Đại Học Quốc Gia Tp . Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

ĐỖ TRẦN NGOAN

NGHIÊN CỨU TỔNG HP PROTEASE KIỀM TÍNH
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN
BỞI TẾ BÀO VI KHUẨN Bac.subtilis CỐ ĐỊNH

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số : 604280

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP.HỒ CHÍ MINH ,tháng 7 năm 2007


CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
------------------------------------

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯNG

Cán bộ chấm nhận xét 1

:

Cán bộ chấm nhận xét 2

:

Luận văn thạc só được bảo vệ tại:
HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Ngày

Tháng

Năm 2007


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH

ĐỘC LẬP- TỰ DO -HẠNH PHÚC

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 06 năm 2007

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Học và tên học viên : ĐỖ TRẦN NGOAN

Phái :Nam

Ngày tháng năm sinh : 03 -03 - 1980

Nơi sinh : Quảng Nam


Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học

MSHV : 03105628

I - ĐỀ TÀI :
NGHIÊN CỨU TỔNG HP PROTEASE KIỀM TÍNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP
LÊN MEN BỞI TẾ BÀO VI KHUẨN Bac.subtilis CỐ ĐỊNH.

II - NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG : Nghiên cứu tổng hợp enzyme protease kiềm tính
bằng phương pháp lên men tế bào vi khuẩn Bac.subtilis cố định .
+ Bước đầu khảo sát hiệu suất cố định tế bào vi khuẩn Bac.subtilis trên một số chất
mang thông dụng .
+ Chọn chất mang - Tối ưu hóa điều kiện cố định tế bào vi khuẩn Bac.subtilis trên
chất mang đã chọn .
+ Tiến hành lên men thu nhận enzyme protease kiềm tính bằng cả 2 phương pháp :
Lên men bởi tế bào vi khuẩn cố định và lên men tế bào vi khuẩn ở dạng tự do.
+ Khảo sát khả năng tái sử dụng tế bào vi khuẩn ở dạng cố định .
III – NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 12/2006
IV – NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 7/2007
V – HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯNG


CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM NGÀNH

BỘ MÔN QUẢN LÍ CHUYÊN NGÀNH

Nội dung và đề cương luận văn thạc só đã được Hội đồng Chuyên ngành thông qua.

Ngày

PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH

tháng

năm 2007

CHỦ NHIỆM NGÀNH


NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------


NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ CHẤM 1
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------


NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ CHẤM 2
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------


LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường Đại Học Bách Khoa Thành
Phố Hồ Chí Minh , nhất là trong giai đoạn thực hiện đề tài tốt nghiệp, tôi đã nhận được
sự giúp đỡ rất tận tình từ phía nhà Trường, Bộ môn, Quý Thầy Cô giáo và tất cả các
bạn bè trong lớp CHCNSH – 05 .
Xin chân thành biết ơn :

Bộ môn Công Nghệ Sinh học đã tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và thực hiện đề tài
nghiên cứu này .
Xin chân thành biết ơn :
Thầy Nguyễn Đức Lượng, Cô Đồng Thị Thanh Thu, Cô Nguyễn Thuý Hương, Cô
Nguyễn Thị Thuỳ Dương đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em thực hiện luận văn.
Cảm ơn sự giúp đỡ, góp ý chân thành của tất cả bạn bè trong hơn 2 năm học
tập và nghiên cứu.
Chắc chắn không thể tránh khỏi những thiếu sót trong quá trình thực hiện đề
tài,tôi xin chân thành ghi nhận sự đóng góp quý báo của tất cả quý thầy cô và bè bạn.

Học Viên : Đỗ Traàn Ngoan


TÓM TẮT
Trong đề tài này tôi tập trung nghiên cứu hiệu suất cố định tế bào trên 2 loại
chất mang polymer sinh học là Alginate 3% xúc tác Ca2+ 2% và Chitosan xúc tác
glutaraldehyde.Tiến hành cố định tế bào theo 2 phương pháp : Nhốt tế bào vi khuẩn
Bac.subtilis trong gel Alginate 3% và hấp phụ tế bào vi khuẩn Bac.subtilis trên
Chitosan. Kết quả, chúng tôi chọn phương pháp : Nhốt tế bào vi khuẩn Bac.subtilis
trong gel Alginate 3% với hiệu suất gắn đạt được là 78,7%.
Tiến hành nuôi cấy để thu nhận enzyme protease kiềm bằng 2 phương pháp :
-

Lên men tế bào ở dạng cố định (1)

-

Lên men tế bào ở dạng tự do (2)
Kết quả : Ở PP1 : Hoạt độ protease kiềm đạt cực đại bằng 8,55UI/ml.h sau 36h
nuôi cấy, pH = 9,56.

Ở PP2 :Hoạt độ protease kiềm đạt cực đại bằng : 8,02UI/ml.h sau 48
h nuôi cấy, pH = 9.63.
Khả năng tái sử dụng của tế bào vi khuẩn Bac.subtilis cố định trong
gel alginate 3% là từ 4 đến 6 chu kỳ, hoạt độ protease kiềm tính thu được cuối
chu kỳ nuôi thứ 6 đạt 4,08UI/ml.h. Giảm còn 47,7 % so với chu kỳ đầu .


SUMMARY
In this study, I concentrate to research the capacity to fix cells on two kinds of
biological polymer such as Alginate (3%) in Ca2+ 2% solution and Chitosan with
glutaraldehyt as catalysis components. Experiences are followed two methods:
entrapment Bac. subtilis cells in the Alginat gel (3%) and adsorb Bac. subtilis cells on
the Chitosan surface.
As a result, I chose the entrapment method Bac. subtilis cells in the Alginate gel
(3%) with fix productivity is 78.7%.
Make the culture to receive alkaline protease by 2 methods:
• Fix fermentation (1)
• Free fermentation (2)
Results:
In the fix fermentation, max activity of alkaline protease is 8.55UI/ml.h after
36 hours culture in pH = 9.56
In the free fermentation, max activity of alkaline protease is 8.02 UI/ml.h
after 48 hours culture in pH = 9.63
Recycle capacity of Bac. subtilis cells is from 4 to 6 cycles, the activity of
alkaline protease in 6th cycle is 4.08UI/ml.h –decreasing 47.7% in comparison with the
first cycle.


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

Bảng 2.1 Nguồn gốc và thành phần một số loại alginate ..................................... 29
Bảng 2.2 Kó thuật cố định tế bào lên Ca- alginate theo phương pháp bẫy ........... 35
Bảng 3.1 Thành phần Môi trường (Morris)............................................................ 45
Bảng 3.2 Thành phần môi trường lên men (Mlm) ................................................. 46
Bảng 3.3 Thành phần môi trường (MKT) ............................................................... 46
Bảng 3.4 Các trị số cho thí nghiệm quy hoạch thực nghiệm theo phương án quay
bậc 2 Box và Hunter ............................................................................. 55
Bảng 4.1 Hiệu suất cố định tế bào trên các chất mang theo 2 phương pháp ........ 58
Bảng 4.2 Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt độ protease theo 2 phương pháp cố định.... 60
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ canxi ………………………………………………………………………………62
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ alginate đến khả năng tạo gel……………………………….64
Bảng 4.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung dịch tế bào trong dung dịch Alginate đến hiệu
suất cố định tế bào …………………………………………………………………………………………………….66
Bảng 4.6 Mức bố trí các yếu tố khảo sát tối ưu .................................................... 67
Bảng 4.7 Ma trận qui hoạch thí nghiệm các yếu tố : .............................................. 68
Bảng 4.8 Bảng kết quả phân tích số liệu thực nghiệm bằng phương pháp Anova
(trong Excel)............................................................................................. 69
Bảng 4.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống vi khuẩn Bac.subtilis đến hiệu suất cố định . 73
Bảng 4.10 Sự thay đổi hiệu suất cố định tế bào theo tốc độ khuấy và thời gian
khuấy ................................................................................................... 74
Bảng 4.11 Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hiệu suất cố định tế bào ............... 75


Bảng 4.12 Kết quả hoạt độ enzyme protease và pH thu được từ lên men tế bào vi
khuẩn Bac.subtilis ở dạng cố định ....................................................... 78
Bảng 4.13 Kết quả hoạt độ enzyme protease và pH thu được từ lên men tế bào vi
khuẩn Bac.subtilis ở dạng tự do. ......................................................... 80
Bảng 4.14 Lượng alkaline protease tạo ra trong các chu kỳ nuôi lặp lại................ 83
Bảng 4.15


Sự thay đổi hàm lượng amin trong quá trình thuỷ phân gelatin........... 85


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1

Phân loại peptidase theo cơ chế xúc tác .................................................. 4

Hình 2.2(a) Cấu tạo hoá học của α-L guluronic acid (G) và β-D mannuronic
acid (M)........................................................................................................ 28
Hình 2.2(b) Cấu trúc không gian của G và M. ........................................................... 28
Hình 2.3

Các loại polymer của alginate MM, GG, M, trang .................................. 28

Hình 2.4

Cơ chế tạo gel của alginate.trang.............................................................. 32

Hình 2.5

Gel của alginate giàu M và alginate giàu G.trang ................................... 32

Hình 2.6

Sự co rút của gel trong quá trình cố định. ................................................. 33

Hình 2.7


Cấu tạo của chitin, chitosan, cellulose. ..................................................... 36

Hình 2.8

Hoà tan chitosan trong môi trường acid. ................................................... 38

Hình 2.9

Liên kết giữa chitosan và glutaraldehyde. ................................................. 39

Hình 2.10 Liên kết giữa chitosan- glutaraldehyde và protein của vi sinh vật. ........... 40
Hình 4.1

So sánh hiệu suất cố định tế bào giữa các phương pháp ........................... 58

Hình 4.2

Sự biến thiên hoạt độ protease theo 3 phương pháp cố định tế bào .......... 63

Hình 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ canxi clorua đến hiệu suất cố định tế bào ........... 64
Hình 4.4

Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến hiệu suất cố định tế bào ........................... 66

Hình 4.5

Sự ảnh hưởng của nồng độ Ca2+ (X1) đến hiệu suất cố định tế bào .......... 71

Hình 4.6


Sự ảnh hưởng của nồng độ Alginate(X3) đến hiệu suất cố định tế bào ..... 71

Hình 4.7

Sự ảnh hưởng của tỷ lệ giống (X2)đến hiệu suất cố định tế bào ................ 72

Hình 4.8

Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến hiệu suất cố định tế bào .......................... 73

Hình 4.9

Sự thay đổi hiệu suất cố định tế bào theo tốc độ và thời gian khuaáy ......... 74


Hình 4.10 Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hiệu suất cố định tế bào ................... 76
Hình 4.11 Hoạt độ enzyme protease kiềm và pH thu được từ phương pháp lên
men tế bào vi khuẩn Bac.subtilis ở dạng cố định trong gel Alginate ....... 79
Hình 4.12 Hoạt độ enzyme protease kiềm và pH thu được từ phương pháp lên
men tế bào vi khuẩn Bac.subtilis ở dạng tự do. ........................................ 81
Hình4.13

Lượng alkaline protease thu được qua các chu kỳ nuôi lặp lại ................. 83

Hình 4.14 Sự thay đổi hàm lượng amin theo thời gian............................................... 86


-1-

Chương1

ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Đặt vấn đề
Sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzyme là một trong những định hướng
phát triển mũi nhọn của lónh vực công nghệ sinh học nói chung và của chuyên ngành
vi sinh công nghiệp nói riêng. Hướng phát triển này được quan tâm đầu tư rất lớn ở
nhiều nước trên thế giới do hiệu quả kinh tế mà ngành này mang lại.
Đến nay, ngành công nghiệp sản xuất chế phẩm enzyme đã có những bước
tiến mạnh mẽ nhưng chủ yếu tập trung ở các nước như : Mỹ, Nhật, Úc, Cuba và một
số nước Tây Âu .
Thị trường enzyme toàn cầu đạt khoảng 1,4 tỷ USD năm 1996 (Cowan 1996)
đạt 1,6 tỷ USD năm 1997 và dự tính tăng từ 6,5 ÷ 10% hàng năm [12]. Cùng với sự
phát triển không ngừng của ngành công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme, những ứng
dụng của enzyme trong các ngành công nghiệp ngày càng phổ biến và đa dạng trong
nhiều lónh vực. Trong đó, enzyme thuộc nhóm protease hiện đang sử dụng nhiều
nhất, có khoảng 500 tấn enzyme protease sản xuất mỗi năm, chiếm 59% tổng sản
lượng enzyme trên toàn thế giới. Đặc biệt là enzyme protease kiềm, cùng với những
ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y học, nông nghiệp, thuộc da, tơ
tằm thì riêng trong công nghiệp chất tẩy rửa enzyme này đã chiếm gần 25%. Nếu
phân tích từng loại enzyme buôn bán trên thị trường, người ta thấy rằng enzyme
protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis được sản xuất nhiều hơn cả [37].
Nhưng các chế phẩm enzyme đa phần ở dạng cô đặc hoặc dạng thô với mức độ
tinh khiết khác nhau. Điều này phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật sản xuất. Đây là điểm
bất lợi cho các lónh vực cần dùng enzyme có độ tinh khiết cao như y học, thực
phẩm, mỹ phẩm. Mặt khác, với phương pháp lên men tế bào vi khuẩn dạng tự do thì
HV : Đỗ Trần Ngoan

Luận văn thạc só


-2-


tế bào vi sinh vật chỉ sử dụng được một lần, việc tách và xử lý cho sạch các enzyme
là khó khăn, phức tạp, đòi hỏi cao về trình độ và thiết bị kỹ thuật, chưa kể đến
những hạn chế của việc ứng dụng enzyme trong thực tế sản xuất. Đây là nguyên
nhân chính đẩy giá thành chế phẩm enzyme lên cao .
Để giải quyết vấn đề trên người ta đẩy mạnh việc tìm tòi và nghiên cứu theo
hướng sử dụng enzyme và tế bào cố định (enzyme and cells immobilization). Những
nghiên cứu cố định enzyme bắt đầu từ năm 1916 do Nelson và Griffin thực hiện với
enzyme invertase bằng phương pháp hấp thụ. Nhưng mãi đến năm 60 mới bắt đầu thử
nghiệm trên quy mô công nghiệp. Năm 1969 Chibita (Mỹ) lần đầu tiên đã ứng dụng
enzyme Racemase cố định trong công nghiệp [39]. Bên cạnh các nghiên cứu về cố
định enzyme, các nghiên cứu về cố định tế bào còn rất hạn chế và hạn chế hơn là
nghiên cứu cố định tế bào để sản xuất chế phẩm enzyme ( đa phần là dùng phương
pháp lên men tế bào ở dạng tự do ).
1.2 Mục tiêu
Với các vấn đề nêu trên, mục tiêu của đề tài là xác lập phương pháp cố định tế
bào vi khuẩn Bac.subtilis để thu nhận enzyme protease kiềm có hoạt tính cao và có
khả năng sử dụng nhiều lần
1.3 Giới hạn đề tài
Nhằm khai thác tính ưu việt của phương pháp cố định tế bào vi sinh vật và phần
nào giải quyết các vấn đề đã nêu nên tôi chọn nghiên cứu tổng hợp protease kiềm tính
bằng phương pháp lên men bởi tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis cố định, một loại
enzyme quan trọng trong các ngành công nghiệp hiện nay.

HV : Đỗ Trần Ngoan

Luận văn thạc só


-3-


1.4 Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với những nội dung
sau :
1. Tối ưu hóa điều kiện cố định tế bào vi khuẩn Bac.subtilis để thu nhận enzyme
protease kiềm .
2. So sánh khả năng sinh tổng hợp enzyme protease kiềm ở 2 phương pháp : lên
men tế bào ở dạng tự do và nuôi cấy tế bào ở dạng cố định .
3. Nghiên cứu khả năng tái sử dụng tế bào cố định để thu nhận enzyme protease
kiềm tính .
4. Thử nghiệm khả năng phân giải của protease kiềm thu được.

HV : Đỗ Trần Ngoan

Luận văn thạc só


-4-

CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1 Tổng quan về enzyme protease
2.1.1 Khái niệm protease
Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thủy phân liên kết peptide
( - O – NH - ) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thuỷ
phân này có thể là các acid amin, các peptide, các polypeptide chuỗi ngắn. Nhiều
enzyme protease còn có thể xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết este, liên kết amid
và phản ứng chuyển vị gốc acid amin [6 ,7].
2.1.2 Phân loại Protease
2.1.2.1


Dựa vào cơ chế xúc tác

Theo IUBMB đã chia peptidase thành 2 nhóm :
Nhóm 1 : Exopeptidase còn gọi là peptidase hay enzyme phân cắt đầu mạch.
Thuỷ phân đầu tận cùng của chuỗi polypeptide. Nếu xúc tác ở đầu có gốc carboxyl
tự do thì gọi là enzyme carboxypeptidase. Nếu xúc tác ở đầu có gốc amin tự do thì
gọi là enzyme aminopeptidase [6,7].
Nhóm 2 : Endopeptidase còn gọi là proteinase hay enzyme phân cắt nội mạch.
Xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptide bên trong chuỗi polypeptidase[6,7].
peptidases (or proteases )
(EC 3.4 .. )

Exopeptiodases
(EC 3.4.11-19-)

Endopeptidases (or proteinases)
(EC 3.4.21-99-)

Hình 2.1 phân loại peptidase theo cơ chế xúc tác

HV : Đỗ Trần Ngoan

Luận văn thạc só


-5-

2.1.2.2


Dựa vào hoạt động của pH

Dựa vào mức hoạt động trong dung dịch có trị số pH khác nhau mà enzyme
protease được chia làm 3 loại :
Loại 1 : Protease acid : pHopt trong khoảng 2 ÷ 5. Loại protease này thường được
thu nhận từ các loại nấm mốc đen như :Aspergillus niger, Asp.awmori,Asp.saitoi [7].
Loại 2 : Protease trung tính : Có pHopt trong khoảng hẹp,từ 6 ÷ 7,5,không bền với
nhiệt độ cao và mất hoạt tính khi có mặt của protease kiềm. Thu nhận chủ yếu từ
các loại nấm mốc vàng như :Asp.oryzae, Asp.flavus, Asp.fumigatus,Asp.tericola [7].
Loại 3 : Protease kiềm tính : Có pHopt trong khoảng 8 ÷ 11 thường được tổng hợp
nhiều bởi nấm men và vi khuẩn .
Những protease kiềm tính là nhóm được quan tâm khá nhiều trong những năm
gần đây vì có thể sử dụng chúng như chất phụ gia trong việc giặt tẩy. Đa số chúng
được thu nhận từ chủng Bac.subtilis hay những vi khuẩn khác [7].
2.1.2.3

Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động

Đây là cách phân loại chi tiết nhất. Cách phân loại này dựa trên đặc điểm cấu
tạo trung tâm hoạt động của enzyme nên phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme đó.
Theo cách phân loại này proteinase được chia thành 4 nhoùm :
Nhoùm I : Serin – proteinase (EC 3.4. 21 )
Đại diện cho nhóm này là các enzyme có nguồn gốc từ động vật như trypsin,
chymotrypsinm elastate, plasmin và thrombin [21].Một số khác được tổng hợp từ vi
sinh vật, mà đặt biệt là từ vi khuẩn và nấm mốc nhö Bacillus cereus Bac.firmus ,
Bac.subtile , Asp.flavus , Asp.oryzae.
Hai acid amin hình thành trung tâm hoạt động là serin và histidine.
Khoảng pHopt là 7 ÷ 11.

HV : Đỗ Trần Ngoan


Luận văn thạc só


-6-

Các tác nhân làm mất hoạt tính của enzym thuộc nhóm này là di-isopropyl
phosphoroflouridate (DFP) hay phenylmethenesulphosphate (PMSF) [6,7].
Nhóm II : Cystein – proteinase ( EC 3.4.22 )
Còn được gọi là thinol protease hoặc sulfhydryl protease.
Đặc trưng cho nhóm này là papain, bromelin, ficin và một số protease từ vi
sinh vật.
Tâm hoạt động bao gồm 2 axit amin là cystein và histidin.
Hoạt động trong vùng pH rộng trong khoảng 4,5 ÷ 10 tuy nhiên vùng pHopt là
6,0 ÷ 7,5 , phụ thuộc vào cơ chất [21, 47].
Có khả năng bền với nhiệt từ 60 ÷ 800 C ở pH tự nhiên.
Nhóm enzym này rất nhạy với các phản ứng oxy hoá vì vậy người ta thường
dùng chúng kèm theo tác nhân khử ( ví dụ cystein ), hoặc dùng các chất có cấu
trúc không gian phức tạp như EDTA.
Bị ức chế hoạt động bởi chất sulfhydryl.
Nhóm III : Aspartic – proteinase ( EC 2.4.23 )
Đại diện cho nhóm là các enzym như rennin, pepsin.
Aspartic peptidase có nguồn gốc từ vi sinh vật được chia làm hai nhóm là
pepsin-like và rennin-like [6,7]. Nhóm pepsin-like thu nhận từ Aspergillus
oryzae, Aspergillus niger, Asp. Awamon, Penicillum spp, và Trametes
sanguinea… Nhóm rennin-like thu nhận từ Asp.Usami, Mucor pusillus…
Phân tử aspartic peptidase có 2 nhóm carbonyl,1 ở miền tiếp xúc và 1 ở tâm
hoạt động.Tâm hoạt động gồm :2 phân tử acidaspartic và 1 tyrosine.
pH hoạt động trong khoảng 2 ÷ 4 và còn gọi là protease-acid tính, riêng
cathepsin D có pHopt trong khoảng pH 6 ÷ 7, cắt liên kết k-casein làm đông tụ

sữa với tính đặc hiệu rất cao [21].
HV : Đỗ Trần Ngoan

Luận văn thạc só


-7-

Hoạt tính enzyme bị ức chế bởi peptatin.
Nhóm IV : Metallo-proteinase (EC 3.4.24)
Các enzym nhóm này

gồm exopeptidase, dipeptidase, amino peptidase,

carboxylpeptidase A&B, prolidase & prolisase và một soprotease thu nhận từ
vi sinh vật như Bac.cereus,Bac.megaterium,Bac.subtilis, streptomyces griseus,
Aspergillus orizae [6].
Hầu hết protease đều chứa các ion kim loại trong phân tử enzym. Phần lớn
chúng chứa 1 mol Zn2+ trên 1 mol protein, nhưng với prolidase và prolinase thì
thay bằng 1 mol Mn2+. Trong kim loại đóng vai trò như một axit lewis trong
enzym carboxypeptidase A, nó thiết lập liên kết với carboxyl trong liên kết
peptid và sẽ phân tách liên kết này.
Hoạt động trong vùng pH 6 ÷ 9.
Các tác nhân vô hoạt là các chất có cấu trúc không gian phức tạp như EDTA
hay natri dodecylsulfate [ 7, 21]
2.1.2.4

Dựa vào tính đặc hiệu của chúng đối với cơ chất tổng hợp hoặc đối với
chuỗi β -insuline đã bị oxi hóa


Năm 1975, Morihara đã phân loại các protease được chia ra thành bốn nhóm
lớn, dựa vào tính đặc hiệu của chúng đối với cơ chất tổng hợp hoặc đối với chuỗi β Insulin đã bị oxy hoá [7].
Nhóm I : Serin proteinase: Tính đặc hiệu đối với các gốc amino acid ở về phía nhóm
– CO2 của liên kết peptide, do đó còn được gọi là carbonxyendopeptidase.
Nhóm II : Cystein proteinase: Giống như cách phân loại theo đặc điểm có cấu tạo
của trung tâm hoạt động.
Nhóm III : Metallo proteinase: Có đặc hiệu đối với các gốc amino acid về phía
nhóm –NH- của liên kết peptide, do đó còn được gọi là aminoendopeptidase.
HV : Đỗ Trần Ngoan

Luận văn thạc só


-8-

Nhóm IV: Aspartic proteinase: có tính đặc hiệu đối với các nguồn gốc amino acid
ở cả hai phía của liên kết peptide.
2.1.3 Cơ chế tác dụng của protease
Việc thủy phân của protease là một tiến trình vật lý khá đa dạng. Hoạt động
của chúng được chia ra làm hai loại như sau:
Thủy phân giới hạn : enzym thủy phân có giới hạn đối với một hay một số các
liên kết peptide có trong phân tử protein và tạo thành các peptide phân tử nhỏ.
Thủy phân không giới hạn : protein bị thủy phân thành những acid amin [9].
Dưới tác dụng của protease, liên kết peptide – CO- NH- sẽ bị thủy phân tạo
thành sản phẩm là aminoacid và một ít peptide có phân tử nhỏ[30].
Với 4 nhóm proteinase được chia theo đặc điểm cấu tạo của trung tâm hoạt
động sẽ có 4 cơ chế xúc tác khác nhau như sau:

HV : Đỗ Trần Ngoan


Luận văn thạc só


-9-

2.1.3.1

Cơ chế thủy phân liên kết peptide của serin - proteinase

HV : Đỗ Trần Ngoan

Luận văn thạc só


- 10 -

2.1.3.2

Cơ chế thủy phân liên kết của cystein - proteinase

HV : Đỗ Trần Ngoan

Luận văn thạc só


- 11 -

2.1.3.3

Cơ chế thủy phân liên kết peptid của Aspartic - proteinase


HV : Đỗ Trần Ngoan

Luận văn thạc só