XÁC ĐỊNH VITAMIN C SỬ
DỤNG HPLC CÙNG VỚI PHÁT
HIỆN ĐIỆN HÓA

1


MỤC LỤC

Tóm tắt

2

1. Giới thiệu
2
1.1. Chức năng sinh học của vitamin C
2
1.2. Nhu cầu hàng ngày của vitamin C
3
1.3. Hàm lượng của vitamin C trong thực phẩm
3
1.4. Phương pháp xác định C (axit ascorbic)
4
2. Nguyên vật liệu và phương pháp
4
2.1. Hóa chất, ngun liệu, đo lường pH
4
2.2. Phân tích phun dịng chảy sắc ký / sắc kí lỏng cao năng với đầu dị
CoulArray hoặc Coulochem
Chuẩn bị mẫu thực
Tính đúng, độ chính xác và độ thu hồi

Thống kê mơ tả

5
5
6
6

2.3.
2.4.
2.5.
3. Kết quả và thảo luận
6
3.1. Phân tích sự phun dịng chảy kết hợp với đầu dị điện hóa CoulArray để
3.2.

xác định acid ascorbic
6
Phân tích sự phun dịng chảy kết hợp với đầu dị điện hóa Coulochem III
để phát hiện AA

10

4. Kết luận
Tài liệu tham khảo

13
14

Tóm tắt: Vitamin C (axit ascorbic, ascorbate, AA) là một hợp chất hữu cơ hòa tan trong
nước và tham gia vào nhiều quá trình sinh học. Mục đích chính của bài viết này là sử dụng

hai máy dị điện hóa (amperometric - Coulochem III và coulometric - CoulArray) kết hợp
với phân tích tiêm dịng chảy cho việc phát hiện axit ascorbic.
Điều kiện thực nghiệm tối ưu như sau: điện thế máy dò 100 mV, nhiệt độ
25 ° C, pha
động 0,09% TFA: ACN, 3:97 (v / v) và lưu lượng 0,13 mL/phút. Các tiếp tuyến của đường
chuẩn là 0,3788 cho phương pháp coulometric và 0,0136 đối với amperometric. Các tiếp
tuyến của đường chuẩn đo bởi máy dò coulometric cao hơn gần 30 lần các tiếp tuyến đo
bằng máy dị amperometric. Do đó, chúng tơi sử dụng máy dị điện hóa CoulArray với sắc
ký lỏng hiệu năng cao và ước tính giới hạn phát hiện cho AA 90 nM (450 fmol cho mỗi 5
ml tiêm). Phương pháp này đã được sử dụng để xác định vitamin C trong chế phẩm dược
(98 ± 2 mg mỗi viên thuốc), trong cam tươi (Citrus aurantium) (dao động 30-56 mg / 100 g
2


trọng lượng tươi), trong táo tươi (Malus sp.) (dao động 11-19 mg / 100 g), và trong huyết
thanh người (dao động 38-78 µM). Sự thu hồi cũng được xác định.
1. Giới thiệu
1.1 Chức năng sinh học của vitamin C
Vitamin C (acid ascorbic, ascorbate, AA) là một dung dịch hòa tan hợp chất hữu cơ
có liên quan đến nhiều q trình sinh học (Hình 1). AA có vai trị quan trọng trong việc vận
chuyển điện tử, phản ứng hydroxyl và dị hóa oxy hóa của các hợp chất rượu mạch vịng
trong quá trình biến dưỡng ở động vật [1]. Mặc dù tất cả các chức năng AA khơng được
giải thích đầy đủ, có khả năng là nó cũng tham gia trong việc duy trì giảm tình trạng đồng
diếu tố kim loại, ví dụ như tại monooxygenase (Cu +) và dioxygenase (Fe2 +) [2]. Trong
các tế bào khác vai trò của AA là giảm hydro peroxide (H2O2), chống phản ứng oxi hóa
các tế bào [3-5]. Một chu trình oxy hóa acid ascorbic thành dehydroascorbic acid được thể
hiện trong hình 1. Các thơng tin chi tiết về hệ thống các chất chống oxy hóa acid ascorbic
phối hợp với glutathione được mơ tả bởi Meister [6]. Bên cạnh đó, linh trưởng và một số
động vật có vú khác khơng thể tổng hợp axit ascorbic [5]. Các lồi động vật có thể sản xuất
phân tử này, sinh tổng hợp từ glucose xúc tác bởi L-Gulonolactoneoxidase [1,2]. Mặc dù

khả năng tổng hợp phân tử này cả hai nhóm lồi động vật bị thiếu hụt AA.

1.2 Nhu cầu vitamin C hàng ngày
Cách duy nhất con người hấp thu acid ascorbic là qua thực phẩm [7], nhưng nhu cầu
vitamin C hàng ngày của một con người là không rõ ràng. Linus Pauling cho rằng nhu cầu
của người dân đối với các vitamin và các dưỡng chất khác thay đổi đáng kể và để duy trì
sức khỏe tốt, nhiều người cần một lượng các chất dinh dưỡng lớn hơn, nhiều hơn so với
liều khuyến cáo. Theo đề xuất của ông, hấp thu hàng ngày vitamin C giảm tỷ lệ mắc bệnh
cảm lạnh và các bệnh khác. Ngày nay nhu cầu trung bình AA được ước tính và đề nghị bổ
sung trong chế độ ăn uống là 100 mg - 120 mg mỗi ngày [8,9].
1.3 Hàm lượng vitamin C trong thực phẩm
AA có thể được tìm thấy chủ yếu trong các loại trái cây và rau quả. Các nguồn chính
của AA là loại trái cây họ cam quýt, quả cây tầm xuân, dâu tây, ớt, cà chua, bắp cải, rau
bina và những nguồn khác [3]. Nếu ai muốn dùng AA từ nguồn động vật thì gan và thận là
các mơ có hàm lượng cao nhất, nhưng so với nguồn AA từ thực vật thì thấp hơn. Hàm
lượng của AA trong thực phẩm có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như khí hậu, phương
pháp thu hoạch, bảo quản và chế biến. Do đó, địi hỏi phải có một quy trình phân tích mà
3


không chỉ theo dõi AA trong nông nghiệp và thực phẩm, mà cịn trong dịch cơ thể và mơ
bào [11]. Tác giả cũng chú ý vào việc phát hiện AA trong huyết thanh [12-15].
khử

Hình 1. Sơ đồ về một chức năng sinh học của axit ascorbic (GSH -glutathion bị
,GSSG-glutathione
bị
oxi
hóa).


1.4 Phương pháp xác định axit ascorbic
Nhiều kỹ thuật phân tích bao gồm cảm biến và cảm biến sinh học [16-18] đã được đề
xuất cho phát hiện acid ascorbic trong các loại mẫu khác nhau. Các công cụ liên quan bao
gồm phân tích phun dịng chảy[19-22], sắc ký lỏng cao năng[23-25] hoặc điện di mao
dẫn[26-29] cùng với các dụng cụ và đầu dò chủ yếu được dùng trong xác định AA.
Tuy nhiên, một số trong những phương pháp này tốn nhiều thời gian, một số là tốn
kém, một số đòi hỏi những người thực hiện cần đào tạo đặc biệt, hoặc chúng bị thiếu độ
nhạy hay tính chọn lọc. Giới hạn phát hiện dao động từ µM [30-32] đển nM [33-36] và thấp
hơn [12].
Phát hiện điện hóa là một phương pháp thay thế hấp dẫn để phát hiện các loại
electroactive, vì những lợi thế vốn có của nó: đơn giản, dễ dàng thu nhỏ kích thước, độ
nhạy cao và giá tương đối thấp. Phát hiện điện hóa thường làm việc bởi đầu dị
amperometric hoặc coulometric có thể kết hợp với sắc ký lỏng để cung cấp độ nhạy cảm
cao với các loại electroactive. Mục đích chính của bài viết này là sử dụng hai máy dị điện
hóa (amperometric - Coulochem III và coulometric - CoulArray) kết hợp với phân tích
phun dịng chảy để phát hiện acid ascorbic.
4


Hơn nữa, kĩ thuật nhạy cảm hơn này được dùng vào việc phân tích các mẫu thực
(chuẩn bị dược phẩm, cam và táo trái cây, và huyết thanh máu người).

2. Nguyên vật liệu và phương pháp
2.1 -Hóa chất, nguyên liệu, đo lường pH
Loại HPCL acetonitrile được sử dụng là từ Merck (Darmstadt, Đức) . Các hóa chất
khác sử dụng thì được mua từ Sigma-Aldrich (đường Louis, Mỹ) ở độ tinh khiết ACS trừ
các ghi chú khác. Các dung dịch mẫu của AA (100 mM) đã được chuẩn bị với ACS và được
lưu trữ trong bóng tối ở -20 ° C. Dung dịch chuẩn được chuẩn bị hàng ngày bằng cách pha
loãng dung dịch mẫu . Sự ổn định của AA trong các mẫu bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi ôxy,
nhân tố mà oxi hóa AA thành dehydroascorbic acid. Thí nghiệm sử dụng Dithiothreitol

(DTT). Tất cả các dung dịch đã được lọc qua đĩa lọc Nylon 0,45 trước khi phân tích
HPLC.

2.2 – Phân tích phun dịng chảy/ sắc kí lỏng cao năng với đầu dị điện hóa CoulArray
hoặc Coulochem:
CoulArray. Hệ thống FIA / HPLC-ECD bao gồm hai máy bơm dung môi hoạt động
trong phạm vi 0,001-9,999 mL/ phút, một cuộn dây phản ứng 1 m và cột đảo ngược và một
CoulArray dị điện hóa . Các máy dị điện bao gồm hai tế bào dòng chảy. Mỗi tế bào gồm
bốn tế bào phân tích có chứa carbon làm điện cực xốp, hai phụ và hai điện cực tham chiếu,
điện cực làm việc được đánh dấu âm dương và tăng dòng chảy của pha động (1 ml/phút).
Cả hai máy dò và cuộn phản ứng / cột được điều nhiệt. Các mẫu (5 µl) được tiêm bằng tay.
Coulochem III. Hệ thống FIA-ED bao gồm một máy bơm cung cấp dung môi hoạt
động trong phạm vi 0,001-9,999 mL/ phút, một tế bào bảo vệ, một cuộn dây phản ứng 1 m
và một máy dò điện hóa. Các máy dị điện hóa (ED) gồm một lượng dịng chảy thấp qua
các tế bào phân tích, bao gồm carbon thủy tinh làm điện cực, điện cực palladium như một
điện cực tham khảo và điện cực carbon phụ trợ, Coulochem III như một module điều khiển.
Một điện cực carbon thủy tinh đã được đánh bóng cơ học 0,1 m bằng alumina ở nhiệt độ
phịng thí nghiệm trong 5 phút bằng cách sử dụng kỹ thuật số Sonorex 10 P sonicator ở 40
W. Các mẫu l đã được tiêm bằng tay. Các dữ liệu thu được được xử lý bằng phần mềm
CSW 32. Các thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng.
2.3 - Chuẩn bị mẫu thực

5


Chuẩn bị dược phẩm (viên) - Celaskon được nghiền trong cối (n = 5). Sau đó, bột
nghiền (khoảng 1 mg) được hòa tan trong nước ACS (1 ml). Cam và táo được bán tại các
cửa hàng Tesco (n = 5). Vỏ của các loại trái cây đã được gỡ bỏ, và sau đó các loại trái cây
(0,25 g) được đồng nhất bằng cách sử dụng vữa. Các chiết xuất thu được được lọc qua giấy
lọc, chuyển vào bình định mức và pha loãng với nước ACS. Các phép đo của các mẫu được

thực hiện ngay lập tức sau bước chuẩn bị, các mẫu huyết thanh máu người thu được từ Sở
lâm sàng Hóa sinh, Bệnh viện Chấn thương Brno (Cộng hịa Séc), (n = 10), huyết thanh
người đã được đơng lạnh ở -20 ° C ngay sau khi thu thập. Các mẫu được pha loãng 100 lần
với nước ACS và lọc qua màng lọc Teflon 0,45 m trước khi đo.

2.4 -Tính đúng, độ chính xác và độ thu hồi
Tính đúng, độ chính xác và độ thu hồi của AA được đánh giá bằng dung dịch đồng
chất (huyết thanh máu người, một loại trái cây và viên Celaskon) so với dung dịch chuẩn.
Trước khi thí nghiệm, dung dịch chuẩn AA (100 ml) và nước (100 ml) đã được thêm vào
dung dịch đồng chất của mẫu thật. Các dung dịch đồng chất đã được kiểm định và nồng độ
AA từ những đường cong hiệu chuẩn. Tính đúng được đánh giá bằng cách so sánh với nồng
độ lí thuyết.
2.5 - Thống kê mơ tả
Dữ liệu được xử lý bằng Microsoft Excel . Kết quả được thể hiện như là ± S.D trừ khi có
ghi chú khác. Các giới hạn phát hiện được tính toán theo Long và Winefordner [42].
3. Kết quả và thảo luận
Các kĩ thuật điện hóa tĩnh và dịng chảy là những công cụ rất hấp dẫn cho việc xác
định các thành phần sinh học khác nhau như protein, chất hữu cơ có nguồn gốc từ thực vật,
thuốc… Ở đây, chúng tơi nhắm vào việc sử dụng các đầu dị Coulouchem III hoặc
CoulArray kết hợp với sắc kí lỏng cao năng để xác định acid ascorbic.
3.1 Phân tích sự phun dịng chảy kết hợp với đầu dị điện hóa CoulArray để xác định
acid ascorbic
Một trạng thái điện hóa của AA tại bề mặt điện cực đang hoạt động đã được kiểm tra.
FIA cho phép chúng ta tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm cho việc phân tích xác định
AA một cách dễ dàng và nhanh chóng. Trước hết, tác động của điện thế được đặt vào các
điện cực hoạt động riêng lẻ dựa vào tín hiệu oxi hóa đã được nghiên cứu. Điện thế thì thay
6


đổi trừ 100 đến 400 mV và tín hiệu của nồng độ AA khác nhau đã được đo lại (12.5, 25, 50,

100, 200, 300, 400, 500 và 1000µM).
Hình2. FIA kết hợp với đầu dị điện hóa CoulArray. FIA-ED qt tồn bộ acid ascorbic
(12.5, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 và 1000 µM). Các điện thế điện cực đầu dị quét toàn
bộ: 100, 150, 200, 250, 300, 350, 380 và 400 mV (A). Sự phụ thuộc của độ cao peak acid
ascorbic với nhiệt độ (B), với hàm lượng của acetonitrile trong pha động gồm acetonitrile
và acid triflouroacetic (C) và với nồng độ TFA (D). các thông số FIA-ED: tốc độ chảy trong
pha động- 0.1 mL/phút; nồng độ acid ascorbic- 100µM; các mẫu 5µL đã được cho vào.

Mỗi nồng độ thuộc về một kí hiệu được biễu diễn trên bảng ghi lại FIA-ED ở hình
2A. Rõ ràng phản ứng dịng chảy tối đa đã được đo lại ở bề mặt của điện cực hoạt động đầu
tiên. Hiện tượng này đã được theo dõi ở tất cả nồng độ của AA mà đã được đo. Hơn thế
nữa, có thể kết luận rằng nồng độ AA đã được đo, tín hiệu này đã biến mất trước đó. Hiện
tượng này kết hợp với i) loại đầu dị được dùng vì đầu dị CoulArray hoạt động theo cơ chế
đo culong (coulometer) và đầu dò culong kích thích gần 100% sự chuyển hóa điện hóa của
các mẫu phân tích dưới điện thế được chỉ định của đầu dị) sự oxi hóa điện hóa dễ dàng của
AA ở bề mặt của điện cực đã hoạt động rồi dưới điện thế thấp (khoảng 100-200mV). Để lựa
chọn điện thế tốt nhất cho việc dị tìm AA, chúng tơi đặt một máy đo điện thế từ 100 đến
400nV mỗi điện cực cách nhau 50mV ở tất cả 8 điện cực và đo tín hiệu chỉ ở điện cực đầu
7


tiên. Dựa trên kết quả này thì điện thế phù hợp nhất cho việc dị tìm AA là 100mV. Thêm
vào đó thì chiều cao tin hiệu bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ cũng đã được nghiên cứu. Nhiệt độ
trong khoảng 15-40°C đã được kiểm tra. Sự phụ thuộc đó đã được thể hiện ở hình 2B. Độ
cao peak tăng khoảng 30% ở 25°C so với các tín hiệu thu được ở những nhiệt độ thấp
hơn( 15 và 20°C). Ở các nhiệt độ cao hơn 25°C độ cao đã được theo dõi ở hình 2B là thay
đổi rất ít. Do đó, nhiệt độ 25°C đã được dùng trong các thực nghiệm sau này.
Hầu hết ai cũng biết rằng việc phân tích điện hóa thì cần có chất điện phân, mặt dù
sự có mặt của dung mơi khơng phải là nước trong pha động là cần thiết cho cho cả việc xác
định thành cơng và nhanh chóng những hợp chất quan tâm. Các dung môi không phải nước

này ảnh hưởng không tốt đến việc phân tích điện hóa. Vì thế, sự thay đổi của các tín hiệu
bởi tỉ lệ acetonitrile: acid trifluoroacetic (ACN : TFA, v/v) đã được điều tra nghiên cứu ở
hình 2C. Chúng tơi đã khơng xác định được bất kì sự thay đổi nào trong việc lặp đi lặp lại
hàm lượng ACN ngày càng tăng trong pha động. Tín hiệu cao nhất đã được đo lúc hàm
lượng ACN 3% (v/v) trong pha động.
Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ AA. Sự phụ thuộc độ cao peak với các nồng độ AA
khác nhau (15, 30, 55, 85, 110 và 140 µM) (A). Huyết thanh người. sự ảnh hưởng của chất
nền sinh học trên tín hiệu AA. Nồng độ AA- 57, 114, 227 và 341 µM (B). Các thơng số
FIA-ED thì như sau: pha động-acetonitrile và 0.09% acid trifluoroacetic có tỉ lệ 3:97; nhiệt
độ đầu dò- 25°C; tốc độ dòng chảy trong pha động – 0.13 mL/phút. 5µL mẫu đã được cho
vào.

8


Các bạn cũng đã biết rằng acid trifluoroacetic (TFA) là ion bắt cặp trung gian trong sắc
kí lỏng, nó có thể phản ứng với vitamin và có lẽ đảm nhận một vai trị nào đó. Vì vậy,
chúng tơi đã chọn một hỗn hợp là acetonitrile và acid trifluoroacetic dạng dung dịch nước
với tỉ lệ 3:97 (v/v) và kiểm tra sự ảnh hưởng của các nồng độ TFA khác nhau. Chúng tôi đã
nhận thấy rằng sự đáp ứng lại phản ứng tăng 0.005% nồng độ TFA, sau đó giảm nhẹ. Tín
hiệu cao nhất của AA đã được đo ở 0.009% TFA: ACN, 3:97 (v/v) ở hình 2D. Hơn nữa, tốc
độ dịng chảy của pha động là một thông số quan trọng khác ảnh hưởng đến độ cao peak.
Chúng tôi kiểm tra dòng chảy của pha động từ 0.05 đến 0.2 mL/phút. Các phản ứng ở dòng
chảy cao nhất đã được ghi lại ở lưu lượng 3mL/phút.
Đây là những điều kiện thực nghiệm tối ưu: điện thế dò 100mV, nhiệt độ 25°C, pha
động 0.09% TFA: ACN, 3:97 (v/v) và tốc độ dòng chảy 0.13 mL/phút. Dưới những điều
kiện trên chúng tôi đo được sự phụ thuộc chiều cao của peak AA với nồng độ của nó.
Những peak đạt được thì được triển khai tốt và đối xứng (hình 3A). Đường cong định
chuẩn được thể hiện ở hình 3A (y= 0.3788x- 0.1461; R2 = 0.9985). Giới hiện dị tìm (3
S/N) cho AA được định lượng là 100fmol/5 µM cho vào. Hơn nữa phương pháp này đã

được sử dụng để xác định AA pha vào các mẫu huyết thanh người. AA đã được pha vào
huyết thanh (pha loãng 100 lần) và các phản ứng điện hóa đã được ghi nhận. Đường cong
đạt được (y = 0.2897x + 0.6118; R2 = 0.9942) thể hiện ở hình 3B. Giới hạn dị tìm(3 S/N)
đã được định lượng là 20pmol/5µL cho vào.
9


3.2 phân tích phun dịng chảy với Coulochem III dị điện hóa để phát hiện AA
Coulochem III là một máy với các đầu dị amperometric khơng mấy hiệu quả vì chỉ
có một phần chất được phân tích (thường là 5-10%) đi qua các điện cực hoạt động và thực
sự khuếch tán lên trên bề mặt điện cực, rồi chuyển đổi điện hóa. Người ta cho rằng đầu dị
coulometric CoulArray nhạy cảm hơn Coulochem III 10-20 lần đơn giản chỉ vì khối lượng
dịch chuyển được cải thiện. Thật không may là hiệu suất chuyển đổi được tăng lên của chất
được phân tích thì đi kèm với sự gia tăng các phản ứng của chất điện phân (nền) , và gần
như không có sự hạ thấp giới hạn phát hiện. Hơn nữa, có thể amperometry cung cấp LOD
tốt hơn về nồng độ bởi những tế bào được thu nhỏ. Vì vậy chúng tôi đã thông qua những
điều kiện thực nghiệm tối ưu ở trên để phát hiện AA bởi FIA cùng đầu dị điện hóa
Coulochem III và so sánh đầu dị Coulometric CoulArray và Coulochem. Khơng giống
như đầu dị CoulArray, Coulochem chứa một thiết bị gọi là "tế bào bảo vệ", mà có thể oxy
hóa các tạp chất electroactive trong pha đoạn động, do đó giảm tạp chất. Chúng tơi thử
nghiệm năm điện thế (-100, -50, 0, 50 và 100 mV) áp dụng trên "tế bào bảo vệ" và đo các
tín hiệu của AA. Sự phụ thuộc thu được được thể hiện trong hình 4A. Dựa trên kết quả thu
được thì điện thế tối ưu cho "tế bào bảo vệ" là 0 mV. Các điện thế thấp hơn hoặc cao hơn
giá trị tối ưu làm giảm nhẹ tín hiệu của AA. Để so sánh các máy dị chúng tơi một lần nữa
đo sự phụ thuộc của nồng độ AA về chiều cao của peak (Hình 4B). Các phương trình của
đường chuẩn thu được là y = 0.0136x + 0,0189, với R2 = 0,9990.
Các mức nồng độ AA phân tích bằng cả coulometric và thiết bị dò amperometric thu
được gần như giống nhau qua sự so sánh về khả năng nhạy của dụng cụ. Các tiếp tuyến của
đường chuẩn là 0,3788 cho coulometric và 0,0136 cho amperometric. Dựa trên những kết
quả các tiếp tuyến của đường cong hiệu chuẩn cho AA đo bằng máy dò coulometric cao

hơn gần 30 lần so với các tiếp tuyến đo bằng máy dò amperometric. Máy dò Coulometric
nhạy cảm hơn nhiều với sự hiện diện của AA, do đó, chúng tơi sử dụng mấy dị này trong
các thí nghiệm sau đây.
Hình 4. FIA kết hợp với đầu dị điện hóa Coulochem III . Sự phụ thuộc của chiều cao
peak với điện thế tế bào bảo vệ (-100, -50, 0, 50 và 100 mV) (A) và với các nồng độ AA
khác nhau (15, 30, 55, 85, 110 và 140 μmol·L -1) (B). thông số FIA-ED là giống như thể
hiện trong hình 3.

10


Hình 5. HPLC-ED phát hiện acid ascorbic. HPLC-ED phát hiện acid ascorbic chuẩn (10
µM) (A). Sự phụ thuộc của diện tích peak với nồng độ AA khác nhau trong phạm vi 0,5-20
mM (B) và 10 - 90 µM (C). thơng số HPLC-ED như sau: sắc ký cột - MetaChem Polaris
C18A (150 ì 2.0 mm, 3 àm kớch thc ht) pha động - acetonitrile và 0,09% axit
trifluoroacetic trong tỷ lệ 3:97; nhiệt độ đầu dò- 25 ° C; tốc độ dòng chảy của pha động 0,13 ml · min-1 ; điện thế của tất cả các đầu dò - 150 mV; 5 µl mẫu được tiêm.

Theo các điều kiện tối ưu hóa nêu trên axit ascorbic được đo bằng sắc kí lỏng cao áp
cùng với CoulArray dị điện hóa (HPLC-ED). Thời gian lưu của AA là 5,4 phút. (Hình 5A).
Sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ AA là tương quan chặt chẽ và độ lệch chuẩn
tương đối (R.S.D.) là khoảng 6% (n = 5). phương trình của đường chuẩn đo trong khoảng
0,5-20 mM của AA là y = 24.921x + 12,043 với R2 = 0,9967 (Hình 5B). Ngồi ra, chúng
tơi cố gắng phân tích phạm vi nồng độ thấp hơn từ 10 đến 90 µM. Các đường chuẩn thu
11


được là y = 0.0307x - 0,1417; R 2 = 0,9905 (Hình 5C). Sử dụng HPLC-ED tối ưu hóa đã có
thể phát hiện nồng độ nanomolar của AA (LOD: 90 nM; 450 fmol/5 µl tiêm).

Hình 6. điển hình sắc ký HPLC-ED của dược phẩm pha chế, chiết xuất từ táo và cam, và

huyết thanh máu người. Các thông số HPLC-ED xem chú thích của Hình 5.

Phân tích các mẫu thực : Nồng độ acid ascorbic đã được xác định trong dược phẩm pha
chế, hai loại trái cây và huyết thanh máu người theo các điều kiện thực nghiệm tối ưu hóa
sử dụng HPLC kết hợp với CoulArray dị điện hóa. sắc ký HPLC-ED điển hình của mẫu
được thể hiện trong hình 6. Chúng tơi xác định nồng độ của acid ascorbic là 98 ± 2 mg
trong mỗi một viên dược phẩm pha chế tên Celaskon. Các nhà sản xuất viên này tuyên bố
lượng AA là 100 mg mỗi viên thuốc. Độ thu hồi lượng AA thêm vào mẫu 105 % cho mức
cộng dưới của AA (5 µg · mL-1) và 95% cho mức cộng trên của AA (15 µg · mL); để biết
thêm chi tiết xem tại bảng 1. Hơn nữa, chúng tôi sử dụng HPLC-ED để xác định nồng độ
AA trong các loại hoa quả. Chúng tôi thấy rằng lượng AA trong cam (Citrus aurantium) dao
động trong khoảng 30-56 mg / 100 g trọng lượng tươi và trong táo (Malus sp.) 11-19 mg /
100 g trọng lượng tươi. Độ thu hồi của AA đo trong dung dịch đồng chất được chuẩn bị từ
trái cây Citrus aurantium là 103% cho mức cộng dưới (5µg/mL) và 104 % cho mức cộng
trên (15 µg/mL). Để đánh giá kỹ thuật HPLC-ED cho phân tích chất lỏng cơ thể người,
chúng tơi đã cố định mẫu huyết thanh máu người và phát hiện ra độ thu hồi của AA từ
102% đến 98 % theo mức cộng dưới (5 µg·mL/1) hoặc mức cộng trên (15 µg·mL/1) hàm
lượng của AA. Huyết thanh được kiểm tra chứa AA trong khoảng 38-78 µM.
12


4.Kết luận
HPLC kết hợp với một máy dị điện hóa tám kênh dường như là một cơng cụ phân
tích rất phù hợp để xác định axit ascorbic nhạy cảm. Dùng kĩ thuật tối ưu hóa này xác định
acid ascorbic trong các chế phẩm dược, trái cây và mẫu huyết thanh người.

13


Tài liệu tham khảo

1.
2.
3.

4.
5.

Velisek, J.; Cejpek, K. Biosynthesis of food constituents: Vitamins. 2. Water-soluble vitamins: part
1 - a review. Czech. J. Food Sci. 2007, 25, 49-64.
Linster, C.L.; Van Schaftingen, E. Vitamin C - Biosynthesis, recycling and degradation in
mammals. Febs J. 2007, 274, 1-22.
Davey, M.W.; Van Montagu, M.; Inze, D.; Sanmartin, M.; Kanellis, A.; Smirnoff, N.; Benzie,
I.J.J.; Strain, J.J.; Favell, D.; Fletcher, J. Plant L-ascorbic acid: chemistry, function, metabolism,
bioavailability and effects of processing. J. Sci. Food Agric. 2000, 80, 825-860.
Noctor, G.; Foyer, C.H. Ascorbate and glutathione: Keeping active oxygen under control. Annu.
Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1998, 49, 249-279.
Kleszczewska, E. L-Ascorbic acid - clinical use, toxicity, properties, methods of determination
and application in chemical analysis. Pharmazie 2000, 55, 640-644.

14


6. Meister, A. Glutathione Ascorbic-Acid Antioxidant System in Animals. J. Biol. Chem. 1994, 269,
9397-9400.
7. Englard, S.; Seifter, S. The Biochemical Functions of Ascorbic-Acid. Annu. Rev. Nutr. 1986, 6,
365-406.
8. Levine, M.; Rumsey, S.C.; Daruwala, R.; Park, J.B.; Wang, Y.H. Criteria and recommendations for
vitamin C intake. JAMA-J. Am. Med. Assoc. 1999, 281, 1415-1423.
9. Gomez-Romero, M.; Arraez-Roman, D.; Segura-Carretero, A.; Fernandez-Gutierrez, A. Analytical
determination of antioxidants in tomato: Typical components of the Mediterranean diet. J. Sep.

Sci. 2007, 30, 452-461.
10. Deicher, R.; Horl, W.H. Vitamin C in chronic kidney disease and hemodialysis patients. Kidney
Blood Pressure Res. 2003, 26, 100-106.
11. Ogiri, Y.; Sun, F.; Hayami, S.; Fujimura, A.; Yamamoto, K.; Yaita, M.; Kojo, S. Very low vitamin
C activity of orally administered L-dehydroascorbic acid. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 227229.
12. Prasad, B.B.; Tiwari, K.; Singh, M.; Sharma, P.S.; Patel, A.K.; Srivastava, S. Molecularly
imprinted polymer-based solid-phase microextraction fiber coupled with molecularly imprinted
polymer-based sensor for ultratrace analysis of ascorbic acid. J. Chromatogr. A 2008, 1198, 5966.
13. Karlsen, A.; Blomhoff, R.; Gundersen, T.E. Stability of whole blood and plasma ascorbic acid.
Eur. J. Clin. Nutr. 2007, 61, 1233-1236.
14. Yao, X.; Wang, Y.T.; Chen, G. Simultaneous determination of am aminothiols, ascorbic acid and
uric acid in biological samples by capillary electrophoresis with electrochemical detection.
Biomed. Chromatogr. 2007, 21, 520-526.
15. Koide, K.; Zhang, X.M.; Ohishi, K.; Usami, Y.; Hotta, Y.; Hiramitsu, T. Ascorbic acid
concentration in rabbit vitreous measured by microdialysis with HPLC-electrochemical detection
before and after vitreous surgery. Exp. Eye Res. 2006, 82, 868-873.
16. Cofan, C.; Radovan, C. Simultaneous chronoamperometric sensing of ascorbic acid and
acetaminophen at a boron-doped diamond electrode. Sensors 2008, 8, 3952-3969.
17. Wang, Y.; Xu, H.; Zhang, J.M.; Li, G. Electrochemical sensors for clinic analysis. Sensors 2008,
8, 2043-2081.
18. Yogeswaran, U.; Chen, S.M. A review on the electrochemical sensors and biosensors composed
of nanowires as sensing material. Sensors 2008, 8, 290-313.
19. Chen, J.; Fang, Y.J. Flow injection technique for biochemical analysis with chemiluminescence
detection in acidic media. Sensors 2007, 7, 448-458.
20. Shaidarova, L.G.; Gedmina, A.V.; Chelnokova, I.A.; Budnikov, G.K. Electrocatalytic oxidation
and flow-injection determination of ascorbic acid at a graphite electrode modified with a
polyaniline film containing electrodeposited palladium. J. Anal. Chem. 2006, 61, 601-608.
21. Matos, R.C.; Augelli, M.A.; Lago, C.L.; Angnes, L. Flow injection analysis-amperometric
determination of ascorbic and uric acids in urine using arrays of gold microelectrodes modified
by electrodeposition of palladium. Anal. Chim. Acta 2000, 404, 151-157.


15


22. Janda, P.; Weber, J.; Dunsch, L.; Lever, A.B.P. Detection of ascorbic acid using a carbon fiber
microelectrode coated with cobalt tetramethylpyridoporphyrazine. Anal. Chem. 1996, 68, 960965.
23. Behrens, W.A.; Madere, R. A Highly Sensitive High-Performance Liquid-Chromatography
Method for the Estimation of Ascorbic and Dehydroascorbic Acid in Tissues, Biological-Fluids,
and Foods. Anal. Biochem. 1987, 165, 102-107.
24. Shakya, R.; Navarre, D.A. Rapid screening of ascorbic acid, glycoalkaloids, and phenolics in
potato using high-performance liquid chromatography. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 52535260.
25. Melendez-Martinez, A.J.; Vicario, I.M.; Heredia, F.J. Provitamin A carotenoids and ascorbic acid
contents of the different types of orange juices marketed in Spain. Food Chem. 2007, 101, 177184.
26. Wang, J.; Chatrathi, M.P.; Tian, B.M.; Polsky, R. Microfabricated electrophoresis chips for
simultaneous bioassays of glucose, uric acid, ascorbic acid, and acetaminophen. Anal. Chem.
2000, 72, 2514-2518.
27. Davey, M.W.; Bauw, G.; VanMontagu, M. Simultaneous high-performance capillary
electrophoresis analysis of the reduced and oxidised forms of ascorbate and glutathione. J.
Chromatogr. B 1997, 697, 269-276.
28. Klejdus, B.; Petrlova, J.; Potesil, D.; Adam, V.; Mikelova, R.; Vacek, J.; Kizek, R.; Kuban, V.
Simultaneous determination of water- and fat-soluble vitamins in pharmaceutical preparations by
high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection. Anal. Chim. Acta
2004, 520, 57-67.
29. Wu, T.; Guan, Y.Q.; Ye, J.N. Determination of flavonoids and ascorbic acid in grapefruit peel and
juice by capillary electrophoresis with electrochemical detection. Food Chem. 2007, 100, 15731579.
30. Sun, X.M.; Niu, Y.; Bi, S.; Zhang, S.S. Determination of ascorbic acid in individual rat
hepatocyte by capillary electrophoresis with electrochemical detection. J. Chromatogr. B 2008,
870, 46-50.
31. Zuo, F.; Luo, C.H.; Zheng, Z.H.; Ding, X.B.; Peng, Y.X. Supramolecular assembly of betacyclodextrin-capped gold nanoparticles on ferrocene-functionalized ITO surface for enhanced
voltammetric analysis of ascorbic acid. Electroanalysis 2008, 20, 894-899.

32. Razmi, H.; Harasi, M. Voltammetric behavior and amperometric determination of ascorbic acid at
cadmium pentacyanonitrosylferrate film modified GC electrode. Int. J. Electrochem. Sci. 2008, 3,
82-95.
33. Abbaspour, A.; Khajehzadeh, A.; Noori, A. A simple and selective sensor for the determination of
ascorbic acid in vitamin C tablets based on paptode. Anal. Sci. 2008, 24, 721-725.
34. Liu, H.Q.; Tian, Y. Analytical application of pyramidal, rodlike, and spherical gold nanostructures:
Simultaneous detection of ascorbic acid and uric acid. Electroanalysis 2008, 20, 1227-1233.
35. Dai, H.; Wu, X.P.; Wang, Y.M.; Zhou, W.C.; Chen, G.N. An electrochemiluminescent biosensor
for vitamin C based on inhibition of luminol electrochemiluminescence on graphite/poly(methyl
methacrylate) composite electrode. Electrochim. Acta 2008, 53, 5113-5117.

16


36. Nezamzadeh, A.; Amini, M.K.; Faghihian, H. Square-wave voltammetric determination of
ascorbic acid based on its electrocatalytic oxidation at zeolite-modified carbon-paste electrodes.
Int. J. Electrochem. Sci. 2007, 2, 583-594.
37. Kizek, R.; Vacek, J.; Trnkova, L.; Jelen, F. Cyclic voltammetric study of the redox system of
glutathione
using
the
disulfide
bond
reductant
tris(2-carboxyethyl)phosphine.
Bioelectrochemistry 2004, 63, 19-24.
38. Mikelova, R.; Baloun, J.; Petrlova, J.; Adam, V.; Havel, L.; Petrek, J.; Horna, A.; Kizek, R.
Electrochemical determination of Ag-ions in environment waters and their action on plant
embryos. Bioelectrochemistry 2007, 70, 508-518.
39. Causon, R. Validation of chromatographic methods in biomedical analysis - Viewpoint and

discussion. J. Chromatogr. B 1997, 689, 175-180.
40. Bugianesi, R.; Serafini, M.; Simone, F.; Wu, D.Y.; Meydani, S.; Ferro-Luzzi, A.; Azzini, E.;
Maiani, G. High-performance liquid chromatography with coulometric electrode array detector
for the determination of quercetin levels in cells of the immune system. Anal. Biochem. 2000,
284, 296-300.
41. Petrlova, J.; Mikelova, R.; Stejskal, K.; Kleckerova, A.; Zitka, O.; Petrek, J.; Havel, L.; Zehnalek,
J.; Adam, V.; Trnkova, L.; Kizek, R. Simultaneous determination of eight biologically active thiol
compounds using gradient elution-liquid chromatography with Coul-Array detection. J. Sep. Sci.
2006, 29, 1166-1173.
42. Long, G.L.; Winefordner, J.D. Limit of Detection. Anal. Chem. 1983, 55, A712-A724.
43. Masarik, M.; Stobiecka, A.; Kizek, R.; Jelen, F.; Pechan, Z.; Hoyer, W.; Jovin, T.M.;
Subramaniam, V.; Palecek, E. Sensitive electrochemical detection of native and aggregated alphasynuclein protein involved in Parkinson's disease. Electroanalysis 2004, 16, 1172-1181.
44. Kizek, R.; Trnkova, L.; Palecek, E. Determination of metallothionein at the femtomole level by
constant current stripping chronopotentiometry. Anal. Chem. 2001, 73, 4801-4807.
45. Hubalek, J.; Hradecky, J.; Adam, V.; Krystofova, O.; Huska, D.; Masarik, M.; Trnkova, L.;
Horna, A.; Klosova, K.; Adamek, M.; Zehnalek, J.; Kizek, R. Spectrometric and voltammetric
analysis of urease – Nickel nanoelectrode as an electrochemical sensor. Sensors 2007, 7, 12381255.
46. Petrlova, J.; Krizkova, S.; Supalkova, V.; Masarik, M.; Adam, V.; Havel, L.; Kramer, K.J.; Kizek,
R. The determination of avidin in genetically modified maize by voltammetric techniques. Plant
Soil Environ. 2007, 53, 345-349.
47. Petrlova, J.; Krizkova, S.; Zitka, O.; Hubalek, J.; Prusa, R.; Adam, V.; Wang, J.; Beklova, M.;
Sures, B.; Kizek, R. Utilizing a chronopotentiometric sensor technique for metallothionein
determination in fish tissues and their host parasites. Sens. Actuator B-Chem. 2007, 127, 112-119.
48. Petrlova, J.; Masarik, M.; Potesil, D.; Adam, V.; Trnkova, L.; Kizek, R. Zeptomole detection of
streptavidin using carbon paste electrode and square wave voltammetry. Electroanalysis 2007,
19, 1177-1182.
49. Fabrik, I.; Krizkova, S.; Huska, D.; Adam, V.; Hubalek, J.; Trnkova, L.; Eckschlager, T.;
Kukacka, J.; Prusa, R.; Kizek, R. Employment of electrochemical techniques for metallothionein
determination in tumour cell lines and patients with a tumour disease. Electroanalysis 2008, 20,
1521-1532.


17


50. Fabrik, I.; Ruferova, Z.; Hilscherova, K.; Adam, V.; Trnkova, L.; Kizek, R. A determination of
metallothionein in larvae of freshwater midges (Chironomus riparius) using Brdicka reaction.
Sensors 2008, 8, 4081-4094.
51. Adam, V.; Baloun, J.; Fabrik, I.; Trnkova, L.; Kizek, R. An electrochemical detection of
metallothioneins in nanolitres at zeptomole level. Sensors 2008, 8, 2293-2305.
52. Adam, V.; Blastik, O.; Krizkova, S.; Lubal, P.; Kukacka, J.; Prusa, R.; Kizek, R. Application of the
Brdicka reaction in determination of metallothionein in patients with tumours. Chem. Listy 2008,
102, 51-58.
53. Adam, V.; Zitka, O.; Dolezal, P.; Zeman, L.; Horna, A.; Hubalek, J.; Sileny, J.; Krizkova, S.;
Trnkova, L.; Kizek, R. Lactoferrin isolation using monolithic column coupled with spectrometric
or micro-amperometric detector. Sensors 2008, 8, 464-487.
54. Zitka, O.; Stejskal, K.; Kleckerova, A.; Adam, V.; Beklova, M.; Horna, A.; Supalkova, V.; Havel,
L.; Kizek, R. Utilizing electrochemical techniques for detection of biological samples. Chem.
Listy 2007, 101, 225-231.
55. Kand'ar, R.; Zakova, P.; Lotkova, H.; Kucera, O.; Cervinkova, Z. Determination of reduced and
oxidized glutathione in biological samples using liquid chromatography with fluorimetric
detection. J. Pharm. Biomed. Anal. 2007, 43, 1382-1387.
56. Supalkova, V.; Huska, D.; Diopan, V.; Hanustiak, P.; Zitka, O.; Stejskal, K.; Baloun, J.; Pikula, J.;
Havel, L.; Zehnalek, J.; Adam, V.; Trnkova, L.; Beklova, M.; Kizek, R. Electroanalysis of plant
thiols. Sensors 2007, 7, 932-959.
57. Supalkova, V.; Petrek, J.; Baloun, J.; Adam, V.; Bartusek, K.; Trnkova, L.; Beklova, M.; Diopan,
V.; Havel, L.; Kizek, R. Multi-instrumental investigation of affecting of early somatic embryos of
Spruce by cadmium(II) and lead(II) ions. Sensors 2007, 7, 743-759.
58. Supalkova, V.; Beklova, M.; Baloun, J.; Singer, C.; Sures, B.; Adam, V.; Huska, D.; Pikula, J.;
Rauscherova, L.; Havel, L.; Zehnalek, J.; Kizek, R. Affecting of aquatic vascular plant Lemna
minor by cisplatin revealed by voltammetry. Bioelectrochemistry 2008, 72, 59-65.

59. Krizkova, S.; Ryant, P.; Krystofova, O.; Adam, V.; Galiova, M.; Beklova, M.; Babula, P.; Kaiser,
J.; Novotny, K.; Novotny, J.; Liska, M.; Malina, R.; Zehnalek, J.; Hubalek, J.; Havel, L.;
Kizek,
R. Multi-instrumental analysis of tissues of sunflower plants treated with silver(I) ions – Plants as
bioindicators of environmental pollution. Sensors 2008, 8, 445-463.
60. Ryant, P.; Dolezelova, E.; Fabrik, I.; Baloun, J.; Adam, V.; Babula, P.; Kizek, R. Electrochemical
determination of low molecular mass thiols content in potatoes (Solanum tuberosum) cultivated
in the presence of various sulphur forms and infected by late blight (Phytophora infestans).
Sensors 2008, 8, 3165-3182.
61. Babula, P.; Huska, D.; Hanustiak, P.; Baloun, J.; Krizkova, S.; Adam, V.; Hubalek, J.; Havel, L.;
Zemlicka, M.; Horna, A.; Beklova, M.; Kizek, R. Flow injection analysis coupled with carbon
electrodes as the tool for analysis of naphthoquinones with respect to their content and functions
in biological samples. Sensors 2006, 6, 1466-1482.
62. Supalkova, V.; Stavelikova, H.; Krizkova, S.; Adam, V.; Horna, A.; Havel, L.; Ryant, P.; Babula,
P.; Kizek, R. Study of capsaicin content in various parts of pepper fruit by liquid chromatography
with electrochemical detection. Acta Chim. Slov. 2007, 54, 55-59.

18


63. Kolouchova-Hanzlikova, I.; Melzoch, K.; Filip, V.; Smidrkal, J. Rapid method for resveratrol
determination by HPLC with electrochemical and UV detections in wines. Food Chem. 2004, 87,
151-158.
64. Diopan, V.; Babula, P.; Shestivska, V.; Adam, V.; Zemlicka, M.; Dvorska, M.; Hubalek, J.;
Trnkova, L.; Havel, L.; Kizek, R. Electrochemical and spectrometric study of antioxidant activity
of pomiferin, isopomiferin, osajin and catalposide. J. Pharm. Biomed. Anal. 2008, 48, 127-133.
65. Supalkova, V.; Petrek, J.; Havel, L.; Krizkova, S.; Petrlova, J.; Adam, V.; Potesil, D.; Babula, P.;
Beklova, M.; Horna, A.; Kizek, R. Electrochemical sensors for detection of acetylsalicylic acid.
Sensors 2006, 6, 1483-1497.
66. Mikelova, R.; Hodek, P.; Hanustiak, P.; Adam, V.; Krizkova, S.; Havel, L.; Stiborova, M.; Horna,

A.; Beklova, M.; Trnkova, L.; Kizek, R. Determination of isoflavones using liquid
chromatography with electrochemical detection. Acta Chim. Slov. 2007, 54, 92-97.
67. Billova, S.; Kizek, R.; Jelen, F.; Novotna, P. Square-wave voltammetric determination of
cefoperazone in a bacterial culture, pharmaceutical drug, milk, and urine. Anal. Bioanal. Chem.
2003, 377, 362-369.
68. Diculescu, V.C.; Vivan, M.; Brett, A.M.O. Voltammetric behavior of antileukemia drug glivec.
Part III: In situ DNA oxidative damage by the Glivec electrochemical metabolite. Electroanalysis
2006, 18, 1963-1970.
69. Beklova, M.; Krizkova, S.; Supalkova, V.; Mikelova, R.; Adam, V.; Pikula, J.; Kizek, R.
Determination of bromadiolone in pheasants and foxes by differential pulse voltammetry. Int. J.
Environ. Anal. Chem. 2007, 87, 459-469.
70. Krizkova, S.; Beklova, M.; Pikula, J.; Adam, V.; Horna, A.; Kizek, R. Hazards of secondary
bromadiolone intoxications evaluated using high-performance liquid chromatography with
electrochemical detection. Sensors 2007, 7, 1271-1286.
71. Potesil, D.; Petrlova, J.; Adam, V.; Vacek, J.; Klejdus, B.; Zehnalek, J.; Trnkova, L.; Havel, L.;
Kizek, R. Simultaneous femtomole determination of cysteine, reduced and oxidized glutathione,
and phytochelatin in maize (Zea mays L.) kernels using high-performance liquid chromatography
with electrochemical detection. J. Chromatogr. A 2005, 1084, 134-144.
72. Wang, J. Analytical Electrochemistry, Wiley-VCH: New York, 2000.
© 2008 by the authors; licensee Molecular Diversity Preservation International, Basel, Switzerland.
This article is an open-access article distributed under the terms and conditions of the Creative
Commons Attribution license ( />
19


20