<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1>

<b>THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT</b>
Bộ môn CNSH Động vật-Khoa Công nghệ sinh học

<b>BÀI 01</b>

KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHA CHẾ, BẢO QUẢN

MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG VÀ CÁCH SỬ DỤNG MỘT SỐ TRANG THIẾT
BỊ CHỦ YẾU TẠI PHỊNG THÍ NGHIỆM CNSH ĐỘNG VẬT

<i><b>Mục đích bài thực tập:</b></i>

- Sinh viên biết cách tổ chức, bố trí các khu vực chức năng của phịng thí nghiệm
CNSHĐV

- Sinh viên hiểu rõ và thực hiện các thao tác cơ bản về sử dụng trang thiết bị, dụng
cụ thường dùng trong phịng thí nghiệm.

- Sinh viên biết cách tra cứu, chuẩn bị và pha chế một số hóa chất cơ bản dùng
trong ni cấy tế bào động vật.

<i><b>1. Nội dung:</b></i>

<i><b>1.1. Pha chế, bảo quản và sử dụng một số mơi trường thơng dụng trong phịng</b></i>
<i><b>thí nghiệm CNSH động vật </b></i>

<i>1.1.1. Mơi trường, hóa chất, vật tư thông dụng </i>
- Môi trường PBS

- Môi trường DMEM
- Môi trường TCM199

- Môi trường M12
- Môi trường M16
- Fetal Bovine Serum
- Peniciline-Streptomycine
- DMSO, Glycerol

- BSA, Hyaluronidase
- Trypsin-EDTA

- Millipore

- Buồng đếm hồng cầu
(Neubauer, Thoma)
- Flask nuôi tế bào

- Đĩa thao tác và nuôi tế bào các loại

<i>1.1.2. Pha ch môi trờng PBS vi thành phần nh sau (dùng pha 1 lÝt):</i>
Hãa chÊt _{Khèi lưỵng (gram)}

NaCl 8

Na pyruvate 0,036

KCl 0,2

Na2HPO4 1,15

KH2PO4 0,2

Glucose 1

MgCl2.6H2O 0,1

CaCl2.2H2O 0,1

</div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>

Bovine Serum Albumin 2-4
<i><b>1.2. Sử dụng một số trang thiết bị chủ yếu </b></i>

<i>1.2.1. Các khu vực chức năng của phòng thí nghiệm </i>
- Khu vực xử lý mẫu

- Khu vực tiền khử trùng

- Khu vực thao tác và nuôi cấy tế bào
- Khu vực bảo quản tế bào

- Khu vực phụ trợ (cất giữ quần áo, vật tư, hóa chất…)
<i>1.2.2. Trang thiết bị và cách vận hành:</i>

- Tủ hút an toàn sinh học cấp II
- Kính hiển vi soi nổi

- Bàn ấm để mẫu
- Đồng hồ bấm giây

- Máy hút môi trường cầm tay
- Tủ ni điều chỉnh CO2
- Bình chứa CO2 lỏng
- Kính hiển vi phản pha

- Bình Nitơ

- Cân phân tích, cân kỹ tḥt
- Máy đo pH

- Máy khuấy từ có gia nhiệt
- Máy ly tâm thường

- Máy ly tâm lạnh
- Bể rửa siêu âm
- Máy vortex

- Máy làm ấm ống nghiệm
- Máy bơm hút mini chân không
- Tủ ni xách tay

- Kính hiển vi quang học

- Bàn ấm trên kính hiển vi soi nổi
- Kính hiển vi vi thao tác

- Tủ khử trùng có đèn cực tím
- Tủ sấy

- Máy xung điện BTX
- Máy cắt kim

- Máy mài kim
- Máy cất nước
- Máy khử ion nước

- Máy PCR

- Máy Realtime PCR
- Máy soi gel

<b>BÀI 02</b>

</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>

<i><b>Mục đích bài thực tập:</b></i>

- Sinh viên hút trứng từ buồng trứng (lợn, bò, dê, trâu…), quan sát, thao tác và đánh
giá chất lượng trứng trên kính hiển vi soi nổi Nikon SMZ1000.

<i><b>Đối tượng: - Buồng trứng (lợn, bò, dê, trâu…) được thu ngay khi con vật bị chết,</b></i>
vận chuyển về phịng thí nghiệm. Các trứng bên trong nang được chọc hút bằng sử
dụng bơm tiêm loại 5ml.

<i><b>2.1. Thu nhận trứng từ buồng trứng vật nuôi </b></i>
<i>2.1.1. Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất </i>

<b>- Kính hiển vi soi nổi Nikon SMZ1000 </b>
- Pipetman loại 1ml, 200ul

- Đĩa nhựa NUNC to (02 cái)
- Đĩa nhựa NUNC bé (06 cái)
- Bơm tiêm loại 5ml (01 cái)
- Găng tay (01 cái)

- Môi trường PBS bổ sung kháng sinh, 10% FBS
<i>2.1.2. Phương pháp tiến hành </i>

<i>Bước 1: </i>

- Hút 20 ml môi trường PBS cho vào đĩa NUNC to số 01 bằng pipetman loại 1ml
<i>Bước 2: </i>

- Hút 02 ml môi trường PBS từ đĩa NUNC to 01 nói trên vào bơm tiêm
<i>Bước 3: </i>

- Tay đeo găng cầm buồng trứng, nhẹ nhàng vừa chọc vừa hút các nang trên bề mặt
buồng trứng (lặp lại vài lần đến khi hút hết tất cả các nang)

<i>Bước 4:</i>

- Tháo kim tiêm, bơm rất cẩn thận mơi trường có trứng, dịch nang, các loại tế bào…
từ bơm tiêm vào đĩa NUNC to số 01

Bước 5:

- Lặp lại bước 3 và 4 vài lần đến khi hút hết tất cả các nang trên bề mặt buồng trứng
<i><b>2.2. Thao tác với trứng động vật bậc cao</b></i>

<i>Bước 6: </i>

- Chuẩn bị đĩa 06 đĩa NUNC nhỏ (đánh số từ 01 đến 06, mỗi số tương ứng 01 sinh
viên), mỗi đĩa nạp 03 ml mơi trường PBS (có bổ sung kháng sinh, 10% FBS)

- Soi tìm trứng (đĩa NUNC to 01) trên kính hiển vi soi nổi NIKON SMZ1000 theo
nguyên tắc hình chữ “chi”

- Hút tồn bợ trứng có trong đĩa NUNC to 01 bằng sử dụng pipetman loại 200ul,

chuyển vào đĩa môi trường NUNC nhỏ số 01 (sinh viên làm chung bước này)

<i>Bước 07: </i>

- Từ đĩa NUNC nhỏ 01, sinh viên số 01 chuyển tồn bợ trứng sang đĩa NUNC nhỏ
02.

- Từ đĩa NUNC nhỏ 02, sinh viên số 02 chuyển tồn bợ trứng sang đĩa NUNC nhỏ
03

- Tương tự với các sinh viên khác

</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>

hợp trạng thái của nguyên sinh chất
<i>Bước 09: </i>

- Nhóm sinh viên hội ý, ghi và báo cáo kết quả

- Giáo viên hướng dẫn thực tập kiểm tra kết quả: sai khác < 20% so với kết quả của
giáo viên thì nhóm sinh viên được đánh giá là đạt yêu cầu, > 20% thì khơng đạt u
cầu (phải thực hành lại vào buổi khác)

<b>BÀI 03</b>

</div>
<span class='text_page_counter'>(5)</span><div class='page_container' data-page=5>

<i><b>Mục đích bài thực tập:</b></i>

- Sinh viên biết tìm thơng tin và chọn lọc các phương pháp, dụng cụ, vật tư, hóa
chất để nhân nuôi in vitro tế bào động vật (www.invitrogen.com).

- Sinh viên quan sát, thu nhận, thao tác, đếm tế bào và nhân nuôi, bảo quản lạnh tế
bào granulose, cumulus bằng sử dụng buồng đếm hồng cầu.

<i><b>Đối tượng:</b></i>

- Trang web: www.invitrogen.com

- Tế bào granulose, cumulus của động vật

<i><b>3.1. Thu thập, đánh giá số lượng và chất lượng tế bào</b></i>
<i>3.1.1. Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất</i>

- Tủ hút an tồn sinh học cấp II

- Kính hiển vi quang học NIKON E200
- Kính hiển vi phản pha NIKON TS100
- Đèn cồn, bật lửa

- Tủ nuôi điều chỉnh CO2
- Máy ly tâm

- Pipetman loại 1ml, 200ul
- Đĩa nhựa NUNC to (01 cái)
- Đĩa nhựa NUNC bé (02 cái)
- Đĩa nhựa 4 lỗ NUNC (01 cái)

- Ống ly tâm có nắp đậy loại 15ml (06 cái)

- Môi trường PBS bổ sung kháng sinh, 10% FBS
- Môi trường DMEM bổ sung kháng sinh, 10% FBS
- Trypsin-EDTA

- Hyaluronidase

- Dầu khoáng (Mineral Oil)
- Dimethyl Sulfoxide (DMSO)
- Kháng sinh Penni/Strep
- Fetal Bovine Serum
<i>3.1.2. Phương pháp tiến hành</i>

<i>Bước 1:</i>

- Dùng pipetman loại 1 ml hút dung dịch và tế bào trong đĩa NUNC lớn 01 của bài
thực hành số 02, chia đều vào 02 ống ly tâm loại 15 ml (đã có sẵn 03ml PBS,
10%FBS và kháng sinh), đậy nắp. Cân bằng và đặt đối xứng 02 ống trên vào máy ly
tâm

<i>Bước 2:</i>

- Ly tâm 1200 rpm/5 phút
<i>Bước 3:</i>

3a - Hút bỏ môi trường bên trên mợt cách cẩn thận từ trên xuống, cịn khoảng 0,5
ml thì dừng lại

3b - Thêm mơi trường PBS (đã có bổ sung kháng sinh và 10% FBS) vào ống ly tâm
đến vạch 5ml, hút trộn đều mẫu

<i>Bước 4:</i>

</div>
<span class='text_page_counter'>(6)</span><div class='page_container' data-page=6>

- Lấy 50 ul mẫu dung dịch có tế bào từ bước 3a, cho lên đĩa NUNC nhỏ, đặt lên
kính hiển vi phản pha NIKON TS100 để quan sát

- Thêm 05ul Trypsin-EDTA/05ul Hyaluronidase để phân tách tế bào (02-03
phút/370_{C) (nếu cần)}

<i>Bước 6:</i>

- Dùng môi trường PBS để pha loãng và đếm số lượng tế bào bằng sử dụng buồng
đếm Thoma, kính hiển vi quang học NIKON E200 (chia 02 lượng tế bào đang có: ½
ni in vitro (bước 7-9), ½ bảo quản lạnh (bước 10-12))

<i><b>3.2. Nhân nuôi in vitro tế bào trong tủ nuôi</b></i>
<i>Bước 7:</i>

- Chuẩn bị dung dịch 05 ml DMEM có tế bào với nồng đợ 1x106 _{cho vào lỗ của đĩa}

nuôi 04 giếng NUNC, phủ dầu khoáng (0,5 ml/ giếng).
<i>Bước 8:</i>

- Đậy nắp và cho đĩa nuôi 04 giếng NUNC vào tủ nuôi đã điều chỉnh 37O_{C, 5%CO}
2

<i>Bước 9:</i>

- Đánh giá khả năng sống của tế bào vào ngày kế tiếp bằng soi kính hiển vi phản
pha NIKON TS100.

<i><b>3.3. Bảo quản lạnh tế bào </b></i>
<i>Bước 10:</i>

- Chuẩn bị dung dịch 02 ml DMEM có bổ sung 10% DMSO, 10% FBS

<i>Bước 11:</i>

- Cho tế bào vào dung dịch DMEM nói trên.
<i>Bước 12:</i>

- Hạ nhiệt đợ (+40_{C trong 30 phút, -20}0_{C trong 30 phút) và bảo quản lạnh tế bào ơ}

-1960_{C. Giải đông 37}0_{C-01 phút, kiểm tra chất lượng tế bào.}

<b>BÀI 04</b>

</div>
<span class='text_page_counter'>(7)</span><div class='page_container' data-page=7>

- Sinh viên biết phương pháp pha loãng, xác định một số chỉ tiêu trong đánh giá
chất lượng tinh trùng vật nuôi.

<i><b>Đối tượng:</b></i>

- Tinh trùng lợn, bò

<i><b>4.1. Chuẩn bị buồng đếm và mẫu tinh trùng</b></i>

<i>4.1.1. Tính tốn nồng độ tế bào bằng cách sử dụng buồng đếm:</i>
C: Nồng độ tế bào ban đầu (số lượng tế bào/ml)

N: Số lượng tế bào đếm được trong 05 ô lớn
H: Hệ số pha loãng (giả sử là 20 lần)

Buồng đếm Thoma, Neubauer có ba thơng số cơ bản sau:
- Một ô lớn gồm 16 ô nhỏ

- Độ sâu của các ô nhỏ và lớn: 0,1mm

- Diện tích mặt đáy của mợt ơ nhỏ: 1/400 mm2

C = ?

- Sau khi hợi ý, nhóm sinh viên điền kết quả sau dấu ? và báo cho giáo viên hướng
dẫn thực tập kết quả.

- Giáo viên hướng dẫn tiếp nhận kết quả.
<i><b>4.2. Xác định số lượng tinh trùng</b></i>

- Bất hoạt tinh trùng bằng dung dịch NaCl 10%

- Cho 07 ul mẫu lên buồng đếm đã gắn lamen đúng tiêu chuẩn

- Xác định vị trí ơ đếm trên kính hiển vi Nikon, vật kính từ nhỏ đến lớn (từ 04 đến
40)

- Vi chỉnh kính hiển vi để nhìn rõ tinh trùng và các ô của buồng đếm

- Đếm số lượng tinh trùng trong 05 ô lớn (lặp lại 03 lần cho mỗi mẫu tinh trùng) và
tính trung bình

<i><b>4.3. Xác định tinh trùng kỳ hình</b></i>

- Tinh trùng kỳ hình: là những tinh trùng có hình dạng khác thường so với tinh
trùng bình thường và khơng hoặc có khả năng thụ thai kém

</div>
<span class='text_page_counter'>(8)</span><div class='page_container' data-page=8></div>

<!--links-->

Tiết 32. Công nghệ tế bào

• 24
• 619
• 0