giới hạn: <120 ppm (part per million) cho các nước Âu châu và Bắc Mỹ.
Nitrosamine cũng được tìm thấy trong khói thuốc lá và các sản phẩm
do cao su chế biến mà ra (latex products). Nhiều cuộc thử nghiệm về
Nitrosamine trên các bong bóng (ballons) và các bao cao su an toàn sinh
lý gọi là condoms, đều thấy rằng chúng có một lượng nhỏ Nitrosamine
phóng thích ra vào nơi tiếp xúc.
Khi thử trên các động vật, thì Nitrosamine hiện rõ nét báo hiệu là
triệu chứng ung thư. Nên người ta lo sợ rằng con người ăn phải nó sẽ bị
ung thư như các lồi vật. Tuy nhiên, khó thấy rõ sự cấu trúc ung thư do

Nitrosamine gây ra trên các ngũ tạng trong cơ thể. Tuy nhiên, một sự
khẳng định là những dữ kiện có được do các cuộc nghiên cứu các bệnh
dịch đã xác quyết là Nitrosamine gây ra ung thư bao tử (stomach cancer).
Tại sao là tại bao tử vì tại đó có hàm lượng acid rất cao.


Cịn một số lớn thuốc sát trùng, chính nó là nguồn chứa Nitrosamine
gây ra ung thư cho những ai vô tình hay bị bắt hít nó, hay ăn phải nó,
nhất là ở Việt Nam hiện nay việc dùng thuốc sát trùng xịt trên rau cải rất
bừa bãi khắp nơi cùng nước tưới bị ô nhiễm.
NO3- khi vào cơ thể người tham gia phản ứng khử ở dạ dày và
đường ruột do tác dụng của các men tiêu hoá sinh ra NO2-. Sau khi
nitrite được tạo thành, sẽ tác dụng với hemoglobine (phương tiện vận
chuyển oxy trong máu) để tạo thành methemoglobine dẫn đến tình trạng
thiếu oxy trong máu (ngộ độc nitrate) hay còn gọi là bệnh da xanh,
thường gặp ở trẻ nhỏ (blue baby)
4HbFe2(O2) 4 No2- 2 H2O ---> 2 HbFe3 OH- 4 No3- O2
Methemoglobine là gì ?
Đó là sản phẩm của Hemoglobine bị oxy hóa, trong đó Fe++ hóa trị 2
trong hemoglobine được chuyển thành Fe3+ hóa trị 3. Hemoglobine có
khả năng chun chở oxy đến mơ cơ thể nên làm da niêm có màu hồng
trong khi methemoglobine khơng có khả năng vận chuyển oxy nên làm
da niêm tím tái . Bình thường trong hồng cầu vẫn hình thành
methemoglobine (<1%) nhưng khơng tồn tại lâu, vì cơ thể có hệ thống
men khử methemoglobine thành hemoglobine bình thường. Tuy nhiên, có
một số tác nhân oxy hóa mạnh như hóa chất (Chlorates, Aniline - phẩm
nhuộm, Trinitrotoluene - thuốc nổ)., thuốc (Nitroglycerine, Sulfonamide,
Primaquine, Chloroquine, Lidocain, Prilocain - EMLA, Benzocain - gây
tê tại chỗ, Nitrate bạc - xức bỏng), thức ăn (nước giếng, củ dền, carrot,
nước cải bẹ xanh, bắp cải, củ cải đường – những thức ăn này có hàm

lượng nitrate cao, khi ăn nhiều và dày ngày sẽ gây methemoglobin ở trẻ
nhỏ) biến đổi hemoglobine thành methemoglobine quá khả năng bù trừ
của hệ thống men khử đưa đến tăng methemoglobine máu, dẫn đến bệnh
nhân bị tím tái, có thể tử vong nếu không điều trị kịp thời.
2.1.4 Quy định hàm lượng nitrate trong một số loại rau củ
Trong hoạt động thương mại quốc tế, các nước nhập khẩu rau tươi
đều phải kiểm tra lượng nitrate trước khi cho nhập. Tổ chức Y tế thế giới
(WHO) và cộng đồng kinh tế châu Âu (EC) giới hạn hàm lượng nitrate
trong nước uống là 50 mg/l, hàm lượng rau không quá 300 mg/kg rau
tươi.


Bảng 2.1 : Hàm lượng nitrate cho phép trong một số loại rau quả
theo tiêu chuẩn của WHO (đơn vị: mg/kg sản phẩm)

Bản thân lượng nitrate dư thừa trong cây trồng là một hiện tượng bình thường
cho sự dinh dưỡng của cây. Tuy nhiên, để đảm bảo năng suất cao, người sản xuất
thường dùng một lượng thừa phân hóa học, nhất là phâm đạm. Sự tích tụ nitrate
trong nơng phẩm phụ thuộc vào số lượng và phương pháp bón phân đạm, bên cạnh
đó cịn phụ thuộc vào đặc điểm sinh học của cây trồng, kỹ thuật canh tác và nhiều
yếu tố môi trường khác. Sản xuất nông nghiệp hiện nay đang tiến dần đến việc sử
dụng các giống lai với đặc điểm di truyền cho phép khơng tích lũy nitrate với lượng
cao.
Việc tích lũy nitrate trong cây trồng do nhiều yếu tố tác động. Người ta đã
nhận thấy có gần 20 yếu tố ảnh hưởng đến việc tích lũy nitrate trong cây trồng, từ
sự can thiệp của người sản xuất bằng chế độ dinh dưỡng cho đến tác động của các
yếu tố môi trường. Khi trời râm và độ ẩm cao, lượng nitrate tích lũy trong cây cao
gấp 3 lần bình thường. Lượng nitrate cũng tăng cao khi trời nắng và nhiệt độ cao.
Nhưng trong điều kiện trời nắng và nhiệt độ thấp thì lượng tích lũy nitrate trong cây
giảm đi rất nhiều. Khả năng tích lũy nitrate trong nơng phẩm còn phụ thuộc vào

từng chủng loại cây trồng và từng bộ phậm khác nhau của nơng phẩm.
• Tích lũy NO3 rất cao (5.000 mg/kg trọng lượng tươi) gồm có các loại cây
trồng như xà lách, bó xơi, củ cải, cải bắp, hành ăn lá, xà lách xoong...


• Tích lũy NO3 trung bình (600-3.000 mg/kg trọng lượng tươi) gồm có sú lơ, cà
rốt, bí...
• Tích lũy NO3 thấp (80-100 mg/kg trọng lượng tươi) gồm có đậu các loại,
khoai tây, cà chua, hành tây, dưa, các loại trái cây...
• Ở cà rốt, NO3 tập trung ở phần chóp củ. • Ở bắp cải, NO3 tập trung ở phần
lõi.
• Ở củ cải, NO3 tập trung ở phần rễ con.
Các cây trồng trong điều kiện bình thường có dư lượng NO3 thấp hơn cây
trồng trong nhà kính từ 2-12 lần, nhất là các cây ăn lá. Mật độ cây trồng cũng là
yếu tố làm tăng hoặc giảm lượng nitrate trong cây. Khi trồng dày, lượng nitrate sẽ
tăng lên do điều kiện chiếu sáng yếu. Tưới nước đầy đủ cho cây cũng làm giảm
hàm lượng này, từ 2-8 lần. Sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật không đúng
phương pháp cũng là yếu tố góp phần làm tăng lượng nitrate dư thừa trong nông
phẩm. Khi chế biến rau quả, nhất là ăn tươi, thơng thường nên loại bỏ những phần
có khả năng tích lũy nhiều nitrate. Q trình nấu chín thức ăn cũng làm giảm lượng
nitrate từ 20-40%.
Ở nhiều nước phát triển như Hoa Kỳ, quy định hàm lượng nitrate phụ thuộc
vào từng loại rau. Ví dụ: măng tây khơng được vượt quá 50 mg/kg, cải củ được
phép tới 3600 mg/kg. Ở Nga lại quy định hàm lượng nitrate trong cải bắp phải dưới
500 mg/kg, cà rốt dưới 250 mg/kg, dưa chuột dưới 150 mg/kg… Trong khi đó,
lượng tồn dư nitrate ở Việt Nam là quá cao so với các quy định trên. Đây là một
vấn đề cần được quan tâm và giải quyết một cách hợp lý để rau sạch Việt Nam có
chỗ đứng trên thị trường quốc tế.
Do nitrate và nitrite có độc tính cao như vậy, ảnh hưởng rất nhiều đến sức
khỏe con người nên cần có phương pháp xác định hàm lượng nitrate trong rau củ để

đưa ra khuyến cáo cho mọi người. Dưới đây là một số phương pháp xác định hàm
lượng nitrate.
2.1.5 Một số phương pháp xác định hàm lượng nitrate
2.1.5.1 Phương pháp thể tích
Người ta có thể xác định nitrate theo phương pháp này dựa trên phản ứng
khử NO3- về các trạng thái oxi hố thấp hơn bằng các chất khử thích hợp. Sau đó
tiến hành phép chuẩn độ ( có thể sử dụng chuẩn độ trực tiếp hay chuẩn độ ngược).
Với phép chuẩn độ ngược thì một lượng chính xác dung dịch chuẩn Fe2+ được
cho dư so với lượng cần thiết vào dung dịch mẫu. Sau đó lượng dư Fe2+ được


chuẩn độ bằng dung dịch Cr2O72+ với chất chỉ thị là ferroin. Các phản ứng xảy ra
như sau:
NO3- 3 Fe2 4 H ---> NO 3 Fe3 2 H2O
2

Fe2 Cr2O72 14H ---> 6Fe3 2 Cr3 7H2O

Phản ứng giữa Fe2+ và NO3- xảy ra nhanh hơn khi đung nóng dung dịch và có
mặt của lượng dư acid H2SO4 65%. Do NO sinh ra phản ứng với oxi khơng khí tạo
thành các chất có khả năng bị khử hay bị oxi hố bởi Fe2+ nên trong quá trình phản
ứng và chuẩn độ phải được tiến hành trong mơi trường khí CO2. Điều này được
thực hiện bằng cách thêm một lượng nhỏ NaHCO3 trước khi đun nóng và chuẩn
độ.
2.1.5.2 Phương pháp so màu
Các phương pháp so màu cũng được dùng để xác định NO3- dựa trên ba loại
phản ứng sau:
 Nitrate hoá các hợp chất phenolic.
 Oxi hố các hợp chất hữu cơ có nhóm mang màu đặc trưng.


 Khử NO3- thành NO2- hoặc NH3 rồi xác định chúng theo phương
pháp thích hợp.
Trong đó phương pháp nitrate hoá chủ yếu được sử dụng để xác định NO3- với
thuốc thử thường dùng là acid Phenol đisunfonic.
Khi sử dụng thuốc thử acid Phenol 2,4 đisunfonic, ion NO3- phản ứng với acid
này tạo thành acid Nitro phenol đisunfonic. Trong môi trường kiềm, acid Nitro
phenol đisunfonic tạo thành một muối có màu vàng cho độ hấp thụ quang cực đại ở
bước sóng 410nm.


Phương pháp này đơn giản và cho độ nhạy khá cao (0,05ppm). Nhưng khi có
mặt các chất hữu cơ, clorua, NO2-, các ion có màu sẽ gây ảnh hưởng đến kết quả
phân tích. Do đú cần phải loại bỏ chúng trước khi phân tích. Sử dụng acid
Sunfamin, urê, hay thiurê để tách loại NO2-. Cl- được loại bỏ bằng cách phản ứng
kết tủa với Ag2SO4. Loại trừ ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ bằng cách oxi
hoá bằng H2O2 hay sử dụng than hoạt tính.
Hiện nay, ở châu Âu người ta chú ý nhiều đến thuốc thử Natri salixylat. Với sự
có mặt của Natri salixylat, nitrate tạo thành hợp chất có màu vàng dạng p Nitrosalixylat cho độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 410nm

Ưu điểm của phương pháp này là sử dụng đơn giản và có độ nhạy cao.

Tuy nhiên, nếu trong mẫu có mặt các hợp chất hữu cơ thì làm thay đổi màu
của sản phẩm màu. Do đó, cần phải loại bỏ chất hữu cơ trước khi phân tích. Hơn
nữa, khi có mặt Clorua sẽ tạo thành Nitrosylclorua ảnh hưởng đến kết quả phân
tích. Vì vậy, trước khi phân tích cũng phải loại trừ ảnh hưởng của clorua
2.1.5.3 Phương pháp dòng chảy FIA (Flow injection analysis)
FIA là một phương pháp kĩ thuật phân tích động, trong đó mẫu phân tích ở
dạng lỏng được bơm trực tiếp vào dòng chất mang chuyển động liên tục. Sau đó
mẫu đi đến vịng phản ứng, rồi trong vịng phản ứng chất phân tích sẽ phản ứng với
thuốc thử có trong chất mang để tạo ra sản phẩm có thể phát hiện được theo một

tính chất hố lí nào đó của nó nhờ một Dertector thích hợp. Các tính chất hóa lí có
thể phát hiện như:
• Sự hấp thụ quang phân tử UV-VIS.
• Sự hấp thụ quang nguyên tử.
• Tính chất huỳnh quang.
• Sự thay đổi chiết suất trong pha động . 
• Sự thay đổi điện thế.


Để xác định nitrate bằng phương pháp FIA người ta tiến hành hai thí
nghiệm sau:

Thí nghiệm 1: Xác định hàm lượng NO2-.
Trong môi trường acid yếu ion NO2- phản ứng với thuốc thử Sunfanyl amin
và N- etylen điamin một cách định lượng và tạo thành hỗn hợp điazo hấp thụ mạnh
ở bước sóng 540 nm. Nếu bơm mẫu phân tích vào FIA có dịng chất mang chứa
thuốc thử trên thì có thể xác định được nồng độ NO2- trong mẫu nhờ Detector hấp
thụ quang UV-VIS ở bước sóng 540 nm.
Thí nghiệm 2: Xác định tổng NO3- và NO2-.
Bằng cách lắp vào thêm vào hệ FIA một cột khử để khử ion NO2- về NO3sau đó xác định tổng hàm lượng NO2- như thí nghiệm một.
Hiệu số kết quả của cả hai lần đo chính là hàm lượng nitrate
2.1.5.4 Phương pháp cực phổ
Trong mơi trường chất điện li có điện tích cao như La3+ hay Ba2+, ion
NO3- cho sóng cực phổ tại thế từ -1,1 đến -1,4V.
Để xác định nitrate người ta thường dùng sóng xúc tác uranin UO22+.
Trong mơi trường tạo phức như n ền Na2CO3 0,1M thì UO22+ chỉ cho một sóng
định lượng có E(1/2)=0,9-1,1V phụ thuộc nồng độ NO3-.
Kolthoff và các cộng sự là những người đầu tiên nghiên cứu xác định
NO3- bằng dòng cực phổ xúc tác. Các tác giả cho rằng trong nền HCl (0,1M) chứa
một lượng nhỏ Urani axetat sự khử U(VI) xảy ra theo hai bước:

U(VI) + e ---> U(V)


U(V) + e ---> U(III)
Tạo nên hai sóng cực phổ :
- Sóng thứ nhất ứng với sự khử U(VI) xuống U(V) có thế bán sóng E(1/2)=0,18V
- Sóng thứ hai ứng với sự khử U(V) xuống U(III) có thế bán sóng E(1/2)=0,94V Khi có mặt của ion NO3- thì chiều cao của sóng thứ hai tăng lên tỉ lệ tuyến
tính với nồng độ NO3- trong khoảng 5.10-5- 4.10-4 M.
2.1.5.5 Phương pháp đo khí
Hassan là người đưa ra một phương pháp đo khí đơn giản thích hợp cho việc
xác định đồng thời nitrate và nitrite trong cùng một mẫu. Theo ông, đầu tiên nitrite
được phân huỷ bằng Urê ( CO(NH2)2 ) hoặc acid Sunfamit ( HSO3NH2 ) để tạo ra
khí N2 trong môi trường acid yếu. Trong điều kiện này, nitrate không tham gia
phản ứng. Khí Nitơ tạo ra được đo bằng một trắc đạm rất nhỏ.
Các phản ứng xảy ra:
2KNO2 + CO(NH2) + 2HCl ---> 2N2 + CO2 + 3H2O + 2KCl
KNO2 + HSO3 ---> N2 + KHSO4 + H2O
Sau đó, đun nóng dung dịch và tạo mơi trường acid mạnh thì nitrate sẽ phản
ứng tạo thành khí N2O:
2KNO3 + CO(NH2)2 + 2HCl ---> 2N2O + CO2 + 3H2O + 2KCl
2KNO3 + HSO3NH2 + HCl ---> N2O + H2SO4 + H2O + KCl
Khí N2 và N2O được giữ lại trong trắc đạm kế bằng dung dịch KOH trên
50%.
2.1.5.6 Phương pháp xác định tổng NO3- và NO2Người ta có thể xác định tổng NO3- và NO2- trong cùng một mẫu bằng
phương pháp khá đơn giản là sử dụng hỗn hợp Cd-Cu.
Nguyên tắc của phương pháp như sau:
- Ion NO3- bị khử thành ion NO2- với sự có mặt của Cd. Các hạt Cd được
xử lý với dung dịch CuSO4, sau đó được nạp vào cột thuỷ tinh. Phản ứng khử tiến
hành tốt nhất ở pH = 6-8. Hiệu suất khử đạt 88-90%.
-Ion NO2- được xác định nhờ phản ứng tạo màu azô hố bằng acid

sunfanilic và αnaphtylamin. Phức tạo thành có cường độ màu lớn. Cực đại hấp thụ


ở bước sóng 520nm. Phương pháp này được dùng để phân tích NO3- với nồng độ
nhở hơn 1ppm mà các phương pháp khác không đủ nhạy để phát hiện.
2.1.5.7 Phương pháp bắt cặp ion trong HPLC
Đây là phương pháp chúng tôi sử dụng trong đề tài nghiên cứu này
2.1.5.7.1 Giới thiệu phương pháp bắt cặp ion
Sắc ký bắt cặp ion là một dạng hình thức khác của sắc ký trao đổi ion.
Nhiều vấn đề có thể được giải quyết bằng một trong hai phương pháp nhưng sắc ký
trao đổi ion không hiệu quả bằng sắc ký bắt cặp ion trong việc tách những hỗn hợp
acid, base và trung tính trong một số tình huống. Pha tĩnh sử dụng trong sắc ký bắt
cặp ion là cột pha đảo.
Những mẫu có ion có thể được tách ra bởi sắc ký hấp phụ pha đảo, với điều
kiện là chúng chỉ chứa những acid yếu hoặc những base yếu, được xác định trong
việc chọn pH, điều này được gọi là ức chế ion. Một hợp chất ion hịa tan được trong
nước có thể được ly trích vào trong một dung mơi hữu cơ bằng cách dùng một ion
trái dấu thích hợp để tạo thành phân tử hữu cơ trơ (kém phân cực) theo phương
trình sau:
Mẫu+ + ion đếm- => (mẫu+ion đếm-)org
Mẫu- + ion đếm+ => (mẫu-ion đếm+)org
Cặp ion (mẫu+ ion đếm-) hoặc (mẫu- ion đếm+) thể hiện như một phân tử phân
cực không ion hố và tan được trong dung mơi hữu cơ. Bằng cách chọn một cặp
đơi thích hợp và điều chỉnh nồng độ của nó, ion Mẫu+ và ion Mẫu- có thể được ly
trích một cách hiệu quả vào trong một pha hữu cơ.
Việc sử dụng phương pháp sắc ký bắt cặp ion để tách những mẫu chứa ion có
những điều thuận lợi được tóm tắt như sau:
• Có thể sử dụng hệ thống pha đảo để tách vì cột C18 có hiệu năng cao hơn
so với cột trao đổi ion và thường nhanh chóng hơn.
• Hỗn hợp của acid, base, trung tính và cả lưỡng tính (vừa có cation và vừa

có anion) có thể được tách ra.
• Sắc ký bắt cặp ion có thể là một lựa chọn tốt nếu giá trị pKa của phân tích
là phù hợp.
• Tính chọn lọc có thể bị ảnh hưởng bởi việc lựa chọn của ion đếm.


2.1.5.7.2 Sắc ký bắt cặp ion trong thực tế
Sắc ký bắt cặp ion phù hợp cho tất cả các hợp chất chứa ion nhưng không
phải tất cả các ion đếm đều tốt như nhau trong mọi trường hợp. Bảng 2.2 liệt kê
một số ion đếm phù hợp cho sắc ký hấp phụ pha đảo với pha động Methanol- Nước
hoặc Acetonitril- Nước.

Bảng 2.2: Tính ứng dụng của các ion đếm khác nhau
Có nhiều hỗn hợp thuốc thử thích hợp để pha trong dung dịch đệm, tuy
nhiên nhiều nhà phân tích thích trộn lại tạo thành “cocktail” pha động phù hợp với
vấn đề của họ. Một vài ví dụ:
- Tetrabutylammonium (C4H9)4N+, dung dịch đệm có pH 7.5, tạo thành
cặp ion với acid mạnh và yếu và ion base yếu của dung dịch đệm.
- Alkylsulphonic acid CH3 (CH2)nSO3- với n = 4-7, dung dịch đệm có pH
3.5, tạo thành cặp ion với base yếu và mạnh và ion acid yếu của dung dịch đệm.
Chuỗi alkyl càng dài, thời gian lưu càng đẹp
Gloor và Johnson đã cung cấp một số hướng dẫn cho sắc ký bắt cặp ion: ¾
Nên sử dụng phương pháp này khi mẫu vừa chứa cả hợp chất ion và
không ion.
 Hỗn hợp Methanol- Nước nên dùng làm pha động, vì thế làm giảm tối
thiểu vấn đề tính tan của ion đếm. Sử dụng Acetonitril nếu tính chọn lọc khơng phù
hợp, nhưng trong trường hợp này tính tan có thể khác.
 Việc chọn đúng ion đếm rất quan trọng, nếu ít sự khác biệt trong cấu
trúc phân tử của mẫu thì sử dụng các chuỗi ion đếm ngắn, sử dụng chuỗi dài hơn
hay các loại kỵ nước nếu thời gian lưu được yêu cầu dài hơn.



 Tính tan của ion đếm nên được kiểm tra cho các tỉ lệ pha trộn của tất cả
pha động để đảm bảo rằng nó sẽ xuất hiện trong suốt q trình phân tích.
 pH của pha động nên được chọn để tạo sự ion hóa mẫu cao nhất. ¾ Pha
đảo C8 hoặc C18 nên được chọn làm pha tĩnh. Chuỗi alkyl ngắn hơn dường như
thiếu sự ổn định.
 Pha động nên được khử khí trước để tránh tạo bọt khí.
2.2 Tổng quan về HPLC
2.2.1 Giới thiệu HPLC
HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là
phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ
phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển
và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân
tích. Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm, đặc biệt là ứng
dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc. Và nó hiện là cơng cụ đắc lực trong phân tích
các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng.
2.2.2 Khái niệm HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là
chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu
phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được
biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng
dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân
tử).
2.2.3 Phân loại sắc ký
Theo cơ chế chia tách của sắc ký, người ta phân ra các loại sau đây :
2.2.3.1 Sắc ký hấp phụ
Nguồn gốc của sắc ký hấp phụ được biết từ sắc ký cột cổ điển và lớp mỏng.

Một vật liệu với độ phân cực trên diện tích bề mặt cao được sử dụng làm pha tĩnh,
silica đang là phổ biến nhất, nhưng ơxít nhơm và magiê ơxít cũng thường được
dùng. Pha động tương đối không phân cực. Các mức độ khác nhau mà các kiểu
khác nhau của các phân tử trong hỗn hợp được hấp thụ vào pha tĩnh cung cấp hiệu
ứng tách ra. Một dung mơi khơng phân cực như hexan thì tách ra chậm hơn một
dung mội phân cực trung bình như ête.
Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh, yếu khác nhau của pha tĩnh đối với
các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột.
Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ. Trong
trường hợp loại này có 2 loại hấp phụ:
• Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP – HPLC): pha tĩnh phân cực, pha động
không phân cực.


• Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP – HPLC): pha tĩnh không phân cực, pha động
phân cực.
Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các chất có
tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung
bình như các Vitamin, thuốc hạ nhiệt, giảm đau…
Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng loại sắc ký hấp phụ pha đảo (RP).
Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị tương ứng như sau:
- L1: RP 18 : Kích thước hạt tương ứng từ 5 – 10 .
- L7: RP 8 : Kích thước hạt tương ứng từ 5 – 10 .
- L3: Si 60 : Kích thước hạt tương ứng từ 5 – 10 .
- Và một số loại cột khác như cột Diol, cột NH2, CN…
2.2.3.2 Sắc ký trao đổi ion
Pha tĩnh chứa những nhóm ion (NR3+ hay SO3-) tương tác với những nhóm
ion của phân tử mẫu. Phương pháp này phù hợp tách các chất (ví dụ như amino
acid), những sản phẩm chuyển hóa ion và ion hữu cơ.
2.2.3.3 Sắc ký ghép cặp ion

Phương pháp ion ghép cặp có thể cũng được sử dụng cho sự tách ra của những
hỗn hợp ion và vượt qua một số vấn đề cố hữu của phương pháp trao đổi ion
2.2.3.4 Sắc ký rây phân tử- sắc ký gel
Chế độ này có thể được chia thành sắc ký thấm chất gel ( với những dung môi
hữu cơ) và sắc ký lọc gel (với những dung dịch nước).
Sắc ký rây phân tử tách phân tử dựa vào kích thước, tức là dựa vào khối lượng
phân tử. Những phân tử lớn nhất được tách ra đầu tiên và những phân tử nhỏ nhất
được tách cuối cùng. Đây là phương pháp tốt nhất để lựa chọn khi hỗn hợp chứa
các chất khác nhau về khối lượng phân tử ít nhất 10%.
Ngồi ra cịn có sắc ký phân bố, sắc ký chiết.
Nhưng thực tế hiện nay chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào
phân tích mẫu.
2.2.4 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và
loại sắc ký:
 Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha
đảo.
 Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion.
 Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết.
 Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử.
Cùng với với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một
pha động.
Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất A, B, C…vào cột


phân tích, kết quả các chất A, B, C…sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột.
Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác:

Hình 2.4: Hình biểu diễn sự tương tác các chất trong quá trình sắc ký
 Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải

ra khỏi cột trước tiên khi lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và
ngược lại.
 Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3.
Trong đó F1 và F2 giữ vai trị quyết định, cịn F3 là yếu tố ảnh
hưởng khơng lớn.
 Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột. F2 là lực kéo của
pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột.
 Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau. Kết
quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác
nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột.


Hình 2.5: Hình minh họa cho quá trình tách các chất trong cột
sắc ký
2.2.5 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ

Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký đồ
như hình trên.
Sắc ký đồ gồm nhiều peak :
- Các peak có thể tách rời nhau hồn tồn.
- Các peak có thể chập nhau một phần.
- Các peak có thể chập nhau hồn tồn.
Từ các thơng số của peak trên đây, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết được
đưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký. Dưới đây là một số đại lượng thường dùng
trong thực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lợi cho quá trình phân tích sắc
ký.


Hình 2.7: Sắc ký đồ biễu diễn thời gian lưu của các chất
Chú thích:

T0 : Thời gian lưu chết
t’r1 : Thời gian lưu thực chất A
t’r2 : Thời gian lưu thực chất B.
tr1 : Thời gian lưu chất A
tr2 : Thời gian lưu chất B.
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến
khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.
Thời gian lưu của một chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian
lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn. Vì vậy thời gian lưu là
đại lượng để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố :
 Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
 Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
 Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
 Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha
động.
Trong một phép phân tích nếu tr nhỏ q thì sự tách kém, cịn nếu tr q lớn thì
peak bị dỗng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng kéo
theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung mơi, hóa chất, độ chính xác của phép
phân tích kém.
Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên đã trình bày.


2.2.5.2 Hệ số dung lượng K’ : Capacity factor
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai
pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng
chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.
K’ = (tR – t0)/t0
Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K’ lớn thì peak bị dỗng. Trong
thực tế K’ từ 1 – 5 là tối ưu.

2.2.5.3 Độ chọn lọc α
Độ chọn lọc α cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi 2 chất A, B có
K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn
lọc α.
α = K’B/ K’A (với điều kiện K’B > K’A )
Với α càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng.

Hình 2.8: Hình biểu diễn độ chọn lọc α
2.2.5.4 Số đĩa lý thuyết N :
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện
sắc ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như là một lớp pha tĩnh
có chiều cao là H. Tất nhiên lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ
phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ
trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố :
 Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh.
 Tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động.
Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột.
Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối
với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định.
Số đĩa lý thuyết N được tính theo cơng thức sau :
N = 5.54 (tR / W0.5)2
Trong đó :
tR : thời gian lưu của chất phân tích
W0.5 :Độ rộng tại điểm ½ của peak.


Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ.
2.2.5.5 Độ phân giải R : (Resolution)
 Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau

trên một điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của 2 peak cạnh nhau
phải được tính theo cơng thức sau :
R = 2(t’RB – t’RA) / (wA + wB) 
Trong thực tế nếu các peak cân đối (Gass) thì độ phân giải tối
thiểu để 2 peak tách ra là R = 1.0. Trong phép định lượng R = 1.5 là
phù hợp.
Nếu R nhỏ thì các peak chưa tách hẳn, việc tính tốn diện tích
peak sẽ khơng chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo 3 cách sau
:


Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động (thay
đổi độ phân cực nếu là RP – HPLC, thay đổi cường độ ion nếu là IE –
HPLC...

 Làm tăng số dĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột
có kích thước nhỏ hơn.
Làm tăng độ chọn lọc α bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với quá
trình tách hoặc thay đổi thành phần pha động.



Nếu R lớn q thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ
nhạy kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng
chương trình gradient dung mơi. Tuy nhiên, trong q trình chạy sắc ký
dùng chương trình dung mơi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ
kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu
và diện tích của các peak ta phân tích.
Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Gradient dung mơi
mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp

ứng các yêu cầu trong quá trình phân tích.
2.2.5.6 Hệ số khơng đối xứng T (Tailing factor)
Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của peak trên
sắc ký đồ thu được.

T được tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nửa peak tại điểm 1/10 chiều cao
peak :
T = a/b


Hình 2.9: Hình biễu diễn hệ số khơng đối xứng T
• Khi T ≤ 2.5 thì phép định lượng được chấp nhận.
• Khi T ≥ 2.5 thì điểm cuối của peak rất khó xác định.
Vì vậy phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm
cho peak cân đối hơn theo cách sau :


Làm giảm thể tích chết tức là giảm đoạn ống nối từ cột đến Detector.

 Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên.


Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha lỗng mẫu hay giảm
thể tích tiêm mẫu.

Hệ thống HPLC