TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM
KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y

BÁO CÁO MƠN DƯỢC PHÂN TÍCH
Đề tài: PHÂN TÍCH SACCHARIDE TRONG TỎI
ĐEN VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HĨA CỦA NĨ
GVHD:
SVTH:


1.TĨM TẮT
Tỏi đen được tạo ra bằng cách giữ tồn bộ tỏi thường trong phòng đi ều
chỉnh nhiệt độ ở 700C-800C từ 10-15 ngày mà khơng có sự xử lí nhân tạo
hay chất phụ gia. Tỏi đen được chiết xuất với 80% ethanol và cô đ ặc đ ể
thu được dẫn xuất ethanol tỏi đen. Các đường saccharide của ch ất chiết
xuất được xác định theo phương pháp đo màu fenol sulfate, DNS và sắc kí
lỏng HPLC. Các khả năng chống oxi hóa trong phịng thí nghiệm của các
chất chiết xuất thì được đánh giá bằng cách đo các hoạt động tìm ki ếm
trên 1,1-difenyl-2-Picrylhydrazyl(DPPH). Ruồi giấm đen đã được sử dụng
để nghiên cứu những tác dụng của các chất chiết xuất từ tỏi đen trên tuổi
thọ và chỉ số chống oxi hóa trong cơ thể. Các kết quả cho thấy hàm lượng
đường trong các chất chiết xuất từ tỏi đen đã 55,5% bao gồm
monosaccharide, disaccharide và polysaccharide, lượng đường kh ử là
25,22%. Các kết quả (thực hiên trong phòng thí nghiêm)từ nghiên c ứu này
đã chứng minh chiết xuất từ tỏi đen có khả năng chống oxi hóa mạnh
trong ống nghiệm, tuổi thọ của ruồi giấm được xử líbằng chiết xuất từ tỏi
đen đã được kéo dài rõ ràng và lượng MDA đã được giảm bằng cách c ải
thiện SOD( bao gồm CuZn-SOD và MnSOD) và hoạt động CAT.
2.GIỚI THIỆU
Tỏi, một thứ ăn được thuộc họ hoa loa kèn, được sử dụng không ch ỉ nh ư là
gia vị và thành phần món ăn mà cịn là thuốc cổ truy ền điều trị và ngăn

ngừa bệnh hơn 4000 năm. Một số tác dụng điều trị và hoạt động sinh h ọc
của tỏi đã được báo cáo, tuy nhiên, tỏi nên được tiêu th ụ một l ượng thích
hợp vì khả năng gây độc báo cáo ở liều cao(Kim et al., 2012). S ự bi ến động
và tính thấm của allicin đẫn đến kích thích cơ th ể và h ơi th ở có mùi. Do đó,
nó cần thiết phát triển loại tỏi mới mà không giới hạn người dùng.


Gần đây, tỏi đen như một cuốn tiểu thuyêt ẩm th ực nổi lên ở Nh ật Bản và
Hàn Quốc, sản phẩm tỏi đúng đầu cho một thời đại mới. Tỏi đen đã đ ược
sản suất thông qua lên men tự nhiên tồn bộ tỏi thơng thường dưới nhiệt
độ cao và độ ẩm cao điều kiện là trong vài ngày mà khơng có s ự x ử lí nhân
tạo hay chất phụ gia(Wang et al.,2010). Trong thời gian diễn ra q trình
lão hóa, các tép tỏi bình thường thay đổi màu sắc của nó t ừ màu tr ắng sang
màu nâu cuối cùng trở thành màu đen, nguyên nhân bởi các phản ứng
Maillard. Tởi đen mềm, chua, và ngọt giống trái cây, th ức ăn chỉ vi ệc bóc v ỏ
khơng có bất kì mùi khó chịu nào trong nó (Wang et al., 2010). Theo báo
cáo trước đó, so với tỏi tươi,tỏi đen đã tăng gấp 7 lần hàm l ượng
polyphenol (Sato et al., 2006), trong đó chỉ ra sự gia tăng hoạt đ ộng ch ống
oxi hóa, hàm lượng acid amin tăng gấp 2,5 lần( Chao et al., 2012), hàm
lượng carbohydrate tăng 28,7-40%, lượng SAC là gấp 8 lần(Sasaki et al.,
2007). Màu đen của tỏi thể hiên một loạt các hoạt động sinh học, ch ẳng
hạn chất chống oxi hóa ( Kim et al., 2012), chống ung th ư (Seo et al., 2012),
hạ đường huyết (Wang et al., 2012), hypolipidemic(Kim et al., 2011a), đ ặc
tính chống oxi hóa( Lee et al., 2011), bảo vệ gan(Kim et al., 2011b) và các
hoạt động miễn dịch( Purev et al.,2012). Hơn nữa, tỏi đen cho th ấy ho ạt
chất chống oxi hóa mạnh hơn trong cơ thể (Zhu et al., 2008) và đ ặc tính
tìm kiếm các gốc tự do cao hơn trong cơ thể so vỏi tỏi tươi (Kim et al.,
2012).
Ruồi giấm đen là loài động vật mẫu tuyệt vời để kiểm tra hiệu quả chống
lão hóa của các hợp chất do nó có tuổi thọ ngắn và bộ gen hồn ch ỉnh h ơn

ở chế độ ăn uống đơn giản(Boyd et el.,2011). Những con chuột thí nghi ệm
và dịng tế bào đã được sử dụng như là hệ thống các mô hình để điều tra
nghiên cứu hoạt động chống oxi hóa, chống ung thư và miễn dịch của các
chất chiết xuất từ tỏi đen đã phổ biến( Sasaki et al.,2007. Seo et al., 2009.


Zhu et al., 2008) nhưng hoạt tính chống oxi hóa của chất chiết xuất từ t ỏi
đen trên Ruồi giấm đen chưa được tìm thấy trong báo cáo nào
Hơn nữa, có vài báo cáo về hàm lượng và sự phân bố carbohydrate trong
tỏi đen và hoạt tính chống oxi hóa của tỏi đen cần được nghiên c ứu và s ử
dụng rộng rãi để chống lại sự rối loạn khác nhau. Vì vậy, m ục đích hi ện
tại của nghiên cứu là kiểm tra thành phần hóa học của chiết xuất ethanol
trong tỏi đenvà đánh giá hoạt tính chống oxi hóa trong phịng thí nghi ệm.
Và chúng tơi thiết kế nghiên cứu để tìm hiểu tác động của các chất chiết
xuất từ tỏi đen đối với tuổi thọ của ruồi giấm đen để xác nh ận tính ch ống
oxi hóa của màu đen chiết xuất từ trong tỏi
3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1.Vật liệu
Tỏi, bột ngô, bột nấm men mua từ thị trường nội địa Thiên Tân, Trung
Quốc. Tỏi đen đã được thực hiện trong phịng thí nghiệm c ủa chúng tôi
theo bằng sáng chế ZL 201110154928.1. Ethanol,phenol, glucosum
anhydricum và thạch là loại phân tích thu được từ Jiangtian cơng ty thuốc
thử hóa học của Thiên Tân, Trung Quốc. 1,1-Diphenyl-2-Picrilhydrazyl
(DPPH), ascorbic acid (Vc) và T-series tiêu chuẩn dextran mua từ công ty
Thuốc thử Sigma (St. Lous, MO, U.S.A.). Superoxide Dismutase (SOD) kh ảo
nghiệm, bộ khảo nghiệm Catalase(CAT), bộ khảo nghiệm
Malondialdehyde (MDA) và Commassie xanh nhuộm KIT là mua
từJiancheing Bioengineering viện Nam Kinh, Trung Quốc. Tất cả các hóa
chất và thuốc thử của phân tích được mua ở địa phương
3.2.Chuẩn bị chiết xuất tỏi đen:

100g tỏi đen bóc vỏ( độ ẩm 52%) đã được cắt nhỏ và nghiền nát và tr ộn
với 3 lần vật chất khô ethanol 80%. Các mẫu đã chiết ethanol trong 24h ở


nhiệt độ phòng 3 lần. Các dung dịch gạn chiết xuất được thu th ập b ằng
cách ly tâm, lọc và dung môi đã được loại bỏ bằng cách bốc h ơi để có
được chiết xuất ethanol từ tỏi đen
Mơi trường và động vật thí nghiệm sự tồn tại ruồi giấm đen: ruồi gi ấm
đen hoang dã nhuộm Orengon K được cung cấp từ phịng thí nghiệm c ủa
chúng tơi, tất cả những con ruồi được ăn lượng thức ăn t ự do mà cần duy
trì ở mức trung bình với độ ẩm tương đối (55±5)%trong lị ấp sinh hóa là
(25±0,5)0C với chu kì chiếu sáng là 12h trước khi được sử dụng.
Bữa ăn cơ bản của đối với ruồi chứa 72g ngô, 72g glucosum anhydricum,
6g thạch và 750ml nước, 40ml ethyl p-hydroxybenzoate 1% trong ethanol
75% sau khi đung sôi hỗn hợp, bổ sung thêm 10g bột n ấm men, cu ối cùng
để giữ cho nấm men sống. Sau đó, mỗi ống nghiệm cho khoảng 8ml h ỗn
hợp. Chất chiết xuất từ tỏi đen đã được thêm môi tr ường ở 3 n ồng độ
18,5; 37,5 và 75mg/ml tương ứng với mỗi nhóm liều.
3.3.Xác định tổng hàm lượng đường
Tổng lượng đường đã được xác định theo phương pháp đo màu phenol
sulphate(Masukoa et al., 2005) với một sửa đổi nhỏ. Lấy 1ml chất chi ết
xuất(1mg/ml) vào pitpette và thêm 1ml nước, sau đó 1ml phenol 6% và
thêm nhanh 5ml H2SO4 đậm đặc , sự hấp thu của hỗn hợp được đo ở
490nm sau đó lắc nhẹ và để yên 20 phút nhiệt độ phịng. Chỗ tr ống th ế
bằng nước cấtcó thể tích giống dung dịch chiết xuất. Các tổng hàm l ượng
đường có thể được xác định bằng cách tham khảo đường cong chuẩn c ủa
fructose (y = 0.080x - 0.063, R = 0.999), nó đ ược vẽ t ừ s ự t ập h ợp các dung
dịch đường khác nhau bằng phương pháp tương tự giải pháp chiết xuất đã
làm.
3.4.Xác đinh hàm lượng đường khử



Hàm lượng đường khử đã được xác định theo phương pháp DNS (Zhao et
al., 2008) vơi một sửa đổi nhỏ bằng cách sử dụng fructose làm đ ường
chuẩn. Thuốc thử DNS đã được bổ sung vào huyết thanh có dung dịch
fructose. Lắc hỗn hợp rồi làm nóng trong 7 phút sau đó làm lành nhanh
bằng dỏng nước chảy qua và có đường cong chuẩn
y = 2.877x - 0.046, R = 0.999
Hoàn thành sau khi hấp thu ở 540nm ghi nh ận kết quả. Các chiết xu ất
ethanol và nước cất đã được thực hiện tương tự như trên
3.5. Phép đo phân phối trọng lượng phân tử carbohydrate
Các mẫu riêng lẻ được hòa tan trong nước cất (10mg/ml). Phân phối tr ọng
lượng phân tử carbohydrate được đo bởi phương pháp GPC( phép ghi s ắc
kí thấm gel) trên một LC-20AT hệ thống HPCL (Shimadzu, Kyoto, Japan)
với máy dị tìm chỉ số khúc xạ 10A. Các dữ liệu phân tích đánh giá b ởi h ệ
thống xử lí Shimadzu LC solution 1.26 SP1. A Shodex OHpak SB-802.5 HQ
(300×8 mm, 6 μm, Showa Denko, New York, U.S.A.). Cột gel được sử dụng
trong các trường hợp sau đây: pha động( nước cất), nhiệt độ cột (30 0C), áp
lực cột( 3.0 MPa), tốc độ dòng chảy( 0.8ml/phút), kh ối l ượng tiêm( 20ml).
Kiểm tra đường kính cột sử dụng tiêu chuẩn T dextra dưới cùng điều kiện.
Xác định trọng lượng phân tử sử dụng các đường cong hiệu chuẩn đ ược
đưa ra như phương trình sau:
Y = -0.0723 X3 + 2.0859 X2 - 20.225 X + 68.868 (r = 0.9996)
3.6.Phép đo DPPH căn bản
Các hoạt động chống oxi hóa của tỏi đen đã được đánh giá bằng cách đo
hoạt động tìm kiếm gốc tự doDPPH dựa trên phương pháp của Blois (Yen
and Hsieh, 1995) với sửa đổi nhỏ. Các chiết xuất đ ược hòa tan trong


0,1ml nước cất vào một loạt các nồng độ dung dịch mẫu khác nhau và trộn

với 1,0ml dung dịch ethanol DPPH và để yên ở 370 trong 60 phút. Độ hấp
thu hỗn hợp là 517nm. Kiểm soát sự ổn định và chỗ trống được chuẩn bị
tương tự như trên trừ Vc được thay thế cho nước cất.
Hoạt động tìm kiếm gốc tự do của DPPH đã được tính tốn bằng cách s ử
dụng phương trình sau:
[DPPH·] hoạt động tìm kiếm(%) = (Achỗ trống – Amẫu) /Achỗ trống×100
3.7. Khảo sát tuổi thọ
Ruồi đực 2 ngày tuổi được chia thành 4 nhóm ngẫu nhiên, bao gồm nhóm
đối chứng và 3 nhóm thực nghiệm. Mỗi ống chưa 20 con ruồi, 10 ống
thành 1 nhóm. Số lượng ruồi chết là đếm lượng ruồi sống sót khi chuy ển
đến mơi trường mới dưới ánh sáng gây mê ni tơ công nghiệp 3 ngày 1 l ần
cho đến khi tất cả các con ruồi chết. Số lượng ruồi ch ết bất th ường khơng
được tính vào lượng trên như là sự gây mê hoặc dính đến mơi trường. Gía
trị trung bình, và số liệu tuổi thọ tối đa và thời gian chết m ội n ữa c ủa m ỗi
nhóm được ghi nhận lần lượt
3.8.Xác định CAT, hoạt động SOD và lượng MDA trên ruồi gi ấm
Ruồi đực 2 ngày tuổi chia thành nhóm đối chứng và 3 nhóm th ực nghiệm.
Mỗi ống chứa 25 con ruồi, 10 ống thành 1 nhóm. Tất cả nh ững con ruồi
nhóm khác nhau được ni bằng những mơi trường khác nhau trong 30
ngày. Sau đó, loại bỏ các mơi trường để cho chúng đói trong 2h và ghi l ại
cân nặng của chúng trong trạng thái mê man. Nh ững con ruồi đ ược đ ồng
nhất trong nước muối sinh lí vơ trùng lạnh rồi pha lỗng 2% và loại bỏ
phần nổi, ly tâm ở 3500 rpm trong 10 phút ở 40C. Việc xác định CAT, hoạt
động SOD và lượng MDA trên ruồi giấm nên so sánh v ới mẫu đ ối ch ứng


Phân tích thống kê
Bài kiểm tra của người nghiên cứu(SPSS) là sử dụng để phân tích s ự khác
biệt giữa nhóm đối chứng và nhóm thực nghiệm và ý nghĩa th ống kê xem
xét p<0.05

4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Saccharide chiết xuất từ tỏi đen: trong báo cáo trước đây, hàm l ượng
carbohydrate có sự thay đổi, nó tăng từ 28.7% lên 47% trong th ời gian
diễn ra quá trình lão hóa, mà có thể kết quả là tăng vị ngọt trong tỏi
đen( Saraki et al., 2007). Chúng tôi điều tra tổng lượng đ ường và l ượng
đường giảm trong chiết xuất ethanol của tỏi đen. Kết quả cho th ấy hàm
lượng đường trong chiết xuất tỏi đen là 55.5% tương tự v ới báo cáo, bao
gồm sucrose, glucose và fructose, lượng đường khử 25.22% cho th ấy việc
giảm đường là ý nghĩa chính của tổng lượng đường trong chiết xu ất t ỏi
đen. Két quả từ HPLC trong các phép đo phân phối tr ọng l ượng phân t ử
carbonhydrate cho thấy trong hình 1 mà phải phù hợp với phát hiện,
chúng tơi tìm thấy trong các thử nghiệm trước đó đường khử là phần
chính trong tổng lượng đường trong tỏi đen


4.1.Hoạt động khử gốc tự do của chiết xuất tỏi
đen trong ống nghiệm: Các hoạt động khử gốc tự
do DPPH để chiết xuất tỏi đen được hiển thị
trong hình. 2. Hoạt động khử gốc tự do DPPH
khảo nghiệm là một trong các cách đơn giản và
hiệu quả nhất để đánh giá hoạt động chống oxy
hóa trong ống nghiệm (MacDonald-Wicks et al.,
2006). Trong thí nghiệm này, chúng tơi kiểm tra
khả năng cho điện tử của tỏi đen , dẫn đến sự đổi
màu của dung dịch DPPH, mà có thể được sáng
tỏ tại 517 nm. Các chiết xuất từ tỏi đen cho thấy
hoạt động khử gốc tự do tương đối thấp với nồng
độ 0,3125 mg / ml so với VC, tuy nhiên, ở nồng độ 10 mg / ml, chiết xuất từ tỏi
đen thực hiện một đánh dấu gia tăng hoạt động khử gốc tự do, mà là gần với
VC, cho thấy chiết xuất từ tỏi đen có hoạt động mạnh mẽ khử gốc tự doDPPH

trong một liều lượng phụ thuộc cách thức.
4.2.Tác dụng của chiết xuất từ tỏi đen trên tuổi thọ ở ruồi giấm: khảo nghiệm
Tuổi thọ có thể điều tra các quy định về lão hóa và làm rõ ảnh hưởng của cách
chống lão hóa thơng qua quan sát trên một nửa thời gian chết, có ý nghĩa và tuổi
thọ tối đa của các sinh vật, đó là một trong những phương pháp đơn giản và
hiệu quả để đánh giá chất chống lão hóa. Drosophila melanogaster được sử
dụng là chủ đề thực nghiệm thường về di truyền vì nó có một tuổi thọ ngắn và
bộ gen hồn chỉnh và dễ nuôi. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thử nghiệm
tác dụng của chiết xuất từ tỏi đen trên tuổi thọ ở ruồi giấm và dữ liệu được trình
bày ở Bảng 1.


Kết quả cho thấy một nửa thời gian chết của nhóm liều sử dụng chiết xuất từ tỏi
đen( nhóm thực nghiệm) đã được kéo dài đáng kể so với nhóm kiểm sốt và cả
ở tuổi thọ trung bình trung bình và tuổi thọ tối đa của ruồi đối có chiết xuất từ
tỏi đen được mở rộng đáng kể, tăng đáng kể ở nồng độ cao của chiết xuất từ tỏi
đen đã được quan sát trong ba thử nghiệm, đó là một cách phụ thuộc vào liều .
4.3.Tác dụng của chiết xuất từ tỏi đen trên hoạt động SOD ở ruồi giấm
Drosophila melanogaster: superoxide dismutase (SOD) là một enzyme chống
oxy hóa quan trọng, được phân bố rộng rãi ở các sinh vật khác nhau. hoạt tính
SOD đóng một vai trị quan trọng trong việc bảo vệ và cải thiện các bệnh khác
nhau. Có hai hình thức chính của SOD trong các tế bào, bao gồm CuZn-SOD và
Mn SOD, chứa CuZn và Mn, tương ứng (Sun et al., 1988). Các tác dụng của tỏi
đen trên hoạt động SOD trong Drosophila melanogaster được thể hiện trong
Bảng 2.

So sánh với nhóm đối chứng, tất cả các nhóm thí nghiệm thực hiện các hoạt
động cao hơn trong cả hai hình thức SOD. Xuất hiện hoạt động SOD trong
Drosophila melanogaster có thể được tăng cường bằng tỏi đen. T-SOD, CuZn-



SOD và hoạt động Mn SOD đã được cải thiện như tăng nồng độ của tỏi đen một
cách phụ thuộc vào liều. Ở nồng độ cao, ảnh hưởng đến hoạt động SOD có ý
nghĩa thống kê với p <0,05.
4.4.Ảnh hưởng của tỏi đen trên hoạt động CAT và hàm lượng MDA trong
Drosophila melanogaster: Sự phân bố của catalase (CAT) được công bố ở các
sinh vật khác nhau, Catalase là một enzyme quan trọng trong hệ thống phòng
thủ, được sản xuất trong peroxisome và cần thiết cho xúc tác phân hủy H202
thành H20 và O2 (Noctor et al., 2000), có thể ức chế việc tạo ra chất độc hại phát
sinh từ phản ứng H202 với chất thuộc nhóm sắt để bảo vệ các tế bào khỏi nhiễm
độc. Malonaldehyde là một trong những sản phẩm cuối cùng trong peroxid hóa
màng tế bào lipid có thể phản ánh mức độ peroxy màng tế bào gián tiếp (Zhu et
al., 2008), việc xác định hàm lượng MDA thường kèm đo hoạt động SOD, mức
độ hàm lượng MDA và hoạt động SOD phản ánh mức độ của các tế bào bị tấn
công bởi các gốc tự do và khả năng làm sạch gốc oxy tự do trong cơ thể . Tác
dụng của tỏi đen trên hoạt động CAT và hàm lượng MDA trong Drosophila
melanogaster đã được thể hiện trong Bảng 3.

Kết quả được minh họa hoạt động của các nhóm CAT tỏi đen đã được tăng lên
rõ rệt so với nhóm đối chứng. Các hàm lượng MDA trong Drosophila
melanogaster đã giảm rõ ràng với nồng độ ngày càng tăng của tỏi đen. Trong cả
hai thử nghiệm, sự khác biệt đáng kể với p <0,05 được phát hiện ở nồng độ tỏi
đen cao hơn so với nhóm đối chứng và phụ thuộc vào liều.
PHẦN KẾT LUẬN


Kết quả từ nghiên cứu này đã chứng minh hàm lượng đường trong các chất
chiết xuất tỏi đen là 55,5%, lượng đường khử như là một phần chính của tổng số
đường, lượng đường khử là 25,22%. Trong xét nghiệm chất chống oxy hóa
trong ống nghiệm và trong cơ thể, chiết xuất từ tỏi đen biểu hiện khả năng

chống oxi hóa gốc tự do phụ thuộc liều, tuổi thọ của ruồi giấm Drosophila
melanogaster được kéo dài rõ rệt, SOD (Bao gồm cả CuZn-SOD và Mn SOD)
và các hoạt động CAT đã được cải thiện như nồng độ của dịch chiết tỏi đen tăng
trong khi hàm lượng của MDA đã được giảm, trong đó chiết xuất từ tỏi đen có
thể kéo dài tuổi thọ của ruồi giấm Drosophila melanogaster qua SOD và kích
hoạt CAT và ức chế sản xuất MDA.
XÁC NHẬN
Dự án được hỗ trợ bởi dự án của Chương trình nghiên cứu phát triển công nghệ
trọng điểm quốc gia và Kế hoạch năm năm lần thứ 12 (NO. 2012BAD33B08)
và Bộ Giáo dục nước Cộng hòa Nhân dân dự án của Trung Quốc (Grant khơng.
IRT1166).
Các ngun liệu và hóa chất thí nghiệm chủ yếu mua từ thị trường trong
nước( Trung Quốc)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu gốc: The Analysis of Saccharide in Black Garlic and its Antioxidant
Activity

(Mengmeng Lei, Mengying Xu, Zesheng Zhang, Min Zhang and

Yunfeng Gao Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Tianjin
University of Science and Technology, Ministry of Education, Tianjin
300457, P.R. China)
Một số trang web và tài liệu.