Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-------------------------

LÂM XUÂN UYÊN

LÊN MEN FED-BATCH LACTOCOCCUS SP. THU NHẬN
BACTERIOCIN VÀ ỨNG DỤNG TRONG
BẢO QUẢN LÒNG ĐỎ TRỨNG VỊT MUỐI
Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2010


i

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô trong bộ môn Công nghệ
sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn.
Em chân thành gởi lịng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thúy Hương, người
đã tận tình hướng dẫn em trong thời gian thực hiện luận văn. Cô luôn ở bên cạnh
động viên và giúp đỡ em tận tình những lúc khó khăn nhất. Cơ cho em hiểu được
tâm huyết, tấm lòng tận tụy và sự tận tâm của người thầy đối với học trị. Cơ đối với
em vừa là người thầy, vừa như người thân trong gia đình. Cơ ơi, em cảm ơn cơ rất
nhiều. Em cũng gởi lời cảm ơn chân thành đến cô Nguyễn Thị Thùy Dương, người
đã hướng dẫn em hoàn thành phần đầu của luận văn.
Cuối cùng, con xin cảm ơn ba mẹ, cảm ơn Phúc cùng với anh Ngân đã luôn
ủng hộ và động viên em trong thời gian qua. Chị cũng cảm ơn em Thảo đã giúp đỡ

chị trong lúc làm luận văn.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 2 tháng 1 năm 2010
Lâm Xuân Uyên


ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN
- Đề tài luận văn: “Lên men fed-batch Lactococcus sp. thu nhận bacteriocin và
ứng dụng trong bảo quản lòng đỏ trứng vịt muối”.

- Học viên thực hiện: Lâm Xuân Uyên.
- Cán bộ hướng dẫn: TS Nguyễn Thúy Hương.
- Thời gian thực hiện: Từ tháng 6/2009 đến tháng 12/2009.
Nội dung đề tài:
1. Xác định đặc điểm giống Lactococcus sp.
2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch ni cấy.
3. Tối ưu hố điều kiện ni cấy quy mơ phịng thí nghiệm.
4. Lên men quy mơ fermenter.
5. Ứng dụng nisin bảo quản lòng đỏ trứng vịt muối.
Kết quả đề tài:
1. Xác định đặc điểm giống Lactococcus sp.: có khả năng sinh bacteriocin là sản
phẩm trao đổi chất bậc một sau 17h lên men.
2. Xác định đặc điểm kháng khuẩn của dịch nuôi cấy: dịch nuôi cấy kháng khuẩn
mạnh ở pH 3.8, kháng các vi khuẩn Gram dương mạnh hơn Gram âm.
3. Tối ưu hố điều kiện ni cấy quy mô PTN: môi trường nuôi cấy tối ưu là
MRS với sucrose 14g/l, peptone 13g/l.
4. Nuôi cấy fed-batch thu nhận bacteriocin.
Theo kết quả đạt được thì fed-batch chế độ 4 g/l.h là hiệu quả nhất, thu được
dịch lên men có hoạt tính kháng khuẩn cao (101 712IU/ml) sau 5h ni cấy.

5. Dùng màng BC hấp phụ nisin để kéo dài thời gian bảo quản lòng đỏ trứng vịt
muối:
- Lòng đỏ trứng được muối trong dung dịch nước muối 15%, 650C, trong 24h.
- Điều kiện để màng BC hấp phụ nisin tối ưu là 12.50C, 45 phút, lắc 180
vòng/phút.
- Dùng màng BC hấp phụ nisin bảo quản lòng đỏ trứng muối là tốt nhất, mẫu
đạt trong thời gian theo dõi bảo quản 30 ngày.


iii

Một phần kết quả trên thể hiện qua 2 bài báo đã đăng:
[1] Lâm Xuân Uyên, Nguyễn Thúy Hương, Huỳnh Tấn Thạnh (2009). Lên men
nuôi cấy bổ sung theo đợt (fed-batch) Lactococcus sp. để thu nhận hợp chất kháng
khuẩn (bacteriocin). Tạp chí KH&CN Nơng nghiệp và phát triển nơng thơn, 133, 3035.
[2] Lâm Xuân Uyên, Nguyễn Thúy Hương, (2009). Bacteriocins production by
Lactococcus sp. in fed-batch culture. Hội nghị Khoa học và Công nghệ lần thứ 11,
Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia tp. Hồ Chí Minh.


iv

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn…………………………………………………………………………i
Tóm tắt luận văn……………………………………………………………………ii
MỤC LỤC…………………………………………………………………………iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT……………………………………………………vii
DANH MỤC BẢNG……………………………………………………………...viii

DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………………x
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU……………………………………………………………1
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Khái quát vi khuẩn lactic ……………………………………………………3

2.2. Các hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn lactic………………………………….4
2.2.1. Bacteriocin từ vi khuẩn lactic …………………………………………….4
2.2.1.1 Khái niệm chung về bacteriocin………………………………….4
2.2.1.2 Đặc điểm hoá lý -Phân loại………………………………………5
2.2.1.3 Cơ chế sinh tổng hợp và kháng khuẩn………………………….6
2.2.1.4 Sự lên men và điều hòa sinh tổng hợp………………………….11
2.2.1.5 Ứng dụng của bacteriocin………………………………………11
2.2.2 Các hợp chất kháng khuẩn khác…………………………………………13
2.2.2.1. Lactic axit, các axit hữu cơ dễ bay hơi và ethanol………………13
2.2.2.2. Hydrogen peroxide ………………………………………………14
2.2.2.3. Carbon dioxide…………………………………………………..15
2.2.2.4. Diacetyl …………………………………………………………15
2.3. Phương pháp nuôi cấy batch, fed-batch ………………………………………15
2.4.1. Batch ………………………………………………………………..15
2.4.2. Fed- batch……………………………………………………………17


v

2.4 Màng bacterial cellulose (BC)…………………………………………………19
2.4.1 Vi khuẩn Acetobacter xylinum………………………………………19
2.4.2 Màng BC……………………………………………………………..20
2.5 Sản phẩm trứng vịt muối………………………………………………………23

2.6 Các nghiên cứu trong và ngoài nước…………………………………………...25
2.6.1 Các nghiên cứu trong nước……………………………………………26
2.6.2 Các nghiên cứu ngoài nước…………………………………………...27
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nguyên vật liệu………………………………………………………………..31
3.1.1. Các chủng vi sinh vật………………………………………………...31
3.1.2. Môi trường ni cấy………………………………………………….31
3.2. Phương pháp phân tích ………………………………………………………..32
3.2.1. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang………...32
3.2.2. Xác định lượng sinh khối khô………………………………………...33
3.2.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn……………………………………...33
3.2.4. Xác định nồng độ protein trong dung dịch …………………………..34
3.2.6 Phương pháp Morh…………………………………………………..35
3.2.6. Phương pháp tính hệ số µ trong batch và fed-batch………………….36
3.2.7. Phương pháp tối ưu hoá thực nghiệm yếu tố toàn phần ……………..37
3.2.8. Phương pháp tối ưu hoá thực nghiệm đường dốc nhất……………....38
3.3. Phương pháp tiến hành thí nghiệm……………………………………………39
3.3.1.

Những nghiên cứu làm tiền đề cho lên men fermenter thu nhận

bacteriocin………………………………………………………………………….40
3.3.1.1 Khảo sát đặc điểm giống Lactococcus sp……………………….40
3.3.1.2. Đặc điểm kháng khuẩn của dịch nuôi cấy……………………...40
3.3.1.3. Tối ưu điều kiện nuôi cấy quy mô PTN………………………..41
3.3.2. Lên men quy mô fermenter…………………………………………..45
3.3.2.1 Lên men theo mẻ………………………………………………..45
3.3.2.2 Lên men fed-batch………………………………………………48



vi

3.3.3 Khảo sát khả năng bảo quản lòng đỏ trứng vịt muối bằng màng BC hấp
phụ nisin …………………………………………………………………………..49
3.3.3.1 Tối ưu điều kiện hấp phụ nisin vào màng BC…………………..50
3.3.3.2 Tối ưu điều kiện muối lòng đỏ trứng……………………………55
3.3.3.3 Khảo sát khả năng bảo quản lòng đỏ trứng muối bằng màng BC
hấp phụ nisin………………………………………………………………………56
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & BÀN LUẬN
4.1 Những nghiên cứu làm tiền đề cho lên men fermenter thu nhận bacteriocin…58
4.1.1 Đặc điểm giống Lactococcus sp………………………………………58
4.1.2. Đặc điểm kháng khuẩn của dịch nuôi cấy …………………………...60
4.1.2.1. pH tối ưu để bacteriocin thể hiện hoạt tính …………………….60
4.1.2.2. Phổ kháng khuẩn của dịch ni cấy.............................................61
4.1.3. Tối ưu hố điều kiện ni cấy quy mơ PTN …………………………62
4.1.3.1. Sàng lọc nguồn cacbon, nitơ …………………………………...62
4.1.3.2. Tối ưu hố thành phần mơi trường theo phương pháp đường dốc
nhất .................................................................................................................64
4.1.3.3 Tối ưu hố điều kiện ni cấy …………………………………..67
4.2 Lên men quy mô fermenter……………………………………………………71
4.2.1. Lên men theo mẻ ở fermenter ………………………………………..71
4.2.2. Lên men fed-batch ở fermenter ………………………………………73
4.2.2.1. Khảo sát cơ chất giới hạn cho nuôi cấy fed-batch …………….74
4.2.2.2. Lên men fed-batch……………………………………………...74
4.3 Khảo sát khả năng bảo quản lòng đỏ trứng vịt muối bằng màng BC hấp phụ
nisin ……………………………………………………………………………….78
4.3.1 Tối ưu điều kiện hấp phụ nisin vào màng BC………………………...78
4.3.1.1 Tạo màng mỏng BC bằng phương pháp lên men truyền
thống………………………………………………………………………………78
4.3.1.2


Tối ưu quá trình hấp phụ nisin vào màng BC………………..81

4.3.2 Tối ưu điều kiện muối lòng đỏ trứng………………………………..86


vii

4.3.3 Bảo quản lòng đỏ trứng muối bằng màng BC hấp phụ nisin………..91
4.3.3.1 Đánh giá chất lượng cảm quan theo thời gian bảo quản………..92
4.3.3.2 Tổng số vi khuẩn hiếu khí theo thời gian bảo quản…………….94
4.4.4.3 Đánh giá chất lượng chung……………………………………..95
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận……………………………………………………………………98
5.1 Đề nghị…………………………………………………………………….98
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ………………………99
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………….100
PHỤ LỤC………………………………………………………………………..105


viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BC: bacterial cellulose, cellulose của vi khuẩn.
PTHQ: phương trình hồi quy
QHTN: quy hoạch thực nghiệm
TSVKHK: tổng số vi khuẩn hiếu khí


ix


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn……………………………………..19
Bảng 2.2: Thành phần dinh dưỡng của trứng.............................................................24
Bảng 3.1: Thông số tối ưu thành phần môi trường ………………………………..42
Bảng 3.2: Số liệu thí nghiệm leo dốc với sucrose và peptone……………………..43
Bảng 3.3: Thông số tối ưu điều kiện nuôi cấy……………………………………..43
Bảng 3.4: Cách bố trí thí nghiệm đo bề dày màng………………………………..53
Bảng 3.5: Thiết kế thí nghiệm quy hoạch thực nghiệm hấp phụ dịch nisin vào màng
BC.............................................................................................................................54
Bảng 3.6: Thiết kế thí nghiệm leo dốc hấp phụ dịch nisin vào màng BC…………54
Bảng 3.7: Thiết kế thí nghiệm quy hoạch thực nghiệm muối lịng đỏ trứng vịt…..55
Bảng 3.8: Thiết kế thí nghiệm leo dốc muối lòng đỏ trứng vịt …………………...56
Bảng 3.9: Khảo sát phương pháp bảo quản trứng vịt muối. ………………………57
Bảng 4.1: Hoạt tính kháng khuẩn thể hiện theo pH………………………………..60
Bảng 4.2: Phổ kháng khuẩn của dịch nuôi cấy..........................................................61
Bảng 4.3: Ảnh hưởng nguồn cacbon, nitơ đến hoạt tính kháng khuẩn…………….63
Bảng 4.4: Kết quả tối ưu thành phần mơi trường......................................................64
Bảng 4.5: Kết quả các thí nghiệm ở tâm………………………………………….. 65
Bảng 4.6: Kết quả thí nghiệm leo dốc……………………………………………...67
Bảng 4.7: Kết quả tối ưu hố điều kiện ni cấy theo QHTN……………………..68
Bảng 4.8: Kết quả khảo sát % giống……………………………………………… 69
Bảng 4.9: Kết quả khảo sát nhiệt độ nuôi cấy…………………………………….. 70
Bảng 4.10: Kết quả khảo sát pH môi trường nuôi cấy……………………………..70
Bảng 4.11: Kết quả khảo sát cơ chất giới hạn……………………………………...73
Bảng 4.12: Tóm tắt các chế độ và kết quả………………………………………….77
Bảng 4.13: Đặc điểm sinh hóa của chủng Acetobacter xylinum. …………………80
Bảng 4.14: Bề dày màng BC ……………………………………………………...80
Bảng 4.15: Khảo sát phổ kháng khuẩn của nisin…………………………………..82



x

Bảng 4.16: Số liệu thu được sau khi thực hiện mơ hình qui hoạch thực nghiệm hấp
phụ nisin vào trong màng………………………………………………………….83
Bảng 4.17: Hệ số của phương trình hồi quy……………………………………….84
Bảng 4.18: Kết quả lượng nisin hấp phụ vào màng BC ở thí nghiệm leo dốc…….85
Bảng 4.19: Kết quả kháng khuẩn của màng BC hấp phụ nisin……………………86
Bảng 4.20: Kết quả quy hoạch thực nghiệm muối lòng đỏ trứng vịt. …………….87
Bảng 4.21: Hệ số của phương trình hồi quy tối ưu quá trình muối trứng…………87
Bảng 4.22: Kết quả thí nghiệm leo dốc muối lòng đỏ trứng………………………88
Bảng 4.23: Kết quả ảnh hưởng của CaCl2 đến cấu trúc sản phẩm…………………90
Bảng 4.24: Đánh giá cảm quan lòng đỏ trứng muối theo thời gian bảo quản……..92
Bảng 4.25: Đánh giá chung các phương pháp bảo quản lòng đỏ trứng muối……..97
Bảng 4.26: Kết quả vi sinh của Trung tâm phân tích dịch vụ thí nghiệm…………97


xi

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Sơ đồ phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương…………………6
Hình 2.2: Sơ đồ sinh tổng hợp nisin A……………………………………………..8
Hình 2.3: Tổ chức của nhóm gen nisin…………………………………………….8
Hình 2.4: Mơ hình điều hịa sinh tổng hợp nisin………………………………….10
Hình 2.5: Sơ đồ tóm tắt sự lên men lactic đồng hình từ glucose………………….14
Hình 2.6: Cấu trúc màng BC......................................................................................21
Hình 2.7: Sự sinh tổng hợp màng BC........................................................................22
Hình 2.8: Con đường dự đốn sự sinh tổng hợp và tiết ra cellulose khi glucose được
tế bào A. xylinum hấp phụ...........................................................................................23
Hình 2.9: Quy trình sản xuất trứng vịt muối .............................................................25

Hình 2.10: Các ứng dụng chủ yếu của BC................................................................26
Hình 3.1: Sơ đồ thí nghiệm chung…………………………………………………39
Hình 3.2: Sơ đồ lên men theo mẻ…………………………………………………..45
Hình 3.3: Lên men Lactococcus sp. bằng fermenter tự động………………………46
Hình 3.4: Sơ đồ lên men fed-batch………………………………………………...48
Hình 3.5: Sơ đồ thí nghiệm bảo quản lịng đỏ trứng muối ………………………..49
Hình 3.6: Các bước lên men thu nhận màng BC thơ………………………………50
Hình 3.7: Các bước xử lý màng BC……………………………………………….52
Hình 4.1: Khuẩn lạc Lactococcus sp……………………………………………….58
Hình 4.2: Tế bào Lactococcus sp. nhuộm Gram…………………………………...58
Hình 4.3: Đường cong sinh trưởng của Lactococcus sp. 1% giống, 300C, khơng
lắc…............................................................................................................................59
Hình 4.4: Vịng kháng khuẩn ở pH 3.8 .....................................................................61
Hình 4.5: Động học lên men theo mẻ không điều khiển pH……………………….71
Hình 4.6: Động học lên men theo mẻ điều khiển pH 6.0…………………………..72
Hình 4.7: Động học lên men fed-batch 3 g/l.h, pH 6.0…………………………….74
Hình 4.8: Động học lên men fed-batch 4 g/l.h, pH 6.0…………………………….75
Hình 4.9: Động học lên men fed-batch 5 g/l.h, pH 6.0…………………………….76


xii

Hình 4.10: Tế bào Acetobacter xylinum nhuộm Gram……………………………78
Hình 4.11: Khuẩn lạc Acetobacter xylinum…………………………………………….79
Hình 4.12: Lịng đỏ trứng sau 24h ngâm ở các chế độ ngâm khác nhau………….88
Hình 4.13: Sự thay đổi nồng độ muối trong trứng theo thời gian ở các chế độ ngâm
trứng khác nhau……………………………………………………………………89
Hình 4.14: Lịng đỏ trứng muối trong dung dịch có CaCl2 ở các nồng độ khác
nhau………………………………………………………………………………..91
Hình 4.15: Lịng đỏ trứng muối sau 4 tuần bảo quản……………………………..93

Hình 4.16: TSVKHK của lịng đỏ trứng theo thời gian bảo quản…………………95


CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU


1

1.1

Đặt vấn đề

Hiện nay trong lĩnh vực thực phẩm, các chất phụ gia thu nhận từ tự nhiên đang
có khuynh hướng thay thế dần các phụ gia hóa học do sự tích lũy độc tính của các
phụ gia hóa học. Một số chất bảo quản tự nhiên đang được sử dụng như lysozyme,
acid hữu cơ, hệ dung dịch đệm hoặc các chất kháng sinh…. Trong đó bacteriocin,
kháng sinh có bản chất protein tự nhiên do vi khuẩn sinh ra, rất có tiềm năng trong
việc thay thế dần các chất bảo quản hóa học. Hầu hết các loại vi khuẩn đều có khả
năng sinh bacteriocin nhưng vi khuẩn Gram dương tạo ra bacteriocin có phổ kháng
khuẩn rộng hơn vi khuẩn Gram âm. Do đó, bacteriocin của vi khuẩn Gram dương
được chú ý và nghiên cứu rộng rãi hơn vi khuẩn Gram âm. Hơn nữa, trong các loại
vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn lactic có khả năng tạo protein kháng sinh rất đa
dạng và là vi sinh vật công nghiệp với nhiều ưu điểm. Vì thế, bacteriocin từ vi
khuẩn lactic đang được nghiên cứu nhiều trên thế giới. Ở Việt Nam, bacteriocin
cũng đang được nghiên cứu, chủ yếu tập trung vào phân lập các giống có khả năng
sinh bacteriocin và một số ứng dụng của bacteriocin. Dựa vào giống vi khuẩn lactic
có khả năng sinh bacteriocin đã được phân lập, đề tài hướng đến mục tiêu cải thiện
hiệu suất thu bacteriocin bằng các phương pháp lên men trên giống vi khuẩn lactic
này.

Trong kỹ thuật lên men có ba phương pháp chính: lên men theo mẻ, fed-batch
và liên tục. Phương pháp lên men theo mẻ đơn giản, dễ thực hiện, tuy nhiên hiệu
suất khơng cao do sự tích lũy cơ chất, độc chất. Phương pháp lên men fed-batch có
thể khắc phục được nhược điểm này, thu được bacteriocin hiệu suất cao, tuy nhiên
sự tự động hóa khơng cao. Lên men liên tục tự động hóa cao nhưng kỹ thuật phức
tạp, phải tiệt trùng liên tục. Do đó, trong phạm vi bài báo cáo này, chúng tôi ứng
dụng phương pháp fed-batch để cải thiện hiệu suất thu nhận bacteriocin.
Một trong các ứng dụng quan trọng của bacteriocin là làm phụ gia thực
phẩm. Nhằm đa dạng hóa ứng dụng của bacteriocin, trong luận văn này, chúng tơi
sử dụng nisin bảo quản lịng đỏ trứng vịt muối. Trứng vịt muối theo phương pháp
truyền thống có nhược điểm thời gian muối trứng lâu và lịng trắng khơng sử dụng


2

được. Do đó, muối lịng đỏ để rút ngắn thời gian muối trứng và tạo ra bán thành
phẩm cho việc sản xuất các thực phẩm khác nhau như: bánh trung thu, bánh pía…
[28, 30]. Nisin là bacteriocin được sản xuất từ vi khuẩn lactic đã được thương mại
hóa và được chấp nhận là chất bảo quản thực phẩm an toàn trên 50 quốc gia, vì có
bản chất protein tự nhiên, khơng có sự tích lũy độc chất, an tồn khi sử dụng. Để
tăng thời gian hoạt động của nisin, hấp phụ nisin vào màng sau đó dùng bao gói
thực phẩm, tránh nisin bị hấp phụ hết vào thực phẩm, mất hoạt tính nhanh. BC là
màng cellulose vi khuẩn, an tồn, bền cơ học, có độ trương nở, hấp phụ nisin dễ
dàng. Do đó, màng BC hấp phụ nisin được sử dụng để khảo sát khả năng bảo quản
của nisin đối với sản phẩm lòng đỏ trứng vịt muối.
1.2 Mục tiêu
Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu để ứng dụng phương pháp lên men fedbatch thu nhận chế phẩm bacteriocin hiệu suất cao.
Ứng dụng nisin để kéo dài thời gian bảo quản lòng đỏ trứng vịt muối.
1.3 Nội dung
 Xác định đặc điểm giống Lactococcus sp.

 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch ni cấy.
 Tối ưu hố điều kiện nuôi cấy quy mô PTN.
 Lên men quy mô fermenter.
 Ứng dụng nisin bảo quản lòng đỏ trứng vịt muối.


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


3

2.1 Khái quát vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic được xếp vào họ Lactobacteriaccae. Chúng có thể là cầu
khuẩn, trực khuẩn ngắn hoặc dài nhưng đều là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào
tử và hầu hết không chuyển động. Chúng khơng có catalase nhưng sống được trong
điều kiện có oxy khơng khí vì có peroxydase phân giải H2O2 thành oxy khơng khí
nên gọi là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện [25].
Sự phân bố của vi khuẩn lactic trong tự nhiên càng chứng tỏ những vi khuẩn
này có yêu cầu dinh dưỡng cao và khả năng phân giải để thu năng lượng của chúng
lớn [25]. Những vi khuẩn lactic ít gặp trong đất, nước mà thường thấy ở:
 Trong sữa và các sản phẩm của sữa: Lactobacillus lactis, L.
bulgaricus, L. helveticus, L. casei, L. fermenti, L. brevis, Streptococcus lactis, Str.
diacetilactis.
 Trên bề mặt của thực vật và xác cây đang phân giải thường gặp:
Lactobacillus plantarum, L. delbruckii, L. fermenti, L. brevis, Streptococcus lactis,
Leuconostoc mesenteroides.
 Trong ruột và ở lớp màng nhầy của người và động vật có:
Lactobacillus acidophilus, Streptococcus faecalis, Str. salivarius, Str. bovis, Str.
pyogenses, Pneumococcus.

Nhóm vi khuẩn lactic là nhóm vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng nhất trong
cơng nghiệp sữa; thực phẩm lên men truyền thống, dùng sản xuất men tiêu hóa
trong y học và dùng để ủ chua thức ăn gia súc trong cơng nghiệp. Ngồi ra, vi
khuẩn lactic đóng góp vào khả năng cảm nhận và bảo quản thực phẩm bởi các chất
kháng khuẩn như: lactic, acetic axit, hydrogen peroxide và bacteriocin…


Vi khuẩn lactic là vi sinh vật công nghiệp với các ưu điểm:

Không sinh độc tố hoặc sản phẩm gây độc
Khơng gây bệnh do đó được sử dụng cùng với thực phẩm
Là vi khuẩn hiếu khí tuỳ tiện, địi hỏi q trình lên men đơn giản.
Phát triển nhanh, địi hỏi q trình lên men ngắn.


4

Dùng trong công nghiệp thực phẩm qua nhiều năm, được nuôi cấy trên quy
mô lớn.
Lên men với nhiều cơ chất rẻ như whey, phế phẩm thực vật, tinh bột thuỷ
phân.
Sự phát triển của chúng ngăn cản sự hư hỏng và sự tạp nhiễm.
Có thể sinh protein.
Biểu hiện protein đồng hình và dị hình [25].
2.2. Các hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn lactic
2.2.1. Bacteriocin từ vi khuẩn lactic
2.2.1.1. Khái niệm chung về bacteriocin
 Khái niệm
Kháng sinh (antibiotic) là những chất do sinh vật tạo ra và có khả năng tiêu
diệt vi sinh vật khác với liều lượng đủ nhỏ [7].

Như vậy chất hoá học nào được gọi là kháng sinh phải đảm bảo hai yêu cầu
cơ bản:
- Phải được sinh vật tạo ra.
- Với liều lượng nhỏ, có khả năng tiêu diệt sinh vật khác.
Vậy, bacteriocin là kháng sinh, được sản xuất từ vi khuẩn, có bản chất protein
tự nhiên, chống lại các lồi vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi.
 Lịch sử nghiên cứu
Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn
Gram âm.
Bacteriocin được khám phá lần đầu tiên năm 1925, khi Gratia khám
phá khả năng ức chế E. coli V của E. coli F, và đặt tên cho chất kháng sinh
đó là colicins. Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm: gồm nhiều loại protein khác nhau
về kích thước, nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn
dịch. Bacteriocin vi khuẩn Gram âm có khả năng ức chế yếu hơn bacteriocin vi
khuẩn Gram dương.
Bacteriocin từ vi khuẩn Gram dương đầu tiên được khám phá năm


5

1947, đặt tên là nisin, do vi khuẩn lactic sinh ra [13]. Bacteriocin của vi khuẩn Gram
dương: các bacteriocin này cũng nhiều như ở vi khuẩn Gram âm. Tuy nhiên, chúng
khác với ở vi khuẩn Gram âm ở hai điểm sau: việc tạo bacteriocin không cần thiết
phải gây chết cho vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram
dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm [19], [28].
Bacteriocin khác biệt với kháng sinh ở những điểm chủ yếu sau:
- Bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome
- Tế bào chủ miễn dịch với chúng
- Phương thức hoạt động khác biệt với kháng sinh
- Phổ kháng khuẩn hẹp vì vậy thường chỉ có khả năng tiêu diệt những chủng

vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất.
Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, trong đó LAB được
quan tâm nhiều nhất do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng và có tiềm
năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm [40].
2.2.1.2. Đặc điểm hoá lý -Phân loại
 Đặc điểm hoá lý
Bacteriocin là protein có bản chất tự nhiên, protein ngoại bào. Nhiều
bacteriocin không thể được phân lập khi vắng mặt tế bào sản xuất. Bacteriocin có
tính kỵ nước, tích điện dương, điểm đẳng điện cao. Độ ổn định hoạt tính của chế
phẩm bacteriocin thường giảm đột ngột khi tăng độ tinh sạch.
Một số loại bacteriocin có khả năng chịu nhiệt, bền nhiệt như nisin, lactacin
B, lactacin S…. Các hoạt động ức chế của chúng xảy ra trên môi trường rắn
không trong môi trường lỏng. Bacteriocin có bản chất protein nên sẽ ngưng
hoạt động bởi proteolytic enzyme (trypsin, a-chymotrypsin, pepsin…), nhưng nó
cũng là chìa khố để phân lập bacteriocin [25].
 Phân loại
Dựa vào cấu trúc, khối lượng phân tử và khả năng chịu nhiệt, bacteriocin của
vi khuẩn lactic được chia làm 4 loại chính (hình 2.1) [13]. Khố phân loại được
chấp nhận bởi hầu hết các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực này:


6

 Nhóm 1: bacteriocin có biến đổi sau dịch mã, gọi là lantibiotic peptides, ví
dụ: nisin, lacticin 481…
 Nhóm 2: bacteriocin kích thước nhỏ (<10 kDa), bền nhiệt (từ trên 30ph,
1000C đến 15 ph, 1210C), ví dụ: diplococcin, lactacin B …
 Nhóm 3: bacteriocin kích thước lớn (>30 kDa), nhạy với nhiệt độ (khơng
hoạt động ở 10-15 ph, 60-1000C). Ví dụ: helveticin J, lactacin A và B…
 Nhóm 4: bacteriocin có peptide vịng. Ví dụ: enterrocin AS-48, gassericin

A….

Hình 2.1: Sơ đồ phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương [26].
2.2.1.3. Cơ chế sinh tổng hợp và kháng khuẩn
Bacteriocin có bản chất protein nên được tổng hợp theo cơ chế phiên mã và
dịch mã ở ribosome. Chúng là chromosome (nisin, lactocin 27, lactococcin…) hoặc
plasmid (diplococcin, lacticin 481…) đã mã hoá. Trong trường hợp carnobacteriocin
B1 gồm cả chromosome và plasmid DNA được bao hàm trong hoạt động của


7

bacteriocin.


Cơ chế sinh tổng hợp chung: bacteriocin được sản xuất như tiền thân

protein (pre-peptide) với sự duỗi ra của xoắn N-terminal của 18-24 amino axits. Các
amino axit này sẽ bị loại ra trong quá trình dịch mã để tạo protein trưởng thành. Tuy
nhiên vai trò của leader peptide này đến nay vẫn chưa được biết, nó khơng có vai trị
được mong đợi trong chuỗi dấu hiệu của vi khuẩn. Các leader peptide này được dự
đoán rằng sẽ bị tách ra để tạo thành peptide trưởng thành trước khi vào môi trường vi
khuẩn. Pre-peptide chịu q trình chuyển hố đặc hiệu riêng biệt từ peptidase, đó là
do sự tiết ra bacteriocin để đáp ứng lại sự dịch chuyển của protein qua màng. Thêm
vào đó, pre-peptide phải chịu sự biến đổi của enzyme biến đổi sau dịch mã.
Nisin thuộc nhóm lantibiotic, do Lactococcus lactis sinh ra, là bacteriocin có
đặc điểm bao quát nhất. Được khám phá năm 1928 trước penicillin, nisin là kháng
sinh peptide được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm như là chất bảo
quản an toàn và tự nhiên [10].



Cơ chế sinh tổng hợp nisin A (hình 2.2):

Sự tạo thành pre-peptide ở ribosome qua cơ chế phiên mã và dịch mã.
Pre-peptide chuyển thành tiền peptide (procursor peptide) với những biến
đổi sau quá trình dịch mã bao gồm sự tách nước của serine hoặc threonine còn lại
(sau khi loại N-terminal Met) và sự hình thành cầu thioether ((ß-methyl)
lanthionines).
Sự tách leader peptide để tạo nisin trưởng thành, nisin có khả năng hoạt
động, gồm 5 chuỗi cấu trúc A, B, C, D và E. [35]


8

Hình 2.2: Sơ đồ sinh tổng hợp nisin A [11].

• Sự tổng hợp nisin đòi hỏi sự biểu hiện và hoạt động của ít nhất 11 gene sản
xuất, mỗi gen có một vai trị trong sự hình thành nisin (hình 2.3):

Hình 2.3: Tổ chức của nhóm gen nisin [10].


9

NisA mã hoá cho tiền peptide (precursor peptide) của nisin A, gồm
57 amino axite.
NisB và nisC mã hoá cho putative enzymes liên quan đến phản ứng biến đổi
sau phiên mã (dựa vào sự tương đồng để gen tìm thấy loại trừ những nhóm gen
lantiboitic khác).
NisT mã hố cho putative protein của nhóm vận chuyển ABC, liên quan đến

sự đi ra của những biến đổi tiền nisin.
NisP mã cho protease ngoại bào neo ở màng có thể tách leader peptide để
giải phóng hoạt động của nisin.
NisI mã cho lipoprotein liên quan đến sự tự bảo vệ chống lại nisin. Mặc dù
phần lớn sự

xuất hiện của nisI được giới hạn trong phạm vi có màng

cytoplasmic, một số lượng đáng kể cũng được tiết ra ở cystoplasm, nơi mà có lẽ
liên kết với nisin bên ngoài trước khi tập hợp ở bề mặt tế bào.
NisFEG là

phức hợp protein vận chuyển ABC, cũng đáp ứng lại sự

miễn dịch nisin theo cách tương tự được dùng để vận chuyển multi-drug, bằng
sự giảm nồng độ nisin trong sự tiếp xúc trực tiếp với màng tế bào.
NisK và nisR là 2 thành phần điều khiển hệ thống, được đặc trưng ở pha log
trễ.
NisK là đầu dò histidine kinase (sensor histidin kinase), nisR điều khiển đáp
ứng. Thật thú vị khi nisin tự nó là ligand được nhận ra bởi sensor nisK, nisin điều
khiển ngược lại sự biểu hiện của chúng.
 Sự sinh tổng hợp và điều hoà nisin trong tế bào, gồm 5 bước
(hình 2.4):
Bước 1: NisK cảm nhận sự có mặt của nisin trong tế bào và tự phosphoryl
hố.
Bước 2: Nhóm phosphat được chuyển vào nisR hoạt hoá sự phiên mã gồm
sự tổng hợp mARN và sự tổng hợp ribosome của unmodified-precursor nisin và
của protein sinh tổng hợp. Sau đó precursor nisin được tổng hợp.
Bước 3: Precursor nisin bị biến đổi bởi putative enzyme, nisB, nisC.



10

Bước 4: precursor peptide đã được biến đổi hoàn toàn được di chuyển dọc
theo màng bởi protein vận chuyển putative ABC, nisT.
Bước 5: tiền nisin đã biến đổi hoàn toàn được đi ra ngoài tế bào nhờ nisP,
tách leader peptide giải phóng hoạt động của nisin. NisI cùng với nis FEG bảo vệ tế
bào khỏi hoạt động của bacteriocin nisin với cơ chế chưa được biết rõ [34].

Hình 2.4: Mơ hình điều hịa sinh tổng hợp nisin [34].


Cơ chế kháng khuẩn và phổ kháng khuẩn
• Cơ chế kháng khuẩn
Giả thuyết được chấp nhận rộng rãi hiện nay về cơ chế kháng khuẩn

của bacteriocin là qua 2 bước:
Bước 1: Đích chính của bacteriocin sinh bởi vi khuẩn lactic là màng
cytoplasmic. Bacteriocin sẽ liên kết với các đầu mang điện tích của phospholipid
trên màng hoặc liên kết với các receptor, theo cơ chế đặc hiệu hoặc không đặc hiệu.
Bước 2: Bacteriocin chèn vào màng, hình thành các lỗ trên màng tế
bào, làm thay đổi tính thấm của màng, gây rối loạn sự di chuyển qua màng hoặc làm
tiêu tan lực chuyển động của proton dẫn đến sự ngăn cản việc sản sinh năng lượng,
sinh tổng hợp protein hoặc amino axit.
Các yếu tố ảnh hưởng đến cơ chế kháng khuẩn: nồng độ tế bào sử dụng, độ
tinh sạch của chất ức chế, loại sinh vật chỉ thị, canh trường hoặc dung dịch đệm [25].