Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA


NGUYỄN THỊ NGỌC THẢO

SÀNG LỌC ENDOPHYTE THỰC VẬT
CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM VÀ
KHÁNG KHUẨN
Chun ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số ngành: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP.HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2010


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ, em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô TS.
Nguyễn Đinh Nga , người thầy hướng dẫn khoa học, người đã dạy dỗ, quan tâm và
tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi về tinh thần và vật chất cho em hồn
thành luận văn và Cơ đã cho em học hỏi nhiều kinh nghiệm quý báu trong những
bước đầu tiếp cận với công tác nghiên cứu khoa học. Cảm ơn những lời lo lắng của
Cô đã giúp em có ý chí, nghị lực và niềm hăng say trong học tập và nghiên cứu.
Em xin gởi lời cảm ơn đến Cô Th.S Lê Thị Ngọc Huệ đã nhiệt tình chỉ dạy và động
viên cho em trong thời gian làm việc ở trường.
Xin gởi lời cảm ơn đến Cô Hồ Thị Song, Kim Yến, Giang Bắc, Hà Vi đã giúp đỡ
rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt luận văn.
Em xin chân thành biết ơn Quý Thầy Cô Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại
Học Bách Khoa đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu và giúp đỡ em trong
thời gian học ở trường.

Xin được cảm ơn đến Bộ mơn Hóa dược và Phịng Vi sinh Cơng nghệ Dược đã
nhiệt tình giúp đỡ em.
Xin chân thành cảm ơn các em: Minh Phương, Phước Tân, Thảo Ly và Hồng Mai
cùng làm luận văn tại Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, đã khơng ngại khó khăn, ln sẵn
sàng giúp đỡ, động viên chị và đã có những kỷ niệm đẹp trong suốt thời gian làm
việc chung với nhau.
Chân thành cảm ơn các bạn Trường Đại Học Bách Khoa đã tận tình giúp đỡ tơi
trong suốt thời gian học tập và làm luận văn.
Con vô cùng cảm ơn Ba và gia đình đã dành cho con là sự quan tâm, thương yêu, lo
lắng, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con học tập để con có được ngày
hơm nay.
XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN SÂU SẮC!


TÓM TẮT
Tiến hành sàng lọc vi nấm nội sinh thực vật kháng Candida albicans ATCC 10231,
Staphylococcus aureus ATCC 29213 và MRSA ATCC 43300 để loại vi sinh vật
ngoại nhiễm. Lần lượt ly trích trên mơi trường thạch nước và mơi trường dinh
dưỡng thích hợp để khảo sát hoạt tính kháng Candida albicans ATCC 10231,
Staphylococcus aureus ATCC 29213 và MRSA ATCC 43300 bằng phương pháp
khuếch tán. Khảo sát điều kiện nuôi cấy những chủng cho hoạt tính mạnh sản xuất
hoạt chất chiết tách sản phẩm kháng nấm, kháng khuẩn thô bằng cách lắc phân bố
với các dung mơi có độ phân cực khác nhau và xác định MIC sản phẩm thô bằng
phương pháp pha loãng.
Kết quả: Từ 31mẫu thực vật ly trích được 104 chủng vi nấm nội sinh, trong đó
11/104 chủng cho chất biến dưỡng có hoạt tính kháng sinh. Đã chiết tách và xác
định MIC của 2 sản phẩm thô từ 2 chủng vi nấm nội sinh thực vật có hoạt tính
mạnh.
Kết quả đạt được cho thấy triển vọng sử dụng vi nấm nội sinh thực vật là nguồn
cung cấp các hoạt chất mới có tác động kháng nấm và kháng khuẩn.



SCREEN ISOLATED ENDOPHYTES FROM PLANT SAMPLES HAVING
THE ANTIFUNGAL AND ANTIMICROBIAL

ABSTRACT
The authors had screening endophytes giving the metabolites that show the
antimicrobial and antifungal activites agains Candida albicans ATCC10231,
Staphylococcus aureus ATCC 29213 and Staphylococcus aureus methicillin
resistance ATCC 43300. Determine the antimicrobial and antifungal activites of
endophytes by diffusion method. Study the best conditions in which endophytes
show high activites and determine MICs of the crude antimicrobial and fungal
products by the dilution method.
Results: in 31 plants, there were 11/104 endophytes having the antifungal and
antimicrobial activites against Candida albicans, Staphylococcus aureus and
MRSA. The culture conditions of endophytes have been determined and the MICs
of there crude products isolated from two endophytes were studied. These products
showed strong activity against the studied strains.
The data suggest the further study of endophytes as a source that supplies new
antifungal and antimicrobial compounds.


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ


ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................ 1
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
1.1

Khái niệm về vi sinh vật nội sinh ............................................................... 3

1.1.1

Định nghĩa .................................................................................................. 3

1.1.2

Quan hệ giữa vi sinh vật nội sinh và thực vật ............................................ 3

1.1.3

Nguyên tắc cơ bản để lựa chọn thực vật ly trích vi sinh vật nội sinh ........ 4

1.1.4

Một số vi sinh vật nội sinh sản xuất các chất biến dƣỡng thứ cấp có
hoạt tính sinh học .................................................................................... .. 5

1.2

ĐỐI TƢỢNG THỬ HOẠT TÍNH ............................................................. 8

1.2.1

Candida albicans ........................................................................................ 8


1.2.2

Staphylococus aureus ............................................................................... 14

1.2.3

Staphylococus aureus kháng methicillin (MRSA) ................................... 17

1.3

TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP ....................................................... 19

1.3.1

Phƣơng pháp ly trích vi sinh vật nội sinh từ thực vật ......................... 19

1.3.2

Phƣơng pháp nuôi cấy và chiết tách chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh
vật nội sinh ..................................................................................... 20

1.3.3

Phƣơng pháp định danh thƣờng quy nấm sợi........................................... 21


PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 23
2.1


VẬT LIỆU ................................................................................................ 23

2.1.1

Thực vật chọn ly trích .............................................................................. 23

2.1.2

Hóa chất .................................................................................................... 25

2.1.3

Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................ ..25

2.1.4

Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm................................................................. 26

2.1.5

Đối tƣợng thử hoạt tính kháng ................................................................. 27

2.2

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 28

2.2.1

Ly trích vi sinh vật nội sinh từ thực vật ................................................... 28


2.2.2

Chuẩn bị vi sinh vật thử nghiệm .............................................................. 30

2.2.3

Sàng lọc vi nấm cho chất biến dƣỡng có hoạt tính kháng nấm, kháng
khuẩn ............................................................................................ ..31

2.2.4

Phƣơng pháp định danh thƣờng quy nấm sợi .................................. ..32

2.2.5

Phƣơng pháp khảo sát khả năng cộng hợp ............................................... 33

2.2.6

Khảo sát điều kiện ni cấy vi nấm có hoạt tính ................................. 34

2.2.7

Chiết tách chất biến dƣỡng có hoạt tính kháng sinh ............................ 36

2.2.8

Xác định nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của vi nấm và vi khuẩn
bằng phƣơng pháp pha loãng (MIC) ....................................................... .38


PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................... 39
3.1

Sàng lọc vi nấm nội sinh sản xuất chất biến dƣỡng kháng nấm và kháng
khuẩn .......................................................................................................... 39

3.1.1 Ly trích vi nấm nội sinh sản xuất chất biến dƣỡng kháng nấm –
kháng khuẩn ............................................................................................... 39
3.1.2 Xác định các đặc điểm hình thái vi nấm nội sinh cho chất biến dƣỡng
kháng nấm và kháng khuẩn ........................................................................ 43
3.2

Sàng lọc vi nấm nội sinh cho chất biến dƣỡng phối hợp tác động với fluconazol và
kháng Candida albicans..........................................................................................................................47

3.3

Nghiên cứu các vi nấm nội sinh cho chất biến dƣỡng kháng VSV mạnh .. 48

3.3.1 Đặc điểm hình thái MĐ-TR1 ..................................................................... .48


3.3.2 Đặc điểm hình thái MĐ-TR3 ..................................................................... .52
3.4

BÀN LUẬN ............................................................................................... .61

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................... 64
KẾT LUẬN ......................................................................................... 64
ĐỀ NGHỊ ............................................................................................ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... .66
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

C. albicans

Candida albicans

CFU

Colony Forming Unit

CH2Cl2

Dichloromethan

CXT

Chiết xuất thô

Cza-Dox

Czapeck - Dox

DMHC

Dung môi hữu cơ


DMSO

Dimethyl Sulfoxide

EtOAc

Etyl acetat

LD

Lethal doses

MeOH

Methanol

MHA

Mueller Hinton Agar

MIC

Minimum Inhibitory Concentration

MRSA

Staphylococcus aureus kháng Methicillin

n-C6H6


n-hexan

PDA

Potato Dextrose Agar

S.aureus

Staphylococcus aureus

SDA

Sabouraud Dextrose Agar

SKC

Sắc ký cột

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

TSA

Trypticase Soy Agar


NCCLS

The National committee for Clinical Laboratory

Standard

VNNS

Vi nấm nội sinh

VSV

Vi sinh vật

THỰC VẬT LY TRÍCH
BH

Bạc hà

Ba

Bàng

BL

Bằng lăng

BCV

Bị cạp vàng

BCA

Bồ cơng anh


BO

Bơng ổi

BTĐ

Bơng trang đỏ

B

Bưởi

CĐD

Cà độc dược

Ca

Cam

C

Chanh

CV

Chìa vơi

CG


Cỏ gà

DB

Dâm bụt

DC

Diếp cá

HN

Hồng ngọc


HC

Húng chanh

HNT

Hương nhu tía

IM

Ích mẫu

KG


Kinh giới

L

Lài

LV

Lượt vàng

MC

Măng cụt

MU

Mù u

RM

Rau má

RMe

Râu mèo

S

Sả


Si

Si

T

Tắc

TL

Thạch lựu

TN

Trinh nữ


CÁC BỘ PHẬN THỰC VẬT
C

Cành

CL

Cuống lá

H

Hoa


L

Lá

R

Rễ

T

Thân

TR

Thân rễ

V

Vỏ


DANH MỤC CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 1.1. Tác động kháng sinh của phomopsichalasin

7

Bảng 1.2. Một số vi sinh vật nội sinh sản xuất paclitaxel

8


Bảng 2.1. Danh sách những thực vật được sử dụng trong nghiên cứu

23

Bảng 2.2. Mức độ kháng nấm, kháng khuẩn dựa theo đường kính

32

vịng kháng sinh của khoanh thạch thử
Bảng 2.3. Tốc độ phát triển của nấm dựa vào đường kính khóm nấm

32

Bảng 3.1. Vi nấm nội sinh sản xuất chất biến dưỡng kháng

39

C. albicans, S. aureus và MRSA từ cây thuộc họ Lamiaceae
Bảng 3.2. Vi nấm nội sinh sản xuất chất biến dưỡng kháng

39

C. albicans, S. aureus và MRSA từ cây thuộc họ Rutaceae
Bảng 3.3. Vi nấm nội sinh sản xuất chất biến dưỡng kháng

41

C. albicans, S. aureus và MRSA từ cây thuộc các họ thực vật khác
Bảng 3.4. Đặc điểm các vi nấm nội sinh cho chất biến dưỡng kháng


46

nấm và kháng khuẩn
Bảng 3.5. Hiệu quả phối hợp giữa fluconazol và chất biến dưỡng từ

47

các chủng vi nấm nội sinh kháng Candida albicans
Bảng 3.6. Tác động kháng C.albicans và MRSA của dịch nuôi cấy 50
MĐ-TR1 theo thời gian
Bảng 3.7. Hoạt tính kháng C. albicans và MRSA của CXT/MĐ-TR1

51

Bảng 3.8. Sự sản xuất hoạt chất kháng khuẩn-kháng nấm của

55

MĐ-TR3 ở điều kiện nuôi cấy tĩnh
Bảng 3.9. Sự sản xuất hoạt chất của MĐ-TR3 ở điều kiện lắc

55


Bảng 3.10. Hoạt tính kháng C.albicans và MRSA của hợp chất thô 57
chiết từ môi trường nuôi cấy MĐ-TR3
Bảng 3.11. Đặc điểm các vết trên sắc ký đồ của CXT / MĐ-TR3

58


Bảng 3.12. Các phân đoạn thu được khi phân lập cao CH2Cl2/ MĐ-

59

TR3
Bảng 3.13. Đặc điểm các vết trên sắc ký đồ của phân đoạn 4

60

Bảng 3.14. Nồng độ tối thiểu ức chế C. albicans và MRSA của các

60

chất chiết thơ và các phân đoạn có hoạt tính


DANH MỤC CÁC HÌNH
TRANG
Hình 1.1. Candida albicans

9

Hình 1.2. Candida albicans gây viêm âm hộ - âm đạo

11

Hình 1.3. Candida albicans gây tổn thương kẻ chân

12


Hình 1.4. Hình thái của Staphylococcus aureus

14

Hình 1.5. Những biểu hiện khi nhiễm Staphylococcus aureus

16

Hình 2.1.Tác động cộng hợp khi phối hợp 2 chất có hoạt tính kháng

34

nấm
Hình 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng VNNS B-CL1 trên S.

40

aureus ATCC 29213 (1) và MRSA ATCC 43300 (2)
Hình 3.2. Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của chủng VNNS C-C2

40

trên C. albicans ATCC 10231 (1), S. aureus ATCC 29213 (2) và
MRSA ATCC 43300 (3)
Hình 3.3: Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của chủng VNNS L-C6

42

trên C. albicans ATCC 10231 (1), S. aureus ATCC 29213 (2) và

MRSA ATCC 43300 (3)
Hình 3.4: Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của chủng VNNS S-R1

42

trên C. albicans ATCC 10231 (1), S. aureus ATCC 29213 (2) và
MRSA ATCC 43300 (3)
Hình 3.5. Đặc điểm hình thái khóm nấm chủng BTĐ-L1

43

Hình 3.6. Hình thể BTĐ-L1 ở kính hiển vi (x40)

44

Hình 3.7 . Đặc điểm hình thái khóm nấm chủng S-R1

45

Hình 3.8. Hiệu quả phối hợp giữa fluconazol và chất biến dưỡng từ

47

L-C6 kháng C. albicans


Hình 3.9. Hiệu quả phối hợp giữa fluconazol và S-R1 kháng

48


C.albicans ATCC 10231
Hình 3.10 . Đặc điểm MĐ-TR1 trên các mơi trường ni cấy

49

Hình 3.11 . Bào tử của MĐ-TR1

50

Hình 3.12. Đặc điểm hình thái khóm nấm chủng MĐ-TR3

53

Hình 3.13 . Đặc điểm hình thể MĐ-TR3 ở kính hiển vi (x 40)

54

Hình 3.14. Vết kháng MRSA từ CXT/CH2Cl2/MĐ-TR3 phát hiện

58

bằng kỹ thuật hiện hình sinh học.
Hình 3.15.Phân đoạn 4 kháng MRSA

59

Hình 3.16. Sắc ký đồ SKLM phân đoạn 4

60


Hình 3.17. Hoạt tính kháng MRSA của các vết tách từ phân đoạn 4

60


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
TRANG
Sơ đồ 1.1. Quy trình ly trích vi sinh vật nội sinh thực vật

20

Sơ đồ 1.2. Quy trình ni cấy và chiết tách hoạt chất từ vi sinh vật 21
nội sinh
Sơ đồ 2.1. Quy trình xử lý mẫu thực vật

29

Sơ đồ 2.2. Quy trình chiết tách chất biến dưỡng có hoạt tính kháng

37

sinh
Sơ đồ 3.1. Quy trình chiết tách thu hoạt chất của chủng Fusarium

52

MĐ-TR1
Sơ đồ 3.2. Quy trình chiết tách hợp chất thơ kháng VSV từ dịch nuôi
cấy MĐ-TR3


56


ĐẶT VẤN ĐỀ


HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Thảo

-1-

GVHD: TS. Nguyễn Đinh Nga

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vấn đề kháng thuốc ở vi sinh vật là một trong những khó khăn lớn trong điều trị các
bệnh nhiễm. Những báo cáo gần đây cho thấy tình trạng kháng thuốc ở
Staphylococcus aureus trở nên nghiêm trọng hơn, đã xuất hiện các chủng MRSA
(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) kháng vancomycin gây khó khăn hơn
cho các thầy thuốc [23].
Ngồi vấn đề vi khuẩn kháng thuốc, các bệnh do vi nấm ngày càng gia tăng ở các
bệnh nhân suy giảm miễn dịch như nhiễm HIV/AIDS, bệnh nhân cấy ghép cơ quan,
bệnh nhân tiểu đường; bệnh nhân cần can thiệp bằng các thủ thuật y khoa xâm lấn
như đặt ống thông, đặt van nhân tạo, mang răng giả,…Đặc biệt, thuốc dùng trị các
bệnh do vi nấm khơng có nhiều chủng loại, các thầy thuốc khơng có nhiều lựa chọn,
bắt buộc phải sử dụng thường xuyên một vài thuốc như ketoconazol, fluconazol,
itraconazol để điều trị, nên đã nảy sinh vấn đề kháng thuốc ở các vi nấm gây bệnh
như Candida spp., Cryptococcus neoformans., Aspergillus fumigatus., Penicillium
marneffei.,[18][35]. Gần đây một số thuốc kháng nấm mới đã tổng hợp và nghiên
cứu đưa vào sử dụng như voriconazol, caspofungin nhưng vẫn chưa đáp ứng nhu
cầu điều trị. Trước các vấn đề trên, việc tìm kháng sinh mới đã trở nên bức thiết.
Các hướng nghiên cứu chính để tìm ra kháng sinh mới thường từ tổng hợp hóa học,

bán tổng hợp, chiết xuất từ dược liệu và hiện nay các nhà nghiên cứu đang quan tâm
đến các vi sinh vật nội sinh trong mô của thực vật (được gọi là Endophyte), sản xuất
ra các chất biến dưỡng có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn để bảo vệ chính thực
vật đó và để ngăn chặn sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh cho cây. Vi sinh vật
nội sinh có hoạt tính sinh học rất đa dạng được xem là một nguồn dược liệu mới lạ
có giá trị [10][18].
Nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy các chất biến dưỡng của vi sinh vật nội sinh là
nguồn sản phẩm tự nhiên có tiềm năng và có thể được ứng dụng có hiệu quả trong y
Sàng lọc Endophyte thực vật có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn


HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Thảo

-2-

GVHD: TS. Nguyễn Đinh Nga

học, nông nghiệp và công nghiệp [18][35]. Lợi thế của vi sinh vật nội sinh là chúng
tạo ra chất kháng sinh và nhiều hợp chất biến dưỡng có tác dụng kháng nấm, kháng
khuẩn, chống lại tế bào ung thư, chữa bệnh ký sinh trùng, bệnh sốt rét, chống oxy
hóa trong bảo quản thực phẩm, làm thuốc giảm đau …. [10][18], nhưng lại thân
thiện với mơi trường, ít tác động xấu đến mơi trường hơn dùng chất hóa học.
Nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh thực vật sản xuất ra chất biến dưỡng có hoạt tính
kháng nấm và kháng khuẩn là một lĩnh vực còn mới ở Việt Nam. Trong các nghiên
cứu gần đây “Sàng lọc vi nấm nội sinh thực vật cho hoạt tính kháng Candida
albicans và Staphylococcus aureus” [8], đã sàng lọc một số vi nấm nội sinh từ các
cây thuốc như Tía tơ, Mã đề và một số cây thuốc khác cho hoạt tính kháng Candida
albicans và Methycillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) mạnh. Cùng với
hy vọng góp phần vào việc khai thác những lợi ích từ các chủng vi sinh vật nội sinh
từ nguồn thực vật và bảo vệ nguồn lợi thực vật nước nhà, chúng tôi mạnh dạn thực

hiện đề tài nghiên cứu: “Sàng lọc endophyte thực vật có hoạt tính kháng nấm và
kháng khuẩn” với mong muốn đạt được những mục tiêu:
Mục tiêu tổng quát: Sàng lọc endophyte thực vật sản xuất chất biến dưỡng có
hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn.
Mục tiêu chuyên biệt:
 Tiếp tục sàng lọc vi nấm sống nội sinh ở thực vật, có thể sản xuất chất biến
dưỡng kháng Candida albicans, Staphylococcus aureus và Staphylococcus aureus
kháng methicillin (MRSA).
 Mô tả đặc điểm các chủng vi nấm nội sinh cho chất biến dưỡng kháng vi sinh
vật làm cơ sở cho việc định danh.
 Khảo sát khả năng cộng hợp kháng Candida albicans giữa các chất biến
dưỡng do vi nấm nội sinh sản xuất và fluconazol.

 Tiếp tục nghiên cứu các vi nấm nội sinh đã phân lập từ cây Mã đề: MĐ-TR1
và MĐ-TR3.

Sàng lọc Endophyte thực vật có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn


HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Thảo

-3-

GVHD: TS. Nguyễn Đinh Nga

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1

KHÁI NIỆM VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH


Mô sâu của hầu hết tất cả các cây khỏe mạnh đều có nhiều vi sinh vật sống
cộng sinh được gọi là vi sinh vật nội sinh. Một số vi sinh vật nội sinh có thể sản
xuất ra những chất biến dưỡng thứ cấp để bảo vệ ký chủ do các chất này có thể
ức chế vi sinh vật gây bệnh cho cây, diệt côn trùng và sâu hại… [18][35].
1.1.1 Định nghĩa
Endophyte là những vi sinh vật sống ở mô sâu thực vật nhưng không gián tiếp
hoặc trực tiếp gây bất lợi cho cây [33].
1.1.2 Quan hệ giữa vi sinh vật nội sinh và thực vật
Giữa vi sinh vật nội sinh và thực vật có mối quan hệ cộng sinh hoặc tương sinh.
Đây là kiểu quan hệ khá mật thiết khi hai sinh vật sống chung với nhau, trong
mối quan hệ này có thể chỉ có lợi cho một bên, hoặc cả hai cùng có lợi. Thường
thì vi sinh vật nội sinh giúp bảo vệ cây chống lại một số yếu tố gây bất lợi cho
ký chủ như động vật ăn cỏ, côn trùng hay những mầm bệnh xâm nhập mơ
[18][33].
Hiện có rất nhiều chất chiết xuất từ cây có tác dụng điều trị một số bệnh. Một
vấn đề đặt ra ở đây là các chất có tác dụng trong cây là do chính cây sản xuất ra
hay là kết quả của mối liên hệ tương sinh với các vi sinh vật nội sinh có ích
trong mơ thực vật . Nhiều tài liệu cho thấy khi sống cộng sinh trong mô thực
vật, một loạt những tương tác phức tạp xảy ra giữa vi sinh vật nội sinh và cây
chủ để có thể tạo nên một số lượng lớn các chất chuyển hóa, điều này đem đến
những hứa hẹn trong việc khai thác. Vi sinh vật nội sinh làm nguồn cung cấp
những chất mới có hoạt tính sinh học [10][18].
Vi khuẩn và vi nấm là các vi sinh vật nội sinh thường gặp nhất. Tần số ly trích
được vi sinh vật nội sinh là vi nấm chiếm tỷ lệ cao hơn, vì vậy cơ hội tìm ra
chủng vi nấm mới từ cây là rất cao. Chúng được xem là nguồn cung cấp khá
nhiều chất mới trong đó bao gồm rất nhiều chất biến dưỡng có hoạt tính sin h
học đáng quan tâm. Những vi nấm trên được phát hiện một cách ngẫu nhiên ở
Sàng lọc Endophyte thực vật có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn



HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Thảo

-4-

GVHD: TS. Nguyễn Đinh Nga

trong mô sâu của những cây chủ sinh trưởng bình thường và ngày nay người ta
tìm thấy chúng ở hầu hết thực vật [18]. Theo nghiên cứu của Hawksworth và
Rossman có thể có đến 1 triệu lồi vi nấm khác nhau, nhưng chỉ khoảng
100.000 lồi đã được mơ tả [22].
1.1.3 Ngun tắc cơ bản để lựa chọn thực vật ly trích vi sinh vật nội sinh
Do số lượng các loài thực vật quá lớn, nên việc lựa chọn thực vật đưa vào ly
trích vi sinh vật nội sinh cần phải dựa trên các đối tượng cây có đặc điểm sinh
học cụ thể. Một số nguyên tắc cơ bản sau đây được áp dụng để chọn lọc thực
vật đưa vào ly trích vi sinh vật nội sinh [18][32].
1.1.3.1 Thực vật sống trong môi trƣờng sinh học bất thƣờng
Khi thực vật sống trong môi trường bất thường, các điều kiện tự nhiên khắc
nghiệt sẽ tạo cho cây có khả năng chịu đựng cao. Ví dụ, Rhyncholacis
penicillata là một loài thực vật sống dưới nước ở Southwest Venezuela, nơi mà
môi trường nước rất khắc nghiệt, cây luôn bị va đập bởi tác dụng nước cuốn,
mảnh vụn, đá sỏi…làm cho cây bị tổn thương. Từ đó các nấm gây bệnh thực
vật có thể xâm nhập, nhưng cây vẫn khỏe mạnh, vì cây được sự bảo vệ bởi các
vi sinh vật nội sinh có trong cây. Dựa vào đặc điểm sinh học này, chủng
Serratia marcescens được ly trích từ cây Rhyncholacis penicillata có khả năng
sản xuất ra oocydin A, một hợp chất kháng nấm mới [18][32].
1.1.3.2 Thực vật đƣợc sử dụng nhƣ dƣợc liệu dân tộc học
Một số loài thực vật đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, từ đời này
sang đời khác để chữa lành các vết thương, kháng nấm, kháng khuẩn…Ví dụ
như, Kennedia nigriscans, một loài cây leo ở Úc đã được dân gian sử dụng sáp
nhựa để trị vết thương, sát trùng. Từ cây này đã ly trích được chủng

Streptomyces sp. NRRL 30562 mới sản xuất kháng sinh munumbicins phổ rộng
[14][18].

Sàng lọc Endophyte thực vật có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn


HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Thảo

-5-

GVHD: TS. Nguyễn Đinh Nga

1.1.3.3 Thực vật có tính đặc thù
Các thực vật có tuổi thọ cao bất thường, phát triển trong các vùng có biến đổi sinh
học lớn, hay sống trong khu vực đất đai cổ xưa …cũng là những đối tượng nghiên
cứu rất lý tưởng để cung cấp các vi sinh vật nội sinh mới lạ [18][32].
1.1.4 Một số vi sinh vật nội sinh sản xuất các chất biến dƣỡng thứ cấp có
hoạt tính sinh học
Nhiều vi sinh vật sống nội sinh trong thực vật đã được ly trích, chúng có khả
năng sản xuất những chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học như kháng sinh
kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u, chống oxy hóa và các hoạt tính sinh
học khác [10][18].
1.1.4.1 Vi sinh vật nội sinh sản xuất kháng sinh [18]
- Cryptosporiopsis quercina được ly trích từ Tripterigeum wilfordii, vi nấm này
có thể sản xuất cryptocandin và cryptocin.
Cryptocandin kháng một số vi nấm gây bệnh cho người như Candida albicans,
Trichophyton spp. và nấm gây bệnh thực vật như Sclerotinia sclerotiorum và
Botrytis cinerea.
Cryptocin có tác dụng kháng Pyricularia oryzae và một số vi nấm gây bệnh
thực vật.

- Pseudomonas viridiflava thường có trong lá của nhiều loại cỏ. Vi khuẩn này
sản xuất ecomycin và pseudomycin.
Ecomycin có tác dụng kháng được nấm gây bệnh ở người như Cryptococcus
neoformans và Candida albicans.
Pseudomycin có tác dụng kháng được nhiều chủng vi nấm gây bệnh cho người
như Candida albicans, Cryptococcus neoformans và nhiều vi nấm gây bệnh
thực vật như Ceratocystis ulmi và Mycosphaerella fijensis. Chất này đang được
quan tâm nghiên cứu để sử dụng trong nông nghiệp.
- Pestalotiopsis microspra là vi sinh vật nội sinh thường gặp ở rừng mưa, sản
xuất nhiều chất có tác dụng sinh học. Một trong những chất này là acid
ambuic có tác động kháng nấm. Chất này được ly trích từ nhiều chủng
Sàng lọc Endophyte thực vật có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn


HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Thảo

-6-

GVHD: TS. Nguyễn Đinh Nga

Pestalotiopsis microspora và được cho là chất tượng trưng được sản xuất bởi vi
sinh vật nội sinh thực vật ở nhiều rừng mưa của thế giới.
- Ngoài ra, nhiều chủng nấm trong chi Pestalotiopsis đã được ly trích từ các
nguồn thực vật khác, các chủng nấm này có thể sản xuất các kháng sinh
kháng nấm .
Pestalotiopsis microspra được ly trích từ cây Torreya taxifolia, sản xuất ra
nhiều chất khác nhau như pestaloside, aromatic  glucoside, pestalopyrone và
hydroxypestalopyrone được sử dựng làm kháng sinh thực vật.
Pestalotiopsis jesteri được ly trích từ các cây mọc ở sông thuộc Papua New
Guinea, sản xuất ra chất jesterone và hợp chất hydroxyl-jesterone, có tác dụng

kháng nấm gây bệnh thực vật.
- Fusarium sp. là vi sinh vật nội sinh ly trích từ cây Selaginella pallescens,
được thu thập từ vùng Bảo vệ thực vật Guanacaste của Costa Rica, sản xuất
được một pentaketide mới là CR 337 cho tác dụng mạnh trên Candida
albicans.
- Colletotrichum gloeosporioides là loại vi nấm nội sinh trong cây Artemisia
mongolica sản xuất acid colletotric có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm
Helminthsporium sativum.
- Colletotrichum sp. được ly trích từ Artemisia annua sản xuất những chất biến
dưỡng kháng khuẩn, kháng vi nấm gây bệnh cho người và vi nấm gây bệnh cho
thực vật.
- Phomopsis sp. là vi sinh vật nội sinh sản xuất phomopsichalasin tiêu biểu cho
nhóm hợp chất đầu tiên loại cytochalasin, hợp chất này có tác động kháng
khuẩn với phổ tác động được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán qua đĩa
giấy ở bảng 1.1.

Sàng lọc Endophyte thực vật có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn


HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Thảo

-7-

GVHD: TS. Nguyễn Đinh Nga

Bảng 1.1. Tác động kháng sinh của phomopsichalasin [18]

Vi sinh vật
Bacillus subtilis


Đƣờng kính vịng kháng khuẩn (mm)
(4µg/đĩa giấy)
12

Salmonella enterica grallinarum 11
Staphylococcus aureus

8

Candida tropicalis

8

- Streptomyces sp. NRRL 30562 là vi sinh vật nội sinh ly trích từ cây Kennedia
nigriscans sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicins kháng vi khuẩn Gram
(+) như Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis đa kháng và một số vi
khuẩn kháng thuốc khác.
- Streptomyces sp. NRRL 30566 phát triển trong lá cây Grevillea pteridifolia
phát triển ở Úc, sản xuất kháng sinh kakadumicins A và echinomycin đều cho
tác động kháng Plasmodium falciparum với LD50 = 7- 10ng/ml.
- Muscodor albus là vi sinh vật nội sinh được ly trích từ cành của cây Quế
(Cinnamomum zeylanicum), vi nấm này sản xuất một số chất bay hơi có thể ức
chế vi khuẩn và vi nấm. Thành phần chính của những hợp chất này đã được xác
định cấu trúc hóa học bằng GC- MS (sắc ký khí ghép với khối phổ), từ đó được
tổng hợp hóa học. Các chất tổng hợp được có hiệu quả kháng khuẩn, kháng
nấm, khơng độc với người.
- Nodulisporium sp. được ly trích từ cây Bontia daphnoides sản xuất hợp chất
nodulisporic có hiệu lực trừ sâu, chống lại ấu trùng của ruồi xanh, nhặng.
- Muscodor vitigenus được ly trích từ cây dây leo Paullina paullinioides sản sinh ra
naphthalen có tác động trừ rệp.

1.1.4.2 Vi sinh vật nội sinh sản xuất kháng sinh kháng khối u [18]
Từ năm 1990 Taxomyces andreanae lần đầu tiên ly trích từ cây Taxus
brevifolia, vi nấm này sản xuất paclitaxel, là chất ức chế các thoi phân bào
Sàng lọc Endophyte thực vật có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn


HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Thảo

-8-

GVHD: TS. Nguyễn Đinh Nga

trong quá trình phân chia tế bào, có phổ khối tương tự như paclitaxel chiết xuất
từ cây thủy tùng (Taxus). Tiếp theo sau đó, một số vi sinh vật nội sinh sản xuất
paclitaxel đã được ly trích từ nhiều thực vật và các loài Taxus khác.
Bảng 1.2. Một số vi sinh vật nội sinh sản xuất paclitaxel [18]
STT Vi sinh vật nội sinh

Nguồn ly trích

1

Pestalotiopsis microspora

Taxus wallichiana

2

Pestalotiopsis guepini


Wollemia nobilis (cây quý hiếm)

3

Seimatoantlerium tepuiense

Maguireothamnus speciosus (họ càfê)

1.1.4.3 Vi sinh vật nội sinh sản xuất các chất có tác động sinh học khác [18]
Từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật nội sinh thực vật, một số chất có tác động
chống oxy hóa, làm hạ đường huyết, gây ức chế miễn dịch cũng đã được ly trích.
Pestalotriopsis microspora được ly trích từ cây Terminalia morobensis, chủng này
sản xuất ra những chất kháng sinh pestacin và isopestacin có tác dụng kháng khuẩn
và chống oxy hóa.
Pseudomasssaria sp. được ly trích ở rừng mưa Châu Phi, sản xuất ra chất
nonpeptidal (L- 783,281) có tác dụng làm giảm glucose huyết với cơ chế tương tự
insulin nhưng sử dụng qua đường uống.
Fusarium subglutinans được ly trích từ cây Tripterygium wilfordii, sản xuất ra
chất subglutinol A và subglutinol B có tác dụng làm giảm lympho bào B và T (ức
chế miễn dịch).

1.2

ĐỐI TƢỢNG THỬ HOẠT TÍNH

1.2.1 Candida albicans
Candida spp., được chú ý đến nhiều nhất là Candida albicans, sống hoại sinh ở cơ
thể người, sống thường trực ở cơ quan tiêu hóa hoặc được tìm thấy ở mơi trường
Sàng lọc Endophyte thực vật có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn