Bài giảng ADB tái tổ hợp

<span class='text_page_counter'>(1)</span>Chương IV. ADN TÁI TỔ HỢP Plant genetic biotechnology lab. Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(2)</span> Bản chất Enzyme cắt giới hạn. Kể tên vector. ADN Tái tổ hợp????. Vector. Bản chất enzyme nối. Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(3)</span> Giới thiệu • Kỹ thuật ADN tái tổ hợp (DNA recombinant), là kỹ thuật cho phép tạo ra phân tử ADN chứa nhiều trình tự ADN khác nhau của nhiều sinh vật khác nhau. • Kỹ thuật ADN tái tổ hợp được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như sản xuất protein, xây dựng thư viện gen, chuyển gen. Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(4)</span> Hệ thống enzyme sử dụng trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp. • Enzyme cắt giới hạn – 1950 : Luria Bertani : thực khuẩn Lamda không xâm nhiễm được một số chủng E. Coli. – 1965 : Werner Arber (Nobel 1978) chứng minh rằng ADN của thực khuẩn bị phân huỷ : ông đưa ra giả thuyết là do hoạt tính của một enzym từ VK tiết ra enzym này được đặt tên là enzym giới hạn. – 1970 : Hamilton Smith và Daniel Nathans (Nobel 1978) tinh sạch từ VK Haemophilus influenzae một enzym endonuclease có khả năng cắt AND ngoại (virus SV40) ở vị trí chuyên biệt : enzym cắt giới hạn đầu tiên được khám phá Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(5)</span> Tên gọi của enzym giới hạn • Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tên VK từ đó RE được trích • Hai chữ kế ko viết hoa tương đương với tên loài của VK • Kế đến là chữ số la mã chỉ thứ tự RE được phát hiện (cùng một VK) • Đôi khi còn có thêm chữ viết hoa để chỉ chủng VK sd – – – –. VD : Escherichia coli giống loài EcoRI: enzym đầu tiên tìm thấy EcoRV: enzym thứ 5 tìm thấy Lop10.com. Ry13 chủng.

<span class='text_page_counter'>(6)</span> Các loại enzym giới hạn • Loại I: Khi enzym nhận biết trình tự nó sẽ di chuyển trên phân tử AND cách đó 1000-5000 nu và giải phóng độ vài chục nu • Loại II: Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó • Loại III: enzym nhận biết trình tự và cắt AND ở vị trí cách đó 20 nu. Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(7)</span> RE loại II • Cắt mạch đôi AND ở những vị trí nhất định • Nhận biết một trình tự đặc trưng gồm vài bp(4-10 thông dụng nhất là 6bp). • Trình tự càng dài, các đoạn AND cắt càng lớn • Khi cắt có thể tạo đầu bằng hoặc đầu so le • VD: • EcoRI cắt ở vị trí G AATTC (đầu so le) CTTAA G • EcoRV cắt ở vị trí GAT ATC (đầu bằng) CTA TAG Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(8)</span> Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(9)</span> Một số dạng khác của RE • RE Mbo và Sau3AI cùng nhận biết trình tự (isoschizomers) 5’…GATC…3’ 3’…CTAG…5’ • RE nhận biết trình tự không đặc hiệu Ví dụ NspI GGGCCC có thể thay thế A, T • RE BglI GCCNNNNGGC • Vị trí N có thể thay bất kỳ loại nào trong 4 loại nu. Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(10)</span> Một số quy tắc khi thực hiện phản ứng cắt bằng RE – Nồng độ NaCl của dd đệm, nếu phải sd nhiều RE có nồng độ NaCl của dd đệm khác nhau thì nên cắt với RE có nồng độ NaCl thấp trước rồi đến RE cần NaCl nồng độ cao hơn – RE được bảo quản trong dd đệm có 50% glycerol ở -200C, nên thêm vào phản ứng sau cùng, thời gian để bên ngoài càng ngắn càng tốt – Thể tích pư càng nhỏ càng có hiệu quả vì RE và DNA tiếp xúc với nhau càng tốt tuy nhiên phải bảo đảm thể tích RE ko quá 1/10 thể tích pư vì glycerol nhiều sẽ gây ức chế hoạt động của RE Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(11)</span> Các lọai dung dịch đệm cho phản ứng cắt bằng RE. Một số RE cần buffer đặc trưng như trường hợp enzyme SmaI phải sử dụng hỗn hợp buffer đặc biệt bao gồm: 20 mM KCl, 10 mM Tris.Cl (pH 8), 10 mM, MgCl2, và 1 mM dithiothreitol. Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(12)</span> Ứng dụng • • • •. Cắt bộ gen khổng lồ của eucaryote Tạo thư viện gen Lập bản đồ giới hạn Sử dụng trong kỹ thuật RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) phân tích đa dạng di truyền của sinh vật • Chuyển gen từ sinh vật này sang sinh vật khác Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(13)</span> Enzyme nối - lygase • Trong tự nhiên enzymes ADN ligase sửa chữa sự đứt đoạn trên một sợi đơn ADN (nick) hoặc nối các đoạn okasaki của sợi sao chép chậm (lagging strand). • Phản ứng nối đoạn (ligation) chỉ có thể được thực hiện khi ở sợi bị đứt đoạn đầu 3’có nhóm OH tự do và đầu 5’ có gốc phosphate • Khi cắt phân tử ADN bằng các RE 5’ ACGG TAATCGCCA 3’ 3’TGCCATTA + GCGGT 5’ E.Coli ADN ligase ACGGTAATCGCCA Lop10.com TGCCATTAGCGGT.

<span class='text_page_counter'>(14)</span> T4 ligase. Enzyme phổ biến trong kỹ thuật tạo dòng Cần cơ chất ATP làm cơ chất trung gian. Phản ứng nối đoạn của enzyme T4Lop10.com ADN ligase.

<span class='text_page_counter'>(15)</span> Enzyme alkaline phosphate • Có thể cắt bỏ gốc phosphat ở đầu 5’ trong mt kiềm (có nguồn gốc từ ruột non bò – CIPcalf intestinal phosphatase) • Vector không tự tái tạo vòng • Chỉ AND ngoại lai không bị cắt gốc phosphat mới có thể nối với vector. Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(16)</span> Enzyme alkaline phosphate. Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(17)</span> Hệ thống vector sử dụng trong ADN tái tổ hợp •. •. Khái niệm vector Vector là một ADN thường có dạng vòng có khả năng xâm nhập vào tế bào chủ (E.coli hoặc nấm men) và mượn bộ máy của tế bào chủ để tạo ra nhiều bản sao giống hệt vector ban đầu. Phương pháp phân lập ADN plasmid. Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(18)</span> Bước 1 Sau khi thu hồi và làm sạch các tế bào có chứa plasmid, người ta xử lý trong hỗn hợp SDS, EDTA hoặc NaOH làm ADN sợi đôi biến tính thành ADN sợi đơn nằm cạnh nhau. Bước 2 Xử lý hỗn hợp trên trong môi trường đệm (NaCH3COO+CH3COOH) để kết tủa protein và SDS dạng tập hợp. Bước 3 Đưa về môi trường trung tính, ADN sợi đơn được hồi tính trở lại. Còn ADN (NST) do dài nên hồi tính chậm và kết tủa cùng SDS. Tách ADN plasmid bằng cách kết tủa trong ethanol hoặc izopropanol, sau đó ly tâm tách được plasmid tinh sạch. Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(19)</span> Các đặc tính của một vector • • • • • •. • •. Có khả năng sao chép tích cực, độc lập bên trong tế bào chủ Dễ xâm nhậpvào tế bào chủ Có khả năng tiếp nhận DNA lạ Có những đặc tính giúp dễ phát hiện tế bào có chứa chúng (được mã hoá bởi các gen chọn lọc) Tồn tại lâu dài nhưng ít làm xáo trộn tế bào chủ Có vị trí nhận biết duy nhất của một số enzym cắt giới hạn, các vị trí này thường đặt vào giữa các gen chọn lọc (điều này làm cho khi có một đoạn DNA lạ gắn vào vị trí cắt thì cũng gắn vào giữa gen chọn lọc làm bất hoạt gen ấy) Kích thước càng nhỏ càng ưu thế vì sẽ thu nhận được một lượng DNA ngọai lai tối đa Một vector càng có nhiều đặt tính nêu trên càng tỏ ra ưu thế, hiện nay có nhiều loại vector: plasmid, phage, cosmid, YAC, BAC,…Tuỳ theo kích thước đoạn DNA và mục đích tạo dòng mà lựa chọn vector phù hợp. Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(20)</span> Các nhóm vector. Nhóm 1: plasmid Nhóm 2: Phage/phagemid Nhóm 3: Nhiễm sắc thể nhân tạo (artificial chromosome: BAC và YAC). Lop10.com.

<span class='text_page_counter'>(21)</span>