ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
---------------- ---oOo--Tp. HCM, ngày . . . . . tháng . . . . . năm .2007 .

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: . . . . . .BÙI TUẤN TÚ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Giới tính : Nam
Ngày, tháng, năm sinh : . . 17/05/1981 . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nơi sinh : . QUẢNG NAM . . .
Chuyên ngành : . . . . . . . . CÔNG NGHỆ SINH HỌC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Khoá (Năm trúng tuyển) : . 2005 . . . . . . . .
1- TÊN ĐỀ TÀI: . . . . . .. . . NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TÁI SINH PHÔI SOMA CÂY TIÊU
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (Piper Nigrum L.). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN
Nghiên cứu phát sinh tế bào soma cây tiêu
Nghiên cứu tăng sinh tế bào soma trên môi trường nuôi cấy bán rắn và môi
trường lỏng
Nghiên cứu tái sinh tế bào soma
Nghiên cứu tái sinh tạo phôi soma
Nghiên cứu nhân chồi và tạo rễ ở cây tiêu
3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : . . . . . . . . . . .11/2006 . . . . . . . . .
4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : . . .11/2007 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi đầy đủ học hàm, học vị ): . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .PGS TS TRẦN VĂN MINH . . . .. . . . . . . . . . . . . .
.....
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký)

PGS TS Trần Văn Minh

i


LỜI CẢM ƠN
Luận văn được hoàn thành theo chương trình đào tạo thạc só chuyên ngành Công
nghệ sinh học hệ chính qui, tại ĐH Kỹ Thuật - Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí
Minh. Để hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp cao học này tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu trường ĐH Kỹ Thuật - Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí
Minh
Phòng đào tạo Sau Đại Học, thuộc ĐH Kỹ Thuật - Đại Học Quốc Gia Thành Phố
Hồ Chí Minh
Bộ môn CNSH, cùng q thầy cô đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện
trong suốt quá trình học tập.
Ban lãnh đạo Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thuộc Viện Khoa Học Và Công Nghệ
Việt Nam
Ban phụ trách phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ tế bào thực
vật thuộc viện sinh học nhiệt đới
Chân thành cảm ơn PGS. TS Trần Văn Minh và cô Bùi Thị Tường Thu đã tận tình
giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi và trực tiếp hướng dẫn cho tôi trong suốt quá
trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp này.
Chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ, nhân viên phòng thí nghiệm trọng điểm quốc
gia về công nghệ tế bào thực vật thuộc viện sinh học nhiệt đới đã giúp đỡ và tạo
điều kiện cho tôi nghiên cứu và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.

Xin chân thành bày tỏ
lòng trân trọng biết ơn.


ii


Tóm tắt luận văn thạc só
Đề tài: Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh phôi soma cây tiêu – Piper Nigrum L. invitro
được tiến hành tại phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ tế bào thực vật Viện sinh học nhiệt đới từ thời gian tháng 11 năm 2006 đến tháng 10 năm 2007. Các thí
nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. Kết quả cho thấy:
-

Nuôi cấy phát sinh tế bào soma: trong môi trường khoáng cơ bản SH có bổ sung

3%(w/v) và 2,4-D 1mgl-1 tạo được tế bào soma với khối lượng cao đồng thời các tế
bào này có khả năng tái sinh cao.
-

Để duy trì tế bào soma trên cả môi trường lỏng và môi trường bán rắn, với các

mốc khối lượng tế bào soma ban đầu là 300mg; 500mg; 1000mg, Sau 4 tuần theo dõi
thì ứng với môi trường bán rắn, các thí nghiệm có khối lượng tế bào soma ban đầu là
1000mg đạt hệ số tăng sinh khối lượng cao nhất. Đối với môi trường lỏng thì các thí
nghiệm có khối lượng tế bào soma ban đầu là 300mg đạt hệ số tăng sinh khối lượng
cao nhất sau 4 tuần.
-

Trong thí nghiệm tái sinh tế bào soma thành cây hoàn chỉnh thì ta sử dụng môi

trường có khoáng cơ bản MS có bổ sung Succrose 3%(w/v), CW 10%(v/v) và chất
kích thích điều hoà sinh trưởng ở thực vật bao gồm IBA 0.1 mgl-1 , KIN 3 mgl-1 và
nồng độ của BA bổ sung là 5mgl-1 có tỷ lệ tái sinh chồi cây tiêu cao nhất.

-

Thí nghiệm tái sinh tạo phôi soma từ tế bào soma, sử dụng môi trường có thành

phần khoáng cơ bản MS bổ sung Sucrose 3% (w/v), CW 20%(v/v), chất điều hoà sinh
trưởng thực vật bao gồm BA 0.2 mgl-1 và TDZ có nồng độ 0.5mgl-1 đạt tỷ lệ tạo phôi
soma cao nhất.
-

Thí nghiệm nhân chồi cây phôi, sử dụng môi trường có khoáng cơ bản MS bổ

sung Succrose 3% (w/v), BA có là 0.1 mgl-1 cho khả năng nhân chồi cao nhất

iii


-

Trong thí nghiệm tạo rễ cho cây tiêu thì việc sử dụng môi trường có khoáng MS

và có bổ sung 3% (w/v) đường và 0.1 mgl-1 NAA tạo rễ cho cây tiêu tốt hơn.

SUMMARY
The thesis, Study the technique to regenerate somatic embryos in Black pepper (
Piper Nigrum L.) invitro is implemented at the Institue of Tropical Biology from Nov
2006 to Oct 2007. Experiments is set up in CRD test with three replications, the
results show that:
Induction of somatic cells: Basic SH mineral medium is provided with 3%
(w/v) Succrose and 1mg/l 2,4-D gave t the highest possible capacity of
induction somatic cells.

To maintain the somatic cells on the agar medium, the innital weight of
somatic cells is 500mg/50ml gave the maximum of increasing biomass index.
And to maintain the somatic cells on the liquid medium, the initial weight of
somatic cells is 300mg/ 50ml gave the maximum of increasing biomass index.
The regeneration of somatic cells, we used the medium with the basal MS
minerals medium with 3% (w/v) Succrose, 10 % (v/v) CW, 0.1 mg/l IBA, 3mg/l
Kin and 5 mg/l BA will give the best ratio of somatic cells regeneration.
The embryogenesis of somatic cells is implemented in the basic MS mineral
medium, provided with 3% (w/v) Succrose, 20% (v/v) CW, 0.2 mg/l BA and
0.5 mg/l TDZ gave the best ratio of somatic embryos ( global embryos)
regeneration capacity.
To multiply the number of black pepper buds from one bud, we used the basic
MS mineral medium with 3% (w/v) Succrose and 0.1 mg/l BA. And to obtain
the strong buds you must increase the concentration of BA up to 0.5 mg/l.

iv


Finally, to create the root of the black pepper plants, we used the basic MS
mineral medium with 3% (w/v) sucrose and 0.1 mgl/l NAA.

v


MỤC LỤC
CHƯƠNG1 ............................................................................ Error! Bookmark not defined.
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................... Error! Bookmark not defined.
1.1
Đặt vấn đề ..................................................... Error! Bookmark not defined.
1.2

Mục tiêu và mục đích của đề tài .................. Error! Bookmark not defined.
1.2.1
Mục đích của đề tài ....................................... Error! Bookmark not defined.
1.2.2
Mục tiêu nghiên cứu ..................................... Error! Bookmark not defined.
1.3
Giới hạn đề tài ............................................... Error! Bookmark not defined.
1.4
Nội dung đề tài .............................................. Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG 2 ........................................................................... Error! Bookmark not defined.
TỔNG QUAN VỀ CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ............. Error! Bookmark not defined.
2.1.
Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật . Error! Bookmark not defined.
2.1.1.
Giới thiệu ....................................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.2.
Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật ..Error!
Bookmark not defined.
2.1.2.1.
Về mặt lý luận sinh học cơ bản .................... Error! Bookmark not defined.
2.1.2.2.
Về mặt thực tiễn sản xuất ............................ Error! Bookmark not defined.
2.2.
Nuôi cấy mô cây tiêu ..................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.1.
Phân loại học thực vật của cây tiêu ............. Error! Bookmark not defined.
2.2.2.
Đặc điểm thực vật học của cây tiêu ............ Error! Bookmark not defined.
2.2.2.1.
Bộ rễ của cây tiêu:........................................ Error! Bookmark not defined.

2.2.2.2.
Thân tiêu ........................................................ Error! Bookmark not defined.
2.2.2.3.
Cành tiêu có 3 loại ........................................ Error! Bookmark not defined.
2.2.2.4.
Lá tiêu:........................................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.2.5.
Hoa quả và hạt tiêu:...................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.3.
Đặc điểm phân bố ......................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.4.
Giá trị kinh tế................................................ Error! Bookmark not defined.
2.2.5.
Nhân giống..................................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.5.1.
Các phương pháp nhân giống truyền thống Error! Bookmark not defined.
2.2.5.2.
Kỹ thuật giâm cành tiêu ............................... Error! Bookmark not defined.
2.3.
Tổng quan về pp vi nhân giống qua nuôi cấy phát sinh phoâi soma. .Error!
Bookmark not defined.
2.3.1.
Phoâi soma....................................................... Error! Bookmark not defined.
2.3.2.
Sự hình thành phôi soma............................... Error! Bookmark not defined.
2.3.3.
Kỹ thuật nuôi cấy phôi: ................................ Error! Bookmark not defined.
2.3.3.1.
Khử trùng mẫu:............................................. Error! Bookmark not defined.
2.3.3.2.

Tách mẫu ....................................................... Error! Bookmark not defined.
2.3.4.
Môi trường nuôi cấy phôi ............................. Error! Bookmark not defined.
2.3.4.1.
Các chất vô cơ ............................................... Error! Bookmark not defined.

vi


2.3.4.2.
Nguoàn cacbon ................................................ Error! Bookmark not defined.
2.3.4.3.
Nguoàn nitrogen.............................................. Error! Bookmark not defined.
2.3.4.4.
Các chất hữu cơ khác và dịch chiết ............. Error! Bookmark not defined.
2.3.4.5.
Chất sinh trưởng ........................................... Error! Bookmark not defined.
2.3.4.6.
Agar................................................................ Error! Bookmark not defined.
2.3.4.7.
Than hoạt tính: .............................................. Error! Bookmark not defined.
2.3.4.8.
pH ................................................................... Error! Bookmark not defined.
2.3.5.
Điều kiện nuôi cấy phôi ................................ Error! Bookmark not defined.
2.3.5.1.
nh sáng ........................................................ Error! Bookmark not defined.
2.3.5.2.
Nhiệt độ: ........................................................ Error! Bookmark not defined.
2.3.6.

Duy trì quá trình phát sinh phôi đồng nhất:Error! Bookmark not defined.
2.3.7.
Tách tế bào phôi ............................................ Error! Bookmark not defined.
2.3.8.
Kiểm tra sự trao đổi khí:.............................. Error! Bookmark not defined.
2.3.9.
Kiểm tra sự sinh trưởng của phôi liên tục bằng áp suất thẩm thấu:Error!
Bookmark not defined.
2.3.10.
Hệ thống nhân sinh khối tế bào soma ......... Error! Bookmark not defined.
2.3.10.1. Nhân sinh khối tế bào phôi:.......................... Error! Bookmark not defined.
2.3.10.2. Đặc tính công nghệ của nhân sinh khối phôi soma... Error! Bookmark not
defined.
2.3.11.
Tái sinh cây hoàn chỉnh từ phôi soma.......... Error! Bookmark not defined.
2.3.11.1. Auxin .............................................................. Error! Bookmark not defined.
2.3.11.2. Làm khô: ........................................................ Error! Bookmark not defined.
2.3.12.
Chất kích thích sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vậtError!
Bookmark not defined.
2.3.13.
Auxin .............................................................. Error! Bookmark not defined.
2.3.14.
Cytokinin........................................................ Error! Bookmark not defined.
2.4.
Các nghiên cứu trong và ngoài nước ........... Error! Bookmark not defined.
2.4.1.
Các nghiên cứu trong nước: ......................... Error! Bookmark not defined.
2.4.2.
Các nghiên cứu ngoài nước: ......................... Error! Bookmark not defined.

CHƯƠNG 4 ........................................................................... Error! Bookmark not defined.
KẾT QUẢ THẢO LUẬN ..................................................... Error! Bookmark not defined.
4.1
Thí nghiệm 1 Nghiên cứu phát sinh tế bào soma từ đọt thân cây tiêuError!
Bookmark not defined.
4.2.
Thí nghiệm 2 Nghiên cứu nuôi cấy tăng sinh tế bào soma trên môi trường bán rắn:
Error! Bookmark not defined.
4.3.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu nuôi cấy tăng sinh tế bào soma trên môi trường lỏng.
Error! Bookmark not defined.
4.4.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào soma trên
môi trường lỏng......................................................... Error! Bookmark not defined.
4.5.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái của phôi soma: ...Error!
Bookmark not defined.

vii


4.6.
Thí nghiệm 6: Tái sinh tế bào soma ........................ Error! Bookmark not defined.
4.7.
Thí nghiệm 7: Tái sinh tạo thành phôi soma từ tế bào somaError! Bookmark not
defined.
4.8.
Thí nghiệm 8 Nhân chồi cây phôi ............................ Error! Bookmark not defined.
4.9.
Thí nghiệm 9: Khả năng tạo rễ của cây tiêu in vitroError! Bookmark not defined.

CHƯƠNG 5 ........................................................................... Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ......................................................... Error! Bookmark not defined.
5.1
Kết luận ......................................................... Error! Bookmark not defined.
5.2
Đề nghị:.......................................................... Error! Bookmark not defined.

viii


Tài liệu tham khảo

ix


LÝ LỊCH TRÍCH NGANG
Họ và tên: Bùi Tuấn Tú
Ngày tháng năm sinh : 17/ 05/ 1981

Nơi sinh: Quảng Nam

Địa chỉ liên lạc: số 345 Phan Chu Trinh, TP Tam Kỳ, Tỉnh Quảng Nam.
Điện thoại: 0510851464

ĐT DD:

0985 007 464

Email:
QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO

Thời gian

Tên trường

2000 – 2004

Đại học Văn Lang TP HCM

2005 – 2007

Đại học Kỹ thuật – Đại học QG TP
HCM

Công trình nghiên cứu:

x

Chuyên
ngành
CNSH

Hệ đào
tạo
CQ

CNSH

CQ

Bằng cấp

Kỹ sư
Thạc só


-1-

CHƯƠNG1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Đặt vấn đề
Trong các loại gia vị thì tiêu đóng vai trò như một vị vua của các loại gia vị,
hạt tiêu còn là một loại gia vị quan trọng nhất và được sử dụng phổ biến nhất trên
thế giới. Tiêu được sử dụng chủ yếu trong các lónh vực như
o Thực phẩm: tiêu được sử dụng chủ yếu là chất điều vị cho thực
phẩm.
o Ngoài ra, tiêu còn được sử dụng là chất bảo quản trong công nghệ
thực phẩm.
o Dược phẩm: Tiêu được sử dụng để chữa một số bệnh về đường tiêu
hoá, hạ nhiệt - giảm sốt, và trị chứng cảm lạnh thông thường.
o Mỹ phẩm
Bên cạnh đó, cây tiêu là một trong các cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu
cao.
Trên thế giới:
Cây tiêu có hơn 120 loài, trong đó 60% có nguồn gốc từ miền trung và bắc
Nam Mỹ. Số còn lại ở vùng Nam Và Đông Nam Châu . Ngày nay tiêu được trồng
chủ yếu ở các nước châu Á Thái Bình Dương, chủ yếu tập trung ở các quốc gia như
: Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Sri Lanka, Thailand, Việt Nam và Campuchia.
Ngoài ra, còn có một số các vùng khác có trồng một diện tích hồ tiêu khá lớn như là
Brasil, Comlombia, Guatemala…Tổng sản lượng của các quốc gia sản xuất hồ tiêu
HV Bùi Tuấn Tú


Luận văn Thạc sĩ


-2-

trên toàn thế giới hiện nay khoảng: 329.000 tấn trong khi đó, nhu cầu tiêu trên toàn
thế giới hiện nay là khoảng 376.500 tấn. (Báo cáo ngành hàng hạt tiêu Q2/ 2007)
Giá hạt tiêu trên toàn thế giới cũng biến động dựa theo sản lượng và chất
lượng hạt tiêu.

Hình 1.1 Diễn biến giá hạt tiêu 6 tháng đầu năm 2007

HV Bùi Tuấn Tú

Luận văn Thạc sĩ


-3-

Tại Việt Nam
Việt Nam, cây tiêu được trồng cách đây 150 năm, song đến giai đoạn
1996-2004, sản xuất và xuất khẩu tiêu mới tăng trưởng mạnh. Năm 2003, Việt Nam
trở thành nước đứng đầu thế giới về sản xuất lẫn xuất khẩu, với sản lượng tiêu đạt
hơn 70.000 tấn, chiếm tỷ trọng 26% thế giới. Cũng trong giai đoạn này, tiêu chiếm
vai trò quan trọng trong xuất khẩu hàng nông sản với giá trị kim ngạch xuất khẩu
bình quân đạt hơn 100 triệu USD/năm. Ông Trịnh Khắc Lý, Phó Chủ tịch, kiêm
Tổng thư ký Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam cho biết, năm 2004, Việt Nam có 52.000ha
tiêu (tốc độ tăng bình quân 27,29%/năm) và đã có vùng sản xuất chuyên canh lớn
tại 7 tỉnh: Bình Phước, Đắklắk, Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Quảng Trị, Gia Lai,
Bình Thuận.

Tiêu là cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu bình quân cao nhất so với các
loại cây công nghiệp khác. Năng suất bình quân tiêu Việt Nam đạt 2,4-2,5 tấn/ha,
có giá trị xuất khẩu khoảng 3.000 USD/ha, trong khi đó, cao su chỉ đạt 1.218
USD/ha, cà phê 750 USD/ha, chè 990 USD/ha... Bên cạnh đó, diện tích trồng cây
tiêu lại ít hơn nhiều so với các loại cây khác. Diện tích cà phê nhiều gấp 9,87 lần
cây tiêu, cao su gấp 8,38 lần và chè gấp 2,23 lần...
Tuy nhiên, người trồng tiêu Việt Nam vẫn đang phải đối mặt với những khó
khăn không nhỏ. Sâu bệnh đang phát triển nhanh chóng tại các vùng trồng trọng
điểm là ĐNB và Tây Nguyên. Theo khảo sát của Viện KHKTNN Miền Nam, tốc
độ phát triển của bệnh virus trên cây tiêu là 5%, của các bệnh khác (chết nhanh,
chết chậm …) là 3%. Tổng diện tích bị sâu, bệnh vào khoảng 15% (riêng bệnh do
virus là 12%). Ngoài ra, hiện tượng nọc vông trồng bị chết hàng loạt bởi một loại
HV Bùi Tuấn Tú

Luận văn Thạc sĩ


-4-

ong ký sinh cũng đã ảnh hưởng không nhỏ đến sản lượng của nhiều vườn tiêu.
Trong khi đến nay chúng ta vẫn chưa có được những loại thuốc đặc trị các bệnh
này. Một điều đáng lo nữa là trong khi các thị trường tiêu thụ lớn có yêu cầu ngày
càng cao đối với mặt hàng hạt tiêu về VSATTP, thì hầu hết các hộ nông dân Việt
Nam đều chưa ý thức được vấn đề này. Sau khi thu hái, hầu hết hạt tiêu vẫn được
phơi dưới đất, tỷ lệ lẫn tạp (đất, đá, que, lá …) vẫn còn cao và rất dễ nhiễm khuẩn.
Bởi vậy, nếu những tồn tại nói trên không sớm được khắc phục, lợi thế mà người
trồng tiêu Việt Nam sẽ bị giảm đi khá nhiều. (Trần Văn Khả - Trung tâm KN Bình
Định)
Hiện tại đối với cây tiêu ở Việt Nam cần có một số giải pháp để phát triển
một cách bền vững:

o Tạo ra các giống tiêu đồng đều về mặt chất lượng và sản lượng
o Thống nhất về mặt kỹ thuật gieo trồng và chăm sóc.
o Đầu tư nâng cấp dây chuyền chế biến hạt tiêu (đạt được các tiêu chuẩn quốc
tế)
o Phải có sự kết hợp của cả 4 ”nhà” để phát triển một cách bền vững để cây
tiêu thật sự là một trong các cây công nghiệp thế mạnh của Việt Nam.
Vì vậy, vấn đề nghiên cứu kỹ thuật tái sinh phôi soma cây tiêu là hết sức
cấp bách, nhằm cung cấp một lượng lớn cây con đầu dòng có chất lượng cao đồng
đều. Do đó chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh phôi
soma cây tiêu– Piper nigrum L.” in vitro và là tiền đề để sản xuất cây tiêu sạch
bệnh.

HV Bùi Tuấn Tú

Luận văn Thạc sĩ


-5-

1.2 Mục tiêu và mục đích của đề tài
1.2.1 Mục đích của đề tài
-

Mục tiêu của luận văn là nghiên cứu kỹ thuật tái sinh phôi soma cây tiêu invitro

-

Tạo ra các dòng tiêu có các đặc điểm di truyền giống với cây mẹ, từ đó tạo
ra một loạt các cây giống đồng đều và ổn định về năng suất, chất lượng
nhằm giúp tạo điều kiện cho việc sản xuất chế biến và xuất khẩu.


-

Là cơ sở cho việc tạo ra các dòng tiêu sạch bệnh.

-

Là nguồn nguyên liệu cho việc tạo ra các hạt nhân tạo, chuyển gen

1.2.2 Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu sự hình thành tế bào soma và từ đó tái sinh tế bào soma thành
cây hoàn chỉnh và cũng như tái sinh để tạo phôi soma.
1.3 Giới hạn đề tài
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên nội dung của luận văn tập trung nghiên
cứu chủ yếu vào kỹ thuật tạo tế bào soma từ đọt thân cây tiêu; nuôi cấy tăng sinh tế
bào soma trên cả môi trường bán rắn; môi trường lỏng; nghiên cứu ảnh hưởng của
các chất kích thích sinh trưởng đến quá trình tái sinh tế bào soma; quá trình phát
sinh phôi soma; và cuối cùng là tạo thành cây tiêu hoàn chænh invitro.

HV Bùi Tuấn Tú

Luận văn Thạc sĩ


-6-

1.4 Nội dung đề tài
Để tái sinh cây tiêu thông qua phôi soma những nội dung cần phải thực hiện là
o Xác định thành phần môi trường nuôi cấy phát sinh phôi soma từ đọt thân
cây tiêu

o Xác định khối lượng thích hợp ban đầu để nuôi cấy tăng sinh tế bào soma
trong môi trường bán rắn và môi trường lỏng
o Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào soma
o Nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái từ tế bào soma đến phôi soma
o Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng phát
sinh phôi trực tiếp từ tế bào soma
o Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng phát
sinh phôi qua các giai đoạn của phôi soma.
o Nghiên cứu khả năng nhân chồi của cây phôi invitro.
o Xác định ảnh hưởng của một số loại auxin đến khả năng tạo rễ của cây tiêu
in vitro

HV Bùi Tuấn Tú

Luận văn Thạc sĩ


-7-

CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN VỀ CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.1. Giới thiệu
Thuật ngữ nuôi cấy mô tế bào thực vật được dùng một cách rộng rãi để nói
về việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật ( tế bào đơn, mô, cơ quan) trong điều
kiện vô trùng. Hệ thống nuôi cấy mô tế bào thực vật được dùng để nghiên cứu tất
cả các vấn đề liên quan đến thực vật như sinh lý học, sinh hoá học, di truyền học,
và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô
tính một cách kinh tế các loại cây trồng quan trọng và có giá trị về mặt kinh tế và
thương mại trong đời sống hằng ngày của con người.

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào và cơ quan thực vật hiện nay được cũng cố
vững chắc ở rất nhiều phòng thí nghiệm trên khắp thế giới. Nhiều phương pháp đã
được phát triển để nhân giống, chọn lọc các đặc điểm mong muốn khác nhau, tạo
dòng tế bào, nhân nhanh các kiểu di truyền, tạo ra các cây đơn bội từ nuôi cấy noãn
và túi phấn, đa dạng hoá các kiểu di truyền bằng cách tạo đột biến và nhân dòng
soma tạo ra các mô sẹo cô lập và nuôi cấy tế bào dể nghiên cứu những ảnh hưởng
của của khoáng,vitamin và các điều hoà sinh trưởng thực vật trên sự tăng trưởng và
biệt hoá tế bào. Nhiều kỹ thuật đặc biệt đã được nghiên cứu và ứng dụng. Trong
tương lai thì nuôi cấy mô tế bào thực vật sẽ được sử dụng như là công cụ cưo vản
và người ta đã sử dụng nhiều thuật ngữ chuyên biệt để phân biệt các kiểu nuôi cấy
khác nhau:
-

Cấy cây: nuôi cấy cây con và các cây lớn hơn

HV Bùi Tuấn Tú

Luận văn Thạc sĩ


-8-

-

Cấy phôi: gồm nuôi cấy các phôi cô lập đã trưởng thành và chưa trưởng thành.

-

Cấy cơ quan: cấy các cơ quan thực vật tách rời.


-

Cấy tế bào soma: cấy các loại mô tách ra từ một phần nào đó của một cơ quan
thực vật.

-

Cấy tế bào và huyền phù tế bào: các tế bào cô lập hay cụm tế bào rất nhỏ trong
môi trường lỏng.

-

Cấy tế bào trần: cấy tế bào trần thực vật là những tế bào không có thành/ vách
dùng trong kỹ thuật di truyền.

-

Cấy túi phấn ( thể đơn bội) cấy túi phấn hoặc những hạt phấn chưa trưởng thành
để thu được tế bào đơn bội hay mô sẹo đơn bội.
2.1.2. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật
Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật có ý nghóa vô cùng to lớn đối với

việc nghiên cứu lý luận sinh học căn bản, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiếp
cho thực tiễn sản xuất và đời sống.
2.1.2.1.

Về mặt lý luận sinh học cơ bản

Nuôi cấy mô mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất
của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tiến hành so sánh

đặc tính của cơ thể với các hợp phần chúng khi được tách rời ra khỏi cơ thể, từ đó
rút ra qui luật về tương tác giữa các bộ phận trong cây. Thực tế cho thấy chúng ta
có thể tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đó cho ra nhóm tế bào
không chuyên biệt còn gọi là tế bào soma, và từ tế bào soma có thể tái sinh thành
cây hoàn chỉnh. Trong tiến trình tạo cây hoàn chỉnh từ tế bào soma, chúng ta có thể

HV Bùi Tuấn Tú

Luận văn Thạc sĩ


-9-

gây ra những thay đổi định hướng ở mức độ tế bào ( trước khi cho một cơ thể hoàn
chỉnh). Đây là ưu thế mà các nhà sinh lý sinh hoá và di truyền học dễ dàng sử dụng
trong công tác của mình.
Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và
chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chúng
ta có thể khắc phục được khó khăn nêu trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh
hình thái được phân biệt một cách rõ rệt. Điều này tạo thuận lợi cho việc nghiên
cứu về các qui luật sinh trưởng và phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với môi
trường bên ngoài. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây
trồng theo chiều hướng mong muốn.
Bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, chúng ta có thể tìm hiểu và tiến
hành nghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa ký sinh và ký chủ. Như vậy, rõ ràng
nhiều vấn đề về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản. Từ đó, người ta tìm ra
những cơ chế miễn dịch ở thực vật tốt hơn. Trong trường hợp người ta hoàn toàn
làm chủ được cơ chế này thì các biện pháp phòng bệnh được hoàn thiện và như vậy
việc chống bệnh sẽ trở nên đơn giản và ít tốn kém hơn rất nhiều.
2.1.2.2.


Về mặt thực tiễn sản xuất

Ngoài tác dụng nghiên cứu lý luận sinh học căn bản, phương pháp nuôi cấy
mô còn có đóng góp hết sức to lớn trong thực tiễn đối với sản xuất và đời sống.
Phương pháp nuôi cấy mô còn được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh
các giống cây trồng q hiếm, có giá trị kinh tế cao. Hiện nay phương pháp nhân
giống vô tính thực vật trong ống nghiệm đã trở thành kỹ thuật nông nghiệp phổ

HV Bùi Tuấn Tú

Luận văn Thạc sĩ


- 10 -

biến. Người ta đã sử dụng phương pháp nuôi cấy mô trong công tác chọn giống cây
trồng.
Phương pháp nuôi cấy mô còn có triển vọng sử dụng rộng rãi trong công
nghệ sinh học. Bằng phương pháp nuôi cấy mô chỉ trong một thời gian ngắn chúng
ta có thể tạo được một sinh khối lớn có hoạt chất, sinh khối được tạo ra vẫn giữ
nguyên được thuộc tính của mình nghóa là vẫn giữ được khả năng tổng hợp các hợp
chất thứ cấp như alkaloid, glycosid, các steoroid (dùng trong y học), các chất dùng
trong công nghiệp thực phẩm. Những chất kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn
dùng trong nông nghiệp. Đó là cơ sở của sự xuất hiện một lónh vực kỹ thuật mới, kỹ
thuật của công nghệ sinh học.
nghóa thực tiễn quan trọng nhất của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực
vật là áp dụng kỹ thuật sản xuất đại trà có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống
cây trồng. Những lợi ích trong việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông
nghiệp và lâm nghiệp được tóm tắt như sau

-

Kiểm soát được dịch bệnh ở cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cấy mô hay
còn gọi là nuôi cấy tế bào, ta hoàn toàn có thể loại được những cá thể nhiễm
bệnh hay đang mang mầm bệnh.

-

Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát chất lượng kiểu gen
của giống đem vào sản xuất.

-

Kiểm soát được toàn bộ quá trình từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch.

-

Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối.
Sự đồng loạt này giúp cơ giới hoá được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch.

HV Bùi Tuấn Tú

Luận văn Thạc sĩ


- 11 -

Do đó năng suất lao động sẽ tăng lên. Chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạo
điều kiện cho khâu tiêu thụ và chế biến.
Tóm lại, nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nuôi cấy tế bào thực vật đã đem

lại hiệu quả to lớn trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp. Đây thật sự đã và
đang là cuộc cách mạng xanh trong ngành trồng trọt (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
2.2. Nuôi cấy mô cây tiêu
2.2.1. Phân loại học thực vật của cây tiêu
Cây tiêu thuộc họ hồ tiêu, có tên tiếng anh là Black pepper.
Tên khoa học: Piper nigrum Linn.
Giới

: Thực Vật

Ngành

: Magnoliophyta

Lớp

: Magnoliophyta,

Bộ

: Piperales

HV Bùi Tuấn Tú

Luận văn Thạc sĩ


- 12 -

Hình 2.1 Các bộ phận của cây tiêu

2.2.2. Đặc điểm thực vật học của cây tiêu
2.2.2.1.

Bộ rễ của cây tiêu:

Có 4 loại rễ chính
o Rễ cọc: chỉ có ở những cây trồng từ hạt có thể ăn sâu từ 2 – 2.5m
o Rễ cái phát triển từ thân cây trồng bằng hom, mỗi hom có từ 3 – 6 rễ cái, có
thể ăn sâu đến 2m.
o Rễ phụ phát sinh từ rễ cái, mọc thành chùm, ở đầu rễ có nhiều lông hút,
phân bố ở tầng đất sâu từ 15 – 40 cm.
o Rễ bám (rễ khí sinh, rễ thằng lằn) mọc từ các đốt trên thân, bám vào các cây
trụ, có nhiệm vụ là giữ cây và hấp thu các chất.
Với sản xuất tiêu thì làm đất sâu từ 0 – 40 cm tạo độ tơi xốp cho các rễ phụ
phát triển để hấp thu nhiều nước và các chất dinh dưỡng cung cấp cho cây.

HV Bùi Tuấn Tú

Luận văn Thạc sĩ


- 13 -

2.2.2.2.

Thân tiêu

Thân tiêu thuộc loại thân bò có khả năng sinh trưởng nhanh. Thân có màu
đỏ nhạt, nâu xám, nâu xanh, xanh lá cây đậm phụ thuộc vào giống và vị trí thân,
nếu không bấm ngọn thân tiêu có thể dài đến 10m. thân cây tiêu chứa nhiều nước

nên phản ứng rất mẫn cảm với nước, phân bón, khi thiếu nước hay thừa nước thì
thân tiêu sẽ chết rất nhanh và phục hồi nhanh khi đủ nước.
2.2.2.3.

Lá tiêu:

Lá tiêu thuộc loại đơn, hình trái tim, mọc cách. Cuống lá dài 2 -3 cm, phiến
lá dài 10 - 25cm, rộng 5 – 10 cm phụ thuộc vào giống.

HV Bùi Tuấn Tú

Luận văn Thạc sĩ


- 14 -

2.2.2.4.

Cành tiêu có 3 loại

o Cành vượt (cành tược) mọc từ các mầm nách của lá khi cây tiêu nhỏ hơn 1
tuổi, tạo với thân một góc nhỏ hơn 45 độ. Cành vượt phát triển mạnh, không
cho hoa quả, nếu dùng làm hom giâm tạo ra cây tiêu chậm ra hoa hơn song
tuổi thọ kéo dài hơn. Trong sản xuất lớn cần chú ý: Bấm ngọn cành vượt khi
cây còn nhỏ, cắt bỏ cành vượt khi cây tiêu lớn.
o Cành ác: là cành mang quả). Là các cành mọc ra ở các nách lá phía trên cuả
thân cây, tạo với thân cây một góc lớn hơn 45 độ, cành ngắn lóng ngắn. Nếu
sử dụng để nhân giống cây sẽ nhanh chóng ra hoa quả, song tuổi thọ của cây
thấp. Trong sản xuất có thể trồng 10% diện tích bằng loại cành này để sớm
thu hoạch. Cành cho thu hoạch quả trên cây, cần được bảo vệ.

o Dây lươn mọc từ các nách lá gần gốc cây, bò trên mặt đất, lóng dài, không
cho thu hoạch quả. Nếu dùng làm hom giâm sẽ cho các cây tiêu chậm cho
thu hái quả (4 – 5 năm), tuổi thọ của cây dài cho năng suất cao. Trong sản
xuất cần tỉa bỏ cành lươn để tập trung dinh dưỡng nuôi quả.
2.2.2.5.

Hoa quả và hạt tiêu:

Hoa tiêu mọc thành gié trên cành ác, mỗi gié dài 7 – 12 cm có từ 20 – 60
hoa/gié, sắp xếp theo hình xoắn ốc. Hoa lưỡng tính hay hoa đơn tính. Hoa đơn có
màu vàng hay màu xanh nhạt, 2- 4 nhị đực và 1 nhị cái. Từ khi xuất hiện gié đến
khi hoa nở là 30 ngày. Sự thụ phấn của hoa không phụ thuộc vào gió, mưa hay côn
trùng mà các hoa trên sẽ thụ phấn cho hoa dưới, thụ phấn khác hoa trên cùng một
gié. Sự thụ phấn của hoa phụ thuộc rất nhiều vào độ ẩm của đất và không khí.

HV Bùi Tuấn Tú

Luận văn Thạc sĩ


- 15 -

Quả tiêu có dạng hình cầu, bên trong có 1 hạt. Thời gian hoa nở đến khi trái
chín là 7- 10 tháng chia ra các thời kỳ như sau:
o Hoa xuất hiện và thụ phấn 1 – 1.5 tháng
o Thụ phấn đạt kích thước tối đa 3 - 4.5 tháng
o Kích thước tối đa – chín 2 – 3 tháng.
Trong thời gian phát triển thì hạt tiêu cần nhiều nước nhất.
Hạt tiêu cấu tạo hai lớp bên ngoài là vỏ hạt, bên trong có chứa phôi nhũ và
các phôi. Hạt tiêu là cơ quan cho thu hoạch sản phẩm trên cây tiêu.

2.2.3. Đặc điểm phân bố
Cây tiêu phân bố ở các vùng có khí hậu nhiệt đới ẩm, đặc tính của khí hậu
để đáp ứng cho sự phát triển của cây tiêu là lượng mưa lớn từ 2000 – 4000 mm,
nhiệt độ ổn định từ 25 – 32 độ C, độ ẩm tương đối cao 65 – 95%. Chính vì vậy cây
tiêu phát triển tốt nhất ở vùng có vó độ là 20 độ bắc và 20 độ Nam và nằm cao hơn
mặt nước biển khoảng 120m. Với đặc điểm phân bố này nên ta thường thấy cây
tiêu được trồng và cho năn g suất cao ở một số vùng/ quốc gia như: Braxin, Ấn Độ,
Malaysia, Indonesia, Thai Lan, Srilanka (IPC) và một số quốc gia như Việt Nam,
Trung Quoác, Madagasca, Mexico (Non - IPC) ( P. N. Ravidan – 2000)
Cây tiêu có thể phân bố ở một biên độ pH rộng từ 4.5 – 6.5

HV Bùi Tuấn Tú

Luận văn Thạc sĩ