Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
**********************

VÕ MINH PHÁT

SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU VI SINH
BACILLUS THURINGIENSIS BẰNG
BÙN THẢI
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2010


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN HỮU PHÚC

Cán bộ chấm nhận xét 1: ...............................................................................

Cán bộ chấm nhận xét 2: ...............................................................................

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN
THẠC SĨ.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 09 tháng 08 năm 2010.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập - Tự do – Hạnh phúc
---oOo--Tp. HCM, ngày 30 tháng 7 năm 2010

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: VÕ MINH PHÁT

Giới tính : Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 24/08/1985

Nơi sinh : An Giang

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
MSHV: 03108140
1- TÊN ĐỀ TÀI: Sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis bằng bùn
thải
2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN
 Xác định một số thành phần hoá học của bùn thải ở nhà máy bia Tiger Việt Nam.
 Khảo sát sơ bộ sự phát triển của Bacillus thuringiensis (Bt) trên môi trường H de
Barjac và mơi trường bùn thải.
 Tối ưu hóa nồng độ bùn và bột bắp bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực
giao bậc hai, cấu trúc có tâm.
 Thử nghiệm lên men chủng vi khuẩn Bt trong fermenter phịng thí nghiệm.

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Tháng 1 năm 2010
4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Tháng 07 năm 2010
5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN HỮU PHÚC
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông
qua.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

TS. NGUYỄN HỮU PHÚC

KHOA QL CHUYÊN NGÀNH


i

LỜI CẢM ƠN
Con nguyện khắc ghi trong tim công ơn sinh thành và dưỡng dục của cha
mẹ. Cha mẹ là nguồn động lực thôi thúc con phấn đấu trong quá trình học. Con xin
cảm ơn tất cả những người thân trong gia đình đã hết lịng quan tâm, chăm sóc, luôn
bên cạnh ủng hộ và động viên con vững vàng hơn trên con đường học vấn.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Bách Khoa Tp. Hồ
Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Em xin được gởi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Hữu Phúc đã tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ em trong những lúc khó khăn. Thầy đã truyền đạt những kiến
thức và kinh nghiệm quý báu giúp em hoàn thành tốt luận văn này.
Em xin cảm ơn TS. Nguyễn Thúy Hương đã truyền đạt kiến thức cho em
trong những học kỳ vừa qua. Cô luôn quan tâm, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em
trong khoảng thời gian thực hiện luận văn.

Xin cảm ơn các bạn lớp Cao học khóa 2008 đã ln giúp đỡ, quan tâm và
chia sẻ những khó khăn trong suốt thời gian học tập và làm luận văn tốt nghiệp.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2010
VÕ MINH PHÁT


ii

SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU VI SINH
BACILLUS THURINGIENSIS BẰNG BÙN THẢI
TĨM TẮT
Việc sử dụng hóa chất tiêu diệt cơn trùng gây hại tuy hiệu quả nhưng vẫn còn
tồn tại nhiều hạn chế: ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái, tiêu diệt các sinh vật
không phải là mục tiêu và gây hại đến sức khỏe con người. Biện pháp đấu tranh
sinh học thông qua sử dụng các vi sinh vật có ích như vi khuẩn, virus và nấm có thể
giảm thiểu tối đa các nhược điểm đó. Trong đó, chế phẩm trừ sâu có nguồn gốc vi
khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) được sử dụng phổ biến nhất.
Sự phát sinh và loại bỏ bùn thải một cách an toàn và kinh tế là một vấn đề
nan giản trên thế giới. Nhiều báo cáo xác định trong bùn thải có chứa những hàm
lượng dinh dưỡng cần cho sự phát triển của vi sinh vật.
Mục tiêu của luận văn này là đánh giá khả năng sử dụng bùn thải từ nhà máy
bia Tiger làm cơ chất trong sản xuất thuốc trừ sâu Bt. Các kết quả thí nghiệm chỉ ra
rằng thành phần dinh dưỡng trong bùn thải này thích hợp cho sự tăng trưởng, sản
sinh bào tử và tinh thể độc tố của Bt. Để nâng cao khả năng tăng trưởng của Bt và
đạt được năng suất cao trong lên men, chúng tôi sử dụng phương pháp quy hoạch
thực nghiệm trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm để tối ưu hóa nồng độ bùn và nồng
độ bột bắp. Kết quả cho thấy nồng độ bùn và bộ bắp tối ưu lần lượt là 41.7 g/l và
8.5 g/l. Sau 62 giờ lên men trong hệ thống fermenter, số lượng bào tử thu được là
2x109 (CFU/ml)



iii

PRODUCTION OF BACILLUS THURINGIENSIS
BIOPESTICIDE USING WASTEWATER
SLUDGE
ABSTRACT
The use of chemicals is effective to control insects pests, however they
present some disadvantages: adverse effecting on ecological environment, killing
non-target organisms, causing human intoxication. The use of microorganisms such
as bacteria, virus, and fungi as biological control agents may minimize those
problems. Among other pesticides of biological origin, Bacillus thuringiensis (Bt) is
the most widely used biopesticide against variety of insects pests.
Economical and safe disposal of wastewater sludge is a worldwide problem.
Many reports show that most of the nutrients required for growth of
microorganisms are embeded in solids contained in wastewater sludge.
Thus, the objective of this thesis is evaluating the ability of using wastewater
sludge from Tiger Beer Factory as a new medium for the production of Bt
biopesticide. Results indicated that the nutrients contained in sludge were sufficient
for growth, sporulation and δ-endotoxin production of Bt. The central composite
design method was used to optimize the concentration of sludge and flour maize in
order to enhance growth rate and to achieve higher product yield in fermentation.
Our results showed that optimal concentration of sludge and flour maize in this
study were 41.7 g/l and 8.5 g/l, respectively. After 62 hours of fermentation in
fermenter, the concentration of spores was 2109 CFU/ml.


iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..........................................................................................................i
TÓM TẮT ...............................................................................................................ii
ABSTRACT...........................................................................................................iii
MỤC LỤC .............................................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................vii
DANH MỤC HÌNH .............................................................................................viii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ix
Chương 1. MỞ ĐẦU ...............................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.....................................................................................................1
1.2. Mục tiêu........................................................................................................2
1.3. Nội dung .......................................................................................................2
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................3
2.1. Vị trí và tác động của thuốc hóa học..............................................................3
2.1.1. Tác động có lợi.......................................................................................3
2.1.2. Tác động gây hại ....................................................................................3
2.2. Ưu và nhược điểm của thuốc trừ sâu vi sinh..................................................4
2.2.1. Ưu điểm..................................................................................................4
2.2.2. Nhược điểm............................................................................................5
2.3. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus thuringiensis ...............................................6
2.3.1. Lịch sử ra đời của Bt và chế phẩm Bt .....................................................6
2.3.2. Phân loại.................................................................................................8
2.3.3. Phân bố...................................................................................................8
2.3.4. Đặc điểm hình thái, sinh học...................................................................9
2.3.5. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa.................................................................... 11
2.3.6. Độc tố và cơ chế gây độc của Bt ........................................................... 12
2.3.6.1. Hình thái, cấu trúc tinh thể độc....................................................... 14
2.3.6.2. Bản chất hóa học của tinh thể độc .................................................. 15



v

2.3.6.3. Hoạt tính của tinh thể độc............................................................... 16
2.3.6.4. Cơ chế gây độc của tinh thể độc ..................................................... 16
2.3.6.5. Triệu chứng nhiễm Bt của sâu hại .................................................. 19
2.3.7. Sự phát tán của Bt................................................................................. 19
2.3.8. Ảnh hưởng của Bt đến môi trường và sinh vật không phải là mục tiêu.. 19
2.3.8.1. Ảnh hưởng của Bt đến sức khỏe con người .................................... 19
2.3.8.2. Ảnh hưởng của Bt đến các sinh vật không phải mục tiêu................ 21
2.3. Khái quát về bùn thải .................................................................................. 21
2.4. Các nghiên cứu trong và ngoài nước ........................................................... 22
2.4.1. Các nghiên cứu trong nước ................................................................... 22
2.4.2. Các nghiên cứu ngoài nước................................................................... 25
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 28
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu................................................................ 28
3.2. Nguyên vật liệu ........................................................................................... 28
3.2.1. Chủng vi sinh vật.................................................................................. 28
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................... 28
3.2.3. Hóa chất ............................................................................................... 28
3.2.4. Môi trường nuôi cấy ............................................................................. 29
3.2.5. Các nguyên liệu khác............................................................................ 30
3.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 31
3.3.1. Sơ đồ nghiên cứu .................................................................................. 31
3.3.2. Xác định thành phần của bùn thải dùng trong nghiên cứu ..................... 31
3.3.3. Khảo sát sự phát triển của Bt trên môi trường H de Barjac.................... 32
3.3.4. Phương pháp giữ giống và nhân giống.................................................. 33
3.3.4.1. Phương pháp giữ giống .................................................................. 33
3.3.4.2. Phương pháp nhân giống................................................................ 33
3.3.5. Khảo sát sơ bộ khả năng phát triển của Bt trên môi trường bùn thải...... 33
3.3.5.1. Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc........... 33

3.3.5.2. Xác định số lượng bào tử bằng phương pháp đếm khuẩn lạc .......... 34


vi

3.3.6. Tối ưu hóa nồng độ bùn và bột bắp bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm....................................................... 35
3.3.7. Thử nghiệm lên men chủng vi khuẩn Bt trong fermenter
phịng thí nghiệm ........................................................................................... 37
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................... 39
4.1. Xác định thành phần của bùn thải dùng trong nghiên cứu............................ 39
4.2. Khảo sát sơ bộ sự phát triển của Bt trên môi trường H de Barjac
và môi trường bùn thải....................................................................................... 43
4.2.1 Khảo sát đặc điểm phát triển của vi khuẩn Bt trên môi trường
H de Barjac .................................................................................................... 43
4.2.1.1. Quan sát vi thể ............................................................................... 43
4.2.1.2. Quan sát đại thể.............................................................................. 45
4.2.2. Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn Bt trên môi trường bùn thải ........... 46
4.3. Tối ưu hóa nồng độ bùn và bột bắp bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm .......................................................... 49
4.3.1. Quy hoạch thực nghiệm với hàm mục tiêu là số lượng tế bào ............... 49
4.3.2. Quy hoạch thực nghiệm với hàm mục tiêu là số lượng bào tử ............... 54
4.4. Thử nghiệm lên men chủng vi khuẩn Bt trong fermenter
phịng thí nghiệm ............................................................................................... 61
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................. 64
5.1. Kết luận ...................................................................................................... 64
5.2. Kiến nghị .................................................................................................... 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 66



vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Các đặc tính của Bacillus nhóm 1 .......................................................... 11
Bảng 2.2: Các nhóm tinh thể diệt cơn trùng ........................................................... 15
Bảng 3.1: Môi trường H de Barjac......................................................................... 29
Bảng 3.2: Dung dịch A .......................................................................................... 29
Bảng 3.3: Dung dịch B .......................................................................................... 29
Bảng 3.4: Các chỉ tiêu kiểm nghiệm của mẫu bùn thải........................................... 32
Bảng 3.5: Các mức tiến hành thí nghiệm ............................................................... 35
Bảng 3.6: Ma trận quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp trực giao
bậc hai, cấu trúc có tâm ......................................................................................... 36
Bảng 4.1: Thành phần của bùn thải từ nhà máy bia Tiger Việt Nam ...................... 41
Bảng 4.2: Thành phần hóa học của một số nguyên liệu
trong nuôi cấy vi sinh vật ...................................................................................... 42
Bảng 4.3: Số lượng tế bào vi khuẩn sau 72 giờ nuôi cấy ........................................ 46
Bảng 4.4: Ma trận quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp trực giao
bậc hai, cấu trúc có tâm và kết quả ........................................................................ 50
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ bùn và bột bắp đến số lượng tế bào ................. 51
Bảng 4.6: Ma trận quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp trực giao
bậc hai, cấu trúc có tâm và kết quả ........................................................................ 56
Bảng 4.7: Ảnh hưởng của nồng độ bùn và bột bắp đến số lượng bào tử ................. 57


viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Vi khuẩn Bacillus thuringiensis ............................................................. 10
Hình 2.2: Tinh thể độc của Bt................................................................................ 14
Hình 2.3: Cơ chế gây độc của tinh thể độc............................................................. 17

Hình 2.4: Cấu trúc 3D và các vùng chức năng của tinh thể Cry1A......................... 18
Hình 3.1: Bùn sau khi phơi khơ và nghiền mịn ...................................................... 30
Hình 3.2: Bột bắp vàng.......................................................................................... 30
Hình 3.3: Sơ đồ tiến trình nghiên cứu .................................................................... 31
Hình 3.4: Quy trình lên men thu nhận sinh khối Bt quy mô fermenter ................... 37
Hình 4.1: Bể phơi bùn ........................................................................................... 40
Hình 4.2: Nhuộm gram vi khuẩn Bt sau 24 giờ cấy và quan sát
dưới kính hiển vi phóng đại 1000 lần..................................................................... 44
Hình 4.3: Nhuộm gram vi khuẩn Bt sau 30 giờ cấy và quan sát
dưới kính hiển vi phóng đại 1000 lần..................................................................... 44
Hình 4.4: Bào tử và tinh thể độc dưới kính hiển vi phóng đại 1000 lần.................. 45
Hình 4.5: Khuẩn lạc của Bt.................................................................................... 45
Hình 4.6: Sự phát triển của Bt trên mơi trường bùn thải......................................... 47
Hình 4.7: Đồ thị đáp ứng bề mặt biểu diễn mối quan hệ của
x1 (nồng độ bùn), x2 (nồng độ bột bắp) và y (số lượng tế bào) ............................... 53
Hình 4.8: Đồ thị đường cong biểu diễn mối quan hệ của
x1 (nồng độ bùn), x2 (nồng độ bột bắp) và y (số lượng tế bào) ............................... 53
Hình 4.9: Nghiệm thức 1 và 2 trong thí nghiệm tối ưu hóa .................................... 55
Hình 4.10: Đồ thị đáp ứng bề mặt biểu diễn mối quan hệ của
x1 (nồng độ bùn), x2 (nồng độ bột bắp) và y (số lượng bào tử) ............................... 59
Hình 4.11: Đồ thị đường cong biểu diễn mối quan hệ của
x1 (nồng độ bùn), x2 (nồng độ bột bắp) và y (số lượng bào tử) ............................... 59
Hình 4.12: Lên men Bt bằng hệ thống fermenter tự động ...................................... 61
Hình 4.13: Sơ đồ lên men quy mơ fermenter phịng thí nghiệm ............................. 62


ix

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Bt: Bacillus thuringiensis

Btk: Bacillus thuringiensis kurstaki
CFU: Colony Forming Unit
Cry: Crystal protein =  endotoxin
Cyt: Cytolitic protein
KHKT: Khoa học kỹ thuật
NXB: Nhà xuất bản
STT: Số thứ tự
TN: Thí nghiệm
Tp. HCM: Thành phố Hồ Chí Minh


1

Chương 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sinh vật gây hại cây trồng là một vấn đề lớn mà con người gặp phải trong
sản xuất nông nghiệp bởi chúng gây thiệt hại nặng nề cho năng suất. Hằng năm, sản
lượng lương thực, rau quả trên thế giới bị mất do sâu bệnh vào khoảng 20 – 35 %.
Từ năm 1960, nhiều nước đã sử dụng các chất hóa học để diệt trừ sâu bệnh [12]. Việc
sử dụng phổ biến thuốc hóa học dẫn đến một loạt các hậu quả mà con người và
thiên nhiên phải gánh chịu: ô nhiễm môi trường, tiêu diệt các loài thiên địch, làm
mất cân bằng sinh thái trong tự nhiên, tạo nòi mới kháng thuốc ở côn trùng làm tăng
thêm mức độ tàn phá trên cây trồng, sự tồn dư lượng thuốc hóa học quá mức cho
phép trên nông sản gây hại nghiêm trọng đến sức khoẻ con người [22, 25].
Trước những mặt trái của thuốc hóa học, các chế phẩm vi sinh an tồn trong
phịng trừ sâu hại cây trồng dựa trên nền tảng khoa học đấu tranh sinh tồn giữa các
loài trong giới sinh vật được khuyến khích sử dụng. Những chế phẩm này khơng
ảnh hưởng đến con người, cũng như những lồi thiên địch bản xứ trong tự nhiên
như động vật ăn thịt, ký sinh và cơn trùng có ích. Sự bảo tồn các lồi thiên địch tự
nhiên là chìa khố vững chắc để phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng một cách an tồn

và hiệu quả

[2]

. Trong đó, thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus

thuringiensis (Bt) được dùng rộng rãi nhất và chưa có bằng chứng nào cho thấy Bt
tác động xấu đến môi trường và sức khỏe con người [53, 74]. Sự ra đời của thuốc trừ
sâu sinh học mà đi đầu là chế phẩm Bt như một biện pháp hữu hiệu để tạo ra sản
phẩm nông nghiệp khơng có dư lượng thuốc hóa học vì sức khỏe cộng đồng và cân
bằng môi trường sinh thái, hướng đến một nền nơng nghiệp bền vững.
Hiện nay, tình trạng ơ nhiễm mơi trường mà điển hình là sự phát sinh và loại
bỏ chất thải đô thị đang trở thành vấn đề nan giải ở nhiều quốc gia trên thế giới.
Cùng với q trình cơng nghiệp hóa, đơ thị hóa là sự gia tăng khơng ngừng của chất
thải. Vì thế, nghiên cứu những khía cạnh kinh tế liên quan đến quá trình thu gom,


2

tái chế và loại bỏ chất thải là một vấn đề cần thiết và cấp bách [36, 83, 84]. Để quản lý
chất thải một cách hiệu quả theo hướng phát triển môi trường bền vững, tránh cho
môi trường phải tiếp nhận nhiều chất thải, các nhà khoa học đã nghĩ đến việc
chuyển hóa, sử dụng chất thải một cách hữu ích [86].
Nhiều kết quả nghiên cứu đã xác định có sự hiện diện của Bt trong bùn thải
và bùn thải này chứa những thành phần dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của
Bt

[46, 83, 84]

. Việc sử dụng bùn thải làm cơ chất trong sản xuất chế phẩm Bt khơng


những mang lợi ích kinh tế mà cịn mang cả lợi ích về sinh thái bởi nó góp phần
giảm chi phí sản xuất, hạn chế lượng bùn thải ra mơi trường và các chế phẩm bảo vệ
cây trồng này an tồn đối với mơi trường sinh thái và con người. Ngoài ra, các
nghiên cứu gần đây cho thấy sử dụng bùn thải làm cơ chất có hiệu quả hơn nhiều so
với các cơ chất khác khi lên men thu nhận Bt bởi lượng bào tử và tinh thể độc tạo ra
nhiều hơn. Có thể nói đây là cơ chất tiềm năng cho việc lên men thu nhận sinh khối
Bt

[40, 65, 76].

Mặt khác, ở Việt Nam chưa có cơng bố nào về việc sử dụng bùn thải

làm cơ chất để nuôi cấy Bacillus thuringiensis. Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài
“Sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis bằng bùn thải”.
1.2. Mục tiêu
Đánh giá khả năng sử dụng bùn thải của nhà máy bia Tiger Việt Nam làm cơ
chất trong sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis.
1.3. Nội dung
- Xác định một số thành phần hoá học của bùn thải ở nhà máy bia Tiger Việt
Nam.
- Khảo sát sơ bộ sự phát triển của Bt trên môi trường H de Barjac và môi
trường bùn thải.
- Tối ưu hóa nồng độ bùn và bột bắp bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm.
- Thử nghiệm lên men chủng vi khuẩn Bt trong fermenter phịng thí nghiệm.


3


Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vị trí và tác động của thuốc hóa học
Theo Hà Huy Niên (2005) và Lê Lương Tề (2005) thì thuốc hóa học, do có
những ưu điểm đặc biệt, vẫn cịn giữ một vị trí trong việc bảo vệ cây trồng. Nhưng
thuốc hóa học cũng có những nhược điểm lớn chưa thể khắc phục được [17, 21].
2.1.1. Tác động có lợi
Phẩm chất và năng suất cây trồng có thể tăng lên do thuốc diệt được dịch hại
mà chúng cịn kích thích cây sinh trưởng và phát triển tốt; tăng tỉ lệ nảy mầm và sức
nảy mầm của hạt; cải thiện sự phát triển của bộ rễ; tăng chiều cao, số nhánh, số
bông, trọng lượng hạt, củ, quả; tăng hàm lượng chất dinh dưỡng; cải thiện mẫu mã
sản phẩm. Một số thuốc có khả năng kích thích sự hút dinh dưỡng cho cây hoặc kích
hoạt vi sinh vật trong đất, cải tạo tính lý hóa của đất [17, 21].
2.1.2. Tác động gây hại
Đi cùng với những ưu điểm đó, thuốc hóa học cũng để lại nhiều hậu quả vô
cùng nghiêm trọng đối với môi trường sinh thái, nhất là khi sử dụng nhiều lần với
nồng độ cao [17, 21].
Làm giảm tỉ lệ nẩy mầm, sức nẩy mầm của hạt, rễ xoăn lại, cây cịi cọc thậm
chí bị chết. Lá có thể bị cháy khi nhiễm thuốc, gây vết đốm, lá bị héo vàng rồi lụi đi;
lá bị rách hoặc bạc trắng; lá dị hình, khảm, cong queo. Hoa bị cháy, rụng quả nhỏ,
biến đổi màu, chín muộn, rối loạn sự phân chia tế bào, phá diệp lục tố, ức chế quang
hợp, làm giảm khả năng chống chịu của cây đối với điều kiện thời tiết bất lợi.
Kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật, kìm hãm q trình khống hóa trong
đất, lượng chất dinh dưỡng giảm, cây sinh trưởng kém
Theo Lưu Hồng Mẫn, ảnh hưởng của những hóa chất độc hại đến hoạt động
của hệ vi sinh vật đất được ghi nhận như sau:


4

- Ảnh hưởng trực tiếp đến quần thể vi khuẩn cố định đạm (Azotobacter,

Rhizobium), quần thể vi sinh vật phân giải cellulose và quần thể vi sinh vật tham gia
quá trình hịa tan lân cố định trong đất.
- Giảm sự kết hợp cộng sinh của nấm Mycorrhiza quanh hệ thống rễ cây
trồng.
- Thay đổi sự cân bằng đạm trong đất do ức chế sự tăng trưởng và hoạt động
của nhóm vi khuẩn tham gia vào q trình nitrat hóa (Nitrosomonas, Nitrobacter).
- Ức chế q trình amon hóa do ức chế quần thể vi khuẩn: Sporosarcia urea,
Proteus vulgaris, Bacterium pasteurii.
Làm giảm rõ rệt tính đa dạng của các quần thể có ích, mất cân bằng sinh thái
và tái phát dịch hại, thậm chí xuất hiện những lồi dịch hại mới do quần thể sâu hại
ban đầu có khả năng chống chịu với thuốc và không bị khống chế bởi thiên địch. Sự
tồn lưu hóa chất lâu dài trong mơi trường tác hại không nhỏ đến sức khỏe con
người. Kết quả nghiên cứu trên một nhóm nơng dân của các nhà khoa học trường
đại học Patilia ở Ấn Độ cho thấy thuốc trừ sâu có thể gây hại tế bào di truyền của
người tiếp xúc với thuốc và họ sẽ dễ mắc bệnh ung thư. Đó là nguyên nhân dẫn đến
tỷ lệ ung thư cao ở nông dân.
Việc phát triển loại thuốc bảo vệ thực vật mới trở thành một nhu cầu cấp
thiết. Xuất phát từ những lý do đó, các chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi sinh
vật ra đời, thay thế dần các loại thuốc hóa học.
2.2. Ưu và nhược điểm của thuốc trừ sâu vi sinh
2.2.1. Ưu điểm
- Không gây độc hại cho người, động vật, cây trồng. Không ảnh hưởng xấu
đến chất lượng nông sản, sự phát triển của hệ vi sinh vật quanh hệ thống rễ cây
trồng. Không phá vỡ cân bằng sinh thái và không gây ô nhiễm môi trường.
- Tiêu diệt một cách chọn lọc các loại sâu bệnh.


5

- Khi phun ra ngồi thiên nhiên thì các vi sinh vật trong chế phẩm có khả

năng thích nghi cao, tham gia vào hoạt động đấu tranh sinh học một cách tích cực.
- Các vi sinh vật có thể nhiễm lên côn trùng bằng nhiều cách khác nhau: con
đường tiêu hóa, qua da… Điều này tăng cường khả năng nhiễm của vi sinh vật vào
côn trùng.
- Các vi sinh vật diệt cơn trùng có thể tồn tại trong điều kiện mơi trường
khơng thuận lợi (khơng vật chủ, điều kiện khí hậu khắc nghiệt…) ở nhiều dạng khác
nhau: bào tử (vi khuẩn thuộc giống Bacillus), dạng hạch nấm hay giả hạch nấm
(giống nấm Beauveria, Metarrhizium)
- Hiệu quả thuốc thường kéo dài vì chúng khơng chỉ tiêu diệt trực tiếp lứa
sâu đang phá hoại mà còn lan truyền đến thế hệ sâu tiếp theo.
- Khả năng phát tán rộng trong tự nhiên của các giống vi sinh vật có ý nghĩa
lớn trong viêc tăng cường lây lan tạo thành dịch bệnh ở cơn trùng. Một số nấm có
khả năng bắn bào tử của nó tới một nơi có khoảng cách gấp ngàn lần so với kích
thước của bào tử. Một số nấm, vi khuẩn, virus có thể lan truyền rộng nhờ dịng
khơng khí, nước mưa và cơn trùng.
Với những đặc điểm trên, các vi sinh vật diệt cơn trùng có thể xuất hiện bất
ngờ, tốc độ lây lan nhanh, mang tính chất một ổ bệnh, dẫn đến giết chết côn trùng
trên diện rộng giúp bảo vệ cây trồng hiệu quả [22, 25].
2.2.2. Nhược điểm
- Phổ tác dụng hẹp.
- Một vài thuốc bị ảnh hưởng bởi điều kiện thời tiết. Nếu phun không đúng
kỹ thuật thì khơng có hiệu quả.
- Tác động chậm do khi vào cơ thể sâu thì phải mất thời gian ủ bệnh.
- Giá thành còn cao [22, 25].


6

2.3. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus thuringiensis
2.3.1. Lịch sử ra đời của Bt và chế phẩm Bt [55, 65, 95, 96]

Trong số rất nhiều lồi vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho cơn trùng thì
Bacillus thuringiensis (thường gọi tắt là Bt) là loài chủ yếu, thường được sử dụng để
tạo chế phẩm sinh học diệt cơn trùng có hại. Có đến trên 300 chủng Bt khác nhau đã
được xác định.
Bt được biết đến lần đầu vào năm 1901 bởi Ishiwata Shigetane, một nhà sinh
vật học người Nhật khi ông đang thực hiện một nghiên cứu tìm hiểu nguyên nhân
gây bệnh Sotto, giết chết rất nhiều quần thể tằm lúc bấy giờ. Ông đã xác định được
một vi khuẩn (Bt ngày nay) chính là nguyên nhân của bệnh và đặt tên là Bacillus
sotto.
Đến năm 1911, Ernst Berliner, khoa học gia người Đức phân lập được vi
khuẩn giết chết một loại sâu xám ở Địa Trung Hải (Mediterranean flour moth) và
phát hiện đây cũng là loại vi khuẩn do Ishiwata Shigetane đã phân lập được cách
đây mười năm. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus thuringiensis phỏng theo địa
danh của thị trấn Thuringia ở Đức, nơi tìm thấy loại sâu bị nhiễm Bt.
Năm 1915, Ernst Berliner đưa ra một báo cáo về sự tồn tại của một tinh thể
độc tố protein do Bt sản sinh ra. Tuy nhiên cơ chế tác động của tinh thể độc này
chưa được quan tâm và mãi rất lâu sau đó, người ta mới bắt đầu nghiên cứu rõ hơn
về nó.
Năm 1920, những người nông dân ở một số quốc gia bắt đầu sử dụng Bt như
là một loại thuốc bảo vệ thực vật.
Năm 1938, nước Pháp đã sớm thương mại hóa thuốc trừ sâu từ bào tử của Bt
gọi là Sporine (Sporeine). Bắt đầu từ đó, nhiều chế phẩm Bt được sản xuất nhưng
vẫn còn tồn tại những hạn chế chẳng hạn như đặc tính dễ bị rửa trơi khi trời mưa của
sản phẩm dạng lỏng, giảm tác dụng dưới tia UV. Thêm vào đó, thuốc chỉ hiệu quả
đối với một số lồi sâu hại ở độ tuổi nhất định. Các lồi cơn trùng ẩn trong cây hoặc


7

dưới đất vẫn có thể sống sót do hạn chế về khả năng tiếp xúc. Lúc bấy giờ, các nòi

Bt được biết chỉ gây độc đối với các côn trùng thuộc bộ cánh vảy. Do đó, các chế
phẩm Bt vẫn chưa được sử dụng rộng rãi.
Năm 1942, Edward Steinhaus bắt đầu chú ý đến tiềm năng của Bt trong bảo
vệ thực vật sau một quá trình nghiên cứu.
Năm 1956, Hannay, Fitz-James và Angus phát hiện tinh thể độc protein do Bt
sinh ra giữ vai trò quan trọng trong khả năng trừ sâu. Khám phá này thu hút nhiều
nhà nghiên cứu quan tâm tìm hiểu sâu hơn về cấu trúc, cơ chế hoạt động của tinh thể
độc. Từ đó đã mở ra nhiều hướng nghiên cứu về Bt.
Năm 1958, thuốc trừ sâu vi sinh có nguồn gốc từ Bt được sử dụng rộng rãi ở
Mỹ. Năm 1961, chế phẩm Bt được đăng ký như một loại thuốc trừ sâu an toàn với tổ
chức EPA (Environmental Protection Agency).
Đến năm 1977, đã có 13 giống Bt được tìm thấy và mơ tả. Tất cả các giống
Bt này chỉ gây độc đối với ấu trùng của côn trùng bộ cánh vảy. Cũng trong thời gian
này, những lồi phụ gây độc cho bộ cơn trùng hai cánh được phát hiện. Và đến năm
1983, các nhà khoa học tiếp tục tìm được lồi phụ gây độc cho bộ côn trùng cánh
cứng.
Vào những năm 80, việc sử dụng chế phẩm Bt trở nên phổ biến rộng rãi khi
các loài sâu hại tăng khả năng kháng thuốc và thuốc hóa học đang dần hủy hoại mơi
trường sinh thái. Những protein tạo ra bởi Bt có độc tính cao đối với một số cơn
trùng gây hại nhưng ít hoặc không độc đối với môi trường, động vật và hầu hết
những cơn trùng có ích. So với thuốc hóa học, thuốc trừ sâu có nguồn gốc Bt khơng
độc với mơi trường và có thể phối hợp với biện pháp sinh học. Vì thế, Bt trở thành
một phần khơng thể thiếu trong chiến lược phát triển nông nghiệp bền vững. Do đó,
các quốc gia bắt đầu đầu tư mạnh mẽ cho các nghiên cứu về Bt.
Novartis (nay là Syngenta), Ecogen, Abbott, Arbico, Becker Microbial,
Gilmore, Shionogi là các hãng phát triển chủ yếu các thuốc Bt. Từ giữa thập kỷ 70


8


thuốc trừ sâu Bt mới trở thành phổ biến với các tên thuốc thương mại Thuricide,
Bactucide, Biobit, Delfin, Xentari...
Bt hiện nay là một loại thuốc trừ sâu vi sinh được sử dụng rộng rãi nhất.
Năm 1995, tổng doanh số của thuốc có nguồn gốc Bt được tính tốn vào khoảng 90
triệu USD, chiếm khoảng 2 % của thị trường thuốc trừ sâu thế giới. Vào đầu năm
1998, đã có gần 200 sản phẩm thuốc trừ sâu Bt được đăng ký ở Mỹ.
Trong nhiều chủng Bt đã phát hiện ra, nhiều nước trên thế giới đã chọn các
chủng phù hợp để sử dụng vào sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh Bt dạng thương mại.
Mỗi chủng Bt có ký hiệu protein độc tố riêng , và căn cứ vào các protein đó, các nhà
khoa học nhận biết được chủng Bt có khả năng diệt được sâu gì ở họ và bộ nào, trên
cây trồng gì, ở đâu.
2.3.2. Phân loại
Vi khuẩn Bacillus thuringiensis thuộc:
- Lớp Shyzomycetes
- Bộ Eubacteriales
- Họ Bacillaceae
- Giống Bacillus
- Lồi Bacillus thuringiensis [6]
Bt thuộc Bacillus nhóm 1, cùng họ với Bacillus cereus, một loại trực khuẩn
gây ngộ độc thực phẩm ở người do tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin
gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa; Bacillus anthracis gây bệnh than ở
người [23].
2.3.3. Phân bố
Bt có khả năng sinh trưởng trong mơi trường đất ẩm, ký sinh trong đường
ruột các loài ấu trùng của nhiều côn trùng, đặc biệt là các côn trùng gây hại cho cây
trồng như sâu tơ, sâu đục quả, sâu cuốn lá... [50, 55].


9


Một số lượng lớn các loài Bt đã được phân lập từ bệnh phẩm côn trùng, chủ
yếu là các bộ cánh cứng, bộ hai cánh, bộ cánh vẩy và các chủng này đều chứa độc tố
diệt sâu hiệu quả cao. Khi các cơn trùng nhiễm Bt này chết thì bào tử và tinh thể độc
của Bt sẽ được phóng thích ra ngồi mơi trường [30, 31, 52].
Trong đất và khơng khí, Bt tồn tại ở dạng bào tử và sống khá bền vững. Quá
trình phát triển sẽ xảy ra khi môi trường thuận lợi và bào tử được cung cấp đầy đủ
chất dinh dưỡng [27, 56, 66, 82].
Nhiều chủng Bt đã được khám phá và nghiên cứu ở nhiều nước, điển hỉnh
như: Bt israelensis (Bti) ở Israel, Btk ở Pháp, Bt kenyae ở Kenya, Bt-HD1 ở Mỹ, Bt
canadensis ở Canada... De Lucca và cộng sự (1981) nhận thấy rằng Bt chiếm từ
0.005 % đến 0.5 % trong số các loài Bacillus được phân lập từ các mẫu đất ở Mỹ
[43]

. Trong 1115 mẫu đất thu thập được, Meadows (1993) đã phân lập được các

chủng Bt từ 785 mẫu đất [68]. Như vậy, 56 % mẫu đất từ New Zealand có sự tồn tại
của Bt và 94 % mẫu đất từ châu Á, trung và nam Phi có sự hiện diện của Bt. Ohba
và Aizawa (1986) cũng phân lập được Bt từ các mẫu đất ở Nhật [71].
Điều này chứng tỏ Bt phân bố ở khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là những nơi
có sự hiện diện của các lồi sâu hại cây trồng [55].
2.3.4. Đặc điểm hình thái, sinh học [12, 22, 25]
Bt là trực khuẩn gram dương, sinh bào tử, hiếu khí
Kích thước tương đối lớn so với các lồi vi khuẩn khác: 3-6 x 0.8-1.3 µm.
Có tiên mao mọc khắp cơ thể, tiên mao dài khoảng 6-8 µm.
Thường đứng riêng lẻ hay tạo thành chuỗi.
Khi tế bào trưởng thành thường xuất hiện một bào tử (kích thước 1-1.8 x 0.80.9 µm) hình trứng và một tinh thể độc có bản chất protein.
Q trình sống có thể chia thành 3 giai đoạn:
- Thể sinh dưỡng.



10

- Nang bào tử
- Bào tử và tinh thể

Hình 2.1: Vi khuẩn Bacillus thuringiensis [94]
(1) Thể sinh dưỡng: dạng que, hai đầu tù, kích thước 1.2 – 1.8 µm x 3 – 5
µm. Lơng xung quanh hơi động hoặc khơng động. Chúng thường tồn tại một cá thể
hay 2 cá thể liền nhau. Trong thời kỳ sinh sản thường có 2, 4, 8 thể sinh dưỡng dính
liền nhau thành chuỗi. Lúc này vi khuẩn sinh trưởng nhanh, trao đổi chất nhiều.
(2) Nang bào tử: Khi cá thể vi khuẩn già, một đầu nào đó trong cơ thể hình
thành bào tử hình bầu dục, cịn đầu kia hình thành tinh thể hình thoi.
(3) Bào tử và tinh thể: Khi nang bào tử phát triển đến một giai đoạn nào đó,
chúng sẽ nứt ra, giải phóng bào tử và tinh thể. Kích thước bào tử 0.8 – 0.9 µm x 2


11

µm. Bào tử dạng ngủ có thể đề kháng với các điều kiện mơi trường bất lợi. Tinh thể
thường có kích thước thay đổi, khoảng 0.6 µm x 2 µm; hình thoi, cũng có loại hình
trịn, hình bầu dục tùy loài. Tinh thể là một protein, là chất diệt sâu có hiệu quả.
2.3.5. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Bảng 2.1: Các đặc tính của Bacillus nhóm 1 [23]
Lồi
Đặc tính

B.
thuringiensis

B.

cereus

B.
mycoides

B.
anthracis

B.
megaterium

Gram

+

+

+

+

+

Catalase

+

+

+


+

+

Di động

+/-

+/-

-

-

+/-

Khử nitrate

+

+

+

+

-

Phân hủy

tyrosine

+

+

+/-

-

+/-

Kháng lysozyme

+

+

+

+

-

+

+

+


+

-

Lên men glucose

+

+

+

+

-

Phản ứng VP

+

+

+

+

-

-


-

-

-

+

+

+

+

-

-

Phản ứng với
lòng đỏ trứng

Sinh acid từ
mannitol
Tan máu (máu
cừu)


12

Bt có nhu cầu dinh dưỡng khơng cao. Chất dinh dưỡng chủ yếu là protein

động thực vật, có thể phát triển bình thường trong nhiều nguồn nitơ, cacbon và
muối vơ cơ [22, 25].
- Nguồn cacbon thường dùng là tinh bột, maltose, glucose.
- Nguồn nitơ là nitơ hữu cơ cao như thịt bò, peptone, bột men, bột bánh đậu,
bột cá.
- Muối vơ cơ thường dùng là K2HPO4, MgSO4, CaCO3.
Bt có thể sinh trưởng trong điều kiện nhiệt độ 12-40 0C, nhiệt độ thích hợp là
27-32 0C. Ở 35-40 0C, chúng sinh trưởng nhanh nhưng chóng lão hóa. Nhiệt độ thấp
thì chúng sinh trưởng rất chậm.
Phát triển với điều kiện kiềm và pH thích hợp là 7.5. Ở pH 8.5 vẫn có thể
hình thành bào tử nhưng ở pH 5 thì khơng hình thành bào tử.
Nếu mơi trường dinh dưỡng khơng đủ oxy thì bào tử hình thành chậm hoặc
khơng hình thành bào tử.
Phản ứng sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn Bt làm ngưng kết sữa, trong đường
glucose, fructose, glycerol, tinh bột, maltose, hình thành acid, khơng hình thành
indol, phản ứng VP dương (ethiryl methyl methanol), có tác dụng hịa tan trong mơi
trường huyết ngựa agar, có thể mọc trong mơi trường muối xianat, khử muối nitrate
thành muối nitrit, không khử muối sulphat, sản sinh ra enzyme phospholipase,
không xuất hiện hạt màu đỏ.
2.3.6. Độc tố và cơ chế gây độc của Bt
Bt gây bệnh cho côn trùng qua con đường tiêu hóa. Yếu tố chính làm cho
cơn trùng chết nhanh chóng là chất độc do Bt sinh ra. Bt sinh ra hai loại độc tố
chính [12, 22, 25]:
(1) Chất độc phân giải tế bào (Cyt) tác động riêng rẽ và tổ hợp cùng tinh thể
độc làm tăng tác dụng của tinh thể độc.


13

- Ngoại độc tố alpha (α exotoxin) là một loại enzyme phospholipase, gọi là

leucitinase C hay phospholipase C, được tiết ra trước khi bào tử và tinh thể độc
được hình thành, gây phân hủy mô trong cơ thể côn trùng. Độc tố này đầu tiên liên
kết với tế bào, sau đó được tách ra và bị hoạt hóa bởi chất khơng bền nhiệt, có trọng
lượng phân tử thấp.
- Ngoại độc tố beta (β exotoxin) được nghiên cứu kỹ nhất, có trọng lượng
phân tử 707-850 đvC, là ngoại độ tố bền nhiệt, ở 120 0C sau 15 phút vẫn cịn hoạt
tính độc, bền ở áp suất khá cao khi khử trùng, được tạo ra trước khi tinh thể độc
được hình thành, có cấu trúc tương tự như ATP, tác dụng cạnh tranh với ATP, ức
chế hoạt động của RNA polymerase, cản trở sự tổng hợp mRNA [24]. Trong phân tử
có chứa adenin-phosphate-ribose, glucose và acid allomunic. Nó cùng với tinh thể
độc xâm nhập vào huyết tương côn trùng, đến các cơ quan làm tăng tính độc. Hiệu
quả thể hiện rõ trên sâu non, làm ngăn quá trình lột xác hay gây ra dị thường trong
quá trinh phát triển. Tác động của độc tố này phụ thuộc liều lượng sử dụng và cách
thức gây độc, gây độc qua tiêm cho hiệu quả mạnh hơn qua đường tiêu hóa. Ở vi
khuẩn Bt có một số type huyết thanh là H1, H4a, H4c, H5, H8, H9 và H10 có khả năng
sinh ngoại độc tố beta [22].
- Ngoại độc tố gamma (γ exotoxin) có phân tử khối lớn hơn 30000 đvC, cũng
là một loại phospholipase, tác động lên phospholipid, làm phá hủy mô tế bào.
(2) Chất độc tinh thể (Cry) còn gọi là nội độc tổ delta (δ endotoxin) được mã
hóa bởi các gen cry khác nhau (một trong những dấu hiệu dùng để phân loại Bt)
So với 3 nhóm ngoại độc tố trên thì tinh thể độc Cry được tạo ra với lượng
lớn hơn nhiều và có hiệu quả gây độc chính cho cơn trùng.