BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ MẪU

XÁC ĐỊNH MÃ VẠCH ADN VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH
ĐỊNH LƯỢNG FRIEDELIN TRONG
CÂY SÂM ĐẤT CÔN ĐẢO
(PARIETARIA DEBILIS G.FORST., URTICACEAE)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2019

.


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

BỘ Y TẾ

Nguyễn Thị Mẫu

XÁC ĐỊNH MÃ VẠCH ADN VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH
ĐỊNH LƯỢNG FRIEDELIN TRONG
CÂY SÂM ĐẤT CÔN ĐẢO

(PARIETARIA DEBILIS G. FORST., URTICACEAE)
Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất
Mã số: 8720210
Luận văn Thạc sĩ Dược học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN MINH
PGS.TS. TRẦN CÔNG LUẬN
Hồ Chí Minh - 2019

.


LỜI CAM ĐOAN

Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận
văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì cơng trình nào khác.

Tác giả

.


LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC – KHÓA 2017 – 2019
Ngành Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất – Mã số: 8720210
XÁC ĐỊNH MÃ VẠCH ADN VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH
ĐỊNH LƯỢNG FRIEDELIN TRONG CÂY SÂM ĐẤT CÔN ĐẢO
( PARIETARIA DEBILIS G. FORST., URTICACEAE)
Nguyễn Thị Mẫu
Người hướng dẫn khoa học:


TS. Lê Văn Minh
PGS.TS. Trần Cơng Luận

Từ khóa: Sâm đất Cơn Đảo, Parietaria debilis, friedelin, mã vạch ADN, matK, ITS, rcbL.
Mở đầu
Sâm đất Côn Đảo được sử dụng nhiều trong dân gian với quy mơ ngày càng rộng. Tuy nhiên
chưa có các báo cáo khoa học nào về việc định danh, thành phần hóa học, tác dụng dược lý của
Sâm đất Cơn Đảo. Đề tài được tiến hành nhằm mục đích góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm
nghiệm nguyên liệu phục vụ cho các nghiên cứu về sau.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Khảo sát đặc điểm hình thái; đặc điểm vi phẫu thân, lá, cuống lá, rễ củ; đặc điểm bột trên mặt
đất, bột rễ củ của Sâm đất Côn Đảo. Xác định thành phần hóa thực vật theo quy trình được cải
tiến từ quy trình của Ciuley (Rumani). Chiết xuất AND tổng số, khuếch đại và giải trình tự 3
đoạn gen ITS – rADN, matK, rcbL của Sâm đất Côn Đảo. Xác định độ tinh khiết của bột rễ củ
Sâm đất Côn Đảo theo DĐVN V. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất và
thẩm định quy trình định lượng friedelin theo hướng dẫn của ICH.
Kết quả
Mô tả được đặc điểm thực vật học của Sâm đất Côn Đảo. Xác định được trong rễ của Sâm đất
Cơn Đảo có chứa chất béo, triterpenoid tự do, flavonoid, tannin, saponin, chất khử và hợp chất
polyuronid. Khuếch đại và giải trình tự thành cơng 3 vùng gen ITS - rADN kích thước 703 bp,
matK kích thước 875 bp, rcbL kích thước 633 bp của lồi Sâm đất Cơn Đảo. Quy trình định
lượng friedelin đã được thẩm định theo hướng dẫn của ICH đạt tính đặc hiệu, tính tuyến tính
(R2=0,9987), độ lặp lại (RSD = 1,89%), độ đúng từ 99,74 đến 100,44% cho phép ứng dụng để
định lượng friedelin trong rễ củ Sâm đất Côn Đảo. Kết quả hàm lượng friedelin trong rễ củ Sâm
đất CĐ là 0,0740 ± 0,0008% tính trên khối lượng dược liệu khơ.
Kết luận
Đề tài đã đưa những kết quả quan trọng phục vụ cho công tác định danh loài Parietaria debilis
G. Forst., Urticaceae sau này.

.



Master’s Thesis of Pharmaceutical – Acedemic course 2017 – 2019
Speciality: Drug Quality Control and Toxicology – Code: 8720210
INDENTIFICATION OF DNA BARCODES AND DEVELOPMENT OF A
PROCEDURE FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF FRIEDELIN IN
PARIETARIA DEBILIS G. FORST., URTICACEAE
Nguyen Thi Mau
Supervisor:

Dr. Le Van Minh
Assoc. Prof. Dr. Tran Cong Luan

Key words: Parietaria debilis, friedelin, DNA barcode, matK, ITS, rcbL.
Introduction: Parietaria debilis G. Forst., Urticaceae is a well – known herb in Con Dao, Ba
Ria-Vung Tau. There has been no documents regulating about identification, chemical
composition and pharmacological effects of the P. debilis. The purpose of the research is
contribution to build the P. debilis raw materials standard.
Objects and method of study
Investigating botany of P. debilis content description, microsurgery of leaf, petiole, trunk,
tuberous roots, characteristics of shoot system and tuberous roots powder. Determining
chemical composition of P. debilis tuberous roots by following an improved procedure from the
procedure of Ciuley (Rumani). Extraction of the total DNA, amplified and sequenced 3 genes
ITS - rADN, matK, rcbL of P. debilis. Determining the purity of tuberous roots powder according
to Viet Nam pharmacopoeia V. Constructing the procedure to extract friedelin from P. debilis
tuberous roots, investigating solvent and time. The analytical procedure was evaluated
according to ICH guidelines.
Result
Botanical properties of P. debilis were determined. P. debilis tuberous roots extract were found
to be good sources of lipid, free triterpenoid, flavonoid, tannin, saponin and polyuronid

compounds. Amplification and sequence success for 3 barcoding regions: ITS - rDNA length of
703 bp, matK length of 875 bp, rcbL length of 633 bp. The method to determine friedelin has
specificity, good linearity with R2 = 0,9987, accuracy was in the range from 99,74-100,44%,
repeatability had RSD% = 1,89%. The developed method was applied to the P. debilis tuberous
roots, the result showed that it contained 0,0740±0,0008% friedelin.
Conclussion
The research gave important results for identification of P. debilis in the future.

.


ii

MỤC LỤC
MỤC LỤC ....................................................................................................................... II
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................VI
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... VIII
DANH MỤC SƠ ĐỒ .....................................................................................................IX
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... X
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................XI
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC .................................................................. 2
Họ Urticaceae ................................................................................................. 2
Chi Parietaria ................................................................................................ 2
Loài Parietaria debilis G.Forst. ..................................................................... 3
1.2. TỔNG QUAN VỀ HĨA HỌC .............................................................................. 4
Thành phần hóa học của họ Urticaceae ......................................................... 4
Thành phần hóa học của chi Parietaria ......................................................... 6
Thành phần hóa học của lồi Parietaria debilis G.Forst. .............................. 6

1.3. TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ ........................................................ 6
Tác dụng dược lý của họ Urticaceae .............................................................. 6
Tác dụng dược lý của chi Parietaria ............................................................. 7
Tác dụng dược lý của loài Parietaria debilis G.Forst. .................................. 7

.


iii

1.4. PHƯƠNG PHÁP CHỈ THỊ MÃ VẠCH ............................................................... 8
Giới thiệu về phương pháp mã vạch ADN..................................................... 8
Các barcode thực vật thường sử dụng ............................................................ 9
Quy trình xác định mã vạch ADN ............................................................... 10
1.5. FRIEDELIN ........................................................................................................ 14
1.6. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC . 15
Các thông số đặc trưng của phương pháp HPLC ......................................... 15
Các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình định lượng chất chiết được trong dược
liệu .......................................................................................................................... 16
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................... 19
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................ 19
Mẫu chuẩn .................................................................................................... 19
Mẫu thử ........................................................................................................ 19
2.2. TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT ................................................... 19
Trang thiết bị ................................................................................................ 19
Dụng cụ ........................................................................................................ 20
Hóa chất ....................................................................................................... 20
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................................................... 21
Khảo sát thực vật học ................................................................................... 21
Xác định đoạn mã vạch ADN cho loài Sâm đất Cơn đảo ............................ 21

Khảo sát thành phần hóa thực vật ................................................................ 24

.


iv

2.4. THỬ TINH KHIẾT ............................................................................................. 26
2.5. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FRIEDELIN .. 26
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ................................................................................................ 30
3.1. KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC .......................................................................... 30
Đặc điểm hình thái ....................................................................................... 30
Bóc tách biểu bì ............................................................................................ 32
Đặc điểm vi phẫu ......................................................................................... 33
Đặc điểm bột dược liệu ................................................................................ 39
3.2. XÁC ĐỊNH ĐOẠN MÃ VẠCH ADN ............................................................... 41
Tách chiết ADN tổng số từ mẫu nghiên cứu................................................ 41
Khuếch đại các đoạn ADN mã vạch quan tâm ............................................ 41
Phân tích trình tự nucleotid của các đoạn ADN được nhân bản .................. 42
3.3. KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT ............................................... 46
3.4. THỬ TINH KHIẾT ............................................................................................. 47
Xác định độ ẩm ............................................................................................ 47
Xác định độ tro toàn phần ............................................................................ 47
Xác định độ tro không tan trong acid ........................................................... 47
3.5. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ....................... 47
Khảo sát điều kiện chiết xuất ....................................................................... 48
Thẩm định quy trình phân tích ..................................................................... 51
Quy trình định lượng friedelin trong mẫu rễ củ Sâm đất CĐ ...................... 57

.



v

3.6. BÀN LUẬN ........................................................................................................ 59
Khảo sát thực vật học ................................................................................... 59
Khảo sát thành phần hóa thực vật ................................................................ 59
Xác định đoạn mã vạch ADN ...................................................................... 59
Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng .............................................. 59
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................................ 61
KẾT LUẬN ................................................................................................................ 61
ĐỀ NGHỊ.................................................................................................................... 61
TAI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 62
PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 69

.


vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Các vùng gen trong thực vật ............................................................................. 9
Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo của friedelin ...................................................................... 14
Hình 2.1 Nguyên vật liệu ............................................................................................... 19
Hình 3.1 Đặc điểm hình thái lồi Parietaria debilis G.Forst., Urticaceace ................... 31
Hình 3.2 Hoa thức và hoa đồ hoa cái ............................................................................. 32
Hình 3.3 Hoa thức và hoa đồ hoa đực ............................................................................ 32
Hình 3.4 Lơng che chở ở biểu bì thân ............................................................................ 32
Hình 3.5 Biểu bì thân với nhiều lơng tiết ....................................................................... 32
Hình 3.6 Biểu bì dưới lá ................................................................................................ 33

Hình 3.7 Biểu bì trên lá có nhiều bào thạch ................................................................... 33
Hình 3.8 Lỗ khí kiểu hỗn bào ở biểu bì dưới ................................................................. 33
Hình 3.9. Vi phẫu cắt ngang rễ củ Parietaria debilis G.Forst., Urticaceace ................. 35
Hình 3.10 Vi phẫu cắt ngang của thân Parietaria debilis G.Forst., Urticaceace........... 36
Hình 3.11 Vi phẫu cắt ngang của lá Parietaria debilis G.Forst., Urticaceace............... 37
Hình 3.12 Vi phẫu cắt ngang của cuống lá Parietaria debilis G.Forst., Urticaceace .... 38
Hình 3.13 Thành phần bột toàn thân trên mặt đất Parietaria debilis G.Forst., Urticaceace
........................................................................................................................................ 39
Hình 3.14 Thành phần bột rễ củ Parietaria debilis G.Forst., Urticaceace .................... 40
Hình 3.15 Kết quả chạy điện di ...................................................................................... 41
Hình 3.16 Kết quả điện di đồ vùng gen ITS-rADN ........................................................ 43
Hình 3.17 Kết quả điện di đồ vùng gen matK ................................................................ 44
Hình 3.18 Kết quả điện di đồ vùng gen rcbL ................................................................. 45
Hình 3.19 Sắc ký đồ mẫu thử chiết bằng methanol 50% ............................................... 49
Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu thử chiết bằng methanol 80% ............................................... 49
Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu thử chiết bằng methanol 100% ............................................. 49

.


vii

Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu thử với thời gian chiết là 30 phút ........................................ 50
Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu thử với thời gian chiết là 45 phút ........................................ 51
Hình 3.24. Sắc ký đồ mẫu thử với thời gian chiết 60 phút ............................................ 51
Hình 3.25. Sắc ký đồ mẫu thử với thời gian chiết 75 phút ............................................ 51
Hình 3.26 Sắc ký đồ mẫu trắng ...................................................................................... 52
Hình 3.27 Sắc ký đồ mẫu chuẩn..................................................................................... 52
Hình 3.28 Sắc ký đồ mẫu thử ......................................................................................... 52
Hình 3.29 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn ..................................................................... 53

Hình 3.30 Đồ thị đường chuẩn ....................................................................................... 54

.


iii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của họ Urticaceae ......................... 4
Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về tác dụng của các loài trong họ Urticaceae .................... 6
Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị sử dụng ....................................................................... 19
Bảng 2.2 Danh mục các hóa chất sử dụng ..................................................................... 20
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR ............................................................................ 23
Bảng 2.4 Thông tin các mồi sử dụng ............................................................................. 24
Bảng 3.1 Bảng kết quả đo quang dịch chiết ADN ......................................................... 41
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát thành phần hóa thực vật trong rễ củ.................................... 46
Bảng 3.3. Kết quả xác định độ ẩm ................................................................................. 47
Bảng 3.4. Kết quả xác định độ tro toàn phần ................................................................. 47
Bảng 3.5. Kết quả xác định độ tro không tan trong acid................................................ 47
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát dung môi chiết ................................................................... 48
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát thời gian chiết xuất............................................................. 50
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát tính tuyến tính .................................................................... 53
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ lặp lại............................................................................. 54
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian ..................................................... 55
Bảng 3.11 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống ....................................................... 55
Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ đúng............................................................................. 56
Bảng 3.13 Hàm lượng friedelin trong rễ củ Sâm đất Côn Đảo ...................................... 58

.



ix

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1 Phân loại thực vật học loài Parietaria debilis Forst. Urticaceace ................... 3
Sơ đồ 2.1 Chu trình nhiệt nhân bản đoạn DNA mã vạch ............................................... 23
Sơ đồ 2.2 Quy trình chiết mẫu thử phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật ................ 25

.


x

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
STT Từ viết tắt
1
2
3

ADN
CĐ
dNTP

4

dsADN

5
6
7


EBA
EBB
F primer

8

HPLC

9

ICH

10
11
12
13
14
15
16

ITS
PCR
PDA
R primer
rcbL
rpm
SDS

17


ssADN

Từ nguyên gốc

Từ tiếng Việt

Deoxyribonucleic Acid

ADN
Côn Đảo
Deoxynucleotid triphoshat

Deoxynucleotide triphosphate
Double stranded Deoxyribonucleic
Acid
Extraction Buffer A
Extraction Buffer B
Forward primer
High-performance liquid
chromatography
International Conference on
Harmonization
Internal Transcribed Spacer
Polymerase chain reaction
Photo diode array
Reverse primer
ribolose-bisphosphate carboxylase
revolutions per minute
Sodium dodecyl sulphate

Single stranded Deoxyribonucleic
Acid

.

ADN sợi đôi
Đệm chiết xuất A
Đệm chiết xuất B
Mồi xuôi
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hội nghị quốc tế về hài hịa hóa các
thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng
cho con người.
Phản ứng khuếch đại gen
Dãy diod quang
Mồi ngược
Số vòng quay trong một phút
Natri dodecyl sulfat
ADN sợi đơn


xi

LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn thầy TS. Lê Văn Minh, thầy PGS.TS. Trần Cơng Luận đã
tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện, cho em những lời khuyên quý báu trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn thầy TS. Võ Văn Lẹo, thầy PGS.TS. Phan Thanh Dũng đã
dành thời gian đọc và nhận xét đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các anh chị trong Trung tâm Sâm và dược liệu, đặc

biệt là chị Thảo, anh Minh, anh Trí đã luôn ở bên động viên, hỗ trợ, tạo điều kiện hết
sức; các anh chị đồng nghiệp đã hỗ trợ cơng việc tạo thời gian giúp em hồn thành đề
tài.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đã luôn động viên, chia sẻ cùng
em, tạo động lực cho em trong suốt thời gian qua.

.


MỞ ĐẦU
Hiện nay, ở Việt Nam cũng như trên toàn thế giới, xu hướng sử dụng thuốc có
nguồn gốc từ dược liệu ngày một gia tăng. Theo WHO khoảng 80% dân số thế
giới hiện nay vẫn sử dụng thuốc có nguồn gốc tự nhiên trong chăm sóc sức khỏe.
Việt Nam có nền y học cổ truyền lâu đời, hệ thống thực vật đa dạng và phong
phú với khoảng 12.000 loài, trong đó có trên 4000 lồi cây thuốc là một lợi thế
trong việc phát triển ngành công nghiệp Dược [3]. Tuy nhiên nhiều dược liệu
có tiềm năng vẫn chưa được nghiên cứu.
Sâm đất Côn Đảo là loại cây mọc tự nhiên ở Côn Đảo. Theo dân gian Sâm đất
Côn Đảo có tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng, long đờm, giúp giảm sưng viêm trong
viêm khớp, đặc biệt củ sâm được sử dụng nhiều để nấu nước hoặc ngâm rượu
uống với tác dụng bồi bổ sức khỏe. Việc sử dụng Sâm đất Cơn Đảo ngày càng
phổ biến vì thế quy mơ trồng Sâm đất của các hộ dân tại Côn Đảo ngày càng
mở rộng. Đây là món quà mà các khách du lịch thường mua về với giá Sâm đất
Côn Đảo dao động từ 800.000 – 3.000.000/kg.
Hiện nay chưa có báo cáo khoa học nào về việc định danh, thành phần hóa học,
tác dụng dược lý của Sâm đất Cơn Đảo.
Vì vậy việc định danh cho đúng tên loài của cây Sâm đất Côn Đảo, cùng với
việc xác định thành phần hóa học và hướng tác dụng sinh học của cây sâm này
là rất cần thiết.
Đề tài được thực hiện nhằm mục đích định danh lồi của Sâm đất Cơn Đảo, xây

dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu với các mục tiêu cụ thể sau:
-

Khảo sát đặc điểm thực vật học của cây Sâm đất Côn Đảo.

-

Xác định đoạn mã vạch ADN của Sâm đất Cơn Đảo

-

Xây dựng quy trình định lượng friedelin trong rễ củ cây Sâm đất Côn
Đảo bằng phương pháp HPLC.

.


CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC
Họ Urticaceae
Họ Gai (Urticaceae Juss.) có khoảng 54 chi, hơn 2000 loài phân bố chủ yếu ở
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, có 23 chi với gần 100 lồi [57].
Thân: Cỏ, đơi khi cây nhỡ. Lá: Có lá kèm, mọc so le hay mọc đối; trên cùng
một cây có thể có cả hai cách đính này. Phiến ngun hay có thùy, gân lá hình
chân vịt hoặc đơi khi hình lơng chim. Cụm hoa: Thường là xim nhưng đơi khi
cũng có thể là chùm hoặc gié. Hoa: Đơn tính cùng gốc hay khác gốc, khơng có
cánh hoa. Bao hoa: Hoa đực có 4-5 lá đài màu xanh. Ở hoa cái các phiến này có

thể rời hay dính nhau ở đáy. Bộ nhị: Hoa đực có 4–5 nhị và mọc đối diện với
các lá đài. Chỉ nhị cong trong nụ hoa. Khi hoa nở, chỉ nhị bung ra rất mạnh để
tung hạt phấn trong gió. Hoa cái có dấu vết của nhị là những vẩy nhỏ nằm đối
diện với lá đài. Bộ nhụy: Hoa cái có 1 lá nỗn tạo thành bầu trên, 1 ơ, 1 nỗn
thẳng đính ở đáy; 1 chùm đầu nhụy. Quả: Bế, thường được bao bọc bởi lá đài
cịn lại và ít nhiều đồng trưởng. Hạt có nội nhũ dầu, mầm thẳng.
Cơ cấu học: Nhiều cây có lơng làm ngứa. Phiến lá thường chứa bào thạch. Sợi
libe rất dài, ít tẩm chất gỗ. Khơng có ống nhựa mủ nhưng có tế bào và túi chứa
gơm [5].

Chi Parietaria
Hiện nay các lồi thuộc chi Parietaria chỉ được quan tâm đến như là các tác
nhân gây dị ứng, chưa có nhiều cơng trình khoa học về thành phần hóa học và
tác dụng dược lý.
Trên thế giới có khoảng 20 lồi chủ yếu phân bố ở vùng ơn đới và nhiệt đới. Ở
châu Âu có 4 lồi được mô tả là Parietaria lusitanica L., Parietaria microphylla
L., Parietaria officinalis L., Parietaria pensylvanica Muhl. ex Will [23]; ở Việt
Nam có 1 lồi được mơ tả. là Parietaria debilis [7].
Cây thân thảo một năm hay nhiều năm, có lơng, khơng có lơng ngứa. Lá mọc
cách, nhỏ, bìa ngun, có gân 3 từ gốc, có cuống. Hoa lưỡng tính hay đơn tính,

.


cụm hay xim co ở nách lá. Bao hoa 3-4 răng màu xanh, 3-4 nhị. Quả bế nằm
trong đài đồng trưởng [52].

Loài Parietaria debilis G.Forst.
Tên Việt Nam: Tường Anh.
Đồng danh: Parietaria coreana Nakai; P. debilis var. micrantha (Ledbour)

Weddell; P. lusitanica Linnaeus subsp. chersonensis (Lang) Chrtek var.
micrantha (Ledbour) Chrtek.
Họ: Urticaceae
Phân bố: Châu Âu, Ấn Độ, Trung Quốc. Ở Việt Nam được tác giả Phạm Hồng
Hộ mơ tả ở tỉnh Thừa Thiên Huế.
Tên nước ngoài: Qiang cao (Trung Quốc); Chamkhalu (Ấn Độ) [36].

Thực vật bậc cao

Ngành ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp ngọc lan (Magnoliopsida)

Bộ Gai (Urticales)

Họ Gai (Urticaceae)

Chi Parietaria
Sơ đồ 1.1 Phân loại thực vật học loài
Parietaria debilis Forst. Urticaceace

.


Đặc điểm hình thái: Cỏ yếu; nhánh sà, có lơng. Lá mọc xen, phiến xoan bầu
dục, bìa nguyên, gân từ đáy 3, có lơng thưa; cuống dài 1 cm, có lơng. Chụm;
hoa đực có lá đài rời; 4 tiểu nhụy; hoa cái có đài hình bầu, nuốm do lơng dài.
Bế quả trong đài có sóng, có lơng [7]
Bộ phận dùng: Tồn cây hoặc rễ [11].


1.2. TỔNG QUAN VỀ HĨA HỌC
Thành phần hóa học của họ Urticaceae
Các lồi trong họ Gai có chứa lignan, norlignan, flavonoid, alcaloid,
sesquiterpenoid, triterpenoid, sterol và sphingolipid [50].
Bảng 1.1 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của họ Urticaceae
Thành phần hóa học

Lồi

Tài liệu
tham khảo

Pouzolzia

Friedelan

indica
Cecropia

Tormentic acid,pomolic acid, a-amyrin,

schreberiana

arjunolic acid, vitexin, orientin,
isoorientin, catechin, epicatechin,

[31]

[29]


cinchonain Ia, cinchonain Ib,
procyanidins
Pouzolzia

Pouzolignan F [4-hydroxy-3- (3,5-

zeylanica

dihydroxyphenyl) -2- [bis (4-hydroxy-3metoxyphenyl) metyl] butyl axetat]
Pouzolignan G [4-hydroxy- 3- (3,5dihydroxyphenyl) -2 - [(4-hydroxy-3,5dimetoxyphenyl) (4-hydroxy-3metoxyphenyl) metyl] butyl axetat]
Pouzolignan H [1,4-dihydroxy -3- (3,5dihydroxyphenyl) -2- [bis (4-hydroxy-3metoxyphenyl) metyl] butan]

.

[16]


Pouzolignan I [1,4-dihydroxy-3- (3,5dihydroxyphenyl) -2 - [(4-hydroxy-3,5dime thoxyphenyl) - (4-hydroxy-3metoxyphenyl) metyl] butan]
Pouzolignan J [1,4-dihydroxy-3- (3,5 dihydroxyphenyl) -2 - [(3,4,5trimethoxyphenyl) (4-hydroxy-3methoxyphenyl) metyl] butan]
Cecropia

Ent-mururin A, ent-vaccinin A

obtusifolia
Pouzolzia

Triterpenoids: Friedelin và 28-hydroxy-

indica


3-

[39]

Friedelanon
Coumarin: 7-methoxy-coumarin
Phenolic: scoparon, scopoletin, và

[46]

methyl caffeat
Glycosides: sitosteryl glucosid;
glycosphingolipid
Pouzolzia

Beta-sitosterol, daucosterol, oleanolic

zeylanicar

acid, epicatechin, alpha-amyrin, eugenylbeta-rutinosid , 2alpha, 3alpha, 19alphatrihydroxyurs-12-en-28-oic, scopolin,
scutellarein-7-O-alpha-L-rhamnosid,

[17]

scopoletin, quercetin, quercetin-3-Obeta-D-glucosid, apigenin, 2alphahydroxyursolic acid.
Pilea

aff. Julandine pileamartines A, pileamartines

martinii


B

.

[44]


Pouzolzia

Pouzolignan A [2-hydroxy-4-[4-

occidentalis

hydroxyphenyl-(4-hydroxy-3methoxybenzyl)]-3-(3,5dihydroxyphenyl)tetrahydrofuran]

[33]

pouzolignan B [ 1,4-dihydroxy-3-[4hydroxyphenyl-(4-hydroxy-3methoxybenzyl)]-2-(3,5dihydroxyphenyl)butan]

Thành phần hóa học của chi Parietaria
Hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Parietaria.
Nghiên cứu của Mansoor Khaledi và cộng sự cho thấy trong Parietaria
judaica L. chứa các hợp chất phenolic và flavonoid [7].

Thành phần hóa học của lồi Parietaria debilis G.Forst.
Nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân lập và xác định trong rễ củ Sâm đất CĐ có
chứa friedelin, 3-friedelanol, daucosterol và pouzolignan N.

1.3. TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ

Tác dụng dược lý của họ Urticaceae
Các lồi trong họ Gai có tác dụng gây độc tế bào, chống ung thư, kháng khuẩn,
kháng nấm, chống HIV, trị đái tháo đường, hạ đường huyết, ức chế 5αreductase, thúc đẩy mọc tóc và chống oxy hóa [50].
Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về tác dụng của các loài trong họ Urticaceae
Tác dụng

Loài

Hạ đường huyết ở chuột

Urtica
pilulifera

Ức chế lipopolysaccharide

Pouzolzia
zeylanica

.

Tài liệu tham khảo
[25]

[16]


Musanga

Bảo vệ gan và chống oxy hóa


cecropioides

trên chuột

Pouzolzia

Ngừa thai

mixta
Độc tế bào

Boehmeria
cylindrica

Chống tăng sinh tế bào

Pouzolzia
indica
Urtica dioica

Hạ huyết áp ở chuột

Pouzolzia

Kháng Acanthamoeba (tác nhân

indica

gây viêm giác mạc)


Holoptelea

Kháng khuẩn, chống oxy hóa,

integrifolia

làm lành vết thương ở chuột

Cecropia

Chống huyết khối

obtusifolia
Pouzolzia

Kháng Helicobacter pylori

pentandra

[35]

[42]

[27]

[31]
[43]
[41]

[38]


[39]

[12]

Tác dụng dược lý của chi Parietaria
Mansoor Khaledi và cộng sự đã thử tác động kháng Enterococcus faecalis của
cao cồn 30% của Parietaria judaica L. cho kết quả nồng độ ức chế tối thiểu là
128 µg/ml, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là 512 µg/ml [26].
Nghiên cứu của Saleh Fares và cộng sự đã cho thấy Parietaria judaica L. có
tiềm năng trong việc kháng loài Streptococcus pneumoniae đa kháng thuốc [26]
Ngoài ra các lồi thuộc chi Parietaria cịn có tác dụng lợi tiểu [19], được ứng
dụng làm vaccin trị dị ứng [18].

Tác dụng dược lý của lồi Parietaria debilis G.Forst.
Hoạt tính sinh học: Theo kết quả của nhóm nghiên cứu khi thử hoạt tính in vitro
cao chiết từ rễ củ Parietaria debilis có hoạt tính chống oxi hóa. Cao ethyl acetat

.


cho hoạt tính mạnh (IC50 là 20,02 µg/ml), cao ethanol tổng cho hoạt tính khá
mạnh (IC50 là 44,99 µg/ml). Về hoạt tính gây độc tế bào: Các cao ethanol tổng,
cao n-hexan, cao dicloromethan có hoạt tính gây độc tế bào yếu nhưng dữ liệu
vẫn chưa đủ để tính IC50. Khả năng gây độc tế bào của các cao ethyl acetat, cao
n-butanol, cao nước của rễ củ Parietaria debilis là không đáng kể. Về tác dụng
kháng viêm: Cao n-hexan và cao dicloromethan cho hoạt tính kháng viêm mạnh
(IC50 lần lượt là 11,57 µg/ml và 15,24 µg/ml) so với chuẩn diclofenac natri
(IC50 là 9,75 µg/ml). Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử hoạt tính sinh học trên
in vivo cho thấy cao ethanol tổng của Parietaria debilis khơng có độc tính cấp

trên đường uống với Dmax = 27,32 g/kg hoặc 9,85 g/kg tính trên cao khô kiệt.
Cao ethanol tổng của rễ Sâm đất Côn Đảo ở cả hai liều 0,68 g/kg (0,25 g/kg tính
trên cao khơ kiệt) và 1,36 g/kg (0,49 g/kg tính trên cao khô kiệt) thể hiện tác
dụng tăng lực dài ngày sau 7 ngày và 14 ngày uống và không thể hiện tác dụng
tăng lực tức thời sau 60 phút uống.
Công dụng: Chữa các loại mụn nhọt đinh độc, nhọt sau lưng, bệnh tróc đầu,
viêm tinh hồn, lở lt. [7], [11].

1.4. PHƯƠNG PHÁP CHỈ THỊ MÃ VẠCH
Giới thiệu về phương pháp mã vạch ADN
Khái niệm mã vạch ADN được Paul Heber, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph,
Ontario đưa ra lần đầu tiên vào năm 2003 như một cách để định danh các loài.
Mã vạch ADN sử dụng một đoạn gen rất ngắn từ bộ gen chuẩn của sinh vật để
phân biệt các lồi với nhau. Hai lồi có thể rất giống nhau về hình thái nhưng
sẽ có mã vạch khác nhau.
Cho đến nay việc phân loại hay giám định sinh vật chủ yếu thực hiện theo
phương pháp truyền thống dựa trên chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh
lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn. Phương pháp
phân loại truyền thống này trong nhiều trường hợp cịn gặp nhiều khó khăn và
hạn chế, như nhiều sinh vật có hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất
khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất khác nhau); ngược lại nhiều sinh

.


vật có hình thái rất khác nhau nhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại
(hệ gen rất giống nhau). Mặt khác, phương pháp phân loại truyền thống dựa trên
các đặc điểm hình thái rất khó phân biệt được sự khác biệt giữa các biến dị dưới
loài. Đặc biệt, đối với những mẫu vật có nguồn gốc sinh vật đã bị biến đổi về
hình thái, như những mẫu sinh vật đã chết, bị chôn vùi dưới đất, ở các cơng trình

xây dựng, đã qua chế biến thì khơng thể xác định được bằng chỉ thị hình thái.

Các barcode thực vật thường sử dụng

Hình 1.1 Các vùng gen trong thực vật
Màu xanh lá cây: Mã vạch tiềm năng
Màu đỏ: Không sử dụng làm mã vạch
Màu vàng: Đang nghiên cứu [15]
Hệ thống mã vạch ADN lý tưởng phải đáp ứng các yêu cầu sau đây:
- Đoạn ADN chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa các loài nhưng cũng
phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài.

.


- Hệ thống định danh bằng ADN phải được chuẩn hóa, với cùng một vùng ADN
có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau.
- Đoạn ADN chỉ thị cần chứa đủ thơng tin phát sinh lồi để có thể dễ dàng định
danh lồi vào các nhóm phân loại (chi, họ,…).
- Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thơ, với vị trí cặp mồi nhân gen
có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự ADN
- Đoạn ADN nghiên cứu nên có kích thước ngắn để q trình nhân bản ADN
khơng bị sai lệch.
Hiện nay chưa có một thống nhất chung trong việc chọn vùng gen dùng làm mã
vạch. Một số vùng thường được chọn làm mã vạch là vùng gen ITS, matK,
rcbL…
Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là một đoạn RNA khơng có chức năng,
nằm giữa các RNA cấu trúc của ribosom thường được dịch mã. Cấu trúc vùng
ITS gồm ITS1 – 5.8S – ITS2. Vùng ITS gồm 2 locus riêng biệt là ITS1 và ITS2
nối với nhau qua locus 5.8S. Vùng 5.8S khá ổn định và có đủ tín hiệu phát sinh

lồi ở mức bộ và ngành.
Vùng gen rbcL (ribolose-bisphosphate carboxylase) được sử dụng nhiều để
dựng cây phát sinh loài. Tuy nhiên đối với mối quan hệ di truyền ở mức dưới
lồi thì gen này cịn gặp nhiều hạn chế.
Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturase K) các nghiên cứu về gen matK cho
thấy gen này có tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp do vậy gen
này trở thành chỉ thị quan trọng để giúp phân loại thực vật [22].

Quy trình xác định mã vạch ADN
1.4.3.1. Chiết tách ADN
Nguyên tắc chung quá trình chiết tách ADN gồm 3 bước phá vỡ tế bào, chiết
tách acid nucleic và kết tủa acid nucleic. Sau khi chiết tách acid nucleic được
tinh chế bằng cách ly tâm, sắc ký hoặc điện di.

.