Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở

BÀI 01:

HỐ HỌC GLUCID
1.Thí nghiệm 01 : Phản ứng Molish
1.1 Nguyên tắc :
Các hợp chất của glucid đều cho màu tím với dung dịch α - naphtol trong mơi trường H2SO4 đậm đặc
1.2 Thuốc thử (tt) : Molish
Dung dịch α - naphtol 01 g pha trong alcol 900
1.3 Tiến hành :
Chuẩn bị : 04 ống nghiệm sạch , khô
Các hợp chất khác nhau của glucid
Thuốc thử Molish 1%
Tiến hành :
Ống nghiệm 01 : 01 ml ( or 20 giọt) dd glucose 1 %
Ống nghiệm 02 : 01 ml ( or 20 giọt) dd fructose or Maltose 1 %
Ống nghiệm 03 : 01 ml ( or 20 giọt) dd lactose 1 %
Ống nghiệm 04 : 01 ml ( or 20 giọt) dd Hồ tinh bột 1%
Tiếp theo cho vào mỗii ống nghiệm trên 3 giọt tt molish , lắc đều .
Tiếp theo nghiêng ống và cho vào từ từ ( chảy theo thành ống ) 10 –15 giọt H2SO4đđ
Chú ý : Lúc này không làm xáo trộn 02 lớp của dd trong ống nghiệm .
Quan sát lớp ranh giới giữa 2 dd trong ống ngiệm
Kết luận được gì về ý nghĩa của phản ứng Molish ?

2.Thí nghiệm 02 : Phản ứng Fehling
2.1. Nguyên tắc :
Các monosaccharide (MS) đều chứa nhóm chức khử (aldehyd hoặc ceton ) , chúng có khả năng khử
các ion kim lọai nặng (Cu 2+ ) trong môi trường kiềm mạnh , đun nóng để giải phóng kim lọai hoặc oxyd
kim lọai có hóa trị thấp hơn và các MS sẽ bị oxyhóa thành acid .

2.2. Thuốc thử :
Thuốc thử Fehling : Gồm 02 dung dịch
+ Dd A : CuSO4 . 5H2O kết tinh
35 g
H2SO4 đđ
06 ml
Nước cất vừa đủ
1000 ml
+ Dd B : KOH or NaOH
135 g
Muối Na. Kali . Tartrat
150 g
Nước cất vừa đủ
1000 ml
Trước khi dùng , trộn 02 dd A và B vớI thể tích 1:1 . Thuốc thử Felling trong suốt có màu xanh lam.
Chú ý : Sinh viên không phải pha ( vì GV đã chuẩn bị trước ).

Trang 1


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
1.3 Tiến hành :
Chuẩn bị : - 05 ống nghiệm sạch, khô đánh số từ 01 tớii 05
- thuốc thử Fehling
- Các hợp chất khác nhau của glucid
- Bếp điện , pipette v…v…
Tiến hành :
Ống nghiệm 01 : 01 ml ( or 20 giọt) dd glucose 1 %
Ống nghiệm 02 : 01 ml ( or 20 giọt) dd Maltose 1 %

Ống nghiệm 03 : 01 ml ( or 20 giọt) dd lactose 1 %
Ống nghiệm 04 : 01 ml ( or 20 giọt) dd Hồ tinh bột 1%
Ống nghiệm 05 : 01 ml ( or 20 giọt ) dd Saccarose 1%
Tiếp theo cho vào mỗi ống 01 ml dd thuốc thử Fehling , lắc đều các ống nghiệm
Tiếp theo đem đun sôi 05 ống nghiệm trên / 3 phút
Nhận xét các ống nghiệm và giải thích .
3.Thí

nghiệm 03 :Phản ứng màu của Polysaccharide

3.1 Nguyên tắc :
Các Polysaccharide (PS) kết hợp với Iode cho những phức hợp có màu khác nhau tuỳ mức độ phân tử
PS
Nếu là tinh bột : sẽ có màu xanh dương
Nếu là Glycogen : sẽ có màu đỏ nâu.
3.2 Thuốc thử :
Dung dịch hồ tinh bột 1%
Dung dịch Lugol 0.1 % : gồm Iode 0.1g
KI 0.2 g trộn chung , tán nhỏ cho tan hết với một ít nước cất
(ED) rồi thêm vừa đủ 100 ml
3.3 Tiến hành :
Chuẩn bị :
- 01 ống nghiệm sạch
- 01 miếng khoai lang đã luộc chín cắt mỏng
Tiến hành :
a- Cho vào ống nghiệm 01 ml ( or 20 giọt ) dd hồ tinh bột 1% , thêm vào 1 giọt dd Lugol
0,1% . Quan sát màu xuất hiện
b - Trên 01 miếng khoai cho vào 1 giọt Lugol 0,1 % .
Quan sát và giải thích hai thí nghiệm trên .
4.


Thí nghiệm 04 : Phản ứng Barfoed

4.1 Nguyên tắc :
Sự khử trong môi trường acid acetic giúp phân biệt được MS và DS .
Với MS tủa đỏ xuất hiện sớm , tủa nhiều trong thời gian 5 –7 phút
Với DS mà có tính khử , tủa chậm ,ít sau 7 –12 phút .
Trang 2


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
4.2 Thuốc thử :
Thuốc thử Barfoed gồm có
- Acetat đồng
60g
- CH3COOH glacial :
13ml
- Nước cất
900 ml
4.3 Tiến hành :
Chuẩn bị : 02 ống nghiệm sạch, khô
- thuốc thử Barfoed
- Các hợp chất khác nhau của glucid
- Bếp điện , pipette v…v…
Tiến hành :
Ống nghiệm 01 : 01 ml ( or 20 giọt) dd glucose 1 %
Ống nghiệm 02 : 01 ml ( or 20 giọt) dd lactose 1 %
Tiếp theo cho vào mỗi ống 02 ml dd thuốc thử Barfoed, lắc đều ống nghiệm
Đem đun sôi cách thủy.

Ghi nhận thời gian và mức độ tủa xuất hiện ở mỗi ống , quan sát sau 2 phút / 01 lần , nhận xét

BÀI 02

HĨA HỌC LIPID
1. Thí nghiệm 01 : Khảo sát tính hịa tan
1.1 Ngun tắc :
Dựa vào tính chất vật lý của hợp chất lipid có khả năng hịa tan trong các lọai dung môi khác nhau
1.2 Tiến hành :
Chuẩn bị : 02 ống nhiệm sạch, khô
Nước cất, Alcool or Acetone
Các bước tiến hành :
Ống nghiệm 01 : 01 ml ( or 20 giọt ) Nước cất
Ống nghiệm 02: 01 ml (or 30 giọt dung môi Alcool or Acetone )
Tiếp theo cho vào mỗi ống 02 giọt dầu ăn
Lắc kỹ , nhận xét kết quả 02 ống nghiệm trên .

2. Thí nghiệm 02 : Phản ứng xà phịng hóa acid béo
2.1 Nguyên tắc :
Dưới tác dụng trong môi trường kiềm , các glycerid bị thủy phân tạo thành glycerol và muối của acid
béo
2.2. Tiến hành :
Chuẩn bị : 01 bình nón sạch , khơ
Dung dịch dầu ăn

Trang 3


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở

Dung dịch NaOH 10% ( pha trong alcoo 900 )
Dung dịch nước cất , bếp điện , pipette.
Dung dịch HCl đđ.
Các bước tiến hành :
Cho vào bình nón : 0,5 ml (or 10 giọt ) dầu ăn , tiếp theo cho vào 2,5 ml dd NaOH 10%
Đun cách thủy khỏang 10 phút , cứ sau 02 phút lắc đều bình cho đến khi dầu tan hết trong dd
NaOH 10% , tiếp tục đun đến khi dung dịch trở nên quánh . Lấy ra
Chú ý : Cẩn thận trong quá trình thao tác, tránh sự cố xảy ra .
Tiếp theo hòa tan xà phịng trong bình nón vớii 10 ml nước cất , đun cho tan ra thành dung dịch
lỏng .
Phân chia vào 01 ống nghiệm khỏang 5 ml ( để dành làm thí nghiệm 03) , phần cịn lại ở trong
bình nón (5 ml)
Tiếp theo cho vào bình nón 10 giọt HCl đđ , lắc mạnh , tiếp tục đun 2 – 4 phút
Quan sát hiện tượng và cho biết thành phần của chúng trong bình nón.
Viết các phương trình phản ứng xảy ra.

3. Thí nghiệm 03 : Khảo sát sự nhũ tương hóa lipid
3.1 Nguyên tắc :
Dầu (or mỡ) khơng hịa tan trong nước , khi tác động mạnh sẽ tạo thành nhữ tương không bền ( nếu
để yên một thời gian chúng phân chia làm 02 lớp dầu ở trên , nước ở dưới ) Nếu thêm một chất làm
nhũ tương hóa ( Na2CO3 , protein , muối mật) thì sẽ tạo thành nhữ tương bền .
3.2 Tiến hành :
Chuẩn bị :
- Dung dịch xà phòng ( ống nghiệm 05 ml đã chuẩn bị ở TN trên )
- Nước cất
- Dung dịch Na2CO3 10%
- Lòng trắng trứng
Các bước tiến hành :
- Tiến hành theo các bước mô tả ở bảng sau :
Nước cất

Dầu ăn
Na2CO3
10%
Xà phòng
TN 02
Lòng
trắng
trứng

Ống N0 01
10 ml
02 giọt
02 giọt

Ống N0 02
10 ml
02 giọt

Ống N0 03
10 ml
02 giọt

02 giọt
02 giọt

Tiếp theo : Lắc mạnh , để yên 05 phút

Trang 4

Ống N0 04

10 ml
02 giọt


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
Quan sát hiện tượng xảy ra mỗi ống và giải thích

4. Thí nghiệm 04 : Phản ứng màu định tính Cholesterol ( P.ứng Liebermann Burchard)
4.1 Nguyên tắc :
Cholesterol tác dụng anhydric acetic cùng vớii sự hiện diện H2SO4 cho ra phức hợp có màu xanh lục
4.2 Tiến hành :
Chuẩn bị :

01 ống nghiệm sạch và khô
Dung dịch H2SO4 đđ
Dung dịch Anhydric acetic
Dung dịch Sulfo salycilic 12%

Các bước tiến hành :
Ống nghiệm 01
Dd cholesterol 200 mg%
Dung dịch Sulfo salycilic 12%
Anhydric acetic
H2SO4 đđ

2 giọt
0,5 ml
1,5 ml
0,2 ml ( or 4 giọt)


Lắc đều để trong bóng tốii 10 phút .
Quan sát màu của dung dịch .

BÀI 03

HĨA HỌC PROTID
1. Thí nghiệm 01 : Phản ứng Ninhydrin
1.1 Nguyên tắc :
Ninhydrin là chất oxyhóa mạnh , có khả năng khử carboxyl oxy hóa acid amin tạo thành CO2 , NH3
và andehyd kém 01 carbon so với acid amin ban đầu . Sau đó Ninhydrin bị khử tác dụng lại với NH3
vừa được phóng thích và kết hợp với một phân tử Ninhydrin thứ hai ,tạo thành sản phẩm ngưng kết
có màu xanh tím .
1.2 Thuốc thử :
Dung dịch Ninhydrin 0,1%
Ninhydrin
0,1g
0
Alool 96
10 ml
Hòa tan rồi thêm
Nước cất vừa đủ
100 ml
1.3 Tiến hành :
Chuẩn bị :
04 ống nghiệm sạch, khô đánh số 01 đến 04
Dung dịch glycin
0,1%
Dung dịch tryptophan
0,1%


Trang 5


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
Dung dịch protein lòng trắng trứng 0,1%
Dung dịch gelatin
0,1%
Tiến hành :

Ống N0 01 Ống N0 02 Ống N0 03

Dung dịch glycin 0,1%
Dung dịch tryptophan 0,1%
Dung dịch protein lòng trắng
trứng 0,1%
Dung dịch gelatin 0,1%
Thuốc thử Ninhydrin 0,1%

Ống N0
04

01 ml
01 ml
01 ml
5 giọt

5 giọt


5 giọt

01 ml
5 giọt

Lắc đều, đun sôi cách thủy 5 –10 phút
Quan sát màu phản ứng , giải thích .

2. Thí nghiệm 02 : Phản ứng Adamkewich
2.1 Nguyên tắc :
Các acid amin có chứa nhóm Indol ( Tryptophan ) dướii tác dụng của acid mạnh như H2SO4 ,
Tryptophan sẽ phản ứng với acid glyoxylic để cho một phức chất có màu tím . Acid glycoxylic là
một chất tạp thường đi theo acid acetic và phản ứng này xảy ra ở nhiệt độ thường .
2.2 Tiến hành
Chuẩn bị :

- 02 ống nghiệm sạch, khô
- Dung dịch Tryptophan 0,1%
- Dung dịch Lòng trắng trứng 0,1%
- Dung dịch H2SO4 đđ
- Dung dịch CH3COOH đđ

Tiến hành :
Dung dịch Tryptophan 0,1%
Dung dịch Lòng trắng trứng 0,1%
Dung dịch CH3COOH đđ
Dung dịch H2SO4 đđ nhỏ từ từ vào
thành ống tránh làm xáo trộn lớp
dung dịch


Ống N0 01
01 ml

Ống N0 02

01 ml

01 ml
01 ml

01 ml

01 ml

Quan sát màu hiện ra ở mặt phân cách 02 lớp dung dịch.

3. Thí nghiệm 03 : Phản ứng Biuret
3.1 Nguyên tắc
Trong môi trường kiềm , các liên kết peptid trong protein sẽ kết hợp Ion của kim lọai nặng như Cu2+
cho một phức chất màu tím.
Trang 6


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
3.2 Tiến hành :
Chuẩn bị :

01 ống nghiệm sạch, khô .
Dung dịch CuSO4 1%

Dung dịch NaOH 40 %
Lòng trắng trứng 0,1%

Tiến hành :
Cho vào ống nghiệm theo trình tự :
Dung dịch lòng trắng trứng 0,1%
Dung dịch NaOH 40 %
Dung dịch CuSO4 1%

1 ml
0,5 ml
03 giọt

Lắc đều và quan sát màu của phản ứng .

4. Thí nghiệm 04 : Phản ứng tủa Protein bởi nhiệt với môi trường acid nhẹ.
4.1 Nguyên tắc
Protein hòa tan trong nước thành dung dịch keo ưa nước, trong dung dịch các tiểu phân protein cùng
lọai tích điện cùng dấu , xung quanh tiểu phân protein có lớp áo nước ( phân tử lưỡng cực liên kết các
nhóm phân cực như –OH , - COOH, -NH2 ,=NH…).Nhờ hai yếu tố trên , protein tồn tại dưới dạng
dung dịch keo bền vững .
Sự tủa của protein :
Protein sẽ kết tủa rõ ràng nếu đồng thời làm mất hai yếu tố hịa tan trên như sau:
• Làm mất điện tích của tiểu phân protein bằng cách:
- Đưa pH của dung dịch protein về pH đẳng điện (pHi) của protein đó , Khi pH của dd bằng
với pHi của protein, đa số các protein ở dạng lưỡng cực , không mang điện tích.
- Thêm chất điện giải NaCl, NH4SO4 … các ion này trung hịa điện tích của tiểu phân
protein .
• Làm mất lớp áo nước bằng cách :
- Gây biến tính protein , cấu trúc protein sẽ bị đảo lộn bằng cách đun sôi, thêm muối kim

lọai nặng , thêm acid, kiềm mạnh …
- Thêm các chất hút nước : NH4SO4 , alcool etylic …
4.2 Thuốc thử
Dung dịch Acid acetic 1%
Dung dịch Acid acetic 10%
Dung dịch NaCl bão hòa
Dung dịch NaOH 10%
4.3 Tiến hành
Chuẩn bị 05 ống nghiệm sạch khơ
Làm theo các bước trình tự được mơ tả bảng sau :
Ống N0
01
Trang 7

Ống N0
02

Ống N0
03

Ống N0
04

Ống N0
05


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
Lòng trắng trứng

Dung dịch Acid acetic 1%
Dung dịch Acid acetic 10%
Dung dịch NaCl bão hòa
Dung dịch NaOH 10%

01 ml

01 ml
02 giọt

01 ml

01 ml

01 ml

05 giọt
02 giọt
02 giọt

Lắc đều, đun sôi cách thủy các ống nghiệm 3 –5 phút .
Quan sát tủa hình thành và nhận xét mức độ khác nhau của các ống nghiệm . Giải thích .

5. Thí nghiệm 05 : Phản ứng tủa Protein bởii Acid mạnh và khơng đun nóng
5.1 Ngun tắc
Các acid vơ cơ, hữu cơ mạnh làm biến tính đại đa số protein
5.2 Thuốc thử
Dung dịch Lòng trắng trứng 0,1%
Dung dịch TCA 30%
Dung dịch H2SO4 đđ.

5.3 Tiến hành :
Dung dịch Lòng trắng trứng 0,1%
Dung dịch TCA 30%
Dung dịch H2SO4 đđ (nhỏ từ từ vào thành ống
nghiệm )

Ống N0 01
02 ml
01 ml

Ống N0 02
02 ml
01 ml

Trộn đều và quan sát

BÀI 04

ENZYM
1. Thí nghiệm 01 : Họat động của enzym thủy phân (α - Amylase)
1.1. Nguyên tắc
Dưới tác dụng của Amylase , tinh bột hoặc glycogen bị thủy phân qua các sản phẩm trung gian là
dextrin , cuối cùng là maltose. Dưới tác dụng của maltase , maltose bị thủy phân thành glucose . Sản
phẩm trung gian dextrin có nhiều lọai nên khi tác dụng với iode sẽ cho phức hợp có màu sắc khác
nhau .
Tinh bột + Iode

Amylodextrin

Erythrodextrin


Acrodextrin
Maltose

Trang 8


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
( Xanh
Tím
Đỏ nâu
1.2 Thuốc thử
Dung dịch tinh bột 0,5%
Dịch nước bọt 1/10
Dung dịch Iode N/200
Thuốc thử Fehling
1.3 Tiến hành
Chuẩn bị : -

vàng nâu

Vàng )

Một ống nghiệm sạch, khô
Một khay sứ có nhiều lỗ.
Pipette, đồng hồ bấm giây .

Tiến hành :


A- Trong một ống nghiệm cho vào:
Dung dịch tinh bột 0.5%
2 ml
Dịch nước bọt chứa enzym 1 ml
Trộn đều để ở nhiệt độ phịng thí nghiệm , cứ sau 01 phút lấy 1 giọt dung dịch trong ống nghiệm
nhỏ lên lỗ khay sứ đã cho sẵn 1 giọt dung dịch iode 1/200 .
Khi dung dịch này không chuyển màu iode nghĩa là tinh bột ban đầu đã thủy phân hết thành
maltose
B – Tiến hành kiểm tra bằng phản ứng Fehling
Thêm 1 ml thuốc thử Fehling vào ống nghiệm còn lại , đem đun sôi / 5 phút

Quan sát phản ứng màu trên khay sứ và ống nghiệm. Nhận xét

2.Thí nghiệm 02 : Khảo sát yếu tố ảnh hưởng bởi nhiệt lên họat tính enzym
2.1 Nguyên tắc
Dưới tác dụng của urease , ure bị thủy phân tạo thành NH3 và CO2 , sản phẩm thủy phân này làm pH môi
trường trở thành kiềm . Phát hiện sản phẩm tạo thành bằng phenolphtalein .
2.2 Thuốc thử
Dung dịch Urê 1.5%
Dung dịch phenolphtalein 0.5%
Dung dịch Urease : nghiền đậu tương với nước , lọc lấy nước trong
2.3 Tiến hành :
Cho vào 03 ống nghiệm :
Dung dịch Urease
Để 5 phút ở nhiệt độ
Dung dịch Urê 1.5%
Để tiếp 5 phút nhiệt độ trên , sau đó lấy ra
Dung dịch phenolphtalein 0.5%

Ống N0 01

0,5 ml
280C
2 ml

Ống N0 02
0.5 ml
60 0C
2 ml

Ống N0 03
0,5 ml
1000C
2ml

3 giọt

3 giọt

3 giọt

Nhận định kết quả : Quan sát sự đổi màu trong 03 ống nghiệm , nhận xét và giải thích .
Trang 9


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
3.

Thí nghiệm 03 : Đo họat tính enzym AST trong huyết tương


Nguyên tắc
α - Ceto glutarat + L. Aspartat
3.1

AST

L . Glutamat + Oxaloacetat

Oxaloacetat + NADH + H+
3.2

3.3

3.4

L. Malat + NAD+

MDH
Mẫu thử
Huyết thanh or huyết tương ( kháng đông Heparine )
Thuốc thử
Dạng kit pha sẵn , gồm các hóa chất sau đây :
A – Buffer/ Substrate ( Reagent 01)
Tris buffer pH 7.5
L. Aspartate
B- Enzym/Coenzym ( Reagent 02)
α - ceto glutarate
Tiến hành

Thuốc thử pha sẵn (R2 pha trong R1 )

Huyết thanh ( hay huyết tương)

Ống nghiệm sạch, khơ
500 µ l
50 µ l

Trộn đều , Chú Ý : đọc nhanh để tránh sai lệch kết quả .
Chương trình trên máy Humalyzer 2000 số 33 or 34
Họat độ AST Huyết tương ( U/L) : = 1746 x ∆A /min
Ý nghĩa lâm sàng : AST có nhiều trong gan tim và cơ
Họat độ AST bình thường trong huyết tương đo 370 C
Nam: < 37 U/L
Nữ < 35U/L
Họat độ AST tăng chủ yếu gặp trong các bệnh lý sau
Nhồi máu cơ tim
Bệnh nhu mô gan
Bệnh lý về cơ xương
4. Thí nghiệm 04 : Đo họat tính enzym ALT trong huyết tương
Nguyên tắc
α - Ceto glutarat + L.Alanin
4.1

ALT

L . Glutamat + Pyruvat

Pyruvat + NADH + H+

L. Lactat + NAD+
LDH


Trang 10


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
Mẫu thử
Huyết thanh or huyết tương ( kháng đông Heparine )
4.3 Thuốc thử
Dạng kit pha sẵn , gồm các hóa chất sau đây :
A – Buffer/ Substrate ( Reagent 01)
Tris buffer pH 7.5
L. Alanin
B- Enzym/Coenzym ( Reagent 02)
α - ceto glutarate
4.2

4.4

Tiến hành :

Thuốc thử pha sẵn (R2 pha trong R1 )
Huyết thanh ( hay huyết tương)

Ống nghiệm sạch, khơ
500 µ l
50 µ l

Trộn đều , Chú Ý : đọc nhanh để tránh sai lệch kết quả .
Chương trình trên máy Humalyzer 2000 số 33 or 34

Họat độ ALT Huyết tương ( U/L) : = 1746 x ∆A /min
Ý nghĩa lâm sàng : ALT có nhiều trong gan và ít ở các mơ khác
Họat độ ALT bình thường trong huyết tương đo 370 C
Nam: < 40 U/L
Nữ < 35U/L
Họat độ ALT tăng chủ yếu gặp trong các bệnh lý sau
Viêm gan cấp tính và mạn tính
Bệnh về họai tử gan
Tắc mật …

BÀI ĐỌC THÊM
NGUYÊN TẮC CÁC XÉT NGHIỆM HÓA SINH LÂM SÀNG
THƯỜNG DÙNG QUA PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG
1.Phương

pháp đo điểm cuối ( End-point method)

Đo số lượng sản phẩm tạo thành từ thời điểm t0 bắt đầu đến thời điểm t kết thúc phản ứng , khi tất cả
chất cần xác định ( substrate ) đã được tiêu thụ hết
Có thể đo và tính kết quả : So với chuẩn (standard) or so với hệ số (Factor)
• kỹ thuật thực hiện :
1.1 Phương pháp hóa học :
Dùng các phản ứng hóa học đặc hiệu cho chất cần xác định

Trang 11


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở


2. Phương

VD : Định lượng protein bằng phản ứng Biuret
Định lượng glucose bằng phản ứng Ortho- Toluidine
1.2 Phương pháp Enzym
Dùng enzym là thuốc thử tác dụng đặc hiệu , chuyên biệt trên chất cần xác định
VD : Định lượng Urê dùng enzym Urease
Định lượng Cholesterol sử dụng enzym cholesterol oxidase
pháp động học ( Kinetic Method)

Theo dõi động học, một cách liên tục quá trình diễn tiến của phản ứng , qua các thời điểm t0, t1, t2 v…v
trong khoảng tiến tính của phản ứng.
• Kỹ thuật thực hiện :
Đo vận tốc tạo thành sản phẩm từ thời điểm t0, t1, t2 …
Hoạt tính enzym được tính bằng cách : F x ∆ A/min
Đơn vị : UI/L
Kỹ thuật này được áp dụng để xác định hoạt tính của các thơng số enzym ( ALT, AST,
amylase, CPK, ALP …)
Lưu ý : Trị số đối chiếu ( giá trị bình thường ) của các thông số tùy thuộc vào loại kỹ thuật
xét nghiệm , điều kiện tiến hành, nhiệt độ… ngòai ra các biến thiên sinh lý cũng có thể
gây ảnh hưởng lên kết quả XN . Khi nhận định kết quả lưu ý các yếu tố trên.

BÀI 05
CHUYỂN HĨA GLUCID
1.

Thí nghiệm 01 : Định lượng glucose huyết thanh

1.1 Phương pháp Somogyi Nelson :
Nguyên tắc

Glucose khử dung dịch thuốc thử sulfate đồng thành Oxyt đồng nhất (Cu2O) .Tủa màu đỏ của Cu2O dễ
bị oxy hóa khơng đo trực tiếp được sẽ tác dụng với arsenomolybdate , khử chất này thành oxid molybdin
màu xanh , đo được trên máy quang phổ kế.
Phản ứng thực hiện trong mơi trường kiềm nóng.
1.2 Phương pháp O. Toluidin
Ngun tắc
Trong mơi trường acid acetic đun nóng với sự hiện diện của Thiourea. Glucose trong huyết thanh sẽ kết
hợp với O.Toluidin cho ra một phức chất màu xanh lục , màu này tỉ lệ thuận với nồng độ Glucose trong
huyết thanh và được đọc trên máy quang phổ kế.
1.3. Phương pháp Enzym
1.3.1 Nguyên tắc
Glucose trong huyết thanh bị oxy hóa bởi enzym glucose oxidase cho ra Gluconic acid và hydrogen
peroxide. Hydrogen peroxide sẽ kết hợp vớp phenol và 4 amino antipyrin với sự hiện diện của enzym
peroxidase sẽ cho một phức chất có màu hồng tím .
1.3.2 Thuốc thử
Trang 12


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
Dạng kit có sẵn bao gồm :
Reagen 01 (R1)
Phosphate buffer pH = 7.4
Phenol
Reagen 02 (R2)
Enzym Glucose oxidase
Enzym Peroxidase
4.amino antipyrin
Chai dung dịch chuẩn (standard ) nồng độ 100 mg/dl ( 5,55 mmol/L)
1.3.3 Kỹ thuật tiến hành

Ống N0 Bệnh nhân
(Unknoun
500 µl
5 µl

Thuốc thử pha sẵn
Huyết thanh BN
Glucose Standard

Ống N0 chuẩn
( Standard)
500 µl
5 µl

Trộn đều, để nhiệt độ PTN .Đọc kết quả sau 10 phút
Chương trình máy Humalyze 2000 số 09
1.3.4 Ý nghĩa lâm sàng
Trị số bình thường : 75 –115 mg/dl
- Glucose máu tăng ( > 6,1 mmol/L) gặp trong bệnh :
Tiểu đường do tụy
Bệnh cường tuyến thượng thận
U tuyến yên
Nhiễm độc tuyến giáp
- Glucose máu giảm (< 4,2 mmol/L) gặp trong bệnh :
Nhịn đói kéo dài
U thân tụy ( u adenoma, carcinoma)
Thiểu năng các tuyến nộI tiết ( vỏ thượng thận, tuyến yên, tuyến giáp)
Tổn thương vùng dướI đồI
Bệnh lý về gan (xơ gan nặng)
Nhiễm độc các chất Asen, CCl4

2.

Định tính sơ bộ glucose trong nước tiểu

2.1 Phương pháp Benedict
2.1.1 Nguyên tắc
Glucose trong nước tiểu khử dung dịch đồng sulfate trong mơi trường kiềm,tạo thành hợp chất Cu2O có
tủa màu đỏ gạch.
2.1.2 Thuốc thử
Thuốc thử Benedict
CuSO4
17.3g
Na2CO3
100g
Trang 13


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
Na. Citrate
Nước cất cho đủ

173 g
1000 ml

Hòa tan riêng CuSO4 vào 100ml ED , xong đổ từ từ vào hỗn hợp Na2CO3 + Na citrate
2.1.3

2.1.4


Tiến hành
Trong một ống nghiệm sạch, khô (19 x 150 mm) cho vào:
Thuốc thử Benedict
2.5 ml
Nước tiểu bất kỳ (BN)
4 giọt
Đun sôi, cách thủy , thời gain 5 phút
Lấy ra làm nguội, đọc kết quả
Kết quả :
Âm tính (-) : Dung dịch có màu xanh dương
Dương tính (+) : Dung dịch đổi xanh lục và có tủa màu vàng xanh
Dương tính (++):Dung dịch đổi màu vàng và có tủa màu vàng nhạt
Dương tính (+++): Tủa vàng đậm
Dương tính (++++): Tủa vàng cam đến đỏ gạch

2.2 Phương pháp giấy nhúng ( xem trong bài nước tiểu)

BÀI 06
CHUYỂN HĨA LIPID
1. Thí nghiệm 01 : Định lượng Cholesterol trong huyết thanh
1.1 Phương pháp Rappoporrt Eichhorn
Nguyên tắc :
Dùng acid sulfosalysilic để phá hủy protein và cầu nối lipoprotein trong huyết thanh phóng thích ra
cholesterol. Cholesterol sẽ kết hợp với H2SO4 đđ để cho ra hợp chất Cholestadien sulfonic acid có màu
xanh lục
1.2 Phương pháp enzym ( PP CHO-PAP với hóa chất kit của Human)
1.2.1 Nguyên tắc
Cholesterol trong huyết thanh dưới tác dụng enzym cholesterol esterase và cholesterol oxidase sẽ
được chuyển thành Cholesteron và H2O2. Sau đó H2O2 kết hợp chất tạo màu 4 amino antipyrin có sự
hiện diện enzym peroxidase tạo ra phức chất có màu đỏ . Đo trực tiếp máy quang phổ kế

1.2.2 Thuốc thử
Dạng kit pha sẵn gồm có :
- Đệm phosphate ( pH =6,5)
100 mmol/ L
- 4 – Amino-antipyrin
0,25 mmol/L
- Phenol
5 mmol/L
- Peroxidase
> 5U/L

Trang 14


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
- Cholesterol esterase
> 150 U/L
- Cholesterol oxidase
> 100 U/L
- Sodium azid
0,05%
Dung dịch cholesterol chuẩn 200 mg/dl ( 5,17 mmol/L)
1.2.2

Kỹ thuật tiến hành :
Ống N0 Bệnh nhân
(Unknoun)
500 µl
5 µl


Thuốc thử pha sẵn
Huyết thanh BN
Cholesterol Standard

Ống N0 chuẩn
( Standard)
500 µl
5 µl

Trộn đều, để nhiệt độ PTN .Đọc kết quả sau 10 phút
Chương trình máy Humalyze 2000 số 06
1.2.3

Ý nghĩa lâm sàng
- Trị số bình thường Cholesterol < 200 mg/dl ( or < 5,7 mmol/L)
- Khi nồng độ cholesterol tăng cần phối hợp với xét nghiệm khá để biện luận
- Cholesterol tăng trong trường hợp sau
+ Cao thứ phát : Đái tháo đường , thiểu năng tuyến giáp , viêm tụy cấp , viêm tụy mạn , thận hư
nhiểm mỡ.
+ Cao nguyên phát : Bệnh bẩm sinh tăng lipoprotein
- Cholesterol giảm hiếm gặp chủ yếu suy giảm chức năng tế bào gan (xơ gan)

2.Thí nghiệm
2.1 Nguyên tắc

02 : Định lượng Triglycerid trong huyết thanh

Phản ứng xảy ra theo các phương trình sau :
Triglyceride + H2O Lipoprotein Lipase glycerol + AB (1)

Glycerol + ATP

Glycerolkinase

Glycerol-3-Phosphate + O2

Glycerol-3-phosphate + ADP (2)
G-3-P. oxidase

H2O2 + 4 amino- antipyrin + ESPA

Peroxidase

H2O2 + Dihydroxyacetone phosphate (3)
Red quinone + H2O (4)

2.2 Thuốc thử
Reagent 01 (R1)
Pipes buffer pH7
N-Ethyl-N-Sulfopropyl –N – Anisidine ( ESPA)
Reagent 2 ( R2)
Lipoprotein Lipase
Glycerokinase
Glycerol –3- phosphate Oxidase
Peroxidase
Trang 15


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở

4 – amino -antipyrin
ATP
Dung dịch Triglyceride standard 200 mg/dl
2.3 Kỹ thuật tiến hành

Thuốc thử pha sẵn
Huyết thanh BN
Triglyceride standard

Ống N0 Bệnh nhân
(Unknoun)
500 µl
5 µl

Ống N0 chuẩn
( Standard)
500 µl
5 µl

Trộn đều, để nhiệt độ PTN .Đọc kết quả sau 10 phút
Chương trình máy Humalyze 2000 số 21
2.4 Ý nghĩa lâm sàng
- Trị số bình thường : Nam : 60 –165 mg/dl ( 0.68 – 1.88 mmol/L)
Nữ : 40 –140 mg/dl ( 0.46 – 1.60 mmol/L)
- Trị số tăng thường gặp trong các bệnh :
Bệnh lý về tim mạch : Xơ mỡ động mạch.
Bệnh nhân tiểu đường nặng
Các bệnh có tổn thương gan
Trong bệnh Buerger Griitz , có thể tăng gấp 20 lần.


BÀI 07
CHUYỂN HĨA PROTID
1

Thí nghiệm 01 : Định lượng Protein trong huyết thanh
1.1 Nguyên tắc : dựa trên phản ứng Biure
Protein ( có chứa từ 2 liên kết peptid trở lên ) + Cu2+ OH- tạo phức chất màu xanh tím .
Độ đậm màu ( mật độ quang) của phức hợp màu xanh tím tỷ lệ thuận với nồng độ protein
1.2 Thuốc thử
Thuốc thử reagent 1 :
Kali natri tartrat
Natri hydroxyd
Kali iodur
Thuốc thử reagent 2 :
CuSO4
6 mmol/L
1.3 Kỹ thuật tiến hành
Ống N0 Bệnh nhân
(Unknoun)

Trang 16

21 mmol/L
58 mmol/L
6 mmol/L

Ống N0 chuẩn
( Standard)



Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
Thuốc thử pha sẵn
Huyết thanh BN
Protein Standard

500 µl
5 µl

500 µl
5 µl

Trộn đều, để nhiệt độ PTN .Đọc kết quả sau 10 phút
Chương trình máy Humalyze 2000 số …19.
1.4 Ý nghĩa lâm sàng
Trị số protein tồn phần huyết thanh bình thường 62 – 80 g/l
Trị số tăng trong các trường hợp sau :
• U tủy
• Mất nước
• Thiểu năng vỏ thượng thận
Trị số giảm thường gặp và có ý nghĩa trong các bệnh sau :
• Suy dinh dưỡng
• Bệnh gan ( viêm gan, xơ gan)
• Giảm do bệnh thận ( viêm thận, thận hư …)
• Giảm do mất protein qua đường ruột
• Giảm do tăng phân hủy ( đái đường, suy kiệt do ung thư, sốt kéo dài )

2. Thí nghiệm 02 : Định tính protein trong nước tiểu
( Phương pháp dùng Acid Sulfosalicylic 3% và nhiệt độ phòng )
2.1 Nguyên tắc

Protein trong nước tiểu sẽ bị kết tủa bởI Acid Sulfosalicylic 3% mà khơng cần yếu tố đun nóng
2.2 Thuốc thử và dụng cụ
Ống nghiệm 13 x 100 . Giá đựng
Ống hút 01 ml
Acid Sulfosalicylic 3%
2.3 Kỹ thuật
Cho vào ống nghiệm :
1 ml nước tiểu
1 ml Acid Sulfosalicylic 3%
Trộn đều , đọc kết quả
2.4 Kết quả
Đưa ống nghiệm ra chổ ánh sáng , đọc độ đục trên một nền đen.
Âm tính : Dung dịch vẫn trong
Dương tính : Dung dịch đục và có tủa
- Biện luận kết quả :
Nước tiểu có Mucin, Bence Jone Protein, Acid Uric sẽ cho phản ứng dương giả.
Xét nghiệm này rất nhạy, thực hiện đơn giản , được áp dụng xét nghiệm hàng loạt trong cộng
đồng

Trang 17


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở

BÀI 08

XÉT NGHIỆM NƯỚC TIỂU
1.Phân tích mẫu nước tiểu với loại giấy nhúng 10 thông số
Tùy theo nhà cung cấp mà có thể có các loại giấy nhúng khác nhau .

Tuy nhiên chúng có những đặc điểm chung như sau :
1.1 Đặc điểm chung :
- Test phân tích nước tiểu 10 thông số ( Urine Reagent Strips viết tắc :URS)là một phim
nhựa mà vùng thuốc thử khác nhau được gắn chặt vào
- Sản phẩm được sử dụng độc lập
- Một test URS có thể cung cấp các thơng số sau : Glucose ,Bilirubine, keton ( Acid
acetoacetic) ,Specific Gravity ,Blood, pH ,Protein , Urobilinogen ,Nitrite, leukocyte và
Acid ascorbic trong mẫu nước tiểu.
- Test URS cho thơng tin về chuyển hóa đường, chức năng thận , chức năng gan,sự cân
bằng acid- bazơ và vi trùng
1.2 Nguyên tắc của các thông số:
1.2.1

1.2.2

1.2.3

1.2.4

1.2.5

Glucose :
Xét ghiệm này cơ bản dựa trên các enzym tham gia phản ứng gồm có Glucose oxidase
và enzym peroxidase với chất tạo màu là potassium iodine . Nếu có hiện diện glucose nước tiểu
sẽ chuyển từ màu xanh sang màu nâu nhạt – nâu – nâu đen.
Bilirubin :
Xét nghiệm này cơ bản dựa trên sự kết hợp cuả bilirubin trong nước tiểu với dichloroaniline
trong mơi trường acid. Nếu có hiện diện Bilirubin mẫu nước tiểu sẽ chuyển màu từ trắng vàng tới
đỏ nâu
Ketone:

Xét nghiệm này cơ bản dựa trên phản ứng acetoacetic trong nước tiểu với Sodium nitroprussside
trong môi trường trung tính . Nếu có sự hiện diện ketone trong mẫu nước tiểu sẽ chuyển từ màu
hồng da bị (âm tính) sang màu hồng tía (dương tính)
Specific Gravity :
Tỉ trọng trong nước tiểu tỉ lệ với số lượng , tỉ trọng và trọng lượng của những chất hòa tan trong
nước tiểu. Xét nghiệm tỉ trọng phản ánh nồng độ ion trong nước tiểu. Đo tỉ trọng của nước tiểu có
thể đánh giá khả năng cô đặc và pha lõang của thận
Với sự hiện diện của chất chỉ thị màu (xanh bromothymol) nồng độ các chất điện ly tạo ra các
màu từ xanh lục qua xanh lá cây đến vàng nâu.
Tỉ trọng nước tiểu bình thường 1.003 –1.030
Khi nước tiểu có pH >7 thì tỉ trọng đo được được cộng thêm 0,005.
Khi có sự hiện diện protein giữa 100 – 500 mg/dl hoặc nước tiểu nhiễm toan chuyển hóa thì tỉ
trọng nước tiểu có khuynh hướng gia tăng
Tỉ trọng nước tiểu có thể vượt quá gam màu ( khi nồng độ glucose niệu > 1000 mg/dl
Tỉ trọng nước tiều giảm dưới 1.005 trong bệnh đái tháo nhạt.
Máu :
Trang 18


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
Xét nghiệm này đo lượng hồng cầu, hemoglobin tự do từ hồng cầu ly giải và myoglobin.
Xét nghiệm dựa trên nguyên tắc hoạt động của hemoglobin giống như peroxidase, giấy thử biểu
diễn dưới hai dạng những đốm lấm chấm màu và sự thay đổi màu ( hồng cầu tươi biểu thị trên ô
thuốc thử bằng sự xuất hiện các đốm lấm chấm tương ứng của sự thay đổi màu )
Một sự hợp nhất các đốm lấm tấm xảy ra khi có trên 250 hồng cầu /ml.
Âm tính giả có thể xảy ra khi xuất hiện formalin trong mẫu thử.
Dương tính giả do sự lây nhiễm mẫu thử nước tiểu từ máu kinh nguyệt của phụ nữ, tỉ trọng nước
tiểu cao , tập thể dục nặng mất nhiều nước , vitamin có khả năng tạo ra những chất oxy hóa với
nồng độ cao

1.2.6 Protein
Xét nghiệm này dựa trên nguyên tắc về sự thay đổi nồng độ protein phụ thuộc vào một số chất chỉ
thị về pH .Chất chỉ thị này đặc biệt nhạy với albumin hơn là globulin , hemoglobin ,protein Bence
Jones ,mucoprotein
Phản ứng có độ nhạy với lượng protein khoảng 10 mg/dl. Do đó nước tiểu người bình thường sẽ
khơng phản ứng với giấy thử tìm protein.
Phản ứng dương tính giả có thể xảy ra với mẫu nước tiểu kiềm (pH> 9) , một số chất sát trùng , tỉ
trọng nước tiểu quá cao hoặc mẫu thử sau khi xoa bóp tuyến tiền liệt, v…v…
1.2.7 pH nước tiểu :
Xét nghiệm pH nước tiểu dựa trên nguyên tắc chất chỉ thị màu kép đỏ methyl và xanh
bromothymol , kỹ thuật cho những màu sắc phân biệt rõ ràng với sự thay đổi pH từ 5 - 9
Xác định pH nước tiểu giúp theo dõi và điều trị nhiễm trùng niệu cũng như sỏi đường tiểu . Nước
tiểu mới bài xuất , bình thường có pH hơi toan khoảng 5,8 –6,2
Nước tiểu kiềm (pH> 9) có thể nghĩ đến một sự nhiểm trùng do nhóm vi khuẩn phân giải urê :
Proteus sp, dịng Klebsiella sp , Pseudomonas … cũng có thể sinh urease và gây nên pH nước tiểu
kiềm.
1.2.8 Các bạch cầu ( leukocytes)
Xét nghiệm này dựa trên nguyên tắc :
Sự hiện diện của các enzym esterase của các bạch cầu có hạt (granulocyte) . Các enzym này có
tác dụng thủy phân este của indoxyl , và indoxyl được giải phóng sẽ phản ứng với muối
diazonium để cho ra sản phẩm có màu tím
Phản ứng này khơng bị ảnh hưởng bởi sự có mặt vi khuẩn , trichomonas , hoặc hồng cầu có mặt
trong nước tiểu
Tuy nhiên độ nhạy xét nghiệm sẽ giảm theo thời gian sau khi lấy mẫu, do sự ly giải bạch cầu
1.2.9 Nitrit :
Nước tiểu bình thường khơng chứa nitrit, tuy nhiên nhiều loại vi khuẩn gram âm có thể biến đổi
nitrat thành nitrit ,do đó xét nghiệm này có thể được sử dụng để phát hiện vi khuẩn niệu.
Xét nghiệm dương tính với lượng nitrit từ 0,06 – 0,1 mg/dl
Một xét nghiệm dương tính với nitrit phụ thuộc ba yếu tố : (1) sự hiện diện đủ số lượng vi khuẩn
khử nitrat, (2) sự hiện diện nitrit trong nước tiểu , (3) vi khuẩn tiếp xúc với nước tiểu trong

khoảng thời gian thỏa đáng (> 4 giờ)
1.2.10 Urobilinogen :
Xét nghiệm này dựa trên nguyên tắc là muối diazodium phản ứng tức thì với Urobilinogen để tạo
nên một chất azo có màu đỏ
Xét nghiệm này đặc hiệu đối với Urobilinogen và không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố gây nhiễu .
Kết quả khơng có màu hoặc có màu nhạt hơn màu của nồng độ urobilinogen là 1 mg/dl được xem
là bình thường.

Trang 19


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
1.3 Thực hành : Phân tích mẫu nước tiểu với giấy nhúng 10 thơng số ( mỗi nhóm 2 –3 mẫu nước
tiểu)
10 Thông số\ mẫu
01 – Glucose
02 – Bilrubine
03 – Ketone
04- Specific Gravity
05 – Blood
06 – pH
07 – Protein
08 – Urobilinogen
09 – Nitrite
10 – Leukocytes

Mẫu 01

Mẫu 02


THE END

PHỤ LỤC
BÀI 01 : HÓA HỌC GLUCID
BÀI 02 : HÓA HỌC LIPID
BÀI 03: HÓA HỌC PROTID

Trang 20

Mẫu 03


Bộ mơn Xét nghiệm
Tài liệu thực hành hóa sinh cơ sở
BÀI 04: ENZYM
BÀI 05: CHUYỂN HÓA GLUCID
BÀI 06: CHUYỂN HÓA LIPID
BÀI 07 : CHUYỂN HÓA PROTID
BÀI 08: XÉT NGHIỆM NƯỚC TIỂU
Tài liệu tham khảo :
1. Thực tập hóa sinh học –Khoa Y –Đại học Y Dược TPHCM
2. Thực tập hóa sinh – BM Hóa Sinh – Đại học Y Hà Nội

Trang 21