NGHIÊN CỨU VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG NITRATE
CÓ TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU CỦ QUẢ BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
HPLC
GVHD:




Nội dung


Chương 1. Giới thiệu
Chương 2.Tổng quan lý thuyết
2.1 Tổng quan về nitrat
2.2 Tổng quan về HPLC
2.3 Hệ thống HPLC
2.4 Chọn điều kiện sắc ký
 Chương 3. Phương pháp nghiên cứu
3.1 Quy trình thử nghiệm
3.2 Thẩm định quy trình thử nghiệm
 Chương 4. Kết quả nghiên cứu
4.1 Kết quả thẩm định
4.2 Kết quả khảo sát hàm lượng nitrate trên 1 số loại rau củ
quả bằng 2 phương pháp
4.3 Một số hình ảnh về sắc kí đồ của mẫu phân tích




Chương 1. Giới thiệu


1.1 Lý do chọn đề tài
1.2 Mục tiêu đối tượng nghiên cứu
Tìm hiểu tính chất vật lí, hố lí, tác hại của nitrate có
trong rau củ quả.
 Đưa ra phương pháp xác định hàm lượng nitrate
trong rau củ quả bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao HPLC.
 Khảo sát hàm lượng nitrate có trong một số loại
rau củ quả có mặt trên thị thường
Đối tượng nghiên cứu: một số loại rau củ quả phổ
biến trong bữa ăn hang ngày.
Phạm vi nghiên cứu: rau củ quả được mua từ một số


Chương 2. Tổng quan lý
thuyết

2.1 Tổng quan về nitrate
2.1.1 Giới thiệu về nitrate
2.1.2 Nguồn gốc của nitrat. Vì sao nitrat
có nhiều trong đất?


Chương 2. Tổng quan lý
thuyết

2.1.3 Ảnh hưởng của nitrate đối với
sức khỏe con người



Chương 2. Tổng quan lý
thuyết


Bảng 2.1 : Hàm lượng nitrate cho phép trong một số loại rau quả theo tiêu
chuẩn của WHO (đơn vị: mg/kg sản phẩm)


Chương 2. Tổng quan lý
thuyết


2.1.5 Một số phương pháp xác định
hàm lượng nitrate
2.1.5.1 Phương pháp thể tích
2.1.5.2 Phương pháp so màu
2.1.5.3 Phương pháp dòng chảy
FIA (Flow injection analysis)
2.1.5.4 Phương pháp cực phổ
2.1.5.5 Phương pháp đo khí


Chương 2. Tổng quan lý
thuyết


.2 Tổng quan về HPLC

1.Bình đựng dung

mơi.
 2Bộ phận khử khí.
 3.Hệ thống bơm cao
áp.
 4.Bộ phận tiêm mẫu
(bằng tay hay
autosample).
 5.Cột sắc ký (pha
tĩnh) ( để ngồi mơi
trường hay trong bộ
điều nhiệt).
 6.Detector (nhận tín
hiệu).
 7.Hệ thống máy tính
gắn phần mềm nhận
tín hiệu, xử lí dữ liệu
và điểu khiển hệ


CHƯƠNG 3. PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Quy trình thử nghiệm
3.1.1 Thuốc thử
3.1.2 Thiết bị - dụng cụ
3.1.3 Cách tiến hành
3.1.3.1 Quy trình xử lý mẫu
3.1.3.2 Dựng đường chuẩn
3.1.3.3Điều kiện thao tác của
HPLC

3.1.3.4 Tính kết quả
3.2 Thẩm định quy trình thử nghiệm
3.2.1 Độ đúng
3.2.2 Độ chính xác
3.2.3 Tính đặc hiệu
3.2.4 Giới hạn phát hiện
3.2.5 Giới hạn định lượng


3.1.1 Thuốc thử
Các thuốc thử sử dụng phải là loại hố chất
tinh khiết dùng trong phân tích.
• ™ Metanol: loại dùng cho HPLC (Merck)
• ™ Acetonitril (ACN): loại dùng cho HPLC
(Merck)
•  Dung dịch Carrez số 1
• Dung dịch Carrez số 2
• Dung dịch chuẩn Nitrate 50ppm
• Dung dịch chuẩn Nitrate 5ppm
• HPLC pha động


3.1.2 Thiết bị - dụng cụ
• Máy trộn phịng thí nghiệm: máy cắt phịng thí
nghiệm.
• Giấy lọc gấp nếp.
• Bộ phận siêu lọc: dùng cho dung dịch lỏng, có cỡ l
0.45àm.
ã Ct chit pha rn SPE: ct RP C18 pha đảo.
• Bộ chiết SPE với bơm hút chân khơng.

• Cân điện tử.
• Máy rung siêu âm.
• Bộ lọc dung mơi sắc ký.
• Máy sắc ký lỏng Agilent 1100: với đầu dị DAD.
• Cột sắc ký C18
• Dụng cụ thủy tinh cần thiết: bình định mức các loại,
pipet các loại, pipet
• Pasteur, bình nón, cốc.


Xay
nhuyễn

Mẫu

Cân 10g

Hịa tan với
300ml nước
cất

3.1.3 Cách tiến hành

3.1.3.1 Quy trình xử lý mẫu
Lọc

Định mức
lên
500ml


Đánh siêu
âm 30 phút

Cho qua cột chiết
pha rắn

Cho thêm thuốc thử
Carrez

Lọc với giấy lọc

Lọc với giấy lọc

Lọ Vial

Lọ Vial


3.1.3.2 Dựng đường chuẩn
Để dựng đường chuẩn, chuẩn bị một dãy các dung dịch
chuẩn có nồng độ thích hợp
Bơm các thể tích bằng nhau của các dung dịch thử và
dung dịch chuẩn. Kiểm tra độ
tuyến tính của hàm số hiệu chuẩn.

3.1.3.3 Điều kiện thao tác của HPLC
Cột:
Zorbax Rx-C18, 4.6mm x 150mm x 5µm
Đệm:
Octylamine 0.01M, pH = 5.5-6 (điều chỉnh

bằng H3PO4)
Pha động:
88:12 (Đệm: ACN)
Tốc độ dịng:
1ml/ phút
Thể tích tiêm:
10µl
Nhiệt độ cột:
40oC
Bước sóng:
210nm
Thời gian chạy:
8phút


3.1.3.5 Tính kết quả
Tính hàm lượng Nitrate trong mẫu theo công thức sau:

Với: ρ: hàm lượng nitrate trong mẫu (mg/kg hoặc
mg/lít)
X: nồng độ nitrate trong dung dịch mẫu thử đọc từ
đường hiệu chỉnh (mg/l)
F1: hệ số pha loãng khi sử dụng phương pháp tinh
sạch (tinh sạch qua cột F1=1, tinh sạch bằng Carrez
F1=1.25)
V: thể tích pha lỗng (ml). (V=500 ml)
m: khối lượng cân, tính bằng g hoặc ml/l dung dịch
mẫu.



3.2 Thẩm định quy trình thử nghiệm
3.2.1 Độ đúng
Định nghĩa:
• Độ đúng của một phương pháp phân tích là sự
giám sát gần (closeness) của các kết quả thử
nghiệm bằng phương pháp đó với giá trị thật sự.
• Độ đúng của một phương pháp phân tích phải
được xác định suốt trong khoảng áp dụng của
phương pháp.


3.2.2 Độ chính xác

Định nghĩa:
• Độ chính xác của một phương pháp phân tích là mức
độ phù hợp giữa các kết quả phù hợp giữa các kết
quả kiểm nghiệm cá thể khi phương pháp được áp
dụng lập lại nhiều lần trên cùng một mẫu.
• Độ chính xác của phương pháp phân tích thường
được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (Standard
deviation- SD) hay độc lêch chuẩn tương đối
(Relative standard devition- RSD) của một loạt các
lần đo.


3.2.3 Tính đặc hiệu

Định nghĩa:
ICH định nghĩa tính đặc hiệu là khả năng xác định
một cách chắc chắn một chất cần phân tích khi có sự

có mặt các thành phần khác, chẳng hạn như các tạp
chất, các sản phẩm giảng hóa và các thành phần hỗn
hợp. Sự thiếu tính đặc hiệu của một phương pháp
phân tích có thể được khắc phục bởi các phương
pháp phân tích hỗ trợ khác


3.2.4 Giới hạn phát hiện

Định nghĩa:
Giới hạn phát hiện là lượng chất cần phân tích thấp
nhất trong mẫu thử có thể phát hiện bởi phương pháp
phân tích trong các điều kiện thí nghiệm đã cơng bố,
nhưng khơng nhất thiết phải có tính định lượng. Giới
hạn phát hiện là một đặc tính của các thử nghiệm giới
hạn (limit tests). Giới hạn phát hiện thường được biểu
thị theo tỷ lệ phần trăm, phần triệu (ppm), phần tỷ
(ppb) nồng độc chất cần phân tích…trong mẫu thử.


3.2.5 Giới hạn định lượng
Định nghĩa:
Giới hạn định lượng là một đặc tính của các phương
pháp định lượng đối với chất hàm lượng thấp trong
cùng hỗn hợp mẫu thử, ví dụ các tạp chất trong
nguyên liệu hoặc các sản phẩm. Đó là lượng chất cần
phân tích thấp nhất trong mẫu thử có thể phát hiện
bởi phương pháp phân tích trong các điều kiện thí
nghiệm đã cơng bố với độc chính xác và độ đúng có
thể chấp nhận được. Giới hạn định lượng thường được

biểu thị theo tỷ lệ phần trăm, phần triệu (ppm), phần
tỷ (ppb)…nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử.


3.2.6 Tính tuyến tính

Định nghĩa:
Tính tuyến tính của một phương pháp phân tích là
khả năng có thể rút ra các kết quả thử nghiệm bằng
phương pháp đó một cách trực tiếp, hoặc bằng một
sự chuyển đổi toán
học cho biết sự tỷ lệ của hàm lượng chất cần phân
tích trong mẫu thử trong vòng một khoảng đã cho.
Trong cả hai trường hợp, giữa đại lượng đo được và
nồng độ phải thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính. Tính
tuyến tính được biểu thị bằng hệ số tương R.


Chương 4. Kết quả nghiên
cứu

•Kiểm tra độ sai lệch của 2 phương pháp xử lý mẫu
Khảo sát trên mẫu rau xà lách:
Bảng 4.1: Kết quả chuẩn nitrate
Chuẩn
nitrate
Nồng độ
(ppm)

Diện

tích

Thời gian lưu
(phút)

50 ppm

3883.8

5.573

20 ppm

1554.9

5.527

10 ppm

772.8

5.494

5 ppm

374.8

5.505

1 ppm


72.3

5.507

4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0

y = 77.86x ‐ 7.4779
R2 = 1

0

10

20

30

40

Hình 4.1: Đường chuẩn nitrate


50

60


Bảng 4.2: Kết quả mẫu xà
lách

Mẫu

Khối Lượng

Diện

Thời gian lưu

(g)

tích

(phút)

Nồng độ

ρ (mg/kg)

Mẫu 1(Carrez)

10.19


1524.1

5.589

19.67091

1206.5

Mẫu 1 (C18)

10.19

1968.4

5.591

25.37731

1245.2

Mẫu 2 (Carrez)

10.02

1517.3

5.578

19.58357


1221.5

Mẫu 2 (C18)

10.02

1910.9

5.556

24.6388

1229.5

Mẫu 3 (Carrez)

10.01

1498.8

5.551

19.34597

1207.9

Mẫu 3 (C18)

10.01


1920.1

5.544

24.75696

1236.6

Ta thấy nồng độ của mẫu được tinh sạch qua cột C18 luôn lớn
hơn mẫu được tinh sạch bằng thuốc thử Carrez. Vì trong quá trình
xử lý mẫu bằng cốt C18 ta khơng có pha lỗng, cịn bằng phương
pháp Carrez ta có pha lỗng (hút 20 ml mẫu rồi định mức lên
25ml). Vì thế tỉ lệ nồng độ của mẫu qua cột C18 luôn gấp khoảng
1.25 lần nồng độ của mẫu xử lý bằng thuốc thử Carrez.


Như vậy cả hai phương pháp xử lý mẫu đều cho kết qua gần như
nhau. Ta có thể áp dụng cả hai phương pháp này. Để tính được ρ
(mg/kg) ta áp dụng cơng thức của TCVN:

Ví dụ:
Xà lách 1 với phương pháp Carrez:
(mg/kg)

Xà lách 1 với phương pháp qua cột C18:

(mg/kg)



Độ lặp lại
 
Khảo sát trên mẫu rau xà lách
 Sử dụng phương pháp tinh sạch mẫu bằng Carrez:
Bảng 4.3: Kết quả mẫu xà lách tinh sạch bằng
Carrez
Mẫu

Diện
tích
1524.1

Nồng
độ
19.671

ρ (mg/kg)

Mẫu 1

Khối lượng mẫu
thử (g)
10.19

Mẫu 2

10.02

1517.3


19.584

1221.5

Mẫu 3

10.01

1498.8

19.346

1207.9

Mẫu 4

10.00

1498.5

19.342

1208.9

Mẫu 5

10.15

1520.3


19.622

1208.3

Mẫu 6

10.09

1515.6

19.562

1211.7

TB

 

 

 

1210.8

SD

 

 


 

5.5

RSD%

 

 

 

0.46

1206.5


Sử dụng phương pháp tinh sạch mẫu bằng cột
C18:
Bảng 4.4: Kết quả mẫu xà lách tinh sạch bằng cột
C18 Khối lượng mẫu thử (g)
Mẫu
Diện tích
Nồng độ
Ρ (mg/kg)
Mẫu 1

10.19

1968.4


25.377

1245.2

Mẫu 2

10.02

1910.9

24.639

1229.5

Mẫu 3

10.01

1920.1

24.757

1236.6

Mẫu 4

10.00

1858.1


23.961

1218.6

Mẫu 5

10.15

1946.0

25.089

1235.9

Mẫu 6

10.09

1909.7

24.623

1220.2

TB

 

 


 

1231.0

SD

 

 

 

10.3

RSD%

 

 

 

0.84

Nhận xét: Quy trình định lượng đảm bảo yêu cầu theo ICH : RSD
< 2%